Araştırma büyüme girişimi (Ödülü No 101 X 340), Ulusal Bilim Vakfı, büyük araştırma araçları programı (Grant No mali desteği anıyoruz PHY-1626450), büyük Milwaukee Vakfı (Shaw Ödülü) ve University of Wisconsin sistemi (uygulamalı araştırma hibe).

1. reaktifler eriyik hazırlığı
<ol><li>Bir başlangıç protein çözüm faiz [20 mM tris (hydroxymethyl) aminomethane ve 150 mM NaCl, pH 7.4] Tris tampon kullanarak istenen konsantrasyonu protein eriterek/sulandrarak hazırlayın. Not: En küçük protein konsantrasyonu hydrogels cross-linking neden için kullanılan protein bağlıdır ve genellikle > 1 mM olan.</li>
	<li>Amonyum Persülfat (APS) (1 M) stokları ve tris(bipyridine)ruthenium(II) klorür hazırlamak ([Ru(bpy)3]2 +) APS eriterek tarafından (6.67 mM) çözümleri ve [Ru(bpy)3]2 + tozları Tris arabellek.</li>
</ol>2. protein bazlı hidrojel sentezi
<ol><li>23 G iğne 1 mL şırınga üzerinde basılı lavabo pompası ile düzeltmek.</li>
	<li>10 cm politetrafloroetilin (PTFE) tüp (0.022 içinde bir iç çapı ve 0.044 içinde bir dış çapı ile) bir jilet kullanılarak kesme. İğne ve şırınga PTFE tüp bir ucunu takın.</li>
	<li>Bir silane çözüme ikinci tüp sonuna yerleştirin ve şırınga pistonu geri çeker tarafından tüp doldurun. Tüp ~ 30 dakika bırakın.</li>
	<li>Silane çözümü kaldırmak ve basınçlı hava ile tüp kuru. Not: tüm silane çözüm kurutulmuş ve hiçbir kalıntı tüp bırakılır emin olun.</li>
	<li>Protein çözüm mix APS ve [Ru (bpy) 3] ile2 + Sabit hacim oranı kullanarak 1,5 mL tüp içinde [Örneğin, 15:1:1 veya 15:0.5:0.5 (v: v: v)].</li>
	<li>Girdap fotoaktif çözüm kadar tamamen karışık.</li>
	<li>(Örneğin, 14.000 x g) herhangi bir kabarcıklar çözümden kaldırmak için maksimum hızda karıştırın santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Tedavi PTFE tüp açık sonuna fotoaktif karışım içine yerleştirin ve çözüm şırınga pistonu geri çeker tarafından tüpün içine çizin.</li>
	<li>Yüklenen tüp ~ 10 cm uzakta o Isıtma önlemek ve orada 30 dakikaya kadar oda sıcaklığında (Şekil 1B) tutmak için 100 W civa lamba yerleştirin. Not: bazı durumlarda, ışığa maruz kalma süresi 30 s. daha kısa jelleşme kez burada floresan tırnaklar için jeller, photobleaching sınırlamak için kullanılan olarak düşük olabilir.</li>
	<li>İğneden tüpü çıkarması ve yakın bir tıraş bıçağı ile hidrojel biter tüp kenarlarını kesme.</li>
	<li>Körelmenin 24 G iğne hidrojel (Şekil 1 c) Tris çözümde Yükselt için kullanın. Not: Körelmenin iğneler herhangi bir çentik önlemek veya hidrojel örnek zarar vermek için kullanılır.</li>
	<li>Jelleri ekstrüzyon sırasında veya kabarcıklar nedeniyle formu ve kusurları ile jelleri atmak herhangi bir kusur için kontrol edin.</li>
</ol>3. protein bazlı hidrojel eki ve kuvvet-kelepçe Rheometer kurulum
<ol><li>Araç kontrol programını başlatın. Üzerinde ses bobini motorunu. Bir değer aralığı (Örneğin, 7.5 mm) sonuna doğru bobin konumunu belirleyin. Not: Ses bobini pozisyon hidrojel mümkün uzantısı maksimize etmek için en fazla hareket aralığının sonuna doğru olmak tavsiye edilir.</li>
	<li>Zkancaları yerinden-yön ve xdönemeçte hizalamadan-(ki çekerek koordinat; Şekil 2Bgörmek) yön. Mikrometre vidalar xdeğerlerini kaydedin-yön.</li>
	<li>2 steril dikiş eşit uzunlukta iplikçikler halinde kesmek (2-3 cm; bkz: Şekil 3A ve B).</li>
	<li>Gevşek bir çift yukarıdan aşağı düğüm her ipliklerini içine kravat ve 2 döngüler (Şekil 3 c ve 3D) kuvvet sensörün bağlı kanca yerleştirin.</li>
	<li>Deneysel odası Tris arabellek ile doldurun ve hidrojel örnek tıbbi Cımbız kullanarak dolu odanın içine aktarın.</li>
	<li>Ses bobini yerleştirin ve sensör kanca çözüm yüzeye yakın zorlamak ve her yöne xkullanarak kanca hizalamak /y/z-manipülatörler konumlandırma.</li>
	<li>Tıbbi cımbız, protein hidrojel örnek ses için bağlı kanca üzerinde her iki bobin ve sensör (Şekil 3 c) kuvvet asmak kullanma.</li>
	<li>Her iki ucunda da dikiş döngü tıbbi cımbız ile tutarak ve onları aynı anda çekerek hidrojel örnek ses bobini oltaya çevresine 1 dikiş daire sıkın (şekil 3D).</li>
	<li>Döngü için yineleme adım 3.8 kuvvet sensör (şekil 3D) bağlı. Not: herhangi bir yapısal hasar ve hidrojel örnek enine kesme önlemek için dikiş aşırı bir sıkma kaçının.</li>
	<li>Herhangi bir kaymayı önlemek için her kanca vurgun üzerinde dikiş döngüler sıkın; Bu vurgun referans olarak puan arasındaki adım 3.2 kanca sıfır mesafeyi bulmak için kullanın. Tıbbi makas (şekil 3D) kullanarak dikiş aşırı uzunlukları kesti.</li>
	<li>Zkullanarak ekli hidrojel hareket-manipülatörler boyunca z-ekseni deneysel çözümde hidrojel sokmak için deneysel odası doğru.</li>
	<li>Y-z jel herhangi bir stres altında değil öyle ki manipülatörler kullanarak hidrojel örnekte hizalayın.</li>
	<li>Kuvvet sensörü sıfır ve xkullanarak iki kanca ayrı-mikrometre aşamalarında jel kuvveti yaşamaya başlayana kadar. Bu gerçekleşirse, biraz geri mikrometre xçevirin-yön.</li>
	<li>Her iki manipülatörler ses bobini motor ve sensör için konumunu kaydetmek ve hayvan zinciri kanca denemenin başlangıcında arasında kesin ayrım hesaplamak için bu değerleri 3.2 adımda ölçülen olan arasındaki farkı kullanın.</li>
	<li>~1.5 - 2 mm aralığı bolluk Curve ayarlayın ve jel bolluk (Şekil 4A) ölçmek. Not: bolluk her ölçüm için 2 rejimler (Şekil 4A) uyacak en uygun sayıda veri noktası için izin ilk ses bobini konumu, bolluk rejimi başlangıcı bulundurmaya çalışın. Jel uzunluğu kancalar ve bolluk içinde 2 rejimleri arasında kavşak arasındaki mesafeyi kullanarak mikron çözünürlüklü belirlenebilir (Ayrıca bkz: adım 5.1) eğri. Kuvvet sensör zamanla deneysel koşullar farklılığı nedeniyle kayması gibi bu mümkün drift raporlarda zorla jel altında olmadığı bolluk eğri parçası. Araç kontrol programı bu fark için ayar noktası komut PID döngü (Şekil 4A iç metin) gönderirken otomatik olarak dengeler.</li>
</ol>4. protein bazlı hidrojel kontrollü kuvvet-rampa ve sabit-Force ölçüleri kullanarak karakterizasyonu
<ol><li>
Kuvvet rampa deneyler
	<ol>
<li>İstenen yükleme hızı (Örneğin, 0.01 mN/s), kuvvet artırarak bir kuvvet rampa döngü gerçekleştirmek için başlangıç ve son kuvvetler ve protokolün süresi çevrilen "V" girdi. Sonra jel 0 mN (ya da düşük güç) > 200 s protein etki alanları indirgenmesi ve kurtarmak için jel esneklik için izin vermek için basılı tutun.</li>
		<li>Izleme kaydedin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sabit-force deneyler
	<ol>
<li>Bir sabit-force protokol tanımlı bir süre sabit bir güç (Örneğin, 1 mN) 30 s ve sonra artış gücü için (Örneğin, 0.1 mN) düşük bir güç uygulayarak gerçekleştirmek (Örneğin, 120 s), ardından gücünün aynı düşük Şoklama değeri (Örneğin, 0.1 mN) > 300 s protein etki alanları indirgenmesi ve kurtarmak için jel esneklik sağlar.</li>
		<li>İlk darbe takip geribildirim yanıt süresini en üst düzeye çıkarmak için PID ayarlarını ayarlayın (bkz. Şekil 2B) döngü. Not: Sert jelleri ve yürürlükteki küçük değişiklikler, tepki süresi döngü kuvvet sensör elektronik ve bobin tepki süresi sınırlıdır ve 5 ms7olarak düşük olabilir. Daha yumuşak jeller ve yürürlükteki büyük değişiklikler için tepki süresi hydrogels (Şekil 2B) esneklik tarafından dikte edilir.</li>
		<li>Izleme kaydedin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. veri analizi
<ol><li>Jel kuvveti (Δx 4A rakam eklemek içinde) deneyim, jel uzunluğu L denklemi kullanarak hesaplamak başladığında kanca ile hesaplanan bobin pozisyon arasındaki ölçülen mesafeyi kullanan: L = L0 + ∆x L0 mikrometre vida deney (adım 3.14) önce konumu ölçülen kanca arasındaki mesafeyi işte. Not: bir tam cross-linking neden düşük protein konsantrasyonları ile jelleri için izleme izleme ölçülen uzunluğu değişir. Ayrıca, uzun süreler, hangi jöleyi genel bir uzatma neden yaşlanma etkileri25, proteinler hydrogels içinde yaşayabilirsiniz.</li>
	<li>Zorlanma elde etmek için jel uzunluğu için ölçülen uzantısı normalleştirmek.</li>
	<li>Enine yüzey alanı ölçülen gücüne polimerizasyon için kullanılan boru iç çapı kullanarak normalleştirmek.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Cao, Y., Li, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+do+chemical+denaturants+affect+the+mechanical+folding+and+unfolding+of+proteins?.">How do chemical denaturants affect the mechanical folding and unfolding of proteins?.</a> Journal of Molecular Biology. 375 (1), 316-324 (2008).</li><li>Carrion-Vazquez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+and+chemical+unfolding+of+a+single+protein:+a+comparison.">Mechanical and chemical unfolding of a single protein: a comparison.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (7), 3694-3699 (1999).</li><li>Wiita, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+chemistry+of+thioredoxin+catalysis+with+force.">Probing the chemistry of thioredoxin catalysis with force.</a> Nature. 450 (7166), 124-127 (2007).</li><li>Lv, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designed+biomaterials+to+mimic+the+mechanical+properties+of+muscles.">Designed biomaterials to mimic the mechanical properties of muscles.</a> Nature. 465 (7294), 69-73 (2010).</li><li>Plumere, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+redox+hydrogel+protects+hydrogenase+from+high-potential+deactivation+and+oxygen+damage.">A redox hydrogel protects hydrogenase from high-potential deactivation and oxygen damage.</a> Nature Chemistry. 6 (9), 822-827 (2014).</li><li>Kong, N., Peng, Q., Li, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rationally+Designed+Dynamic+Protein+Hydrogels+with+Reversibly+Tunable+Mechanical+Properties.">Rationally Designed Dynamic Protein Hydrogels with Reversibly Tunable Mechanical Properties.</a> Advanced Functional Materials. 24 (46), 7310-7317 (2014).</li><li>Khoury, L. R., Nowitzke, J., Shmilovich, K., Popa, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+Biomechanical+Properties+of+Protein-Based+Hydrogels+Using+Force-Clamp+Rheometry.">Study of Biomechanical Properties of Protein-Based Hydrogels Using Force-Clamp Rheometry.</a> Macromolecules. 51 (4), 1441-1452 (2018).</li><li>Auton, M., Rosgen, J., Sinev, M., Holthauzen, L. M. F., Bolen, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osmolyte+effects+on+protein+stability+and+solubility:+A+balancing+act+between+backbone+and+side-chains.">Osmolyte effects on protein stability and solubility: A balancing act between backbone and side-chains.