Gunzer laboratuarında yapılan araştırmalar Alman Federal Eğitim ve Araştırma Bakanlığı (AD 0315590 no&#39;lu hibe ile) ve Alman Araştırma Vakfı (hibe numarası GU769 / 4-1, GU769 / 4-2) tarafından desteklendi. Teknik destek için IMCES&#39;e, 3D karikatür modellemede yardım için Sebastian Kubat&#39;a da teşekkür ediyoruz.

Tüm hayvan deneyleri, AB yönergelerine uygun olarak yürütülmüş ve Essen&#39;deki ilgili yerel makamlar tarafından onaylanmıştır (AZ 84-02.04.2014.A036 - Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen, Essen, Almanya). Hayvanlar spesifik patojen içermeyen (SPF) koşullar altında kullanıldı ve muhafaza edildi. 1. Difteri Tehlikesi (DTX) ile Miyokardit İndüksiyonu <ol><li> DTX stok solüsyonunu 1 μg / mL çalışma solüsyonuna fosfat tamponlu salin (PBS) ile seyrelterek miyokardın indüksiyonu için DTX solüsyonunu hazırlayın. </li><li> Hasenberg ve diğerleri tarafından gösterildiği gibi, bu solüsyondan 100 μL, 8 ila 10 haftalık CD11c.DTR farelerine ( yaklaşık 5 ng / g vücut ağırlığı (bw)) intratrakeal (it) uygulayın . Bir fungal spor süspansiyonunun uygulanması için 20 . NOT: Toksin intraperitoneal olarak uygulanması, benzer bir indüksiyon ile sonuçlanabilirÖlümcül miyokardit. Bununla birlikte, bu yaklaşım ilk onaylanmalıdır. <ol><li> Bunun için hayvanlara 100 mg / kg bw ketamine ve 10 mg / kg bw xylazine&#39;in intraperitoneal (ip) enjeksiyonu ile anestezi uygulanır. </li><li> Derin narkoza (toe pinch test) ulaştıktan sonra, ağız boşluğundan 22 G&#39;lik bir ven kateteri kullanarak hayvanları entübe edin. Hayvanları, küçük bir hayvan solunum cihazı ile dakikada 250 solunum ile ve nefes başına 250 μL solunum hacmi havalandırarak, aynı zamanda Hasenberg ve diğerleri tarafından gösterilen lens tüpünün doğru konumlandırılmasını kontrol edin . ark. 20 . NOT: Doğru yerleştirildiğinde, hayvanların nefes oranı uygulanan havalandırma ayarlarına göre değişir. </li><li> Havalandırma sisteminin bağlantısını kesin ve kateterle akciğere kontrol olarak 100 μL DTX solüsyonu veya eşit miktarda PBS yerleştirin ve hayvanları 1 dakika daha havalandırmaya devam edin. </li></ol></li><li> Hayvanların anesteziden kurtulmasına ve genel sağlık durumunu ve vücut ağırlığını 4 gün boyunca izlemesine izin verin. NOT: Genetik zemine, fare suşuna veya başlangıç ​​ağırlığına bağlı olarak, miyokarditin şiddeti ve başlangıcı değişebilir ve önce belirlenmelidir. </li></ol> 2. Light-sheet Microscopy için Örnek Hazırlama <ol><li> Toksin uygulamasından 4 gün sonra, bir indüksiyon hücresini buharlaşmış% 2 izofluran / oksijen karışımı ile yıkayarak farelere anestezi uygulayın. Retro-yörünge uygulama yolunu kullanarak, intravenöz (iv) 50 ul PBS içerisinde 15 ug doğrudan etiketli bir anti-CD45 antikoru (klon 30-F11, AlexaFluor647 (AF647)) enjekte ederek, Doğru miktarda antikor. NOT: İstenen narkoz derinliğine, fareler yatıkken ve parmak ucu testine tepki vermediğinde ulaşılmıştır. </li><li> Kuluçka 2 saat sonra, servikal çıkığı veKalpleri, 5 mL PBS / EDTA (5 mM) ile yerinde perfüze edin. <ol><li> Kalbi ortaya çıkarın ve perfüzyon solüsyonunu 21 G&#39;lik bir kateter kullanarak sağ ventriküle enjekte edin. Yavaþ ve sabit bir basınçla besleyin ve aortayı kesip açtıktan sonra kanın boşaltılabileceğinden emin olun. NOT: Bu transkardiyal perfüzyon, organın nihai 3B görselleştirilmesini bozabilecek küçük hazırlık eserleriyle sonuçlanabilir. Bu nedenle, gelişmiş hayvan deneycileri, inferior vena kava yoluyla perfüzyon uygulayarak abdominal aortu çıkarabilir. </li></ol></li><li> Kimyasal fiksasyon için, 5 mL% 4 paraformaldehit (PFA) ile kalbe aynı boşluk boyunca kalp boşaltın. Kateteri yerinde tutun ve basitçe PFA ile doldurulmuş yeni bir şırınga takın. Yavaş ve sabit basınçlı bir gaz. NOT: Paraformaldehit oldukça toksiktir; Cilt, gözler ve diğer mukoza ile temasından kaçının. <ol><li> Tırtıklı forseps ile kalbi hafifçe kavrayın; puBiraz yükselterim; Ve gelen ve giden arterler ve damarlar da dahil olmak üzere tüm doku bağlantılarını keser. Daha fazla fiksasyon için organı% 4&#39;lük bir PFA&#39;da 4 saat daha saklayın. </li></ol></li><li> Organı kurutmak için kalbi, karanlıkta 4 ° C&#39;de 12 saat süreyle% 50,% 70 ve iki kez artan etanol serisinde inkübe edin. Burada, hava kabarcığı oluşumunu önlemek için yavaş dönme hızıyla bir tüp rotatöründe sürekli dönmelerine izin veren siyah 5 mL polipropilen reaksiyon tüplerini kullanın. </li><li> Kimyasal temizleme ile komple numune hazırlama. Kalpler şeffaf hale getirmek için, gece boyunca sürekli dönerken% 98 dibenzil eter (DBE) içinde inkübe edin. NOT: DBE gözleri, deriyi ve solunum sistemini tahriş eder. </li></ol> 3. Açık levha mikroskopisi <ol><li> LSFM&#39;yi ışık saçlı mikroskop kullanarak uygulayın (materyal tablosuna bakın). Numuneyi, DBE dolu cu&#39;ya mikroskopun standart numune tutucusuna yerleştirinVette, 30 mm x 30 mm x 15 mm&#39;ye kadar olan numuneler için uygundur. </li><li> Kurutulmuş ve temizlenmiş agaroz blokları kullanarak görüntü yakalama işlemi sırasında numuneyi yerine sıkıca tutun. <ol><li> Agaroz blokları hazırlamak için% 2 eritilmiş agaroz bir kalıba (15 mm x 15 mm x 5 mm) döküldü. Agaroz sertleşene kadar soğumasını bekleyin. </li><li> Artan bir etanol serisinde kurutun (% 50,% 70 ve iki kez% 100). Agaroz blokları gece boyunca% 98 DBE&#39;de inkübe edin. Agaroz, kullanılıncaya kadar DBE&#39;de saklayın. NOT: Agaroz ağırlıklı olarak sudan oluştuğundan bloğun büyüklüğüne bağlı olarak her dehidrasyon aşamasındaki inkübasyon süreleri uzatılabilir. NOT: DBE gözleri, deriyi ve solunum sistemini tahriş eder. </li><li> Gerektiğinde, keskin bir neşter kullanarak hazırlanan agaroz bloğu istenilen şekle getirin. Tipik olarak, numune adaptörünün kenarlarına yerleştirilecek prizma veya kama şeklindeki formları kesin. NOT: Agaroz bloklar elastik olduğu için,Küçük kuvvetle itildiğinde numune yerinde kalır. </li></ol></li><li> İlgili uyarılma ve emisyon filtresi ayarları ile ilgilenilen floresans sinyallerini (burada, otofloresans ve anti-CD45 antikor boyaması) tespit edin. <ol><li> Bağ dokusundan elde edilen otofloresans sinyalinin saptanması için, 488 nm&#39;lik uyarım dalga boyunda (OPSL: 50 mW) 525/50 nm band geçiş filtresi kullanın; AF647 ile bağlanmış bir antikor ile CD45 boyaması 668 nm&#39;de (bant geçiren filtre: 680/30 nm) ve 647 nm&#39;lik bir uyarılma dalga boyunda (diyot lazeri: 50 mW) tespit edilmiştir. </li><li> İki ayrı z-düzlemi arasındaki mesafe olarak 4 μm&#39;yu seçin. </li></ol></li></ol> 4. Görüntü Post-processing NOT: Elde edilen dijital görüntü verileri, bilimsel bir 3B / 4D görüntü işleme ve analiz yazılımı ile daha da işlenmiştir (materyal tablosuna bakınız). <ol><li> Veri dosyalarının açılması ve ön ayarlanması. </strong&gt; <ol><li> Analiz yazılımını başlattıktan sonra, sol üst köşedeki &quot;Aşmak&quot; düğmesini seçin. Görüntü yığınlarını açmak için &quot;Dosya&quot;, &quot;Aç&quot; ı seçin ve ilk edinilen kanaldaki verileri içeren bir klasörü seçin. Edinilen diğer kanalları eklemek için &quot;Düzenle&quot; ve &quot;Kanal Ekle&quot; yi seçin. NOT: Veri boyutuna ve bilgisayar sistemine bağlı olarak, bu işlem birkaç dakika alabilir. Sunulan protokol, 2 alım kanalı için tüm aşamaları (otofloresans ve AF647) göstermektedir. </li><li> &quot;Düzenle&quot; yi tıklayıp &quot;Görüntü Özellikleri&quot; ni seçerek x, y ve z voksel boyutlarını düzeltin. Yeni pencere açıldığında, parametreleri ayarlayın. NOT: Bu adım, kullanılan mikroskop sistemi ve belirli veri formatına bağlıdır. Doğru xyz değerleri daha sonraki boyut ve uzak ölçümler için kritik önem taşır. Çoğu durumda, bu parametreler mikrograf dosyalarında meta veri olarak saklanır. Ancak, eğer dosyaRmat, analiz yazılımı tarafından doğru şekilde yorumlanamaz, piksel boyutunu manuel olarak girmek önemlidir. X ve y boyutlarındaki piksel boyutu kamera piksel boyutuna, potansiyel olarak uygulanan bölme ve objektif ve nesnel büyütmeye bağlıdır. Z&#39;deki piksel boyutu kendi kendini tanımlayan z adım boyutuna eşittir ( örn. 4 μm). </li></ol></li><li> Kanal ayarlamaları <ol><li> Önce &quot;Görüntü ayarı&quot; nı (&quot;Düzenle&quot; ve &quot;Ekran Ayarı Göster&quot;) açarak otofloresans sinyalini gri ölçeğe çevirin. Açılan tüm kanalları ve hepsinin ekran ayarlarını yeni bir pencere listeler; Varsayılan rengini değiştirmek için, otofluoresan kanalı seçin ve &quot;beyaz&quot; görüntü stilini seçin. Başlamak için &quot;tamam&quot; ı tıklayın. </li><li> Siyah seviye ayarı için, &quot;Görüntü ayarı&quot; na dönün ve örnek düzeyi temsil etmeyen istenmeyen arka plan sinyallerini hariç tutmak için siyah seviye değerini ayarlayıns. <ol><li> Bunu yapmak için, kanal çubuğundaki sol üst üçgeni kullanın ve soldan sağa sürükleyin. NOT: Değişikliklerin hemen görselleştirilmesi sağlanacaktır. Sadece örnekten türetilmemiş sinyalleri bastırdığınızdan emin olun. Ek hesaplamalar için gürültü sinyalleri gerekebileceğinden zemin-siyah piksellerden kaçınmak için arka plandaki minimum değerler asla &quot;0&quot; olmamalıdır. Tüm siyah seviye değişikliklerinin görüntü elde ettikten sonra gerçekleştirildiğinden emin olun. Aksi takdirde, değerli numune bilgileri kaybolabilir. Siyah seviye ayarlaması sadece temsili amaçlara hizmet eder. Aynı görüntü ayarlarını farklı örneklerde kullanmak için, kanal listesinin altındaki &quot;min&quot; rakamsal alanına kesin değerler girilebilir. Bu, niceliksel analizler için çok yararlıdır. </li></ol></li><li> İlgili kanal yoğunluğunu ayarlamak için sağ üst üçgeni kullanarak veya kanalın altındaki &quot;maksimum&quot; rakamsal alana kesin değerler girerek yoğunluk ayarını yapınBen liste. </li><li> Gama değerini artırmak veya azaltmak veya hassas değerleri girmek için kanal çubuğunun ortasındaki alttaki üçgeni sürükleyerek kontrast ayarı yapın. </li><li> AF647 kanalını, otofloresans kanalına göre ayarlayın. Bir farklılık olarak, AF647 sinyalinin görselleştirmesini bir ısı haritası renk arama tablosuna ayarlayın. Adım 4.2.1&#39;deki gibi bir yaklaşımla &quot;ateş&quot; kanal modunu seçerek bunu yapın. NOT: Genel sinyal yoğunlukları, otofloresan kanala kıyasla önemli ölüde düşük olduğundan, siyah seviyeler genellikle daha düşük değerlere ayarlanır. Otofloresan kanal gelince, bu kanalın parlaklığı genellikle artar. </li><li> Doku yapılarını ayrıntılı olarak görselleştirmek için &quot;karışım modu&quot; nu seçin. Aynı parametre değerleriyle bir serideki tüm örnekleri analiz edin. </li></ol></li><li> Sanal kırpma <ol><li> 3D sahne fuarından önce organı sanal olarak kesmek içinRt, oluşturulan 3D nesneye bir kırpma düzlemi uygulayın. <ol><li> Nesne listesinde &quot;Kırpma Düzlemi&quot; simgesini (makas) tıklayın. Resim görünümünün içinde sarı bir çerçeve ve bir manipülatör (beyaz işmili) görünecektir. İş milini fare ile inceltici uca döndürün, böylece kırpma düzleminin yönünü değiştirin ve istenen kırpma derinliğini seçmek için iş milinin kalın orta bölümünü hareket ettirin. </li><li> Nesne listesinin altında ilgili onay kutularının işaretini kaldırarak çerçeve ve manipülatörü gizleyin ve istediğiniz anlık görüntüleri oluşturun. