HUVEC tüp-formasyon assay doğal ürünlerin anjiyogenezi üzerinde etkisini değerlendirmek için

Tüp oluşumu Tahlil yeni kan damarlarının oluşumuna yol açan çeşitli adımların altında yatan moleküler mekanizmaları incelemek için bir in vitro testtir. Bu tizin bileşikleri ve anjiyogenez ile ilişkili sinyal basamakları belirlemek için izin verir. Bir testle, RGWE gibi doğal bir bileşiğin endotel hücrelerinin tüp benzeri bir yapı oluşturma yeteneğini azalttığını, hücre canlılığını etkilemediğini ve bu etkinin MEK/ERK yolunun aktivasyonuna bağlı olduğunu gösterebiliyoruz. Testi doğru sayıda hücre yle gerçekleştirmek önemlidir. Aslında, çok az veya çok fazla hücre tüplerin doğru oluşumuna izin veremedi. Bu nedenle, hücrelerin doğru sayısını bulmak için bir ön test yapmak için tavsiye edilir. Luca Olga Pastorino, laboratuvarımda doktora öğrencisi, prosedürleri gösterecek. İlk olarak, ruta graveolens ilkbahar ve yaz aylarında yaprakları toplamak. Konik bir şişeye 250 gram doğranmış yaprak koyun ve el yazmasında açıklandığı gibi bir litre distile su, kaynatın ve süzün. Ertesi gün, yaprak ekstresi lyophilize için bir lyophilizer kullanın. Toz elde ettikten sonra, tartMak ve aliquots bölün. Kültür HUVECs endotel hücre büyüme orta, metin protokolüne göre. Hücreler %80 birleştiğinde, hücreleri bir ile üç arasında bir oranda iletin. Pasaj iki ve pasaj beş arasında elde edilen hücreleri kullanın. Bir kez pasajlı HUVECs% 70 birleştiğinde, ilgi geni içeren vektör bir mikrogram ile onları transvect.Seyreltilmiş Lipofektamin üç mikrolitre ile DNA bir mikrogram birleştirin 2000.Sonra, HUVECs orta çıkarın, ve taze tam orta bir mililitre ile değiştirin. Transvekting çözeltisini hücrelere ekleyin ve hücreleri 37 santigrat derecede ve %5 karbondioksitle kuluçkaya yatırın. Transveksiyondan üç saat sonra, yedi mililitre taze tam ortam ekleyin ve hücreleri 24 ila 48 saat daha kuluçkaya yatırın. Bodrum hazırlığından hemen önce, önceden soğutulmuş, 96 kuyulu bir tablayı buza koyun ve her kuyuya 50 mikrolitre soğuk matris ekleyin. Plaka kuluçkaya yatarken, HUVEC'leri bir mililitre PBS/EDTA çözeltisi ile yıkayın. Sonra, hücrelere Tripsin-EDTA çözeltisi bir mililitre ekleyin ve 37 santigrat derece beş dakika kuluçka.Askıya alınan hücreleri içeren orta toplamak ve santrifüj yoluyla hücreleri hasat. Sonra, pbs bir mililitre hücreleri askıya. 0.2 mililitre hücre süspansiyonunun trippan mavi solüsyonu ile 0,5 mililitre PBS'ye aktarın. Süspansiyonu oda sıcaklığında beş dakika tuttuktan sonra, hücreleri B'de sayın