Yazarlar Bakalorya bilim programı Postane ve Novartis Enstitüleri Bu çalışmada finansmanı için bir bütün olarak Biyomedikal araştırma için teşekkür etmek istiyorum.

1. hücre hazırlanması
Not: NR1 ve NR2A hücreleri kodlama bir baculovirus ile transduced HEK293 hücreleri veri üretimi, dahil olmak üzere bu protokolü kullanır.
<ol><li>HEK293 hücreler uygun sayıda tohum ve NR1 ve/veya NR2A virüs uygun son konsantrasyonları (1.00 her µL) ekleyin. 384-şey plaka için 10.000 30 µL son bir hacim içinde hücre/iyi kullanın.</li>
	<li>Alternatif olarak, tohum HEK293-NR1-NR2A hücreleri uygun cep telefonu numarasını ve birim (384-şey plaka, kullanım 10.000 hücre/kuyuda son hacmi 30 µL için). Tetrasiklin bir konsantrasyon 2 µg/mL NR2A ifade teşvik ve bileşik koruma eklemek için Ekle (100 µM MDL105, 519 veya 5 mikron CGP07066724).</li>
	<li>Not: NR1 ve NR2 kodlama baculovirus 5 x 109 - 10 x 109 bulaşıcı mililitre24birim arasında yaklaşık bir titresi olmalıdır.</li>
</ol>2. NMDA reseptör etkinlik ölçümü
<ol><li>384-şey plaka ya da koruyucu bileşik huzurunda NR1/NR2 veya HEK293-NR1-NR2A hücreleri ile transduced HEK293 hücreleri ile hazır olun. Bir açık alt, siyah çerçeve, poli-D-lizin boyalı tabak kullanın. Not: Koruma 100 µM ile MDL105, 519 glisin, 5 mikron ise duyarlılık görüşmek için kullanılır CGP070667 glutamat duyarlılık görüşmek için kullanılır.</li>
	<li>Plaka 37 ° C ve % 5 CO2 (gece) on altı saat kuluçkaya.</li>
	<li>Plaka da kuluçka kaldır ve yavaşça hücre medya plaka uyumlu Biyoatik konteyner üzerinde saygısız yavaşlatarak atın. Plaka basına kapalı plaka kenarlarını temizlemek ve kalan herhangi bir medya drenaj için kağıt havlu üzerine hafifçe dokunun.</li>
	<li>Calcium6 boya calcium6 boya (1 plaka boyutu) bir şişe çözücü tarafından 10 mL kuluçka arabellek (HBSS pH 7.5, 20 mM HEPES, 1 mM MgCl2, 1 mM Probenesid) hazırlayın. 2 saat 37 ° C ve % 5 CO2plaka kuluçkaya.</li>
	<li>Plaka da kuluçka kaldırmak ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca ayarlamak hücreleri izin.</li>
	<li>Yavaşça 2.3 adımda anlatıldığı gibi calcium6-boya dökmek ve tahlil arabelleği (HBSS pH 7.5, 20 mM HEPES, 1.8 mM CaCl2, 1 mM Probenesid) 30 µL ekleyin.</li>
	<li>2.6 iki kez olmak üzere toplam 3 yıkar, adımları yineleyin. Tahlil arabelleği 30 µL hücreleri üzerinde son yıkama sonra bırakın.</li>
	<li>Oda sıcaklığında 5 dakika dinlenme hücreleri izin.</li>
	<li>Ligand plaka 400 µM glisin ve 400 µM glutamat (100 µM son konsantrasyonu; aşağıda açıklandığı gibi belirlenecek ligandlar en iyi konsantrasyon) 4-fold bir stok yaparak hazırlamak. En az 25 µL ligand stokunun bir V-alt 384-şey plaka aktarın.</li>
	<li>Ligand plaka ve hücre plaka FDSS (fonksiyonel uyuşturucu eleme sistemi) yerleştirin.</li>
	<li>Temel Floresan (Fo) hücre plaka 30 saniye için ölçmek. 10 µL ligand stokunun FDSS dağıtım işlevini ve ölçü kalsiyum akı calcium6-boya floresans 5 dakika kaydederek kullanarak hücre plaka içine aktarın.</li>
	<li>Temel Floresan (Fmax/Fo) tarafından elde edilen maksimal floresans bölerek maksimal floresans oranını hesaplamak.</li>
</ol>3. NMDAR ifade düzey optimizasyon
<ol><li>Baculovirus kullanmak için en uygun miktarını belirlemek için bir titrasyon NR1 ve NR2A virüslerin gerçekleştirin. HEK293 hücreler (10.000 hücre/iyi tavsiye, medya 30 µL) 384-şey plakalı hazırlamak ve 2.1 adımda anlatıldığı gibi koruma bileşikleri içerir.</li>