</a> Biophysical Chemistry. 159 (1), 90-99 (2011).</li><li>Popa, I., Kosuri, P., Alegre-Cebollada, J., Garcia-Manyes, S., Fernandez, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+dependency+of+biochemical+reactions+measured+by+single-molecule+force-clamp+spectroscopy.">Force dependency of biochemical reactions measured by single-molecule force-clamp spectroscopy.</a> Nature Protocols. 8 (7), 1261-1276 (2013).</li><li>Aioanei, D., Brucale, M., Tessari, I., Bubacco, L., Samori, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Worm-Like+Ising+Model+for+Protein+Mechanical+Unfolding+under+the+Effect+of+Osmolytes.">Worm-Like Ising Model for Protein Mechanical Unfolding under the Effect of Osmolytes.</a> Biophysical Journal. 102 (2), 342-350 (2012).</li><li>Wheeldon, I. R., Gallaway, J. W., Barton, S. C., Banta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioelectrocatalytic+hydrogels+from+electron-conducting+metallopolypeptides+coassembled+with+bifunctional+enzymatic+building+blocks.">Bioelectrocatalytic hydrogels from electron-conducting metallopolypeptides coassembled with bifunctional enzymatic building blocks.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (40), 15275-15280 (2008).</li><li>Sathaye, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rheology+of+peptide-+and+protein-based+physical+hydrogels:+are+everyday+measurements+just+scratching+the+surface?.">Rheology of peptide- and protein-based physical hydrogels: are everyday measurements just scratching the surface?.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 7 (1), 34-68 (2015).</li><li>Ma, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Biocompatible+and+Biodegradable+Protein+Hydrogel+with+Green+and+Red+Autofluorescence:+Preparation,+Characterization+and+In+Vivo+Biodegradation+Tracking+and+Modeling.">A Biocompatible and Biodegradable Protein Hydrogel with Green and Red Autofluorescence: Preparation, Characterization and In Vivo Biodegradation Tracking and Modeling.</a> Scientific Reports. 6, 19370 (2016).</li><li>Fancy, D. A., Kodadek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry+for+the+analysis+of+protein-protein+interactions:+rapid+and+efficient+cross-linking+triggered+by+long+wavelength+light.">Chemistry for the analysis of protein-protein interactions: rapid and efficient cross-linking triggered by long wavelength light.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (11), 6020-6024 (1999).</li><li>Saqlain, F., Popa, I., Fernandez, J. M., Alegre-Cebollada, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Strategy+for+Utilizing+Voice+Coil+Servoactuators+in+Tensile+Tests+of+Low+Volume+Protein+Hydrogels.">A Novel Strategy for Utilizing Voice Coil Servoactuators in Tensile Tests of Low Volume Protein Hydrogels.</a> Macromolecular Materials and Engineering. 300 (3), 369-376 (2015).</li><li>Sun, F., Zhang, W. B., Mahdavi, A., Arnold, F. H., Tirrell, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+bioactive+protein+hydrogels+by+genetically+encoded+SpyTag-SpyCatcher+chemistry.">Synthesis of bioactive protein hydrogels by genetically encoded SpyTag-SpyCatcher chemistry.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (31), 11269-11274 (2014).</li><li>Thompson, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-assembling+hydrogels+crosslinked+solely+by+receptor-ligand+interactions:+tunability,+rationalization+of+physical+properties,+and+3D+cell+culture.">Self-assembling hydrogels crosslinked solely by receptor-ligand interactions: tunability, rationalization of physical properties, and 3D cell culture.</a> Chemistry. 21 (8), 3178-3182 (2015).</li><li>Kocen, R., Gasik, M., Gantar, A., Novak, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Viscoelastic+behaviour+of+hydrogel-based+composites+for+tissue+engineering+under+mechanical+load.">Viscoelastic behaviour of hydrogel-based composites for tissue engineering under mechanical load.</a> Biomedical Materials. 12 (2), (2017).</li><li>Desai, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastin-Based+Rubber-Like+Hydrogels.">Elastin-Based Rubber-Like Hydrogels.</a> Biomacromolecules. 17 (7), 2409-2416 (2016).</li><li>Fusi, L., Brunello, E., Yan, Z., Irving, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thick+filament+mechano-sensing+is+a+calcium-independent+regulatory+mechanism+in+skeletal+muscle.">Thick filament mechano-sensing is a calcium-independent regulatory mechanism in skeletal muscle.</a> Nature Communications. 7, (2016).</li><li>McDonald, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++dependence+of+loaded+shortening+in+rat+skinned+cardiac+myocytes+and+skeletal+muscle+fibres.">Ca2+ dependence of loaded shortening in rat skinned cardiac myocytes and skeletal muscle fibres.</a> Journal of Physiology-London. 525 (1), 169-181 (2000).</li><li>Wu, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rationally+designed+synthetic+protein+hydrogels+with+predictable+mechanical+properties.">Rationally designed synthetic protein hydrogels with predictable mechanical properties.</a> Nature Communications. 9, (2018).</li><li>Bharadwaj, N. A., Ewoldt, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-point+parallel+disk+correction+for+asymptotically+nonlinear+oscillatory+shear.">Single-point parallel disk correction for asymptotically nonlinear oscillatory shear.</a> Rheologica Acta. 54 (3), 223-233 (2015).</li><li>Valle-Orero, J., Rivas-Pardo, J. A., Popa, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multidomain+proteins+under+force.">Multidomain proteins under force.</a> Nanotechnology. 28 (17), 174003 (2017).</li><li>Valle-Orero, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+Deformation+Accelerates+Protein+Ageing.">Mechanical Deformation Accelerates Protein Ageing.</a> Angewandte Chemie International Edition. 56 (33), 9741-9746 (2017).</li><li>Fang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Forced+protein+unfolding+leads+to+highly+elastic+and+tough+protein+hydrogels.">Forced protein unfolding leads to highly elastic and tough protein hydrogels.</a> Nature Communications. 4, (2013).</li><li>Gungor-Ozkerim, P. S., Inci, I., Zhang, Y. S., Khademhosseini, A., Dokmeci, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioinks+for+3D+bioprinting:+an+overview.">Bioinks for 3D bioprinting: an overview.</a> Biomaterial Science. , (2018).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Burada, düşük hacimli protein bazlı hydrogels biyomekanik yanıt araştırmak için bir kuvvet-kelepçe rheometry tekniğini tanımlamak. Ayrıca, bir protokol Tekdüzen silindirik düşük hacimli protein hidrojel örnek sentezlemek için sağlanmıştır. Bir iletişim kuralı da nasıl kanca herhangi bir mekanik deformasyon veya protein bazlı hidrojel örnekleri veya kayma jel zarar vermeden farklı protein bazlı hydrogels çeşitli elasticities ile bağlamayı açıklayan sunulur. Doğrusal ses bobini ve kuvvet sensör ile birlikte analog PID sistemi kuvvet rampa ve sürekli kuvvet gibi kontrollü güç iletişim kurallarını uygulama etkinleştirin. Son zamanlarda, bu teknik BSA tabanlı hydrogels farklı deneysel çözümleri7farklı çapraz bağlı konsantrasyonları biyomekanik yanıt eğitim için kullanılmıştır.
Formüle ve protein hydrogels ile çalışma önemli bir tekrarlanabilirlik ölçümlerin yönüdür. Jelleri bir çok düşük protein konsantrasyonu veya eksik cross-linking ile formüle edilmiş, kalıcı plastik deformasyona uzantısı7sırasında görünür. Viskoelastik etkileri etki alanı unfolding ve moleküler düzenlenmesi jel içinde çıktı gibi bu plastik deformasyona veri yorumlanması, büyük ölçüde sınırlar. Eğer görmek için kolay bir test var tamamlamak cross-linking olduğunu 6 M guanidinium klorür1gibi kimyasal denatüranlar hidrojel sokmak için. Bu durumda, olmamalıdır herhangi bir viskoelastik etkileri stres -karşıiçinde-zorlanma eğrileri, tüm etki alanları kimyasal olarak gelişeceğini ve molekülleri şimdi basit polimerler4,7,26davranıyor. Ayrıca, jel geri ilk arabellek7içinde dalmış zaman onun ilk elastikiyet kurtarmanız gerekir.
Varyasyonlar ile farklı jeller elde izleri arasında ölçülen yanıt varsa, çeşitli yönleri sorun giderme için düşünülmelidir: çözüm cross-linking ile karıştırma, homojen olmayan bir protein, protein toplamada kimyasallar, kabarcıklar, protein bazlı hidrojel yanlış silanization nedeniyle PFTE Tüp bağlama varlığı. Silane tüp duvarlarda artıkları hidrojel kontamine ve yapısal kusurlar için yol. Bu hatanın oluşmaması için daha fazla basınçlı hava tüp silane toplam kaldırılmasını sağlamak için gereklidir. Ayrıca, kabarcıklar hidrojel fotoaktif karışımı PTFE tüp içine emme sırasında oluşabilir. Bu baloncuklar hasar örnek ve hidrojel biyomekanik yanıt tesir açabilir. Herhangi bir kabarcık oluşumunu önlemek için PTFE tüp sonu yükleme işlemi sırasında çözüm mix içinde olması gerekir ve yavaş yavaş şırınga pistonu geri çekildi. Başka bir tipik bir dikiş döngüler hidrojel örnekleri etrafında bir çentik oluşumu ve hidrojel kesme yol açabilecek ek işlemi sırasında aşırı sıkma hatadır. Ses bobini hareket aralığını ekli hidrojel örnek maksimum uzantısı sınırlar. Bu sınırlama dikkate alınmak ne zaman birkaç yüz genişletmek jelleri ölçme zorunda ilk uzunlukları yüzdesi. Örneğin, bir hidrojel için % 200'den fazla genişletmek için bir başlangıç uzunluğu daha az 4 mm gereklidir.
Protein bazlı hydrogels biyouyumluluk ve proteinler, onların ana bina üniteleri ve proteinler için karakteristik olan doğal katlama geçiş türetilmiş yüksek esnekliği nedeniyle Biyomalzeme benzersiz bir sınıfıdır. Ayrıca, bu hydrogels doku mühendisliği, ilaç dağıtım sistemleri ve biyolojik mürekkep (bioink) 3D yazdırma27için mükemmel bir potansiyele sahip. Kuvvet-kelepçe hidrojel rheometer proteinler, büyük bir çeşitlilik araştırmak için kullanılabilir. Ayrıca, kuvvet-kelepçe rheometer sabit-force protokol düşük hacimli hidrojel örnekleri üzerinde uygulama sağlar. Bu deneyler elastik ve viskoelastik davranışları ayırımı izin ve (BM) katlanır mekanik bir toplu yaklaşım konusunda çalışma.

