Geçiş metallerinin memeli gelişimindeki rolü büyük ölçüde küçümsenmemelidir. Ortaya çıkan kanıtlar metal homeostazın hücre ve dokuların gelişim evresine göre değişmeye devam ettiğini göstermektedir. Ayrıca, metallerin belirli hücresel hedefleri de geliştirme varietal, ve tabii ki, onların yerini belirlemek için zor.
Bugüne kadar, metalleri ölçmek için farklı analitik teknikler geliştirilmiştir, ancak bunların çoğu pahalı veya erişilemezdir. Yoğun araştırma daha erişilebilir ve verimli bir şekilde metal tayinleri geliştirmek için odaklanmıştır. Grafit fırın atomik absorpsiyon spektroskopisi, GF-AAS, iki ana avantajı vardır.
Çinko için düşük algılama limitleri sağlayarak doğru iz çinko analizi sağlar. Aynı zamanda yüksek hacimli numune gerektirmeyen bir tekniktir, çözeltinin mikrolitreleri analizi gerçekleştirmek için yeterli olma eğilimindedir. Bu iki avantajın birleşimi, GF-AAS'ı düşük hacimli numunelerde eser öğeleri analiz etmek için ideal hale getirsin.
Birçok insan patolojik koşulları metal dengesizlikleri ile ilgilidir. Bazı örnekler anemi, akrodermatit enteropaica ve Wilson ve Menkes hastalıklarıdır. Bu nedenle biyolojik numunelerdeki geçiş metallerinin seviyelerini yüksek hassasiyet ve doğrulukla ölçmek için etkin ve güvenilir yöntemler geliştirmek önemlidir.
GF-AAS, normal fizyolojik koşullarda ve patojenik vakalarda herhangi bir metalin belirlenmesini kolaylaştıran bir teknoloji üzerinde mükemmel bir örnektir. Yöntem çok yönlüdür. Birçok sistem uygulanabilir ve birçok eleman GF-AAS kullanılarak analiz edilebilir.
Zorluklar, örneklerin bu sınıra düşmesini sağlayarak gerçekte algılama yöntemi sınırını belirlemektir. Örneklerin hacminin düşük olduğu göz önüne alındığında, test için çok fazla yer yoktur, bu nedenle verilerin dikkatle incelenmesi en başından beri yapılması gerekir. Numunelerin ilk analizinden sonra, numuneleri nicelleştirme için gerekli sınırlara getirmek için gereken seyreltme faktörünün ne olduğunu belirlememiz gerekir.
AAS'ye gitmeden önce çekirdekleri düzgün bir şekilde kesirleyebildiğinizden emin olun. Batı lekeleri spektroskopik analizden önce her zaman iyi bir doğrulamadır. GF-AAS düşük hacimli olsa da, hücre içi havuzlar zaten düşük hacimlerdedir.
Bu test için çok az yer verir. İlk ölçümler dikkatle yapılmalı ve incelenmelidir, böylece numune tedavisi sadece bir seyreltme faktörüne indirgenebilir. Başlamak için, kültür 55 santimetre kare plakalar ilgi hücreleri.
Kültür medyaaspirate için bir vakum tuzağı kullanın. Ortamın tüm izlerini kaldırdıklarından emin olun. İstenilen zaman noktalarından veya kültür koşullarından hücreleri üç kez durulamak için kalsiyum ve magnezyum içermeyen buz gibi PBS kullanın.
Sonra plakaya bir mililitre buz gibi pBS ekleyin ve hücreleri tabaktan kazıyın. Hücre süspansiyonlarını 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve buzda tutun. 10, 000 kez G'de 10 saniye santrifüj yapın ve aspirasyon la supernatant'ı çıkarın.
Sitoplazmik ve nükleer fraksiyonların metal analizi isteniyorsa, iyonik olmayan bir deterjan olan 0.1%NP-40 içeren 400 mikrolitre buz gibi pbs içeren hücre peletini yeniden askıya alın. 100 mikrolitreyi tüm hücre numunesi olarak yeni bir mikrosentrifuge tüpüne aktarın ve eksi 20 derecede saklayın. Çekirdekleri izole etmek için, 400 mikrolitrelik hücre süspansiyonunun buzüzerinde 5 ila 10 kez yukarı ve aşağı inip çıkarmasını pipetlemek için P1000 mikropipet ucu kullanın.