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Siedentopf, H., Uber Zsigmondy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sichtbarmachung+und+Gr&#246;&#223;enbestimmung+ultramikoskopischer+Teilchen,+mit+besonderer+Anwendung+auf+Goldrubingl&#228;ser.">Sichtbarmachung und Gr&#246;&#223;enbestimmung ultramikoskopischer Teilchen, mit besonderer Anwendung auf Goldrubingl&#228;ser.</a> Annalen der Physik. 315 (1), 1-39 (1902).</li><li>Voie, A. H., Burns, D. H., Spelman, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Orthogonal-plane+fluorescence+optical+sectioning:+three-dimensional+imaging+of+macroscopic+biological+specimens.">Orthogonal-plane fluorescence optical sectioning: three-dimensional imaging of macroscopic biological specimens.</a> J. Microsc. 170 (Pt 3), 229-236 (1993).</li><li>Epp, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+CLARITY+for+Clearing+Whole-Brain+and+Other+Intact+Organs(1,2,3).">Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs(1,2,3).</a> eNeuro. 2 (3), (2015).</li><li>Greger, K., Swoger, J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+building+units+and+properties+of+a+fluorescence+single+plane+illumination+microscope.">Basic building units and properties of a fluorescence single plane illumination microscope.</a> Rev. Sci. Instrum. 78 (2), 023705 (2007).</li><li>Keller, P. J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+scanned+laser+light+sheet+fluorescence+microscopy.">Digital scanned laser light sheet fluorescence microscopy.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2010 (5), (2010).</li><li>Becker, K., Jahrling, N., Kramer, E. R., Schnorrer, F., Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultramicroscopy:+3D+reconstruction+of+large+microscopical+specimens.">Ultramicroscopy: 3D reconstruction of large microscopical specimens.</a> J Biophotonics. 1 (1), 36-42 (2008).</li><li>Dodt, H. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultramicroscopy:+three-dimensional+visualization+of+neuronal+networks+in+the+whole+mouse+brain.">Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain.</a> Nat. Methods. 4 (4), 331-336 (2007).</li><li>Taormina, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+bacterial-animal+symbioses+with+light+sheet+microscopy.">Investigating bacterial-animal symbioses with light sheet microscopy.</a> Biol. Bull. 223 (1), 7-20 (2012).</li><li>Klingberg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fully+Automated+Evaluation+of+Total+Glomerular+Number+and+Capillary+Tuft+Size+in+Nephritic+Kidneys+Using+Lightsheet+Microscopy.">Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy.</a> J. Am. Soc. Nephrol. , (2016).</li><li>Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+and+fast+live+imaging+with+two-photon+scanned+light-sheet+microscopy.">Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy.</a> Nat. Methods. 8 (9), 757-760 (2011).</li><li>Schmid, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-speed+panoramic+light-sheet+microscopy+reveals+global+endodermal+cell+dynamics.">High-speed panoramic light-sheet microscopy reveals global endodermal cell dynamics.</a> Nat Commun. 4, 2207 (2013).</li><li>Cella Zanacchi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+3D+super-resolution+imaging+in+thick+biological+samples.">Live-cell 3D super-resolution imaging in thick biological samples.</a> Nat. Methods. 8 (12), 1047-1049 (2011).</li><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clarifying+Tissue+Clearing.">Clarifying Tissue Clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li><li>Maruyama, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wide+field+intravital+imaging+by+two-photon-excitation+digital-scanned+light-sheet+microscopy+(2p-DSLM)+with+a+high-pulse+energy+laser.">Wide field intravital imaging by two-photon-excitation digital-scanned light-sheet microscopy (2p-DSLM) with a high-pulse energy laser.</a> Biomed Opt Express. 5 (10), 3311-3325 (2014).</li><li>Mann, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD11c.DTR+mice+develop+a+fatal+fulminant+myocarditis+after+local+or+systemic+treatment+with+diphtheria+toxin.">CD11c.DTR mice develop a fatal fulminant myocarditis after local or systemic treatment with diphtheria toxin.</a> Eur. J. Immunol. 46 (8), 2028-2042 (2016).</li><li>Jung, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+depletion+of+CD11c++dendritic+cells+abrogates+priming+of+CD8++T+cells+by+exogenous+cell-associated+antigens.">In vivo depletion of CD11c+ dendritic cells abrogates priming of CD8+ T cells by exogenous cell-associated antigens.</a> Immunity. 17 (2), 211-220 (2002).</li><li>Corbi, A. L., Lopez-Rodriguez, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD11c+integrin+gene+promoter+activity+during+myeloid+differentiation.">CD11c integrin gene promoter activity during myeloid differentiation.</a> Leuk. Lymphoma. 25 (5-6), 415-425 (1997).</li><li>Zaft, T., Sapoznikov, A., Krauthgamer, R., Littman, D. R., Jung, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD11chigh+dendritic+cell+ablation+impairs+lymphopenia-driven+proliferation+of+naive+and+memory+CD8++T+cells.">CD11chigh dendritic cell ablation impairs lymphopenia-driven proliferation of naive and memory CD8+ T cells.</a> J. Immunol. 175 (10), 6428-6435 (2005).</li><li>Zammit, D. J., Cauley, L. S., Pham, Q. M., Lefrancois, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cells+maximize+the+memory+CD8+T+cell+response+to+infection.">Dendritic cells maximize the memory CD8 T cell response to infection.</a> Immunity. 22 (5), 561-570 (2005).</li><li>Hasenberg, M., Kohler, A., Bonifatius, S., Jeron, A., Gunzer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+observation+of+phagocytosis+and+NET-formation+by+neutrophils+in+infected+lungs+using+2-photon+microscopy.">Direct observation of phagocytosis and NET-formation by neutrophils in infected lungs using 2-photon microscopy.</a> J. Vis. Exp. (52), (2011).</li><li>Bailey, B., Farkas, D. L., Taylor, D. L., Lanni, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+axial+resolution+in+fluorescence+microscopy+by+standing-wave+excitation.">Enhancement of axial resolution in fluorescence microscopy by standing-wave excitation.</a> Nature. 366 (6450), 44-48 (1993).</li><li>Gustafsson, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy.">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> J. Microsc. 198 (Pt 2), 82-87 (2000).</li><li>Hell, S. W., Wichmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+the+diffraction+resolution+limit+by+stimulated+emission:+stimulated-emission-depletion+fluorescence+microscopy.">Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy.</a> Opt Lett. 19 (11), 780-782 (1994).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li><li>Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-high+resolution+imaging+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy.">Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Biophys. J. 91 (11), 4258-4272 (2006).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat. Methods. 3 (10), 793-795 (2006).</li><li>Abbe, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beitr&#228;ge+zur+Theorie+des+Mikroskops+und+der+mikroskopischen+Wahrnehmung.">Beitr&#228;ge zur Theorie des Mikroskops und der mikroskopischen Wahrnehmung.</a> Archiv f&#252;r mikroskopische Anatomie. 9 (1), 413-418 (1873).</li><li>G&#246;ppert-Mayer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#220;ber+Elementarakte+mit+zwei+Quantenspr&#252;ngen.">&#220;ber Elementarakte mit zwei Quantenspr&#252;ngen.</a> Annalen der Physik. 401 (3), 273-294 (1931).</li><li>Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-photon+laser+scanning+fluorescence+microscopy.">Two-photon laser scanning fluorescence microscopy.</a> Science. 248 (4951), 73-76 (1990).</li><li>M&#228;nn, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD11c.DTR+mice+develop+a+fatal+fulminant+myocarditis+after+local+or+systemic+treatment+with+diphtheria+toxin.">CD11c.DTR mice develop a fatal fulminant myocarditis after local or systemic treatment with diphtheria toxin.</a> Eur. J. Immunol. , (2016).</li><li>Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SeeDB:+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction.">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nat. Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).</li><li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO.">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nat. Protoc. 7 (11), 1983-1995 (2012).</li><li>Dirckx, J. J., Kuypers, L. C., Decraemer, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refractive+index+of+tissue+measured+with+confocal+microscopy.">Refractive index of tissue measured with confocal microscopy.</a> J Biomed Opt. 10 (4), 44014 (2005).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li><li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues.">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nat. Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).</li><li>Schwarz, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent-protein+stabilization+and+high-resolution+imaging+of+cleared,+intact+mouse+brains.">Fluorescent-protein stabilization and high-resolution imaging of cleared, intact mouse brains.</a> PLoS One. 10 (5), e0124650 (2015).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale:+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain.">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nat. Neurosci. 14 (11), 1481-1488 (2011).</li><li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis.">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157 (3), 726-739 (2014).</li><li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing.">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158 (4), 945-958 (2014).</li><li>Shivapathasundharam, B., Berti, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transparent+tooth+model+system.+An+aid+in+the+study+of+root+canal+anatomy.">Transparent tooth model system. An aid in the study of root canal anatomy.</a> Indian J. Dent. Res. 11 (3), 89-94 (2000).</li><li>Karreman, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+precise+targeting+of+single+tumor+cells+in+vivo+by+multimodal+correlative+microscopy.">Fast and precise targeting of single tumor cells in vivo by multimodal correlative microscopy.</a> J. Cell Sci. 129 (2), 444-456 (2016).</li><li>Pan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shrinkage-mediated+imaging+of+entire+organs+and+organisms+using+uDISCO.">Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO.</a> Nat. Methods. 13 (10), 859-867 (2016).