Benzersiz fiziksel özelliklere sahip olma dışında protein bazlı hydrogels kuvvet Spektroskopi böylece protein kalabalık ortamlarda çalışma etkinleştirme bir 'Çek', içinde birkaç milyar molekülleri ölçümü etkinleştirerek devrim sözü tutun, Bu deri ve diğer doku karşılaştı benzer. Ortakları ve kimyasal koşullar bağlayıcı protein etki alanları zorlamak için biyomekanik cevapları çalışma izin hydrogels içinde katlanmış olarak kalır. Buna ek olarak, hydrogels içinde protein etki alanlarının biyomekanik yanıt tek molekül kuvvet Spektroskopi teknikleri ile görülen yanıt benzer. Örneğin, kimyasal denatüranlar ve oksitleyici ajanlar istikrar katlanmış devletin tek protein etki alanı düzey1,2,3 hem de makroskopik düzey4,5 azaltmak , 6 , 7. benzer şekilde, osmolytes hydrogels, visko elastik yanıt azalmasına aynı koşullar7,10kuvvet için önde gelen tek proteinler8,9, kararlılığı artırır.
Birkaç yaklaşım hydrogels, protein bazlı sentez için tarafından uygulanmış olan fiziksel etkileşimleri11,12 -kovalent cross-linking4,13kullanarak. Kovalent reaksiyonları sabit cross-linking yerlerde için izin ve bu hydrogels mekanik veya kimyasal tedirginlikler kaldırılması üzerine başlangıç durumu kurtarabilirsiniz. Amonyum Persülfat (APS) bir oksidan ve Rutenyum (II) tuzu kullanarak bir başlatıcı (Şekil 1)14olarak maruz Tirozin amino asitler arasındaki kovalent karbon-karbon bağları oluşturan kovalent cross-linking için başarılı bir yaklaşım kullanır. Beyaz ışığa maruz kalma konsantre proteinlerin bir çözüm-ebilmek var olmak dönük hidrojel. Reaksiyon başlar, protein-APS karışımı herhangi bir döküm formu enjekte edilebilir güncelleştirip kontrol ederek Politetrafloroetilen (PFTE) gibi tüpler (Şekil 1B ve 1 C), son derece küçük çözüm cilt15kullanımını sağlar. Ayrıca, cross-linking tepki tetiklemek için beyaz ışık kullanımı sonuçlar floresan proteinlerin sınırlı bir beyazlatma ve bileşik hydrogels formülasyonu floresan işaretleri (Şekil 1) ile sağlar. SpyTag-SpyCatcher kovalent etkileşim16, Amin cross-linking via oxazolidin13veya biotin streptavidin etkileşimi17temel cross-linking diğer protein bazlı hidrojel oluşumu yöntemleri kullanın.
Dinamik mekanik analiz (DMA), şu anda yoğun polimer esaslı hydrogels13,18çalışma için kullanılan bir tekniktir. DMA Biyomalzeme için sürekli güç iletişim kuralları uygulayabilirsiniz olmakla birlikte, üzerinde 10 kPa ve 200'den fazla µL19hacimleri büyük örnek Young'un dönmeler gerektirir. Bu sınırlamalar nedeniyle, protein hydrogels genellikle bu tekniği ile araştırılması çok yumuşak. Mühendislik polyproteins üretmek için canlı bir sistem gerektiren bu yana polimerler sentez zordur bu tür yüksek birimleri en iyi4,15' verimsiz şunlardır. Ayrıca, çoğu biyolojik doku 10 kPa yumuşak. Birkaç yaklaşım kas elastikiyeti20,21çalışmada özellikle biyolojik örnekler için geliştirilmiştir. Bu teknikler de sürekli kuvvet uygulamak için geribildirim altında çalışabilir ama örnekleri çok kısa zamanlar için zorlamaya maruz küçük çapı (mikron aralığındaki) için optimize edilmiş (genellikle daha az 1 s).
Protein bazlı hydrogels tarihinde rheometry teknikleri ile başarılı bir şekilde incelenmiştir. Örneğin, bir halka şeklinde hidrojel döküm deneyimli kuvvet değişikliği uzantısı4,22bir fonksiyonu olarak ölçmek için extensional rheometry kullanımına izin verir. Protein bazlı hydrogels rheological özelliklerini çalışmak için diğer yaklaşımlar kontrollü kesme-stres rheometry kullanın. Bu teknikler de düşük numune hacmi elde etmek ve yumuşak malzeme tahammül. Ancak, bu yöntemleri eksikliği çekerek taklit yeteneği o neden protein unfolding içinde vivozorlar ve Young katsayısı çeşitli varsayımlar ve düzeltmeler23gerektiren karmaşık teorileri dayanarak hesaplanır.
Son zamanlarda küçük hacimli tüp çapı içindeki polimerli proteinlerin kullanan yeni bir yaklaşım bildirdin < 1 mm. Bu teknik ilk bizim uygulanması nerede jel istenen protokol15genişletildi uzunluğu-kelepçe modunda çalışan. Etki alanlarını açılmak iken, bu yöntemde, veri yorumu hantal yapma sürekli bir değişim uzantısı ve kuvvet proteinler deneyim. Son zamanlarda, yeni bir kuvvet-kelepçe rheometry tekniği, nerede bir geri besleme döngüsü düşük hacimli protein hydrogels bir önceden tanımlanmış kuvvet Protokolü7 (Şekil 2) açığa çıkarabilir bildirdin. Analog bir PID sistemi ile bilgisayardan gönderilen ayar noktası kuvvet algılayıcı ile ölçülmüş güç karşılaştırır ve iki giriş arasındaki fark en aza indirmek için ses bobini taşıyarak jel uzantısı ayarlar. Bu 'sıkma kuvveti' Şimdi yeni türlerine deneyler için protein hydrogels biyomekanik ölçmek için izin verir.
Kuvvet rampa modunda bir hayvan zinciri protein hidrojel sürekli artış ve zamanla kuvvet azalması deneyimleri. PID doğrusal olmayan bir şekilde, protein ve hidrojel formülasyonu türüne bağlı olarak uzatma değiştirerek için herhangi bir visko elastik deformasyon oluşan koyu çizgileri giderir. Kuvvet rampa en büyük avantajı Young katsayısı ve bir unfolding ve protein etki alanından refolding nedeniyle enerji dağıtımı gibi standart parametreler miktar sağlanmıştır.
Sabit-force modunda uygulanan kuvvet bir adım gibi moda değiştirir. Bu modda, jel genişletir ve kuvvet artırılması veya azaltılması, anılan sıraya göre ne zaman Melosun sözleşmeleri, zamana bağımlı deformasyon tarafından takip. Sabit bir güç, jel deneyimleri sırasında gerçekleşen bu visko elastik deformasyon etki alanı unfolding/refolding için doğrudan ilgilidir. Basitleştirilmiş bir şekilde, bu uzantı ortalama ve tek seferde ölçülen birkaç milyar tek molekül izlemeler eşdeğeri olarak görülebilir. Sabit-force protokolleri sürüngen ve protein hydrogels gevşeme kuvvet ve zamanın bir fonksiyonu olarak kullanılabilir. BSA tabanlı protein hydrogels için güç bir fonksiyonu olarak biz son zamanlarda elastik ve viskoelastik uzantısı ve geri tepme ile uygulanan gerilim7arasında doğrusal bir bağımlılık olduğunu göstermiştir.
Burada bir kuvvet-kelepçe rheometer bileşik jelleri protein L (L8olarak tasvir 8 etki24,) bir karışımı ve bir protein L-eGFP yapısı (L-eGFP), yapılan genel hidrojel yapar floresan ve basit-e doğru kullanma işlemi ayrıntılı göstermektedir.