Sonra, hücre süspansiyon beş mikrolitre ayıklayın ve bir mikroskop cam slayt aktarın. Çekirdek bütünlüğünü doğrulamak için 40 kat objektif kullanarak bir ışık mikroskobu altında beş mikrolitre yerleştirin. Kalan 395 mikrolitre likit süspansiyonu 10 saniyede 10 saniye için santrifüj edin, 000 kez G.Sitosolik fraksiyonu içeren süpernatantı yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
Daha sonra, 0.1% NP-40 içeren PBS 500 mikrolitre ekleyin nükleer fraksiyonu ile pelet durulayın, ve 10 saniye için santrifüj 10, 000 kez G.Supernatant çıkarın, ve aynı çözeltinin 100 mikrolitre çekirdekleri içeren pelet yeniden askıya. Hücreleri lyse için, beş dakika boyunca, üç kez, her biri için çözüm içeren tüm hücre ve çekirdekleri sonicate bir Bioruptor kullanın. Nükleer veya sitosolik fraksiyonlara özgü antikorlar kullanarak, fraksiyonların saflığının batı lekeleri tarafından kalite kontrolünü gerçekleştirmeye devam edin.
İlk olarak, tüm hücre, sitoplazmik ve 1.5 mililitre mikrocentrifuge tüpler hücre süspansiyon 100, 500 ve 100 mikrolitre içeren nükleer fraksiyonları, tüm hücre, sitoplazmik ve nükleer fraksiyonları konsantre nitrik asit eşit hacimli ekleyin ve bir saat hücre kültürünü mineralize etmek için 80 santigrat derece bir termal blok yerleştirin. Bundan sonra, termal blok tüpleri çıkarmak ve 20 santigrat derece de bir gecede asit sindirim devam etmek için bir rafa yerleştirin. Hidrojen peroksit numune hacminin% 30 ekleyerek reaksiyonu durdurun.
18 mega Ohm saf su ile 500 mikrolitre numune hacmi getirin. Sonra, 15 mililitrelik Falcon tüp seyreltilmiş analitik sınıf standart nitrik oksit saflaştırılmış suda 18 mega Ohms kalibrasyon sırasında boş çözelti olarak iki hacimli nitrik asit çözeltisi hazırlamak için. Daha sonra, milyarda 1,000 parça konsantrasyonu ile ticari olarak kullanılabilir 1, 000 ppm çinko stok çözeltisi seyreltmek için iki hacimli nitrik asit çözeltisi kullanın.
Çalışma standardı çözümleri milyon çinko standart çözeltisi başına 1, 000 parça, milyar çözelti başına 1,000 parça hazırlayın, sonra 5, 8, 10, 15, 20 ve 25 ppb doğrudan 2 hacimli nitrik asit çözeltisi ile seyreltin. Polipropilen örnek bardak içine% 0.1 magnezyum nitrat matris değiştirici bir mililitre yerleştirin ve sonra autosampler atlıkarınca içine bardak yükleyin. Otomatik olarak çinko standartlarına matris değiştirici beş mikrolitre eklemek için atomik soğurma spektrometre programlayın ve boş.
Standart çözeltiler ve numuneler için atomik soğurma spektrometresinde aynı optimize edilmiş koşulu, dakikada 250 mililitre giriş akış hızı, 20 santigrat derecede enjeksiyon sıcaklığı ve dört adımlı işlemlerde 1, 800 santigrat dereceye ulaşan grafit fırın sıcaklığı ile ayarlayın. Kalibrasyon farklılıkları veya buharlaşma nedeniyle yapılan hataları önlemek için tek bir deneyin tüm standartları ve numuneleri aynı anda ölçülmelidir. Lamba C-HCL'yi 20 amper, dalga boyu 213,9 nanometre ve 0,7 nanometre yarık ile optimize edin.
