Bu yöntem, adaptif immün yanıtların rolü ve bu multifaktöriyel hastalığın patogenezi gibi tüberküloz alanındaki temel soruların yanıtlaştırılabildiği gibi yardımcı olabilir. Bu nükleik asit baz yönteminin en büyük avantajı hem bakteriyüklerinin hem de gen ekspresyonu seviyelerinin aynı bireyden ölçülebiliyor olmasıdır. Bu prosedüre başlamak için, metin protokolünde belirtildiği gibi 7H10 plaka üzerinde kültür M.marinum.
ADC zenginleştirme içeren 7H9 orta 10 mililitre transfer, polisorbat 80, ve gliserol bir hücre kültürü şişesi. Daha sonra, aseptik şişe içine M.marinum bakteriyel kitle bir döngü aktarmak için steril bir mikrolitre aşılama döngü kullanın. Kapağı gevşek bırakın veya OD600 yaklaşık 0,7 ulaşana kadar üç ila dört gün boyunca sallayarak olmadan karanlıkta 29 santigrat derece yeterli gaz değişimi ve kültür için izin vermek için bir filtre kapağı kullanın.
Seyreltin ve metinde belirtildiği gibi bakteri kültüre devam. Enfeksiyon için bakteriyel çözüm hazırlamaya başlamak için, taze bir tüp içine kültürün bir mililitre aktarın. Santrifüj 10, 000 g üç dakika.
Supernatant çıkarın ve steril PBS bir mililitre pelet resuspend. Bir izleyici olarak fenol kırmızı mililitre başına 0.3 miligram ile steril PBS kullanarak, istenilen bakteri konsantrasyonuna ulaşmak için süspansiyon seyreltin. Bundan sonra, bir mililitreşşüş yavaş yavaş bir 27 gauge iğne ile süspansiyon çekmek için kullanın üç kez.
Her aliquot için kullanmadan hemen önce bu adımı gerçekleştirin. İlk olarak, pipet parafin film bir parça üzerine seyreltilmiş bakteriyel çözelti beş mikrolitre damlacık. Sonra, damlacık bir 30 gauge insülin iğne içine çekin.
Biri vahşi balık, diğeri bez mutant balık olan bu deney için beş ila sekiz aylık bir balık kullanın. Nemli köpüklü plastik bir parça nın yarımktıları bu balık ventral tarafı konumlandırın. 45 derecelik bir açıyla pelvik yüzgeçleri arasında insülin iğnesi enjekte edin.
Tüm açıklığın karın boşluğunun içinde olduğundan emin olmak için iğneyi yukarı doğru aç. Sonra, yavaş yavaş bakteriyel çözelti enjekte edin. Bundan sonra, dikkatlice iğne çıkarın ve hemen taze tank suyu ile dolu bir kurtarma tankı balık aktarın.
7H10 plakaları üzerinde her 15 dakikada bir kullanılan bakteriyel aliquot örnekleri alın. Enfeksiyon dozunu doğrulamak için bu örnekleri beş gün boyunca 29 derecede kuluçkaya yatırın. Düzenli olarak balık ların refahını kontrol edin, 3-aminobenzoik asit etil ester fazla% 0.02 ile suda kuluçka tarafından enfeksiyon belirtileri ile herhangi bir balık ötenazi emin olun.
Balık ötenazi sonra, branchiostegal ışınları için bir pin posterior takın. Balığı platforma sokmak için kuyruktan ikinci bir iğne yerleştirin. Neşter kullanarak tüm karın boşluğunu açın.
Sonra, kalpten başlayıp bir bloktaki tüm iç organları ayırmak için omurga boyunca kuyruk boyunca çalışan iç organları toplamak için küçük bir kaşık ve keskin uçlu cımbız kullanın. Cloaca bağırsak ağı ayırmak ve yarım düzine 2,8 milimetre seramik boncuk içeren 1,5 mililitrelik homojenizasyon tüpü içine organları aktarmak için cımbız kullanın. Numuneyi dondurmak için tüpü hemen kuru buzüzerine yerleştirin.
Numuneyi homojenize olana kadar negatif 80 santigrat derecede saklayın. DNA ve RNA ayıkladıktan sonra, metin protokolünde belirtildiği gibi kantitatif PCR ile mikobakteriyel yükleri ölçün. Bu çalışmada, yetişkin zebra balıkları intraperitoneal enjeksiyon ile M.marinum ile enfekte olur.
Yüksek enfeksiyon dozu hangi mikobakteriyel yük ortalama yük sonuçta balık öldürerek yaklaşık beş milyon bakteri ulaşana kadar artmaya devam eden ilerleyici bir hastalığa yol olduğu görülmektedir. Öte yandan düşük doz, ilerleyici, gizli, yeniden aktive edilmiş ve sterilize edilmiş enfeksiyonlarla insan tüberkülozunda görülene benzer bir hastalık spektrumunun gelişmesine yol açar. Bu durumda, yük dört hafta boyunca artmaya devam ediyor ve bu hastalık balığın çoğunda sabit bir duruma ulaşıyor.
Bu veriler, balık enfekte etmek için kullanılan mikobakterilerin ilk sayısı enfeksiyonun sonucu için kritik bir belirleyici olduğunu ortaya koymaktadır. Rag mutant zebra balıkları yeterince yüksek bakteri yükleri ve artan morbidite yol mikobakterilerin büyümesini sınırlamak mümkün olduğu görülmektedir. Bu açıkça mikobakteriyel enfeksiyonu kontrol adaptif bağışıklık önemini göstermektedir.
Interlökin-4 düzeyleri, interlökin-4'ün etkin bir şekilde piyasaya sürülmesi için adaptif yanıtın gerekli olduğunu, ancak mikobakteriyel enfeksiyon sonrası interferon gamanın getirilmesi için vazgeçilmez olduğunu ortaya koyan yabani tip grupta anlamlı olarak daha yüksektir. Bu protokol, hem DNA hem de RNA'nın aynı örnekten toplanmasını sağlar ve bu da numunenin mikobakteriyel yükünü hem konak hem de bakterilerin gen ekspresyonu verileriyle birleştirmeyi mümkün kılar. Bu teknik, mikobakteriyel yükler ve immün yanıtlar üzerindeki etkilerini değerlendirmek için ilaç veya aşı adaylarının yönetimi ile kombine edilebilir.
Bu prosedürü denerken, bir biyogüvenlik düzeyi iki patojen ile çalışırken kişisel güvenlik ve atık bertaraf için yerel kurallara uymayı unutmayın önemlidir. Bu teknik, in vivo modelinde etik olmayan bir memeli olmayan zebra balığında hareketsiz mikobakterilerle hem aktif hem de gizli tüberkülozun incelenmesini mümkün kıldığıdır.