<table><tbody><tr><td>SI-KG4A force transducer</td><td>World Precision Instruments (WPI)</td><td>SI-KG4A</td><td></td></tr><tr><td>Linear Voice Coil Motor</td><td>Equipement Solutions</td><td>LFA2010</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Rocky Mountain Biologicals (RMBIO)</td><td>BSA-AAF-1XG / 100 G</td><td></td></tr><tr><td>Trizma</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium persulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>248614-100G</td><td></td></tr><tr><td>Tris(bipyridine)ruthenium(II) chloride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>544981-1G</td><td></td></tr><tr><td>EXPRESS MEDICAL SUPPLIES&amp;nbsp;6-0 NYLON SUTURE 12/PK</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0395626</td><td></td></tr><tr><td>1mL Syringe Only, Luer-Lok Tip</td><td>BD</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>Silane, Sigmacote</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SL2-25ML</td><td></td></tr><tr><td>Microbore PTFE Tubing, 0.022&quot;ID x 0.042&quot;OD, 100 ft/roll</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-06417-21</td><td></td></tr><tr><td>Hypodermic Needle, 23 Gauge</td><td>Healthcare Supply Pros</td><td>305194</td><td></td></tr><tr><td>Jensen Global JG24-1.5X Red IT Dispensing Tips - 24 gauge</td><td>KIMCO</td><td>JG24-1.5X</td><td></td></tr><tr><td>USH-103D USHIO 100W Short Arc Mercury Lamp</td><td>ALB</td><td>USH-103D USHIO</td><td></td></tr><tr><td>Medical Tweezers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Medical scissors</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>The computer code and CAD design of the custom parts can be made available on request to the corresponding author.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