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Modern yaşam biliminde, biyolojik süreçlerin mikroskopik olarak görselleştirilmesi gittikçe önemli bir rol oynamaktadır. Bu bağlamda, son iki yüzyılda bu noktaya kadar adreslenemeyen sorulara cevap bulmaya yardımcı olan birçok gelişme sağlandı. Birincisi, ışık mikroskoplarının çözünürlük yeteneğini temelde arttırma eğiliminde olmuştur. Yapısal aydınlatma mikroskopisi (SIM) 21 , 22 , stimulated emission-depletion (STED) mikroskopi 23 ve foto aktif lokalizasyon mikroskobu (PALM) 24 , 25 veya stokastik optik rekonstrüksiyon mikroskobu (STORM) 26 ile , bir zamanlar öngörülen çözünürlük sınırlaması nedeniyle Işık kırınımı 27 önemli ölçüde kırılmıştı. Sıklıkla hedeflenen ikinci sıkıntı, benzer bir ortamda hücresel davranışları gözlemlemektiDoğal durumu olabildiğince yakından takip edin. Bu bağlamda in situ veya in vivo görüntüleme yaklaşımlarının geliştirilmesi zorunluydu. Kompleks biyolojik dokularda sınırlı ışık penetrasyon derinliğini aşmak için, 2-foton mikroskopi 28 , 29 bu araştırma alanında yeni standartlar belirlemiştir. Bununla birlikte, tüm bu mikroskopik teknikler genellikle paylaştığı bir özellik mümkün olan en iyi çözünürlüğü garanti etmek için yüksek NA hedeflerinin kullanılmasıdır. Mikro yapıları daha ayrıntılı olarak çözümlemesine rağmen, yüksek NA hedeflerinin kullanılması, çalışma alanının yanı sıra görüş alanı da önemli ölçüde kısıtlar. Sonuç olarak, çevreleyen çevre açısından biyolojik bağlam, çoğunlukla, sözcüğün gerçek anlamıyla odağın dışına çıkmaktadır. Bu boşluğu kapatmak için, LSFM gelişimi son zamanlarda hücresel boyutta floresan yapıları çözebilen bir mikroskopi tekniği sağlayarak ilgi kazanmıştır.Aynı zamanda 1 cm&#39;den daha büyük boyutlu bir numunenin tüm 3D bilgilerini rahatça değerlendirmektir. Burada açıklanan protokol, tüm murin kalplerindeki bir hücresel lökosit infiltrasyonunu görselleştirmek için bir ultra mikroskop nasıl kullanılacağının bir metodunu sunar. Bir CD11c.DTR fare modeli 30&#39;da steril miyokarditin başarıyla indüklenmesinden sonra ilgili hayvan hayvanda 2 saat boyunca dolaşan bir florokrom bağlı anti-CD45 antikorunun bir IV enjeksiyonu alır. Prensipte, ölüm sonrası bir ölüm gerçekleştirmek suretiyle, organ fiksasyonu ve numune dehidrasyonu arasında boyama yapan bütün montaj antikoru mümkün olmalıdır. Ne yazık ki, bütün montajlı boyama çok daha uzun inkübasyon adımları gerektirir ve bu nedenle örnek oluşturma için gereken zamanı ( örneğin, 4-21 güne kadar) artırır 6,31. Dahası, bu intravital boyama yaklaşımı sadece hızlı değil aynı zamandaAntikorun doku penetrasyonu daha etkili olur ve tüm montaj boyası protokolüne kıyasla 9 . Mutlak boyama verimi belirlenmemiş olsa da, ortaya çıkan flüoresan sinyalinin dikkate değer derecede güçlü olması nedeniyle, lökosit popülasyonunun büyük bir kısmının etiketlenmesi beklenmektedir. Hem floresan proteinleri hem de antikor kendini etiketleyen sonraki temizleme işleminden sonra hayatta kalır ve her ikisi de uzun süre stabil kalır. Ayrıca, doku temizleme için çözücü bazlı bir maddenin kullanıldığı da belirtilmelidir. Bu, temizleme işlemini takiben bütünüyle monte boyama yaklaşımını büyük ölçüde engeller. Solvent bazlı doku temizleme, tersinir bir fenomendir; bu nedenle temizlenmiş dokunun, standart antikor boyama için genellikle kullanılan, su bazlı bir ortama (PBS gibi) aktarılması, saydam olmayan bir numuneye neden olur. Bu nedenle, organik çözücülerdeki standart dışı boyama protokolleri i<html> Numune temizlendikten sonra tüm montaj boyama prosedürüne ihtiyaç duyulmaktadır. Sonraki kalp perfüzyonu, mümkün olduğunca fazla artık kanın yok edilmesi için kesinlikle gereklidir; çünkü kan, aşağıdaki adımlarda iyi temizlenmez ve görüntüleme sonuçlarını önemli ölçüde kötüleştirir. Yüreği çıkardıktan sonra, doku suyu artan bir etanol sırası ile çıkarılır. Bu aşama, kimyasal temizlemenin ilk kısmı olarak görülebilir. Fikir, seçilen numunenin ortalama refraktif indeksine (RI) daha iyi uyan daldırma ortamı ile doku suyunun yerini almaktır. DBE Ertuk ve ark.&#39;nın protokolünü takiben daldırma ortamı olarak seçilmiştir . 32 , bazı değişikliklerle. DBE, 1.55 (nD20) kırılma indisine ve benzil alkol gibi diğer temizleyici ajanlarla karşılaştırıldığında: benzil benzoat (BABB; RI (nD20) = 1.56) 6 , 7 veya sakaroz (RI (nD20) = 1.44 )F &quot;&gt; 13, bu protokolde kullanılan floresan etiketleri en iyi şekilde korudu Benzer bir flüoresans koruması etil sinnamat (ECI) kullanılarak üretildi Nefretik böbreklerde glomerüllerin otomatik olarak ölçülmesi üzerine bir çalışmada kullanıldığını açıkladık 9. Kas Bir kere refrakter indeksi 1.382 ± 0.004 33 olduğu tahmin edilen doku, değerlendirdiğimiz tüm maddelerle eşit derecede temizlendi.9 Bu nedenle DBE seçimi için kritik faktör, floresans korumasıydı ve temizleme potansiyeli değildi. Bu pasif temizleme protokolüne geçtiğinde, bir elektroforetik akım yardımıyla lipidlerin uzaklaştırılmasının Ciddi derecede temizlenmiş dokulara neden olduğu aktif bir yöntem olan CLARITY 34 , 35&#39;in kullanılması mümkün olmalıdır, ancak böyle bir suyun aksine Tabanlı temizleme yöntemi ile DBE silinmesi önemli bir sertleşme ile sonuçlanmaktadırDokuya, az miktarda küçülme eşlik etti. Bu, numunelerin kolay taşınmasını sağlar ve numunenin bir agaroz bloğuna yerleştirilmesi gibi görüntüleme için başka uyarlamalar gerektirmez. Bu nedenle, bu protokolün CLARITY gibi bir metoda aktarılması zor olabilir, ancak insanlar bu yaklaşımı kullanarak seçilen ultramikroskopun (materyal tablosuna bakınız) başarıyla kanıtlamıştır. Seçilen temizleme yöntemiyle endojen floresan sinyallerinin olası tahribatını dikkatle değerlendirmek önemlidir. CLARITY veya diğer etkin temizleme protokolleriyle hiç çalışmadığımız için, bu sistemlerde florokrom reaksiyonu hakkında yorum yapamayız. En kötü durum, bir sonraki tüm montaj antikor boyamanın gerçekleştirilmesi gerektiği şeklinde olacaktır. Bu yöntem, sıçan akciğerleri gibi diğer organlara kolayca ayarlanabilir; böbrekler; beyin; Ve hatta femur, tibia veya kalvaria gibi kemikler. Değerlendirme yapılırken<html> Yeni doku bölgelerindeki uygulama potansiyelini ve / veya yeni flüoresan etiketleme stratejilerini en büyük zorluk protokolü flüoresanın hayatta kalacağı şekilde tasarlamaktır. Solvent bazlı daldırma ortamı 13 ve dehidrasyon ajanları 36 , florokromların bütünlüğü üzerinde doğrudan bir etkiye sahiptir. Çeşitli protokollerde oldukça kararlı görünen AlexaFluor türevlerinin kullanımı önerilir. Bununla birlikte, çoğu zaman, diğer florokromlar kullanılmalıdır. Bu durumda kesinlikle diğer temizleyici ajanların ( örneğin Scale 37 , Cubic 38 , Succrose 13 , Clarity 13 , 34 , PACT 39 , FocusClear 13 , SeeDB 31 , metil salisilat 40 , 3Disco 32 , BABBLass = &quot;xref&quot;&gt; 6 ve ECI 9 ) ve diğer dehidrasyon alternatifleri ( örn., Metanol ve tetrahidrofuran 13 ). Birçok LSFM yaklaşımında olduğu gibi şeffaf kalbin mikroskop altında konumlandırılması işlemi zorunludur. Ticari sistemler akciğer lobları, böbrekler veya kalpler de dahil olmak üzere fare organlarının büyüklüğünde numunelerin yüklenmesi için yeterli alan sağlar. Bununla birlikte, şu anda, bu numuneler için standartlaştırılmış örnek tutucuları mevcut değildir. Bu nedenle temizlenmiş ve yeniden şekillendirilmiş agaroz bloklar kullanarak bir montaj aparatı kurmak zorunda kaldık. Yine de, hareket eserlerinden dolayı belirli sayıda resim veri seti atılmak zorunda kaldı. Bu problem, burada kullanılan mikroskopun uzun kazanma süresine bağlı olarak da artmıştır. Potansiyel olarak, büyük veri setlerinin üretilmesi daha hızlı sistemlerden önemli ölçüde kazanç sağlayacak, ancak henüz daha hızlı bir mikroskop kullanma şansımız olmadı. Mikroskopumuz (bkz. Tablo oF materyalleri) bir zum mikroskop gövdesi etrafında yapıldı ve bir lazer modülü, 6.5 x 6.5 mm2&#39;lik bir piksel boyutuna sahip bir sCMOS kamera ve 1.26X ila 12.6X arasındaki bir optik büyütme aralığına sahip algılama optiği ile donatıldı. Algılama optiklerinin merkezi kısmı çapraz olarak 1.7 ila 17.6 mm arasında değişen geniş bir görüş alanının gözlemlenmesine izin veren 5,5 NA&#39;lık bir 0,5 NA&#39;lık objektif lensdi. Bu, tüm fare kalbinin optik kesitlemesini gerçekleştirecek kadar büyüktü. 400 ila 800 nm arasındaki renk sapmalarının düzeltilmesi, objektifin mekanik ayarı ile sağlandı. Gerektiğinde, bilgisayar destekli post-processing sırasında kromatik düzeltmeler yapıldı. Bu sistemde de daha kalın örneklerde küresel sapmalar gözlenmemiştir ve bu nedenle düzeltilmesi gerekmez. Sonuç olarak, burada mekanik l temizleme ve analiz için sağlam bir protokol sunuyoruzIşık-tabakalı mikroskopi kullanılarak murin kalplerindeki eukosit dağılımı. Bu noktada, bu LSFM prosedürünün kılcal gibi ince doku yapılarını çözmesi pek mümkün olmadığını vurgulamak önemlidir. Bu bağlamda, bu LSFM, genel bağışıklık hücre dağılımını karakterize etmek ve organın içindeki potansiyel bağışıklık hücresi birikimlerini tanımlamak için çok uygundur. Bununla birlikte, LSFM&#39;nin vaskülatür gibi küçük organ alt yapılarında hücresel lokalizasyonu analiz etmek ve ölçmek için mükemmel bir seçim olmadığı unutulmamalıdır. Bu gibi soruları cevaplamak için, LSFM, histoloji veya 2-foton mikroskobu gibi diğer yöntemlerle tamamlanmalıdır. Bu protokolün diğer sınırlamaları maksimum 3-4 renge kadar kısıtlamayı içerir; mavi kanal, otofloresans dışında diğer sinyaller için-sabit örnekler için kısıtlama ve 30 mm x 30 mm x 15 en çok örnek boyutu mm. Ayrıca DBE&#39;nin kuvvetli kokusu ve akut toksisitesi de alınmalıdır.Hesaba katılmaz. Eğer son nokta sorunlu ise, alternatif bir temizleyici ajan olarak etil sinnamat kullanılabilir 9 . Bu mikroskopi tekniğini seçmenin en büyük avantajı, tüm organı bir kerede analiz edebilmesidir. Hematoksilin ve eozin boyalı, formalin ile fikse edilmiş ve parafine gömülmüş (FFPE) histolojik doku kesitlerinin geleneksel analizlerinde, her bir bölüm analiz edilmedikçe, önemli mekânsal alanları kaybetme olasılığı yüksektir. Üstelik, ışık levha mikroskopisi, her üç boyutlu düzlemde numunenin sanal olarak kesilmesini sağlamakla kalmaz, aynı zamanda, bu olasılığı, numuneyi yok etmeden ya da kesim artefaktlarına neden olmadan sunar. Gerekli görüldüğünde, sabit organ daha sonra belirli bölgeler üzerinde yüksek derecede çözüm bulmak için bir bağıntılı ışık ve elektron mikroskopisi yaklaşımı gibi daha ileri analizler için işlenebilir. Böyle bir çalışma için bir şablon Karreman ve ark.&#39;nın çalışmasında bulunabilir . , Burada korelasyon bahisi2-fotonlu mikroskopi görüntü yığını ve üç boyutlu elektron mikroskobu verileri başarılı bir şekilde gösterildi. Bir diğer umut vaat eden yaklaşım, bu protokolün, yakın zamanda yayınlanmış, bir organik çözücüye dayanan ve standart bir LSFM 42 tarafından daha büyük organların araştırılmasına olanak tanıyan uDISCO yöntemi ile kombinasyonu olabilir.

