Spontan otoreaktif germinal merkezlerinin fizyolojik olarak ilgili bu şimerik modeli, in vivo hücresel lokalizasyonun downstream moleküler analizlerle bağlanmasını sağlar. Otoreaktif germinal merkezlerinin karışık şimerik modelinin en büyük avantajı, hemen hemen her istenilen hücresel alt küme veya moleküler yolun sorgulanmasına olanak tanıyan çok yönlü ve marjinal doğasıdır. Otoimmün hastalık gelişimi bu modelin fizyolojik alaka yeni tedavilerin ilerlemesine yardımcı olabilir yeni anlayışlar sağlar.
Bu kemik iliği kimera modeli immünoloji, immüno-onkoloji ve kök hücre araştırmalarında kullanılabilir. Fotoaktivasyon bileşeni geniş kullanıma sahiptir, doku lokalizasyonunu hücre analizine bağlar. Kemik iliği hazırlama ve yeniden yapılanma ve in vivo etiketleme ve doku eksplantasyon adımları görsel gösteriler için kendilerini ödünç tüm teknik olarak karmaşık prosedürlerdir.
Donör 564Igi fare femur ve tibia ayıklamak için, bir arka ekstremite deri kaldırmak ve ayak kuvvetle çekerek diz ve ayak bileği eklemleri dışarı pop. Ayak bileği eklemini kırmaya devam edin. Daha sonra, tibia tutunarak vücuda doğru ayak çekin, bu nedenle tibia tendonlar ve kasları sıyırma.
Kaval kemiğini serbest bırakmak için diz eklemini kırın ve uyluk kemiğinden tendonlar ve kasları soymak için femura tutunarak kemiği vücuda doğru çekin. Sonra, kalça ekleminde bir kesi yapmak ve kalça soketi dışarı femur çekmeden önce tendonlar kesti. Benzer bir şekilde kontralateral arka ekstremite kemikleri çıkardıktan sonra, dikkatle kalan kas ve bağ dokusu kaldırmak için kaba bir kağıt havlu ile kemikleri ovmak ve buz gibi kemik iliği tampon soyulmuş kemikleri durulayın.
Sonra, kemikleri buz üzerinde taze kemik iliği tampon bir konteyner aktarmak için Dumont sayısı yedi forceps kullanın. Kemik iliği hücrelerini ayıklamak için, buz gibi kemik iliği tamponbir harç durulayın ve taze, buz gibi kemik iliği tampon 10 mililitre ile yıkama tampon yerine 10 mililitre serolojik pipet kullanın. Havan kemikleri aktarmak için forceps kullanın ve ezmek ve kemik iliği serbest bırakmak için kemikleri öğütmek için bir havaneli kullanın.
Kemik iliği çözeltisini 70 mikrometrelik bir hücre süzgecinden geçirerek buz üzerinde 50 mililitrelik konik bir tüpe geçirmeden önce kemik iliği ekstresini toplamak için 10 mililitrelik pipetkullanın. Daha sonra, hücrelerin tamamen iyileşmesini sağlamak için harcı 10 mililitre taze, buz gibi kemik iliği tamponuyla durulayın. Donör süspansiyonları hazırlamak için, 50 mililitrelik konik bir tüp içinde fotoaktibl GFP ve 564Igi donör iliği uygun hacimlerde karıştırın ve santrifüj ile hücreleri pelet.
Buz gibi kemik iliği tampon mililitre başına sekiz hücre ye bir kez 10 konsantrasyonda karışık hücre pelet resuspend ve önceden soğutulmuş hücreleri aktarın, 1.5 mililitrelik mikrosentrifüge tüp buz üzerinde. Daha sonra, anestezili CD45.1 alıcı faresinde ayak ucutuya yanıt eksikliğini onaylayın ve yeterli bir süspansiyon sağlamak için donör kemik iliği hücrelerinin tüpünü hareket ettirin. Bir 0.3 mililitre, 30-gauge insülin şırınga içine kemik iliği karışımı 200 mikrolitre yükleyin ve, onun tarafında alıcı ile, yavaşça göz biraz dışarı pop için gözün üstünde ve altında deri germek.
Şırınganın ucunu göz çukurunun önüne yaklaşık 30 derecelik bir açıyla dikkatlice takın ve göz ve çevresindeki dokudan uzak durmaya özen gösterdi. İğnenin ucu göz çukurunun altını çizen kemiğe dokunduğunda, donör kemik iliğini yavaşça enjekte etmek için sabit basınç kullanmadan önce iğneyi yaklaşık 0,5 milimetre geri çekin. Daha sonra fareyi tam iyileşme ye kadar izleyerek reklam libitum antibiyotik suyu ile kafesine geri döndürün.
Popliteal lenf düğümü etiketlemek için, pbs 18 mikrolitre içinde phycoerythrin etiketli sıçan anti-fare CD169 antikor iki mikrolitre seyreltmek ve plastik parafin film bir parça üzerine antikor iki 10 mikrolitre damlacıkları ekleyin. Her damlacık 30-gauge iğne ile tek bir 0.3 mililitrelik insülin şırınga içine yükleyin ve anestezi alıcı hayvanın ayak takımı içine antikor 10 mikrolitre enjekte. Lenf düğümünü hasat etmeden önce, düz bir yüzeye kare bir kapak kayması yerleştirin ve her kenardan yaklaşık 1-2 milimetre lik yağ ile kapak kenarını izlemek için vakum gres yüklü, beş mililitrelik şırınga kullanın.