force-clamp rheometry for characterizing protein-based hydrogels

Burada, protein bazlı hydrogels biyomekanik özellikleri tanımlamak için bir kuvvet-kelepçe rheometry yöntemi açıklanmaktadır. Bu yöntem bir analog oransal-integral-türev (PID) sistemi bir doğrusal ses bobini motor ve güç dönüştürücü gergin silindirik protein bazlı hidrojel örnekleri üzerinde kontrol-force iletişim kuralları uygulamak için kullanır. İşlem sırasında ölçülen ve ayar noktası kuvvetleri arasındaki farkı en aza indirerek bir önceden tanımlanmış kuvvet protokolü takip etmek hidrojel örnek uzantısı PID sistemi ayarlar. Hydrogels protein bazlı benzersiz bu yaklaşım son derece düşük hacimli hidrojel örnekleri (< 5 µL) farklı protein konsantrasyonları ile hayvan zinciri sağlar. Burada uygulanan stres artırır ve doğrusal olarak zamanla azalır, kuvvet rampa protokolleri altında sistem (BM) proteinler ve standart elastik ölçümü katlama ile ilişkilendirilen esneklik ve histeresis davranışlar çalışma sağlar ve visko elastik parametreler. Sabit-kuvvet, güç darbe bir adım benzeri şekli, elastik yanıt, kusura bakma ama değişikliği yürürlükte, sahip olduğu unfolding ve refolding protein etki alanından gelen viskoelastik yanıt dan bilgisini iletmiyor altındadır. Düşük hacimli örnek ve çeşitli mekanik tedirginlikler uygulanmasında çok yönlülük nedeniyle kuvvet-kelepçe rheometry proteinlerin bir toplu yaklaşım kullanarak kuvveti altında mekanik yanıt araştırmak için optimize edilmiştir.