Işık mikroskopisinin gelişimi sırasında, birçoğu özel formlar ortaya çıktı, bunların hepsi belirli örnekler için görselleştirme sürecindeki sınırlamaları en aza indirmek için geliştirildi. Böyle bir yöntem, ışık saçlı floresan mikroskobu (LSFM) &#39;dir. İlk olarak 1903&#39;te Siedentopf ve Zsigmondy 1 tarafından geliştirilmiş ve 1990&#39;ların başında ilk temel biyolojik uygulamaları bulan 2 , LSFM, flüoresan sinyal çözünürlüğü ile bozulmamış fare organları gibi büyük örneklerin görselleştirilmesi için şimdiye kadarki en güçlü mikroskopik araç haline gelmiştir Hücresel seviyeye iner. Bu avantajlardan dolayı, canlı hücre görüntüleme potansiyeli ile birlikte Nature Methods LSFM &quot;Yılın Metodu 2014 3 &quot; olarak adlandırılmıştır. Adından da anlaşılacağı üzere, bir LSFM&#39;deki örnek aydınlatma, kullanılan objektifin eksenine dikey olarak yönlendirilmiş ışık saçak levhaları tarafından yürütülür.Veya emisyon ışık toplama ve müteakip görüntü oluşumu. Işık tabakası genellikle silikon lensli geniş, kollektrik lazer ışınlarına odaklanarak veya dar, odaklanmış lazer ışınlarının hızlı yatay hareketiyle sadece bir yatay veya dikey düzlem 4 , 5&#39;de oluşturulur. Böylece görüntüleme optiklerinin sadece odak düzlemi, tipik olarak 1-4 μm kalınlıkta aydınlatılır. Sonuç olarak, aydınlatma düzlemine yerleştirilen bir flüoresan numune için hem dağınık ışık üretimi hem de odak düzleminin üstündeki veya altındaki bölgelerden gelen foto-ağartma etkileri elimine edilir veya büyük ölçüde bastırılır 6 , 7 . Odak dışına çıkan tüm düzlemler aydınlatılamadığından, bu alanlarda fotoblokaj efektleri ihmal edilir. Standart konfokal veya çoklu foton mikroskopisinin aksine, aydınlatılmış ve yayılan ışık yolları birbirinden ayrıdır, bu nedenle son görüntü niteliği<html> Uyarı ışık ışınının hedefler boyunca mükemmel şekilde odaklanmasına bağlı değildir. Bu nedenle, altta yatan soruya bağlı olarak, aydınlatılmış düzlemin mümkün olan en geniş alanı, xy yönünde hareket eden herhangi bir bileşen parçası olmadan görüntülenecek şekilde muazzam bir görüş alanına sahip hedefleri (FOV) kullanmak mümkündür. Modern LSFM sistemlerinde, üretilen optik bölümün flüoresan görüntüsü, tüm görüş alanını (FOV) elde edebilen oldukça hassas bir şarj kuplajlı cihaz (CCD) veya tamamlayıcı metal oksit yarı iletken (CMOS) kameralar üzerinde yakalanır. Mikrosaniye cinsinden. Bu nedenle, numuneyi ışık tabakası boyunca hareket ettirerek ve tanımlanmış z adımlarında görüntü elde ederek, bu tekniği canlı hücre için geçerli hale getiren makul bir süre 8 , 9 olan bir numunenin tam 3D bilgisini elde etmek mümkündür Çalışmalar 10 ,Ass = &quot;xref&quot;&gt; 11 , 12 . Bununla birlikte, LSFM hızlı, hassas ve fluoresan dostu bir yöntem sunsa da, özellikle büyük biyolojik numuneler bir 3B analizi için hedef olduğunda, örnek üzerinden ışık iletimi hala önemli bir konudur. Işık iletimi, emilimin fiziksel yönleri ve farklı kırılma indeksleri olan yapıların ara yüzlerindeki ışık saçılımıyla eleştirel olarak modifiye edilmiştir 13 . Bu nedenle, görüntüleme örnekleri birkaç milimetre boyutunda olduğunda LSFM, çoğunlukla örnekleri optik olarak şeffaf hale getirmek için temizleme protokolleriyle birleştirilir. Bu teknikler, suyun ilgili biyolojik dokudan çıkarılması ve belirli hedef doku bileşenlerinin kırılma indekslerine dar bir şekilde uyacak şekilde seçilen su veya organik solvent bazlı daldırma ortamlarıyla değiştirilmesi fikrine dayanmaktadır. Sonuç olarak, yanal ışık saçılımı en aza indirilir ve tüm dalga boylarıIşığın dokudan daha etkin bir şekilde geçebileceğini 13 . Birçok durumda, bu şekilde tedavi edilen biyolojik örnekler makroskopik açıdan berrak görünür ve LSFM&#39;nin tüm fare organlarında bile uzun çalışma mesafesi, düşük büyütme hedefleri kullanılarak gerçekleştirilmesini sağlar. Burada, miyokardit 15&#39;teki bir fare modelinde hücresel kardiyak infiltratı araştırmak için kurduğumuz ışık saçlı mikroskopta (materyal tablosuna bakınız) geniş örneklem görüntüleme için bir hazırlama protokolü sunulmaktadır. CD11c.DTR fareleri primat difteri toksin reseptörünü (DTR) CD11c promotor 16 kontrolü altında ifade eder. Sonuç olarak, DTR ile birlikte CD11c&#39;yi eksprese eden bu farelerdeki hücreler, Corynebacterium difteri (difteri toksini, DTX) ekzotoksinine duyarlı hale getirilir; Bu hayvanların DTX ile sistemik olarak muamele edilmesi, tüm CD11c + ce&#39;nin tükenmesine yol açarrf. CD11c, bir integrindir ve çeşitli farklı çözünür faktörler için bir hücre yüzeyi reseptörü olarak, esasen monositik soy 17 hücrelerinde aktivasyon ve olgunlaşma süreçlerinde yer alır. Sonuç olarak CD11c.DTR fare modeli, birçok farklı immünolojik soru bağlamında dendritik hücrelerin ve makrofaj alt kümelerinin rolünü incelemek için yoğun bir şekilde kullanılmıştır. Zamanla, sistemik olarak DTX ile tedavi edilen CD11c.DTR farelerinin yan etkiler geliştirebileceği ve yüksek mortalite oranlarını 18 , 19 görüntüleyebildiği bildirildi. Son zamanlarda, bu hayvanlarda intratrakeal DTX uygulaması sonrasında fulminan miyokardit gelişimini tanımlayan temel ölüm nedenini tanımladık. Toksin uyarısı, kalpteki uyarıcı iletim sisteminin merkez kısımları da dahil olmak üzere hücresel yıkıma neden oldu. Buna büyük CD45 eşlik ediyordu+ Lökosit infiltratı, sonuç olarak öldürücü kardiyak aritmilere yol açar. Bu durumda, sadece lökosit popülasyonunun ortaya çıkışı değil, kalpteki mekansal dağılımı da önemli idi. Bu deneysel soru, intravital antikor boyama ve organik solvent bazlı optik temizleme protokolü tarafından desteklenen bir ışık levha mikroskopik yaklaşımla çözülen modern mikroskobik görüntüleme için bir sorundur.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>diphtheria toxin</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D0564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>phosphate buffered saline</td>
			<td>Biochrom</td>
			<td>L182-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ketamine [50 mg/ml]</td>
			<td>Inresa</td>
			<td>PZN 4089014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>xylazine [2 %]</td>
			<td>Ceva</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>syringe</td>
			<td>Braun</td>
			<td>REF 9161502</td>
			<td>Braun Omincan F&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>indwelt venous catheter&#160;</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>REF 381923</td>
			<td>BD Insyte Autoguard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>small animal respirator</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>73-0044</td>
			<td>MiniVent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anit-CD45 antibody (AF647)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>103124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>8043.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>catheter (21 G)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>REF 387455</td>
			<td>BD valu-set</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE tube (5 ml)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>EKY9.1</td>
			<td>Rotilabo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ethanol</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9065.4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dibenzyl ether</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>108014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tube rotator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-753</td>
			<td>MACSmix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>agarose (low gelling)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>A4018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mold (15x15x5 mm)</td>
			<td>Tissue Tek</td>
			<td>4566</td>
			<td>Cryomold&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>light sheet microscope system</td>
			<td>LaVision Biotec</td>
			<td></td>
			<td>Ultramicroscope&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope body</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>MVX10&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>objective</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>0.5&#160;NA MVPLAPO 2XC, WD 5.5&#160;mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sCMOS camera 5.5MP</td>
			<td>Andor Technology</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>488 nm OPSL (50mW) laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>647 nm&#160; diode laser (50mW)</td>
			<td>Coherent</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D image processing &#38; analysis software</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td>IMARIS Ver. 8.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>transgenic mouse strain</td>
			<td>Steffen Jung et al.</td>
			<td></td>
			<td>CD11c.DTR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>wt mouse strain</td>
			<td>Envigo</td>
			<td></td>
			<td>Balb/c Ola Hsd J</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Module</td>
			<td>LaVision Biotec</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MVPLAPO 2XC Objective Lens</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative visualization of leukocyte infiltrate in a murine model of fulminant myocarditis by light sheet microscopy

