Bu tekrarlanabilir ve protokolü gerçekleştirmek kolay in-vivo lenf düğümü görüntüleme stratejisi lokal sekonder lenfoid organlara floresan etiketli antikorların drenaj izlemek için kullanır. Bu tekniğin gösterilmesi, protokolün başarılı bir şekilde yürütülmesini kolaylaştıracak yordamın belirli bir görselleştirmesine olanak tanır. Bu herkes tarafından yapılabilir çok basit ve basit bir tekniktir.
Tek zorlu yönü bazı eğitim gerektiren fare işleme, . Bu teknik, geleneksel floresan boyama yöntemlerine göre geliştirilmiş bir hız dokusu eforunun korunması ve hücre canlılığının yararınadır. Prosedürü niçin eğitime tabi tutulacağı, laboratuvarteknisyeni Bruna Tatematsu olacak.
İlgi antikorları seyreltmek, uygun florofores konjuge, inguinal lenf nodu görüntüleme için PBS 100 mikrolitre, ya da popliteal lenf nodu görüntüleme için PBS 50 mikrolitre. Inguinal lenf nod görüntüleme için, bir mililitre insülin şırınga içine antikor kokteyl 100 mikrolitre yük, yarım inç iğne 30 gauge ile donatılmış, ve subkutan deneysel farenin iç uyluk içine antikorenjekte. Popliteal lenf nod görüntüleme için, deneysel hayvanın bir pençe ped içine subkutan olarak antikor kokteyl 50 mikrolitre enjekte.
Sonra hayvanı ev kutusuna geri ver. Inguinal drenaj lenf düğümü hasat için, enjeksiyondan en az üç saat bekledikten sonra, yapışkan bant ile akrilik aşamada fare immobilize ve karın cilde mineral yağ uygulayın. Standart mikrocerrahi makas ve mikrocerrahi kavisli forceps pubis gelen ksifoid sürecine karın bir orta hat deri kesi yapmak ve deriden karın kas ayrıştırmak için kullanın.
Enjeksiyon tarafında cilt flepleri oluşturmak için dikey kesi hattının üst ve alt kısmında yatay deri kesiler yapmak ve lenf düğümü görselleştirmek için cilt geri çekmek. Cilt flebini akrilik plakaya sabitle ve yarı saydam, genellikle bilobular küresel inguinal drenaj lenf nodu çıkarmak için forseps kullanın. Popliteal drenaj lenf düğümü hasat için, enjeksiyondan en az 12 saat sonra, akrilik aşamada eğilimli pozisyonda fare immobilize.
Hayvanın enjekte edilen tarafında buzağı ve diz mineral yağ uygulayın. Daha sonra, topuktan diz e doğru baldırda bir orta hat kesi yapın ve baldır kaslarını deriden ayırın. Popliteal fossa ortaya çıkarmak.
Popliteal lenf düğümü fossa içinde yarı saydam bir küre olarak görünür. Sonra, mikrocerrahi kavisli forseps ile lenf düğümü çıkarın. Görüntüleme için lenf düğümü hazırlamak için, bir cam alt ile 35 tarafından 10 milimetrelik kültür çanak tüm organları yerleştirin ve doku çevreleyen herhangi bir yağ kaldırmak için forseps kullanın.
Yemeğin ortasında organ ortalayın ve tuzlu batırılmış hassas görev silecek bir parça ile doku kapağı. Ex vivo görüntüleme için, ters konfokal mikroskop yuvasında çanak konumlandırmak ve doğru odak elde etmek için konfokal mikroskop ve 4-10X objektif konvansiyonel ışık kullanın. Işık işlevinden lazer moduna geçin ve lazer gücünü ayarlamak için izotop lekeli, lekesiz veya floresan olmayan bir örnek kullanın, ofset, ve otomatik floresan ve herhangi bir belirtilmemiş boyama kaldırmak için kazanç.
Lenf nodül yapısına ve hücresel dağılıma odaklanan ve 1024 x 1024 piksel tanımı nı kullanan 4, 10 ve 20X hedefleri altında görüntüler edinin. Ardından, kanalları ayırmak, ilgi alanı nın ölçeğini ve renklerini eklemek ve 3B görünümü yeniden oluşturmak için uygun bir görüntüleme analizi yazılımı programı kullanın. Anti-CD4 ve anti-CD19 antikorları ve konfokal görüntüleme analizi ile lenf nodül hücrelerinin immünetiketleme güçlü kombinasyonu inguinal lenf düğümleri içinde T ve B hücrelerinin lokalizasyonu sağlar.
Popliteal lenf düğümlerinde, inguinal dokuda olduğu gibi, B hücre folikülleri T hücre popülasyonları ile çevrilidir, lenf nodunun bir özelliği. Bu görüntülerde de görüldüğü gibi fagositler enjekte edilen antikorları içselleştirmez, bu da B ve T hücre boyamasının spesifik olduğunu gösterir. Ayrıca, etiketlemenin yeniden rekonstrüksiyonu, T ve B hücre boyamanın örtüşmediğini gösterir ve bu da boyamanın özgüllüğünü doğrular.
Monosellüler hücreler inguinal lenf düğümü boyunca gözlenir, subkapsüler sinüs de dahil olmak üzere. CX3XR1 ifade mononükleer hücrelerin çoğunluğu ile, CCR2 ve CXCR31CCR2 çift pozitif hücreleri izledi. Popliteal lenf nodunda hücre dağılımı ve hücre fenotiplerinin aynı paterni gözlenir.
Her iki lenf düğümleri de lenfositler tarafından işgal mononükleer hücre reseptör ekspresyonu olmadan karanlık bölgeler sergiler. Ayrıca, mononükleer hücreler lenf düğümlerinin iç bölgesinde kıt, bu hücrelerin öncelikle lenf düğümü subkapsüler sinüs işgal gösteren, dokunun dış bölgelerinde konsantre kalan. Antikor karışımı tam olarak lenfatik sistem için deri altı doku içine enjekte edilmesi gerekir düzgün lenf düğümü ne antikorları drenaj.
Bu yöntem floresan etiketli ilaçların biyodağıtımına ve floresan etiketli nano partiküllerin hücre hedefleme çalışmalarına uygulanabilir.