Şekil 1A düzeni L-EGP/L8 hidrojel sentezlemek için kullanılan fotoaktif tepki gösterir. Şekil 1B hidrojel karışımı PTFE tüpe önce ve photoactivation sonra gösterir. Şekil 1 c haddelenmiş L-eGFP-L8 hidrojel Tris çözüm içinde sunar. Hidrojel örnek hiçbir yapısal kusurları gibi çentikler var. Hydrogels açıkça görünür bir hasar ile atılmalıdır.
Birleştirilmiş işlenmesi ve kuvvet-kelepçe rheometer görünümlerini patladı Şekil 2A ve 2B'yisunulmaktadır. Şekil 2C nerede hidrojel örnek bağlı doğrusal ses bobini ve kuvvet sensör ve arabellek çözeltilerine dalmış kanca arasında gergin kuvvet-kelepçe rheometer düzeni gösterir. Analog PID sistemi kuvvet ayar noktası izleyin için doğrusal ses bobini pozisyon kontrol ederek hidrojel uzantısı ayarlar. Şekil 2B sürecin ayarlama ayrılmaz kazanç için çeşitli aralıklarla kullanarak gösterir.
Şekil 3 tipik ek işlem hidrojel örneği gösterir. Hizalanmış kanca arasında hidrojel hayvan zinciri sonra dikiş döngüler hidrojel vurgun hidrojel uzunluğu kesin belirlenmesi için izin veren ve örnek kaymasını önlemek için yakın çevresinde sıkılır.
Kuvvet rampa ölçüm ve çözümleme-in Protein Bazlı Hydrogels: Kuvvet rampa Protokolü'nün temsilcisi ölçüleri Şekil 4A - 4 Cgösterilir. Her yeni çekme Şekil 4Agörüldüğü gibi bir bolluk ölçüm ile başlar. Sonra güç eğrisi yükü artırır ve doğrusal olarak zamanla azalır gibi bir ters "V" Protokolü uygulayarak elde edilir. Daha sonra hidrojel 0 mN kuvvet 200 için düzenlenen s protein etki alanları içinde (Şekil 4B) refold için hidrojel örnek izin vermek için. Stres sırasında önceden tanımlanmış kuvvet ayar noktası takip etmek bobin konuma göre temsil hidrojel uzantısı PID sistem değiştirir. Bolluk her eğrinin için 2 satır (Şekil 4 c) uygun. Mavi hatta ilk rejimi sığdırmak için kullanılır ne zaman hidrojel recoils ve turuncu çizgi hidrojel bolluğu olduğunda rejim sığdırmak için kullanılır. İki çizgi arasındaki kavşak mikrometre çözünürlüğe (Şekil 4A) doğru jel uzunluğunu hesaplamak için kullanılır. Daha sonra hidrojel örnek uzantısı bobin pozisyon izleme (Şekil 4 d) ilk bobin pozisyondan çıkarılarak hesaplanır. Şekil 4F stres gerginlik eğrisi sunar. Stres kesiti hidrojel örnek uygulamalı zorla bölünerek hesaplanır ve zorlanma (4E rakam) uzantısı bölünerek Şekil 4A sunulan bolluk eğrisi hesaplanan gerçek jel uzunluğu tarafından hesaplanır .
Sabit güç ölçüm ve çözümleme-in Protein Bazlı Hydrogels: Bir sabit-force protokol temsilcisi ölçümleri are göstermek içinde Şekil 5A - 5 D. 0.1 mN sabit bir güç 30 hidrojel örnek uygulanır s, kuvvet sonra 120 için 1 mN değiştiğinde s ve son olarak, kuvvet için 300 mN 0.1 başa söndürülür s (Şekil 5A) refold protein etki alanları sağlar. Sırasında ilk 30 s düşük güç jel uzantısındaki önemli hiçbir değişiklik yok. 1 mN gücünün artırılması hidrojel hızlı elastik bir uzantısı gösterir. Bu ilk uzantısı hidrojel (1 mN) kuvvet sabit tutarken, zaman içinde uzanan tutar. Daha sonra kuvvet geri ilk düşük değeri için (0.1 mN) su ve hidrojel ilk uzunluğu (Şekil 5B) kurtarır. Hidrojel örnek (Şekil 5C) ve güç uzatma zorlanma (üst) ve stres (alt) benzer bir şekilde olduğu gibi kuvvet rampa ölçümleri (Şekil 5 d) hesaplamak için kullanılır.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58280/58280fig1.jpg"> Resim 1: L-eGFP/(L)8-hidrojel sentez dayalı. (A) Bu panel gösterir bir photoactivated tepki kullanarak bir L-eGFP/(L)8 protein sentezi hidrojel şemaları. Protein APS ile karıştırılır ve [Ru(bpy)3]2 + ve beyaz ışık maruz, hangi bitişik Tirozin amino asitler (gömme) arasında Kovalent bağlar oluşumunu destekler. (B) Bu panel gösterir bir L-eGFP/(L)8-, [Ru(bpy)3]2 +- ve APS-karışım dolu pozlama için beyaz ışık (üst) ve sonra (alt) önce 23 G iğne kullanarak bir PTFE tüp içine. (C) Bu panel haddelenmiş L-eGFP/(L)8gösterir-hidrojel Tris çözümde dayalı. İlave bir L-eGFP/(L)8büyütülmüş bir görüntüsünü gösterir-hidrojel dayalı. (558 mikron) polimerizasyon sırasında kullanılan PFTE boru iç çapı ile anlaşma 552 ± 8 mikron çapında dağılımıdır. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58280/58280fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58280/58280fig2.jpg"> Şekil 2: Force-kelepçe rheometer tasarım ve set-up. (A)monte kuvvet-kelepçe hidrojel rheometer işlenmesi. Kangal ve sensör kanca çözüm odası içinde zorla bir protein bazlı hidrojel örnek ses için bağlı iç metin gösterir. Kuvvet-kelepçe hidrojel rheometer şemayı göster (B) Render: (a - c) ses bobini ayarlamak için x-y-z manipülatörler kanca konum, (d) Doğrusal ses bobini motorlu, (e) güç dönüştürücü, (f) kuvvet dönüştürücü sahibi, (g) çözüm odası, ve (h - ben) x-y manipülatörler güç dönüştürücü konumunu ayarlamak için. (C) kuvvet-kelepçe hidrojel rheometer kurulum şeması. Düzeni kuvvet algılayıcıyı bağlı bir protein bazlı hidrojel örnek gösterir ve tıbbi dikiş kullanarak ses bobini kanca. Analog PID sistemi kuvvet ayar noktası izleyin için ses bobini konumunu ayarlayarak hidrojel uzunluğu değiştirir. (D) PID sistem yanıtı kuvvet ulaşmak için farklı integral-kazanç değerleri (ben) kullanarak noktası (kesik çizgi) ayarlayın. Renkli izlemeler ölçülen kuvvet (alt) temsil ve zorlanma (üst) elde edilen PID sistem yanıtı. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58280/58280fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58280/58280fig3.jpg"> Şekil 3: L-eGFP/(L)8-bağlı hidrojel eki işlemi. (A)yakın çekim görüntülemek için kanca hidrojel örnek bağlamak için kullanılan gevşek çift yukarıdan aşağı düğüm ile bağlı bir dikiş döngü. (B) iki dikiş döngüler protein bazlı hidrojel ek olarak kullanılan kuvvet sensör kanca yerleştirilir. (C) bir L-eGFP/(L)8-tabanlı hidrojel örnek arasında (oklarla gösterilen) kanca asılı. (D) dikiş (solda) ses bobini tarafında döngüler ve kuvvet sensör kanca (sağda) hidrojel örneği örnek ölçümler sırasında kaymasını önlemek için her kanca bend'etrafında sıkılır. Daha sonra tıbbi makas (kırmızı oklarla gösterilen) kullanarak aşırı dikiş atılır. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58280/58280fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58280/58280fig4.jpg"> Şekil 4: Temsilcisi kuvvet-rampa ölçüm ve veri analizi eğriler için bir L-eGFP/(L)8-hidrojel örneğe bağlı. (A)tipik bolluk ölçüm eğrisi (kırmızı) sıfır güç kuvvet sensörün ve hidrojel gerçek uzunluğunu belirlemek için kullanılır. İki doğrusal eğrileri (mavi ve turuncu çizgiler) her iki rejimler sığdırmak için kullanılır: jel (mavi çizgi), kuvvet altında olduğunda ilk ve ikinci, jel bolluk (Plato - turuncu çizgi) olduğu. İki çizgi arasındaki kavşak sıfır güç, gerçek hidrojel uzunluğunu hesaplamak için kullanılır. Oku hareket yönünü gösterir. İlave sıfır güç konumunu ve hidrojel uzunluğu düzeltme gösterir. (B) temsilcisi kuvvet-rampa eğrisi hidrojel örneğine uygulanan. (C) izleme zamanın bir fonksiyonu olarak bobin pozisyon hareketi temsil eden. Bobin adımda 3.1 (7,5 mm) protokolünde tanımlanan ilk konumdan başlar. (D) temsilcisi eğrisi hidrojel örnek zamanın bir fonksiyonu olarak uzantısı. Uzantının başlangıç konumunu arasındaki ölçülen bobin pozisyon deplasman olarak hesaplanır. (E) temsilcisi zorlanma -karşı-zaman eğrisi. Zorlanma bolluk ölçüm hesaplanan gerçek jel uzunluğu uzantısı bölünerek hesaplanır. (F) temsilcisi stres gerginlik eğrisi hidrojel örneği. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58280/58280fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58280/58280fig5.jpg"> Şekil 5: Sabit Kuvvet ölçüm ve veri analiz. (A)bir hidrojel için uygulanan sabit-force protokol temsilcisi iz. Hidrojel 30 0.1 mN maruz s sonra kuvvet 120 için 1 mN artırılır s ve son olarak, kuvvet söndürülür 0.1 mN için h uzunluğu değişikliği temsil eden zaman izleme karşı bir bobin 300 s. (B) Bu panel gösterir konumlandırmak için force protokol sonrası ydrogel örnek. (C) Bu panel ses bobini uzaklığı ölçülen jel uzantısı gösterir. Stres (alt) ve veri analizi sonra gerginlik izlerini (üst) (D) temsilcisi figürü. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58280/58280fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Force-Clamp Rheometry for Characterizing Protein-based Hydrogels at JoVE.com

Force-Clamp Rheometry for Characterizing Protein-based Hydrogels

Protein Bazlı Hydrogels karakterize için kuvvet-kelepçe Rheometry

Yeni bir kuvvet-kelepçe rheometry teknik bir ses bobini motor ve bir kuvvet sensör arasında gergin düşük hacimli protein bazlı hidrojel örnekleri mekanik özelliklerini araştırmak için kullanılır. Bir analog oransal-integral-türev (PID) sistemi 'için istenen protokol deneyimli kuvvet sıkma için' sağlar.

Here, we describe a force-clamp rheometry method to characterize the biomechanical properties of protein-based hydrogels. This method uses an analog ...

force-clamp-rheometry-for-characterizing-protein-based-hydrogels

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Engineering

6.9K Görüntüleme.  University of Wisconsin-Milwaukee. Yeni bir kuvvet-kelepçe rheometry teknik bir ses bobini motor ve bir kuvvet sensör arasında gergin düşük hacimli protein bazlı hidrojel örnekleri mekanik özelliklerini araştırmak için kullanılır. Bir analog oransal-integral-türev (PID) sistemi 'için istenen protokol deneyimli kuvvet sıkma için' sağlar.

Video: Force-Clamp Rheometry for Characterizing Protein-based Hydrogels

Preparation of Complaint Matrices for Quantifying Cellular Contraction

The regulation of cellular adhesion to the extracellular matrix (ECM) is essential for cell migration and ECM remodeling. Focal adhesions are macromolecular assemblies that couple the contractile F-actin cytoskeleton to the ECM. This connection allows for the transmission of intracellular mechanical forces across the cell membrane to the underlying substrate. Recent work has shown the mechanical properties of the ECM regulate focal adhesion and F-actin morphology as well as numerous physiological processes, including cell differentiation, division, proliferation and migration. Thus, the use of cell culture substrates has become an increasingly prevalent method to precisely control and modulate ECM mechanical properties.
To quantify traction forces at focal adhesions in an adherent cell, compliant substrates are used in conjunction with high-resolution imaging and computational techniques in a method termed traction force microscopy (TFM). This technique relies on measurements of the local magnitude and direction of substrate deformations induced by cellular contraction. In combination with high-resolution fluorescence microscopy of fluorescently tagged proteins, it is possible to correlate cytoskeletal organization and remodeling with traction forces.
Here we present a detailed experimental protocol for the preparation of two-dimensional, compliant matrices for the purpose of creating a cell culture substrate with a well-characterized, tunable mechanical stiffness, which is suitable for measuring cellular contraction. These protocols include the fabrication of polyacrylamide hydrogels, coating of ECM proteins on such gels, plating cells on gels, and high-resolution confocal microscopy using a perfusion chamber. Additionally, we provide a representative sample of data demonstrating location and magnitude of cellular forces using cited TFM protocols.

