Yöntemimizin önemi çok yönlülüğü ve gücüdür. Araştırmacıların mevcut yöntemleri kullanarak elde etmek için zor olan şekillerde endojen gen ekspresyonu üzerinde sağlam kontrole sahip olmasını sağlar. Araştırmacıların bir genin işlevini çeşitli ekspresyon düzeylerinde ve spatio-temporal bir şekilde araştırmalarına olanak tanır.
Böylece hastalıkla ilgili genleri incelerken yararlı olan bir fenotipin geri döndürülemesini test etmeye olanak sağlar. Baskıyı gerçekleştirmek için, hedef gen intron 12 simetrik Lac operatörleri içeren repron R içerecek şekilde tasarlanır. LacIGY represör istenilen doku özel organizatörü ifade edildiğinde, hedef gen bastırılır.
Hedef genin baskısı, LacIGY represörünün bir antagonisti olan IPTG'nin uygulanması yla tersine çevrilebilir veya istenilen ifade düzeyine ayarlanabilir. Upregulation gerçekleştirmek için, hedef gen organizatörü rtTA-M2 aktivatörleri için bağlayıcı siteleri olarak dört veya daha fazla Tat operatörleri, T, içerecek şekilde tasarlanmıştır. Aktivatör doksisiklin varlığında istenilen dokuya özgü promotörden ifade edildiğinde, hedef genin yeniregülasyonu na neden olur.
Doksisiklin konsantrasyonu geri çekilerek veya değiştirilerek hedef genin yükseltilmesi tersine çevrilebilir veya istenilen ifade düzeyine ayarlanabilir. Hem baskı hem de aktivasyon gerçekleştirmek için, Lac baskı ve Tat aktivatör sistemleri kombine edilebilir. Baskı için ilgi genini değiştirmek için, repron dizisinin eklenmesi için ilgi geninin beş asal ucuna doğru transkripsiyonel inert intron tanımlanmalıdır.
İlgi geni için genomik diziyi elde etmek için UCSC genom tarayıcısına gidin ve genom sekmesi altındaki fare genomunun en son taslağını seçin. Genin transkriptlerini görüntülemek için arama çubuğuna ilgi geninin adını veya sembolüni girin ve ardından git'e tıklayın. Daha sonra, ilgi geni için istenilen transkript varyantını seçin ve ilginin transkript varyantının yanındaki gen sembolüne tıklayın.
Daha sonra, dizi ve araçlar ve veritabanları afiş bağlantılar altında, genomik dizi bağlantısını tıklatın. Sıra alma bölgesi seçenekleri için yalnızca ekzonlar, intronlar ve gen başına varsayılan bir FASTA kaydı nı seçin. Biçimlendirme seçeneklerini sıralamak için, büyük harfle exons seçin, küçük harf ve maske yinelenen her şey N.Then, gönder'i tıklatın.
Son olarak, açıklamalı olabilecek bir belge veya programdaki üst ve küçük harflerle biçimlendirmeyi koruyarak bu sırayı kaydedin. CpG adalarının kesintiye uğramasını önlemek için, UCSC genom tarayıcısının ifade ve düzenleme bayrağı altında CpG adaları için göster'i seçin ve yenile'yi tıklatın. Beş asal intronları yakınlaştırırken, yeşil renkte gösterilen her CpG adasına tıklayın ve bu özellik için görünüm DNA'sını seçin.
Maske tekrarlarını N'ye seçtikten sonra, CpG adaları dizisini elde etmek için DNA'yı edinin'i tıklatın. Son olarak, bu dizileri özgün sıra dosyasıyla birlikte bindirme ve önlemek için bunları intronic bölgeler olarak açıklama olarak ekleyin. İlgi çekici dokularda artırıcı imzaları bulunan intronik bölgeleri önlemek için ENCODE veri tabanına gidin ve denemeler simgesini seçin.
Teşp türü için ChiP-seq veya DNase-seq'yi seçin ve diğer kategorileri tasarlanacak hücrelere göre doldurun. Özellik seçiminden sonra, sonuçları liste olarak görüntüleyen mavi renkte soldaki en piktogramı seçin. Daha sonra, h3k4 monometilasyon, h3k27 asetilasyon, DNase 1 ve kullanılacak hücrelerle en yakından eşleşen CTCF hedefleri için veri kümelerini seçin.