Odayı soğuk, düz bir yüzeye aktarın ve vakum gres odasını buz gibi kemik iliği tamponuyla doldurun. Popliteal lenf düğümlerine erişmek için, ötanazi alan hayvanın diz çukurunun hemen altındaki deride bir kesi yapmak için düz, ince makas kullanın ve neredeyse kalça eklemine kadar hamstring hattı boyunca kesimi yukarı doğru uzatın. Dumont sayısı beş veya yedi numaralı forseps kullanarak, popliteal fossa doku ortaya çıkarmak için dışa deri maruz kalan fleplerin her çekin, ve dikkatle popliteal ven için fossa sadece medial girmek için forseps kullanın.
Başparmak ve işaret parmağını kullanmadan önce altta yatan popliteal lenf nodunu ortaya çıkarmak için bacak ekseni boyunca forsepsleri açın ve kapatın ön taraftaki kaslardan dize kadar quadriceps kasLarını çimdiklemek için, lenf düğümünün fossadan çıkması için. Düğüm'ü çevreleyen dokudan kurtarmak için forsepsleri lenf düğümünün altına kaydırın ve vakum gres odasına yerleştirin. İkinci lenf düğümü toplandıktan sonra, vakum gres jant üzerine ikinci bir coverslip yerleştirin ve yavaşça aşağı oda kapatmak için bastırın, tüm hava kabarcıkları ekstrüzyon dikkat.
Hasat edilen dalak doku örneklerindeki germinal merkezleri belirlemek için, görüntüleme odasını iki fotonlu floresan mikroskobunun aşamasına yerleştirin ve üst kapak kapağının üstüne bir damla distile su yerleştirmek için 3,5 mililitrelik plastik transfer pipetkullanın. Temas noktasına kadar hedefi düşürün ve doku üstüne odaklanmak için iletilen ışığı kullanın. Karanlık mod ve iki foton uyarma geçiş ve 940 nanometre için lazer ayarlayın.
Doku yüzeyine yakın CD169 boyama ile sınırlanan bireysel beyaz hamuru alanları bulmak ve merkezi arteriol ile ilişkili ikinci harmonik nesil periarterioler lenfoid kılıf belirlemek. Periarterioler lenfoid kılıf ve marjinal bölge arasındaki bölgede, son derece otofloresan varlığını belirlemek, aktif tingible-vücut makrofajlar ve, bu işaretleri kullanarak, tek bir germinal merkezi alan etrafında ilgi bir bölge çizmek. Daha sonra, doku yüzeyinden başlayarak ve 830 nanometre uyarma dalga boyuna geçmeden önce yaklaşık üç mikrometrelik bir adım boyutu kullanarak, derinliği yaklaşık 100 ila 150 mikrometre bir Z-yığın kurun.
Dedektörlerin fotohasar görmesini önlemek için tüm kanalları kapatın veya karartın ve yığını görüntüleyin. Ardından, 940 nanometre uyarma dalga boyuna geri geçin ve etkili bir fotoaktivasyon ve görüntü yığını boyunca fotohasar olmamasını onaylamak için yığında taramayı onaylayın. Karışık kemik iliği kimeralarının serotiplemesi, 564Igi bölmesi türetilen 9D11-pozitif sirkülasyon B hücrelerinin düşük frekansı ile, reconstitution sonrası altı hafta normalleştirilmiş B hücre sayılarını ortaya çıkarır.
Toplam lenfosit kapısı içinde, kalıntı alıcı kaynaklı hücrelerin düşük bir frekans vardı, yaklaşık 6% CD45.1-türetilmiş olan, yaklaşık kimerizm genel bir derece gösteren 94%B hücre bölmesi neredeyse tam bir kimerizm ve fotoaktiviz GFP kemik iliği türetilmiş B hücrelerinin hakimiyeti, 564Igi-türetilmiş B hücrelerinin ağır negatif seçimi nin bir sonucu. Görüldüğü gibi, CD169 ile in vivo etiketleme marjinal bölgenin sağlam bir görselleştirme kolaylaştırır. İkinci harmonik sinyali kollajen içeren yapısal elementler ve ana damarlarda belirgindir, periarterioler lenfoid kılıfın merkezi arteriol ve yüksek otofloresan dahil, germinal merkez aktivitesi ile ilişkili aktive tingible-vücut makrofajlar.
Birlikte ele alındığında, bu veriler büyük olasılıkla tek bir fotoaktivmikroyabl germinal merkezi içeren ilgi bir bölgenin belirlenmesine olanak sağlar. Downstream akış sitometrik değerlendirme daha normalleştirilmiş B hücre bölmesi numaraları, spontan bir germinal merkezi popülasyonu ve fotoaktik germinal merkezi B hücrelerinin bir alt kümesi varlığını doğrular. Yeterli hücre canlılığını sağlamak için ekstrasyon, fotoaktivasyon ve doku işleme adımlarının toplam geri dönüş süresini dört ila altı saatle sınırlamak önemlidir.
Fotoaktik hücreler akış sıralanabilir ve tek hücreli dizileme tabi tutulabilir, örneğin, tek bir germinal merkezinin B hücre reseptör repertoisini karakterize eder. Karışık kimera modeli yeni bir derinlikte otoreaktif germinal merkezi biyoloji keşif izin verdi, örneğin, epitop yayma sürecinin nasıl geliştiğine dair fikir sağlayan. İki fotonlu mikroskopi için ışık kaynağı ciddi gözlere zarar verebilir çok güçlü darbeli Sınıf 4 lazerler olduğunu unutmayın.