In this video, we demonstrate the experimental techniques used to fabricate compliant, extracellular matrix (ECM) coated substrates suitable for cell culture, and which are amenable to traction force microscopy and observing effects of ECM stiffness on cell behavior.

Hücresel Daralma miktarının Şikayet Matrisler hazırlanması

The regulation of cellular adhesion to the extracellular matrix (ECM) is essential for cell migration and ECM remodeling.  Focal adhesions are ...

Biyomühendislik

Easy Manipulation of Architectures in Protein-based Hydrogels for Cell Culture Applications

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field of 3D templates is rising due to the potential resemblance of those materials to the natural extracellular matrix. Protein-based hydrogels are particularly promising because they can easily be functionalized and can achieve defined structures with adjustable physicochemical properties. However, the production of macroporous 3D templates for cell culture applications using natural materials is often limited by their weaker mechanical properties compared to those of synthetic materials. Here, different methods were evaluated to produce macroporous bovine serum albumin (BSA)-based hydrogel systems, with adjustable pore sizes in the range of 10 to 70 &#181;m in radius. Furthermore, a method to generate channels in this protein-based material that are several hundred microns long was established. The different methods to produce pores, as well as the influence of pore size on material properties such as swelling ratio, pH, temperature stability, and enzymatic degradation behavior, were analyzed. Pore sizes were investigated in the native, swollen state of the hydrogels using confocal laser scanning microscopy. The feasibility for cell culture applications was evaluated using a cell-adhesive RGD peptide modification of the protein system and two model cell lines: human breast cancer cells (A549) and adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cells (MCF7).

Different methods to manipulate three-dimensional architecture in protein-based hydrogels are evaluated here with respect to material properties. The macroporous networks are functionalized with a cell-adhesive peptide, and their feasibility in cell culture is evaluated using two different model cell lines.

Protein bazlı Hydrogels mimarilerde kolayca idare hücre kültür uygulamaları için

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field ...

Biyokimya

Combining Microfluidics and Microrheology to Determine Rheological Properties of Soft Matter during Repeated Phase Transitions

The microstructure of soft matter directly impacts macroscopic rheological properties and can be changed by factors including colloidal rearrangement during previous phase changes and applied shear. To determine the extent of these changes, we have developed a microfluidic device that enables repeated phase transitions induced by exchange of the surrounding fluid and microrheological characterization while limiting shear on the sample. This technique is &#181;2rheology, the combination of microfluidics and microrheology. The microfluidic device is a two-layer design with symmetric inlet streams entering a sample chamber that traps the gel sample in place during fluid exchange. Suction can be applied far away from the sample chamber to pull fluids into the sample chamber. Material rheological properties are characterized using multiple particle tracking microrheology (MPT). In MPT, fluorescent probe particles are embedded into the material and the Brownian motion of the probes is recorded using video microscopy. The movement of the particles is tracked and the mean-squared displacement (MSD) is calculated. The MSD is related to macroscopic rheological properties, using the Generalized Stokes-Einstein Relation. The phase of the material is identified by comparison to the critical relaxation exponent, determined using time-cure superposition. Measurements of a fibrous colloidal gel illustrate the utility of the technique. This gel has a delicate structure that can be irreversibly changed when shear is applied. &#181;2rheology data shows that the material repeatedly equilibrates to the same rheological properties after each phase transition, indicating that phase transitions do not play a role in microstructural changes. To determine the role of shear, samples can be sheared prior to injection into our microfluidic device. &#181;2rheology is a widely applicable technique for the characterization of soft matter enabling the determination of rheological properties of delicate microstructures in a single sample during phase transitions in response to repeated changes in the surrounding environmental conditions.

We demonstrate the fabrication and use of a microfluidic device that enables multiple particle tracking microrheology measurements to study the rheological effects of repeated phase transitions on soft matter.

Havacilik ve Microrheology tekrarlanan faz geçişleri sırasında yumuşak madde Rheological özellikleri belirlemek için birleştirme

The microstructure of soft matter directly impacts macroscopic rheological properties and can be changed by factors including colloidal rearrangement ...

Mühendislik

Sample Preparation in Quartz Crystal Microbalance Measurements of Protein Adsorption and Polymer Mechanics

In this study, we present various examples of how thin film preparation for quartz crystal microbalance experiments informs the appropriate modeling of the data and determines which properties of the film can be quantified. The quartz crystal microbalance offers a uniquely sensitive platform for measuring fine changes in mass and/or mechanical properties of an applied film by observing the changes in mechanical resonance of a quartz crystal oscillating at high frequency. The advantages of this approach include its experimental versatility, ability to study changes in properties over a wide range of experimental time lengths, and the use of small sample sizes. We demonstrate that, based on the thickness and shear modulus of the layer deposited on the sensor, we can acquire different information from the material. Here, this concept is specifically exploited to display experimental parameters resulting in mass and viscoelastic calculations of adsorbed collagen on gold and polyelectrolyte complexes during swelling as a function of salt concentration.

The quartz crystal microbalance can provide accurate mass and viscoelastic properties for films in the micron or submicron range, which is relevant for investigations in biomedical and environmental sensing, coatings, and polymer science. The sample thickness influences which information can be obtained from the material in contact with the sensor.

Protein Adsorpsiyon ve Polimer Mekaniğinin Kuvars Kristal Mikroterazi Ölçümlerinde Örnek Hazırlama

In this study, we present various examples of how thin film preparation for quartz crystal microbalance experiments informs the appropriate modeling of ...

Kimya

The Synthesis of RGD-functionalized Hydrogels as a Tool for Therapeutic Applications

The use of polymers as biomaterials has provided significant advantages in therapeutic applications. In particular, the possibility to modify and functionalize polymer chains with compounds that are able to improve biocompatibility, mechanical properties, or cell viability allows the design of novel materials to meet new challenges in the biomedical field. With the polymer functionalization strategies, click chemistry is a powerful tool to improve cell-compatibility and drug delivery properties of polymeric devices. Similarly, the fundamental need of biomedicine to use sterile tools to avoid potential adverse-side effects, such as toxicity or contamination of the biological environment, gives rise to increasing interest in the microwave-assisted strategy.
The combination of click chemistry and the microwave-assisted method is suitable to produce biocompatible hydrogels with desired functionalities and improved performances in biomedical applications. This work aims to synthesize RGD-functionalized hydrogels. RGD (arginylglycylaspartic acid) is a tripeptide that can mimic cell adhesion proteins and bind to cell-surface receptors, creating a hospitable microenvironment for cells within the 3D polymeric network of the hydrogels. RGD functionalization occurs through Huisgen 1,3-dipolar cycloaddition. Some PAA carboxyl groups are modified with an alkyne moiety, whereas RGD is functionalized with azido acid as the terminal residue of the peptide sequence. Finally, both products are used in a copper catalyzed click reaction to permanently link the peptide to PAA. This modified polymer is used with carbomer, agarose and polyethylene glycol (PEG) to synthesize a hydrogel matrix. The 3D structure is formed due to an esterification reaction involving carboxyl groups from PAA and carbomer and hydroxyl groups from agarose and PEG through microwave-assisted polycondensation. The efficiency of the gelation mechanism ensures a high degree of RGD functionalization. In addition, the procedure to load therapeutic compounds or biological tools within this functionalized network is very simple and reproducible.

