Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области туберкулеза, такие как роль адаптивной иммунной реакции и патогенез этого многофакторного заболевания. Основным преимуществом этого базового метода нуклеиновой кислоты является то, что как бактериальные нагрузки, так и уровни экспрессии генов могут быть измерены одним и тем же человеком. Чтобы начать эту процедуру, культура M.marinum на пластине 7H10, как указано в текстовом протоколе.
Перенесите 10 миллилитров среды 7H9, содержащей обогащение ADC, полисорбат 80 и глицерол в колбу клеточной культуры. Затем используйте стерильную одну цикл прививки микролитара, чтобы асептически перенести одну петлю бактериальной массы M.marinum в колбу. Оставьте крышку свободной или использовать крышку фильтра, чтобы обеспечить достаточный обмен газа и культуры при 29 градусов по Цельсию в темноте без встряхивания в течение трех-четырех дней, пока OD600 достигает около 0,7.
Разбавить и продолжать культивирование бактерий, как указано в тексте. Чтобы начать готовить бактериальный раствор к инфекции, перенесите один миллилитр культуры в свежую трубку. Центрифуга при 10 000 г в течение трех минут.
Удалите супернатант и повторно посовелите гранулы в один миллилитр стерильного PBS. Используя стерильный PBS с 0,3 миллиграмма на миллилитр фенола красного в качестве трассировщика, разбавить суспензию, чтобы достичь желаемой бактериальной концентрации. После этого используйте один миллилитровый шприц, чтобы медленно тянуть подвеску через 27 калибровочных игл три раза.
Выполните этот шаг перед использованием для каждого aliquot. Во-первых, пипетка пять микролитров капли разбавленного бактериального раствора на кусок парафиновой пленки. Затем потяните каплю в иглу инсулина 30 калибра.
Используйте пять-восемь месяцев рыбы для этого эксперимента с одним из которых дикий тип рыбы, а другой является тряпкой мутант рыбы. Распорежьте эти рыбы брюшной стороны вверх в щелях кусок влажного вспененной пластика. Ввимить инсулиновую иглу между тазовыми плавниками под углом 45 градусов.
Держите иглу открытия вверх, чтобы убедиться, что все отверстие находится внутри брюшной полости. Затем медленно вводят бактериальный раствор. После этого аккуратно снимите иглу и немедленно перенесите рыбу в восстановительный резервуар, наполненный пресной водой.
Возьмите образцы из бактериальной aliquot в использовании каждые 15 минут на 7H10 пластин. Инкубировать эти образцы при 29 градусах по Цельсию в течение пяти дней, чтобы проверить дозу инфекции. Регулярно проверяйте самочувствие рыбы, убедившись, что усылать любую рыбу с симптомами инфекции, инкубируя их в воде более чем на 0,02% от 3-аминобензойной кислоты этилового эстера.
После усыпления рыбы, вставьте булавку задней в branchiostegal лучей. Вставьте второй штифт через хвост, чтобы прикрепить рыбу на платформу. Используя скальпель, откройте всю брюшную полость.
Затем используйте небольшую ложку и острым пинцетом, чтобы собрать внутренние органы, начиная с сердца и работая вдоль позвоночника к хвосту, чтобы отделить все внутренние органы в одном блоке. Используйте пинцет, чтобы отделить китроу от клоакы и перенести органы в 1,5 миллилитровую гомогенизацию трубки, содержащей полдюжины 2,8-миллиметровых керамических бусин. Немедленно поместите трубку на сухой лед, чтобы заморозить образец.
Храните образец при отрицательном 80 градусов по Цельсию до готовности к гомогенизации. После извлечения ДНК и РНК, измерить микобактериальные нагрузки по количественным ПЦР, как указано в текстовом протоколе. В этом исследовании взрослые зебры заражены M.marinum внутриперитонеальной инъекцией.
Высокая доза инфекции, как видно, приведет к прогрессирующему заболеванию, при котором микобактериальная нагрузка продолжает увеличиваться до тех пор, пока средняя нагрузка не достигнет около пяти миллионов бактерий, в конечном счете убивая рыбу. Низкая доза, с другой стороны, приводит к развитию спектра заболеваний, аналогичного тому, который наблюдается при туберкулезе человека с прогрессирующими, скрытыми, реактивированными и стерилизованными инфекциями. В этом случае нагрузка продолжает увеличиваться в течение четырех недель, после чего болезнь достигает стабильного состояния у большинства рыб.
Эти данные показывают, что первоначальное число микобактерий, используемых для заражения рыбы является критическим фактором, определяющим исход инфекции. Rag мутант зебры, как видно, не в состоянии достаточно ограничить рост микобактерий, ведущих к более высоким бактериальным нагрузкам и повышенной заболеваемости. Это наглядно демонстрирует важность адаптивного иммунитета в борьбе с микобактериальной инфекцией.
Уровни интерлекина-4 значительно выше в группе дикого типа, что показывает, что адаптивная реакция необходима для эффективного введения интерлейкина-4, но может быть незаменима для введения интерферон гамма после микобактериальной инфекции. Этот протокол позволяет сбор как ДНК, так и РНК из одного и того же образца, что позволяет сочетать микобактериальное бремя образца с данными экспрессии генов как хозяина, так и бактерий. Этот метод может быть объединен с введения препаратов или вакцин кандидатов для оценки их влияния на микобактериальные нагрузки и иммунные реакции.
При попытке этой процедуры, важно помнить, чтобы следовать местным руководящим принципам для личной безопасности и удаления отходов при работе с биобезопасности уровне два патогена. Этот метод позволяет изучать как активный, так и скрытый туберкулез с спящими микобактериями у зебры, которая является этической моделью in vivo, не являющейся млекопитающим.