Kimyasal temizleme protokolleri ile birlikte, ışık saçlı floresans mikroskobu (LSFM), büyük biyolojik örneklerde flüoresan etiketli yapıların analizi için altın standart haline geldi ve hücresel çözünürlüğe indirgendi. Bu arada, temel protokollerin sürekli arıtılması ve uzmanlaşmış ticari sistemlerin artan kullanılabilirliği, tüm fare organlarının mikroyapısını araştırmamızı ve hatta çeşitli canlı hücre görüntüleme yaklaşımlarında hücresel davranışın karakterizasyonuna izin vermemizi sağlıyor. Burada, iltihaplı fare kalplerindeki CD45 + lökosit popülasyonunun mekansal tüm montaj görüntüsü ve miktarının belirlenmesi için bir protokolü açıklıyoruz. Yöntem ölümcül kardiyak aritmilerle karakterize fulminan ölümcül miyokardit gelişimi için son zamanlarda sağlam ve endüklenebilir bir model olarak hizmet ettiği gösterilmiş bir transgenik fare soyunu (CD11c.DTR) kullanmaktadır. Bu protokol miyokardit indüksiyonu, intravitAl antikor aracılı hücre boyaması, organ hazırlığı ve LSFM&#39;den sonra bilgisayar destekli görüntü sonrası işleme tabi tutulur. Belirli bilimsel sorunuz için oldukça uyarlanmış bir yöntem olarak sunulmasına rağmen, protokol, diğer organlarda ve hatta diğer türlerde bile tamamen farklı florasan yapıları hedefleyebilen kolayca ayarlanabilen bir sistemin planını temsil etmektedir.