We present a protocol for the synthesis of RGD-functionalized hydrogels as devices for cell and drug delivery. The procedure involves copper catalyzed alkyne-azide cycloaddition (CuAAC) between alkyne-modified polyacrylic acid (PAA) and a RGD-azide derivative. The hydrogels are formed using microwave-assisted polycondensation and their physicochemical properties are investigated.

Tedavi Uygulamaları için bir alet olarak RGD-fonksiyonelleştirilmiş Hidrojeller Sentezi

The use of polymers as biomaterials has provided significant advantages in therapeutic applications. In particular, the possibility to modify and ...

DNA Nanotubes as a Versatile Tool to Study Semiflexible Polymers

Mechanical properties of complex, polymer-based soft matter, such as cells or biopolymer networks, can be understood in neither the classical frame of flexible polymers nor of rigid rods. Underlying filaments remain outstretched due to their non-vanishing backbone stiffness, which is quantified via the persistence length (lp), but they are also subject to strong thermal fluctuations. Their finite bending stiffness leads to unique, non-trivial collective mechanics of bulk networks, enabling the formation of stable scaffolds at low volume fractions while providing large mesh sizes. This underlying principle is prevalent in nature (e.g., in cells or tissues), minimizing the high molecular content and thereby facilitating diffusive or active transport. Due to their biological implications and potential technological applications in biocompatible hydrogels, semiflexible polymers have been subject to considerable study. However, comprehensible investigations remained challenging since they relied on natural polymers, such as actin filaments, which are not freely tunable. Despite these limitations and due to the lack of synthetic, mechanically tunable, and semiflexible polymers, actin filaments were established as the common model system. A major limitation is that the central quantity lp cannot be freely tuned to study its impact on macroscopic bulk structures. This limitation was resolved by employing structurally programmable DNA nanotubes, enabling controlled alteration of the filament stiffness. They are formed through tile-based designs, where a discrete set of partially complementary strands hybridize in a ring structure with a discrete circumference. These rings feature sticky ends, enabling the effective polymerization into filaments several microns in length, and display similar polymerization kinetics as natural biopolymers. Due to their programmable mechanics, these tubes are versatile, novel tools to study the impact of lp on the single-molecule as well as the bulk scale. In contrast to actin filaments, they remain stable over weeks, without notable degeneration, and their handling is comparably straightforward.

Semiflexible polymers display unique mechanical properties that are extensively applied by living systems. However, systematic studies on biopolymers are limited since properties such as polymer rigidity are inaccessible. This manuscript describes how this limitation is circumvented by programmable DNA nanotubes, enabling experimental studies on the impact of filament rigidity.

DNA nanotüpler Semiflexible polimerler eğitim için çok yönlü bir araç olarak

Mechanical properties of complex, polymer-based soft matter, such as cells or biopolymer networks, can be understood in neither the classical frame of ...

Characterizing Multiscale Mechanical Properties of Brain Tissue Using Atomic Force Microscopy, Impact Indentation, and Rheometry

To design and engineer materials inspired by the properties of the brain, whether for mechanical simulants or for tissue regeneration studies, the brain tissue itself must be well characterized at various length and time scales. Like many biological tissues, brain tissue exhibits a complex, hierarchical structure. However, in contrast to most other tissues, brain is of very low mechanical stiffness, with Young&#39;s elastic moduli E on the order of 100s of Pa. This low stiffness can present challenges to experimental characterization of key mechanical properties. Here, we demonstrate several mechanical characterization techniques that have been adapted to measure the elastic and viscoelastic properties of hydrated, compliant biological materials such as brain tissue, at different length scales and loading rates. At the microscale, we conduct creep-compliance and force relaxation experiments using atomic force microscope-enabled indentation. At the mesoscale, we perform impact indentation experiments using a pendulum-based instrumented indenter. At the macroscale, we conduct parallel plate rheometry to quantify the frequency dependent shear elastic moduli. We also discuss the challenges and limitations associated with each method. Together these techniques enable an in-depth mechanical characterization of brain tissue that can be used to better understand the structure of brain and to engineer bio-inspired materials.

We present a set of techniques to characterize the viscoelastic mechanical properties of brain at the micro-, meso-, and macro-scales.

Atomik Kuvvet Mikroskobu, Darbe girinti ve reometre kullanarak Beyin Doku Ölçekli Mekanik Özellikleri karakterize

To design and engineer materials inspired by the properties of the brain, whether for mechanical simulants or for tissue regeneration studies, the brain ...

Nörobilim

<meta charset="utf8"></head><body> Peptit Hidrojeller: ECF-5'in Çevreye Duyarlı Jelasyonu için Yöntemler

Preparation of Mechanically Stable Self-Assembled Peptides Hydrogels

Peptide hydrogels are highly hydrophilic, three-dimensional network gels formed by the self-assembly of nanofibers or polymers, creating water-locking networks. Their morphology closely resembles that of the extracellular matrix, allowing them to exhibit both the biological functions of peptides and responsive gelation properties. These unique characteristics have led to their extensive application in tissue engineering, three-dimensional cell culture, cancer therapy, regenerative medicine, and other biomedical fields. This article describes three methods for preparing ECF-5 peptide hydrogels using self-assembling peptides with environmentally responsive gelation processes: (1) pH-responsive gelation: varying pH levels induce the protonation or deprotonation of amino acid residues, altering electrostatic interactions between peptide molecules and promoting their self-assembly into hydrogels; (2) Metal ion addition: polyvalent metal ions chelate with negatively charged amino acid residues, acting as bridges between peptides to form a network hydrogel; (3) Solvent exchange: hydrophobic peptides are initially dissolved in non-polar organic solvents and subsequently induce self-assembly into hydrogels upon transitioning to a polar aqueous environment. These methods utilize conventional experimental procedures to facilitate peptide self-assembly into hydrogels. By designing peptide sequences to align with specific gelation-inducing conditions, it is possible to achieve finely tuned micro/nanostructures and biological functions, highlighting the significant potential of peptide hydrogels in the biomedical domain.

<meta charset="utf8"></head><body>Yazar Spot Işığı: Üstün Biyouyumluluk için Kendi Kendine Birleşen Liflerin ve Peptit Hidrojellerin Üretiminin İyileştirilmesi

This protocol presents three fast and simple preparation methods that use environmental conditions to trigger the self-assembly of peptides into hydrogels. Additionally, the characterization of peptide hydrogels is described, demonstrating that mechanically stable peptide hydrogels can be formed under these straightforward conditions.

Mekanik Olarak Kararlı Kendinden Montajlı Peptitler Hidrojellerin Hazırlanması

Peptide hydrogels are highly hydrophilic, three-dimensional network gels formed by the self-assembly of nanofibers or polymers, creating water-locking ...

Protein Bazlı Hydrogels karakterize için kuvvet-kelepçe Rheometry

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Hücresel Daralma miktarının Şikayet Matrisler hazırlanması

Protein bazlı Hydrogels mimarilerde kolayca idare hücre kültür uygulamaları için

Havacilik ve Microrheology tekrarlanan faz geçişleri sırasında yumuşak madde Rheological özellikleri belirlemek için birleştirme

Protein Adsorpsiyon ve Polimer Mekaniğinin Kuvars Kristal Mikroterazi Ölçümlerinde Örnek Hazırlama

Tedavi Uygulamaları için bir alet olarak RGD-fonksiyonelleştirilmiş Hidrojeller Sentezi

DNA nanotüpler Semiflexible polimerler eğitim için çok yönlü bir araç olarak

Atomik Kuvvet Mikroskobu, Darbe girinti ve reometre kullanarak Beyin Doku Ölçekli Mekanik Özellikleri karakterize

Mekanik Olarak Kararlı Kendinden Montajlı Peptitler Hidrojellerin Hazırlanması

Mekanik Olarak Kararlı Kendinden Montajlı Peptitler Hidrojellerin Hazırlanması

Mekanik Olarak Kararlı Kendinden Montajlı Peptitler Hidrojellerin Hazırlanması