İlgili her veri kümesiiçinde dosya bölümüne gidin, mm10 ve UCSC'nin seçili olduğundan doğrulayın ve visualize düğmesini tıklatın. Şimdi, UCSC genom tarayıcısında, beş asal intronu yakınlaştırın ve açıklamalı tepe parçadaki her tepeye tıklayın. Her tepe bölgesi için kromozom koordinatlarını tıklayarak her tepe bölgesi için DNA dizilimini elde edin.
Görünüm açılır menüsünde DNA'yı seçin ve Maske Yinelemeleri'ni N.Finally'a tıklatın, bu dizileri orijinal sıra dosyasıyla birlikte böşeyr ve önlemek için bunları intronic bölgeler olarak açıklama olarak ekleyin. Yüksek özgüllük ve öngörülen verimlilik puanlarıile kalan intronic bölgelerde bir sgRNA belirlemek için, CRISPOR gibi tercih edilen bir çevrimiçi sgRNA tasarım aracına gidin. İlgi intronic bölgenin sırasını girin, ilgili referans genomu belirtin ve istenilen protospacer bitişik motifi seçin.
Ardından gönder'i tıklatın. Daha sonra, öngörülen sgRNA'ları özgüllük puanına göre sıralayın ve öngörülen verimlilik puanı yüksek olan bir veya daha fazla sgRNA seçin. Son olarak, sgRNA kesme alanına karşılık gelen 60 bazlık homoloji kolları ile her iki tarafta kuşatılmış bir PITT iniş pisti dizisi içeren bir DNA şablonu tasarlayın.
Hedef gen baskısının tersine çevrilmesi için, homozigot yetiştirilen farelerin içme suyunda IPTG'yi, yönetim gününde steril distile suda istenilen miktarda IPTG'yi tamamen eriterek değiştirilmiş ilgi aleliyle iptg uygulayın. Şişeyi folyoyla sarın ve IPTG suyunu ışık korumalı bir şişede uygun genotip ve kontrollere sahip farelere en az bir hafta boyunca uygulayın. Hedef dokudaki ilgi geninin ekspresyonunu analiz etmeye devam edin.
Gen upregülasyon indüklemek için, bir hafta boyunca diyet doksisiklin yönetmek ve hedef dokuda ilgi genin ekspresyonunu analiz etmeye devam. qRT PCR anaylisis DNMT1 ifadesinin promotör tabanlı yaklaşımı kullanarak düzensiz seviyelerin %15'ine bastırıldığını göstermiştir. Baskı, farklı miktarlarda IPTG ile farelertedavi edilerek doza bağımlı bir şekilde tersine çevrildi.
Gözlenen DNMT1 baskısı ve IPTG tedavisi ile DNMT1 baskısının tersine çevrilmesi immünoboyama ile protein düzeyinde doğrulandı. mKate2 ekspresyonunun qRT PCR analizi, transkripsiyon uzaması nedeniyle transkripsiyon başlangıç bölgesinin birkaç kilobase'inde bulunan operatörlerden intron tabanlı yaklaşımın %90'dan fazla baskı elde ettiğini göstermiştir. LacIGY represörü olan veya olmayan farelerin küçük intenstine mKate2 ifadesinin konfokal görüntüleri intron tabanlı yaklaşımı doğruladı.
Tat ve Lac operatör dizilimi ile modifiye endojen DNMT1 alel içeren embriyonik kök hücrelerde DNMT1 ekspresyonunun sağlam upregülasyonu ve downregülasyonu sağlandı. Her iki yönetmelik de IPTG ve Dox tedavileri ile tamamen geri dönüşümlü ve indükleyiciydi. Karaciğer, dalak ve böbrekten Güçlü DNMT1 regülasyonu gözlendi.
Ancak, dmnt1 hücre döngüsüne bağlı ekspresyon deseni ve kalpte proliferatif hücrelerin azlığı bu gözlemaltında yatan olabileceğini düşündüren, kalpte tespit edilebilir bir upregulationgözlenme gözlenmiştir. Kritik bir genin in vivo işlevini, ifadesini manipüle ederek incelemek, öldürücülük nedeniyle sık sık zor olmuştur. Metodumuz, ilgi genimiz için ölümcül fenotipin üstesinden gelmemizi sağladı ve in vivo'daki tümörogenezdeki rolünü incelememizi sağladı.
Aynı şekilde, bu teknoloji, incelenmesi zor olan diğer temel genlerin araştırılmasını sağlayacaktır.