Sunulan LSFM yaklaşımı, ciddi miyokarditin indüksiyonu üzerine murin kalplerindeki lökosit dağılımını ve miktarını analiz etmektedir. Şekil 1A , miyokardit indüksiyonu için transjenik CD11c.DTR farelerinin ön tedavi protokolünü açıklamaktadır. Bu aşama miyokarda lökositlerin alınması için gerekli tetikleyiciyi temsil eder. Başarılı bir DTX uygulamasından sonra, hayvanlar genel zayıflık, iştahsızlık ve 2-4 gün aralığında kilo kaybı gibi ciddi hastalık semptomları geliştirir. 4 gün sonra lökositler iv ile lekelenir . Dolaşımdan kanı çıkarmak için transkardiyal perfüzyona önce florokrom bağlı anti-CD45 antikorunun uygulanması. Başarılı bir şekilde gerçekleştirilirse, kalp ve diğer organlar beyazımsı renk alır. Ardından organ eksize edilir ve doku suyu artan bir etanol dizisi ve DBE&#39;de nihai bir kuluçka ile DBE ile değiştirilir. Şekil 1B , zaman çizelgesini göstermektedirOrganın önemli ölçüde büzülmesine uğradığı bireysel inkübasyon adımlarının Kimyasal olarak temizlenen organ daha sonra standart mikroskop doku tutacağı üzerinde DBE dolu bir görüntüleme odasına aktarılır. 3D görüntü elde edilmesi sırasında organı dengeye getirmek için, şeffaf agaroz bloklarla sabitlenir. Numunenin ayrıntılı konumlandırılması Şekil 2&#39;de görülmektedir. 2 kanaldan (otofloresans ve anti-CD45) oluşan toplam bir görüntü yığını edinimi yaklaşık 20-30 dakika sürer ve yaklaşık 16 GB&#39;lık bir veri dosyası oluşturur. Son olarak, elde edilen veriler lökosit dağılımının bir ısı haritası görünümünde gösterildiği suni 3D render olarak analiz edilir. Şekil 3&#39;te (üst sıra), DTX ile muamele edilmiş bir hayvanın kalbinin güçlü şekilde iltihaplanmış alanları, kırmızımsı / beyazımsı görünümleri ile algılanabilir. 3D modelin daha ayrıntılı bir çalışması, özellikle atriyovent gibi kardiyak iletim sisteminin bulunduğu bölgelerdeki lökosit konsantrasyonunu ortaya koymaktadır<html> Ricular paketi ve Purkinje lifleri. Buna karşılık, PBS ile tedavi edilen hayvanların kalpleri bu iltihaplanma modelini hiç göstermez (alt sıra). <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/55450/55450fig1.jpg" /> Şekil 1: Difteri toksin kaynaklı miyokarditin indüksiyon ve numune hazırlama şeması. ( A ) Miyokardit gelişimi bununla indüklendi . Difteri toksini (100 ng / hayvan) uygulaması. 4 gün sonra, miyokardit tamamen gelişim göstermiş ve bir AF647-çift anti-CD45 antikoru (15 ug / hayvan) iv enjekte edilmiştir . CD45 + lökositleri saptamak için. Hayvanlar 2 saat sonra servikal çıkılarak sakrifiye edildi ve kalpler PBS / EDTA (5 mM) ve ardından% 4 PFA ile perfüze edildi. ( B ) Çıkarıldıktan sonra, organ artan bir etanol serisi ile dehidre edildi ve nihayet dibenzil eter içinde gece boyu inkübe edilerek temizlendi..com / files / ftp_upload / 55450 / 55450fig1large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bu figürde daha büyük bir sürümünü görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="şekil 2" src="/files/ftp_upload/55450/55450fig2.jpg" /> Şekil 2: Mikroskopta Örnek Yerleştirme Şeması. Kimyasal olarak temizlenmiş şeffaf kalp (4) numune tutacağı (2 ve 5) üzerine yerleştirildi ve temizlenmiş agaroz blokların (6) yardımı ile stabilize edildi. Bu yapı daha sonra DBE dolu cam küvete batırılmıştır (3). Alım için 5.5 mm&#39;lik bir çalışma mesafesine sahip 0.5 NA&#39;lik bir objektif mercek (1) kullanıldı. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55450/55450fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/55450/55450fig3.jpg" /> Şekil 3: Tam veya Yasal Temsilci 3D İşaretleriHafif yaprak mikroskobu. CD11c.DTR fareleri intratrakeal olarak DTX (üst sıra) veya PBS (alt sıra) ile tedavi edildi. 4 gün sonra, CD45 + lökosit infiltrasyonu ile temsil edilen miyokardit gelişimi, flüoresan ışık saçlı mikroskopi ile görselleştirildi. CD45 + hücrelerini lekelemek için, AF647&#39;ye bağlanmış bir anti-CD45 antikoru, fareleri feda etmeden önce 2 saat enjekte edildi. CD45 + infiltrat, ısı haritası renklerinde (mavi: düşük sinyal, beyaz: yüksek sinyal) gösterilirken, bağ dokusunun otofloresans sinyali gri renkte görüntülenir. Her satır, organın içindeki durumu gösteren 4 adet dijital olarak kırpılmış 3D görüntülerden oluşur. Kalbin ön kısmına göre kırpma derinliği, tek tek görüntülerin üstünde bildirilir. Şekil, Mann ve diğerleri tarafından değiştirildi. 15 . Ölçek çubuğu = 1 mm. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55450/55450fig3large.jpg" target="_blank">Lütfen buraya tıklayınız</a>Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için.