Pipet polipropilen örnek bardak örnekleri, ve autosampler atlıkarınca içine yerleştirin. Çinko tespiti alt sınırı milyarda 0.01 parçadır. Standartların konsantrasyonu artırılarak, çinko tespiti üst sınırı milyarda 20 parça olarak belirlenmiştir.
Çinko standart eğrisi elde edildikten sonra, metal içeriğini belirlemek için mineralize numuneleri ölçün. Elde edilen veriler algılama sınırının ötesindeyse, numuneleri %0,1 analitik sınıf nitrik asitle arıtılmış 18 mega Ohm arıtılmış su ile seyreltin. Çekirdek protokolünün bu hızlı yalıtımında, ayırt edici birincil miyoblastlardan temsili bir batı lekesi hücre altı fraksiyonlarının saflığını gösterir.
Kromatin remodeler enzimi Brg1 nükleer fraksiyonu tanımlamak için kullanıldı ve tubulin sitosolik fraksiyonu tanımlamak için kullanıldı. Bu şekil, her hücre tipinin çoğalan ve farklılaştırılmış veya confluent monolayers için temsili ışık mikrograflar gösterir, ve tüm hücre özleri karşılık gelen çinko içeriği, sitosolik ve nükleer fraksiyonları. Bu çalışmada analiz edilen tüm hücre hatları nanomolar aralığında çinko konsantrasyonları gösterdi.
Diferansiye primer miyotüpler çoğalan hücrelere göre daha yüksek düzeyde çinko sergiledi. Benzer bir althücre çinko dağılımı nöroblastom türetilmiş hücre hattı N2A tespit edildi. Öte yandan, kurulan 3T3-L1 hücre hattı, pre-adipositler indüklenen veya farklılaştırılan zamana göre çoğalan çinko daha yüksek düzeyde sergiledi.
MCF10A hücreleri çoğalan hücrelerde sitosolik ve nükleer fraksiyonlar arasında eşit düzeyde çinko gösterdi. MCF10A hücreleri biraraya ulaştığında, tüm hücre çinko düzeylerinde %40 azalma saptanır ve metalin en çok sitosolik fraksiyonda yoğunlaştığı bulunmuştur. Grafit fırın atomik absorpsiyon spektrometresi biyolojik ve çevresel örneklerde geçiş ve ağır metaller ölçmek için son derece hassas bir tekniktir.
Hücre altı fraksiyonlarının hazırlanmasında özel bakım ve temizlik yapılmalıdır, çünkü minimum kontaminasyon, ekipmanın hassasiyeti nedeniyle analize engel olacaktır. Her deneydeki düşük hacimler ve metallerin iz seviyeleri göz önüne alındığında, çinkoölçmek için GF-AAS'den daha iyi ve daha doğru bir teknik düşünmek zordur. GF-AAS'ın nispeten düşük maliyetinde algılama ve düşük hacim limitlerini sağlayabilecek güncel teknikler yoktur.
Grafit fırın atomik absorpsiyon spektrometresi doğru, hassas, uygun maliyetli ve erişilebilir. Bu analitik teknik, temel algılama teknolojileri ilerlemeye devam ettikçe gelişmeye devam edecektir. Çinko ve diğer metallerin GF-AAS tarafından saptanması için gelecekte yapılacak uygulama, organlar, hayvan modellerinden elde edilen dokular ve sistemik metal dengesizlikleri ile ilişkili hastalığı olan hastalardan alınan biyopsileri içerecektir.
Nitrik asit çok hızlı bir şekilde ciddi kimyasal yanıklara neden yeteneğine sahip son derece aşındırıcı bir asittir. Bu kimyasal aynı zamanda metalik tozlar gibi bazı bileşikler ile şiddetle tepki verebilir. Nitrik asitin oluşturduğu tehlike nedeniyle, nitrik asit kullanımı nda sıkı güvenlik önlemleri almak önemlidir.
Nitrik asit kullanırken, havalandırma yeterli değilse güvenlik kimyasal gözlükleri, sıçrama koruması için yüz kalkanı, eldiven ve onaylı buhar solunumu takmanızı şiddetle tavsiye ediyoruz.