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy at JoVE.com

Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy

Burada, CD11c.DTR farelerinin intratrakeal difteri toksini tedavisi ile indüklenen, bir aseptik fulminan miyokardit modelinde kardiyak CD45 + lökosit infiltrasyonunu görselleştirmek için bir ışık-tabakalı mikroskopik yaklaşım anlatılmaktadır.

Bir Fulminan Miyokardit Modelinde Işık Yeri Mikroskopisi İle Lökosit İnfiltrasyonunun Nicel Görselleştirilmesi

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently ...

quantitative-visualization-leukocyte-infiltrate-murine-model

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

7.7K Görüntüleme.  University of Duisburg/Essen.  Burada, CD11c.DTR farelerinin intratrakeal difteri toksini tedavisi ile indüklenen, bir aseptik fulminan miyokardit modelinde kardiyak CD45 + lökosit infiltrasyonunu görselleştirmek için bir ışık-tabakalı mikroskopik yaklaşım anlatılmaktadır. 

Video: Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy

A Murine Model of Muscle Training by Neuromuscular Electrical Stimulation

Neuromuscular electrical stimulation (NMES) is a common clinical modality that is widely used to restore1, maintain2 or enhance3-5 muscle functional capacity. Transcutaneous surface stimulation of skeletal muscle involves a current flow between a cathode and an anode, thereby inducing excitement of the motor unit and the surrounding muscle fibers. 
NMES is an attractive modality to evaluate skeletal muscle adaptive responses for several reasons. First, it provides a reproducible experimental model in which physiological adaptations, such as myofiber hypertophy and muscle strengthening6, angiogenesis7-9, growth factor secretion9-11, and muscle precursor cell activation12 are well documented. Such physiological responses may be carefully titrated using different parameters of stimulation (for Cochrane review, see 13). In addition, NMES recruits motor units non-selectively, and in a spatially fixed and temporally synchronous manner14, offering the advantage of exerting a treatment effect on all fibers, regardless of fiber type. Although there are specified contraindications to NMES in clinical populations, including peripheral venous disorders or malignancy, for example, NMES is safe and feasible, even for those who are ill and/or bedridden and for populations in which rigorous exercise may be challenging. 
Here, we demonstrate the protocol for adapting commercially available electrodes and performing a NMES protocol using a murine model. This animal model has the advantage of utilizing a clinically available device and providing instant feedback regarding positioning of the electrode to elicit the desired muscle contractile effect. For the purpose of this manuscript, we will describe the protocol for muscle stimulation of the anterior compartment muscles of a mouse hindlimb.

A murine model of neuromuscular electrical stimulation (NMES), a safe and inexpensive clinical modality, to the anterior compartment muscles is described. This model has the advantage of modifying a readily available clinical device for the purpose of eliciting targeted and specific muscle contractions in mice.

Nöromüsküler Elektriksel Stimülasyon tarafından Kas Eğitimi A Mürin Modeli

Neuromuscular electrical stimulation (NMES) is a common clinical modality that is widely used to restore1, maintain2 or enhance3-5 muscle functional ...

Tıp

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules that regulate HSCs. In these transplant model systems, the function of HSCs is determined by the ability of these cells to engraft and reconstitute lethally irradiated recipient mice. Commonly, the donor cell contribution/engraftment is measured by antibodies to donor- specific cell surface proteins using flow cytometry. However, this method heavily depends on the specificity and the ability of the cell surface marker to differentiate donor-derived cells from recipient-originated cells, which may not be available for all mouse strains. Considering the various backgrounds of genetically modified mouse strains in the market, this cell surface/ flow cytometry-based method has significant limitations especially in mouse strains that lack well-defined surface markers to separate donor cells from congenic recipient cells. Here, we reported a PCR-based technique to determine donor cell engraftment/contribution in transplant recipient mice. We transplanted male donor bone marrow HSCs to lethally irradiated congenic female mice. Peripheral blood samples were collected at different time points post transplantation. Bone marrow samples were obtained at the end of the experiments. Genomic DNA was isolated and the Y chromosome specific gene, Zfy1, was amplified using quantitative Real time PCR. The engraftment of male donor-derived cells in the female recipient mice was calculated against standard curve with known percentage of male vs. female DNAs. Bcl2 was used as a reference gene to normalize the total DNA amount. Our data suggested that this approach reliably determines donor cell engraftment and provides a useful, yet simple method in measuring hematopoietic cell reconstitution in murine bone marrow transplantation models. Our method can be routinely performed in most laboratories because no costly equipment such as flow cytometry is required.

Determining donor cell engraftment presents a challenge in mouse bone marrow transplant models that lack well-defined phenotypical markers. We described a methodology to quantify male donor cell engraftment in female transplant recipient mice. This method can be used in all mouse strains for the study of HSC functions.

Rekabetçi bir mürin Kemik İliği Transplantasyon Modelinde Donör Hücre Aşı belirleme Kantitatif Gerçek-zamanlı PCR kullanarak

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

Murine Model of Wound Healing

Wound healing and repair are the most complex biological processes that occur in human life. After injury, multiple biological pathways become activated. Impaired wound healing, which occurs in diabetic patients for example, can lead to severe unfavorable outcomes such as amputation. There is, therefore, an increasing impetus to develop novel agents that promote wound repair. The testing of these has been limited to large animal models such as swine, which are often impractical. Mice represent the ideal preclinical model, as they are economical and amenable to genetic manipulation, which allows for mechanistic investigation. However, wound healing in a mouse is fundamentally different to that of humans as it primarily occurs via contraction. Our murine model overcomes this by incorporating a splint around the wound. By splinting the wound, the repair process is then dependent on epithelialization, cellular proliferation and angiogenesis, which closely mirror the biological processes of human wound healing. Whilst requiring consistency and care, this murine model does not involve complicated surgical techniques and allows for the robust testing of promising agents that may, for example, promote angiogenesis or inhibit inflammation. Furthermore, each mouse acts as its own control as two wounds are prepared, enabling the application of both the test compound and the vehicle control on the same animal. In conclusion, we demonstrate a practical, easy-to-learn, and robust model of wound healing, which is comparable to that of humans.

A murine model of cutaneous wound healing that can be used to assess therapeutic compounds in physiological and pathophysiological settings.

Yara Şifa murin Modeli

Wound healing and repair are the most complex biological processes that occur in human life. After injury, multiple biological pathways become activated. ...

A Murine Model of Subarachnoid Hemorrhage

In this video publication a standardized mouse model of subarachnoid hemorrhage (SAH) is presented. Bleeding is induced by endovascular Circle of Willis perforation (CWp) and proven by intracranial pressure (ICP) monitoring. Thereby a homogenous blood distribution in subarachnoid spaces surrounding the arterial circulation and cerebellar fissures is achieved. Animal physiology is maintained by intubation, mechanical ventilation, and continuous on-line monitoring of various physiological and cardiovascular parameters: body temperature, systemic blood pressure, heart rate, and hemoglobin saturation. Thereby the cerebral perfusion pressure can be tightly monitored resulting in a less variable volume of extravasated blood. This allows a better standardization of endovascular filament perforation in mice and makes the whole model highly reproducible. Thus it is readily available for pharmacological and pathophysiological studies in wild type and genetically altered mice.

A standardized mouse model of subarachnoid hemorrhage by intraluminal Circle of Willis perforation is described. Vessel perforation and subarachnoid bleeding are monitored by intracranial pressure monitoring. In addition various vital parameters are recorded and controlled to maintain physiologic conditions.

Subaraknoid Kanama bir fare modeli

In this video publication a standardized mouse model of subarachnoid  hemorrhage (SAH) is presented. Bleeding is induced by endovascular Circle of  Willis ...

Reproducable Paraplegia by Thoracic Aortic Occlusion in a Murine Model of Spinal Cord Ischemia-reperfusion

Background 
Lower extremity paralysis continues to complicate aortic interventions. The lack of understanding of the underlying pathology has hindered advancements to decrease the occurrence this injury.&#160;The current model demonstrates reproducible lower&#160;extremity paralysis following thoracic aortic occlusion.
Methods 
Adult male C57BL6 mice were anesthetized with isoflurane. Through a cervicosternal incision the aorta was exposed. The descending thoracic aorta and left subclavian arteries were identified without entrance into pleural space. Skeletonization of these arteries was followed by immediate closure (Sham) or occlusion for 4 min (moderate ischemia) or 8 min (prolonged ischemia). The sternotomy and skin were closed and the mouse was transferred to warming bed for recovery.&#160; Following recovery, functional analysis was obtained at 12 hr intervals until 48 hr.
Results 
Mice that underwent sham surgery showed no observable hind&#160;limb deficit. Mice subjected to moderate ischemia for 4 min had minimal functional deficit at 12 hr followed by progression to complete paralysis at 48 hr. Mice subjected to prolonged ischemia had an immediate paralysis with no observable hind-limb movement at any point in the postoperative period. There was no observed intraoperative or post&#160;operative mortality.
Conclusion 
Reproducible lower extremity paralysis whether immediate or delayed can be achieved in a murine model. Additionally, by using a median sternotomy and careful dissection, high survival rates, and reproducibility can be achieved.

The lack of mechanistic understanding of spinal cord ischemia-reperfusion injury has hindered further adjuncts to prevent paraplegia following high risk aortic operations. Thus, the development of animal models is imperative. This manuscript demonstrates reproducible lower extremity paralysis following thoracic aortic occlusion in a murine model.

Spinal Kord İskemi-reperfüzyon bir Mürin Modelinde Torasik Aort Tıkanıklığı tarafından tekrarlanabilir Parapleji

Background
Lower extremity paralysis continues to complicate aortic interventions. The lack of understanding of the underlying pathology has hindered ...

Noninvasive Assessment of Cardiac Abnormalities in Experimental Autoimmune Myocarditis by Magnetic Resonance Microscopy Imaging in the Mouse

Myocarditis is an inflammation of the myocardium, but only ~10% of those affected show clinical manifestations of the disease. To study the immune events of myocardial injuries, various mouse models of myocarditis have been widely used. This study involved experimental autoimmune myocarditis (EAM) induced with cardiac myosin heavy chain (Myhc)-&#945; 334-352 in A/J mice; the affected animals develop lymphocytic myocarditis but with no apparent clinical signs. In this model, the utility of magnetic resonance microscopy (MRM) as a non-invasive modality to determine the cardiac structural and functional changes in animals immunized with Myhc-&#945; 334-352 is shown. EAM and healthy mice were imaged using a 9.4 T (400 MHz) 89 mm vertical core bore scanner equipped with a 4 cm millipede radio-frequency imaging probe and 100 G/cm triple axis gradients. Cardiac images were acquired from anesthetized animals using a gradient-echo-based cine pulse sequence, and the animals were monitored by respiration and pulse oximetry. The analysis revealed an increase in the thickness of the ventricular wall in EAM mice, with a corresponding decrease in the interior diameter of ventricles, when compared with healthy mice. The data suggest that morphological and functional changes in the inflamed hearts can be non-invasively monitored by MRM in live animals. In conclusion, MRM offers an advantage of assessing the progression and regression of myocardial injuries in diseases caused by infectious agents, as well as response to therapies.

This study demonstrates the successful establishment of magnetic resonance microscopy imaging as a non-invasive tool to assess the cardiac abnormalities in mice affected with autoimmune myocarditis. The data indicate that the technique can be used to monitor the disease-progression in live animals.

Fare Manyetik Rezonans Görüntüleme Mikroskopi tarafından Deneysel Otoimmün Miyokardit Kardiyak anormallikler noninvaziv değerlendirilmesi

Myocarditis is an inflammation of the myocardium, but only ~10% of those affected show clinical manifestations of the disease. To study the immune events ...

Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model

Specialized immune cells that infiltrate the tumor microenvironment regulate the growth and survival of neoplasia.&#160; Malignant cells must elude or subvert anti-tumor immune responses in order to survive and flourish. Tumors take advantage of a number of different mechanisms of immune &#8220;escape,&#8221; including the recruitment of tolerogenic DC, immunosuppressive regulatory T cells (Tregs), and myeloid-derived suppressor cells (MDSC) that inhibit cytotoxic anti-tumor responses. Conversely, anti-tumor effector immune cells can slow the growth and expansion of malignancies: immunostimulatory dendritic cells, natural killer cells which harbor innate anti-tumor immunity, and cytotoxic T cells all can participate in tumor suppression. The balance between pro- and anti-tumor leukocytes ultimately determines the behavior and fate of transformed cells; a multitude of human clinical studies have borne this out. Thus, detailed analysis of leukocyte subsets within the tumor microenvironment has become increasingly important. Here, we describe a method for analyzing infiltrating leukocyte subsets present in the tumor microenvironment in a mouse tumor model. Mouse B16 melanoma tumor cells were inoculated subcutaneously in C57BL/6 mice. At a specified time, tumors and surrounding skin were resected en bloc and processed into single cell suspensions, which were then stained for multi-color flow cytometry. Using a variety of leukocyte subset markers, we were able to compare the relative percentages of infiltrating leukocyte subsets between control and chemerin-expressing tumors. Investigators may use such a tool to study the immune presence in the tumor microenvironment and when combined with traditional caliper size measurements of tumor growth, will potentially allow them to elucidate the impact of changes in immune composition on tumor growth. Such a technique can be applied to any tumor model in which the tumor and its microenvironment can be resected and processed.

This protocol describes a method for the detailed evaluation of leukocyte subsets within the tumor microenvironment in a mouse tumor model. Chemerin-expressing B16 melanoma cells were implanted subcutaneously into syngeneic mice. Cells from the tumor microenvironment were then stained and analyzed by flow cytometry, allowing for detailed leukocyte subset analyses.

Bir deri altı tümör modelinde tümör-süzücü lökosit subsetleri Değerlendirilmesi

Specialized immune cells that infiltrate the tumor microenvironment regulate the growth and survival of neoplasia.&#160; Malignant cells must elude or ...

Evaluation of Lung Metastasis in Mouse Mammary Tumor Models by Quantitative Real-time PCR

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated death 1. Common sites of metastatic spread include lung, lymph node, brain, and bone 2. Mechanisms that drive metastasis are intense areas of cancer research. Consequently, effective assays to measure metastatic burden in distant sites of metastasis are instrumental for cancer research. Evaluation of lung metastases in mammary tumor models is generally performed by gross qualitative observation of lung tissue following dissection. Quantitative methods of evaluating metastasis are currently limited to ex vivo and in vivo imaging based techniques that require user defined parameters. Many of these techniques are at the whole organism level rather than the cellular level 3-6. Although newer imaging methods utilizing multi-photon microscopy are able to evaluate metastasis at the cellular level 7, these highly elegant procedures are more suited to evaluating mechanisms of dissemination rather than quantitative assessment of metastatic burden. Here, a simple in vitro method to quantitatively assess metastasis is presented. Using quantitative Real-time PCR (QRT-PCR), tumor cell specific mRNA can be detected within the mouse lung tissue.

This protocol describes how to use quantitative Real-time PCR (QRT-PCR) to detect tumor cell specific mRNA representing metastasis within the mouse lung tissue.

Kantitatif gerçek zamanlı PCR ile fare meme tümör modellerinde akciğer metastazı Değerlendirilmesi

Metastatic disease is the spread of malignant tumor cells from the primary cancer site to a distant organ and is the primary cause of cancer associated ...

Reproducible Arterial Denudation Injury by Infrarenal Abdominal Aortic Clamping in a Murine Model

Percutaneous vascular interventions uniformly result in arterial denudation injuries that subsequently lead to thrombosis and restenosis. These complications can be attributed to impairments in re-endothelialization within the wound margins. Yet, the cellular and molecular mechanisms of re-endothelialization remain to be defined. While several animal models to study re-endothelialization after arterial denudation are available, few are performed in the mouse because of surgical limitations. This undermines the opportunity to exploit transgenic mouse lines and investigate the contribution of specific genes to the process of re-endothelialization. Here, we present a step-by-step protocol for creating a highly reproducible murine model of arterial denudation injury in the infrarenal abdominal aorta using external vascular clamping. Immunocytochemical staining of injured aortas for fibrinogen and &#946;-catenin demonstrate the exposure of a pro-thrombotic surface and the border of intact endothelium, respectively. The method presented here has the advantages of speed, excellent overall survival rate, and relative technical ease, creating a uniquely practical tool for imposing arterial denudation injury in transgenic mouse models. Using this method, investigators may elucidate the mechanisms of re-endothelialization under normal or pathological conditions.

Understanding the cellular and molecular mechanisms of re-endothelialization following arterial denudation injury is of paramount importance in preventing thrombosis and restenosis of arteries. Here we describe a protocol for reproducible arterial denudation injury of the infrarenal abdominal aorta. The procedure was developed to investigate the underlying mechanisms that regulate endothelial regeneration using mouse models.

Bir Fare Modelinde İnfrarenal Abdominal Aort Bağlama Ekipmanları tarafından tekrarlanabilir Arter denüdasyon Yaralanma

Percutaneous vascular interventions uniformly result in arterial denudation injuries that subsequently lead to thrombosis and restenosis. These ...

Intravital Microscopy of Monocyte Homing and Tumor-Related Angiogenesis in a Murine Model of Peripheral Arterial Disease

The therapeutic goal for peripheral arterial disease and ischemic heart disease is to increase blood flow to ischemic areas caused by hemodynamic stenosis. Vascular surgery is a viable option in selected cases, but for patients without indications for surgery such as progression to rest pain, critical limb ischemia, or major disruptions to life or work, there are few possibilities for mitigating their disease. Cell therapy via monocyte-enhanced perfusion through the stimulation of collateral formation is one of a few non-invasive options.
Our group examines arteriogenesis after monocyte transplantation into mice using the hindlimb ischemia model. Previously, we have demonstrated improvement in hindlimb perfusion using tetanus-stimulated syngeneic monocyte transplantation. In addition to the effects on the collateral formation, tumor growth could be affected by this therapy as well. To investigate these effects, we use a basement membrane-like matrix mouse model by injecting the extracellular matrix of the Engelbreth-Holm-Swarm sarcoma into the flank of the mouse, after occlusion of the femoral artery.
After the artificial tumor studies, we use intravital microscopy to study in vivo tumor-angiogenesis and monocyte homing within collateral arteries. Previous studies have described the histological examination of animal models, which presupposes subsequent analysis to post-mortem artifacts. Our approach visualizes monocyte homing to areas of collateralization in real time sequences, is easy to perform, and investigates the process of arteriogenesis and tumor angiogenesis in vivo.

Monocytes are important mediators of arteriogenesis in the context of peripheral arterial disease. Using a basement membrane-like matrix and intravital microscopy, this protocol investigates monocyte homing and tumor-related angiogenesis after monocyte injection in the femoral artery ligation murine model.