	<li>NR1 virüs değişen miktarlarda plaka farklı satırları ekleyin (örneğin: 0 µL, 2 µL, 1 µL, 0.5 µL, 0,25 µL satırları AE sırasıyla Ekle). Veri doğruluğunu çoğaltmaları ekleyin.</li>
	<li>NR2A virüs değişen miktarlarda plaka farklı sütunlar ekleyin (örneğin: 0 µL, 2 µL, 1 µL, 0.5 µL, 0,25 µL satırları AE sırasıyla Ekle). Veri doğruluğunu çoğaltmaları ekleyin.</li>
	<li>Plaka 37 ° C ve % 5 CO2 (gece) on altı saat kuluçkaya.</li>
	<li>En iyi oranı ve NR1 ve NR2A virüs miktarı FDSS (yukarı bakın) kalsiyum akı ölçüm gerçekleştirerek belirler.</li>
</ol>4. ligand titrasyon
<ol><li>Hücreleri 2.3. adımda açıklandığı şekilde hazırlayın.</li>
	<li>Her ligand konsantrasyonu (100 µM) doyurarak huzurunda dilutions 4-fold hisse senedi çözüm olarak diğer ligand hazırlayın. Örneğin: bir 10 µM son test konsantrasyon glisin için glisin 400 µM glutamat dahil olmak üzere 40 µM stok çözeltisi hazırlamak.</li>
	<li>2.11. adımda açıklandığı gibi FDSS ölçüm ile devam edin.</li>
</ol>5. test bileşik
<ol><li>1. adımda açıklandığı şekilde hücreleri hazırlayın.</li>
	<li>Son ligand konsantrasyonu tahlil arabellekte bir 5-fold hazır ligand plakalı hazırlayın.</li>
	<li>Bileşikler plaka tahlil arabellekte bileşiklerin istenen son konsantrasyonunun 4-fold hisse senedi ile hazırlayın. Bir son bileşik konsantrasyon tahlil arabelleğinde 10 µM için 40 µM hisse senedi çözüm hazırlamak.<ol>
<li>Dimetil sülfoksit (DMSO) konsantrasyonu daha fazla seyreltme tahlil arabellek içine önce DMSO bahçedeki öncesi bir seyreltme hazırlayarak tüm örnekler üzerindeki sabit tutmak.</li>
		<li>Bahçedeki 3 ve 30 µM arasında değişen son tahlil bir doz yanıt için 1'den 10 mM den kadar DMSO bahçedeki öncesi bir seyreltme hazırlayın. Bu 4-fold hisse senedi toplama için tahlil arabellekte oranında seyreltin. DMSO son konsantrasyonu % 0.5 aşmaması gerekir. Not: Bu triplicates içinde her bir örneği test etmek için tavsiye edilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ligand, bileşik ve hücre plaka FDSS yükleyin.</li>
	<li>30 saniye için temel floresans ölçmek.</li>
	<li>Bileşik stokunun 10 µL ekleyin ve 5 dakika floresans ölçmek.</li>
	<li>Ligand stokunun 10 µL ekleyin ve 5 dakika floresans ölçmek.</li>
	<li>Ölçüm son 5 dakika boyunca floresan oranları eğri altındaki alan hesaplayarak floresans oranı integrali belirlemek. Not: Alternatif olarak, floresans ligand ek sonra maksimal oranı analiz için kullanılabilir.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Farrall, A. J., Wardlaw, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier:+ageing+and+microvascular+disease--systematic+review+and+meta-analysis.">Blood-brain barrier: ageing and microvascular disease--systematic review and meta-analysis.</a> Neurobiology of Aging. 30 (3), 337-352 (2009).</li><li>Walhovd, K. B., Fjell, A. M., Espeseth, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cognitive+decline+and+brain+pathology+in+aging--need+for+a+dimensional,+lifespan+and+systems+vulnerability+view.">Cognitive decline and brain pathology in aging--need for a dimensional, lifespan and systems vulnerability view.</a> Scandinavian Journal of Psychology. 55 (3), 244-254 (2014).</li><li>Wittchen, H. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+size+and+burden+of+mental+disorders+and+other+disorders+of+the+brain+in+Europe+2010.">The size and burden of mental disorders and other disorders of the brain in Europe 2010.</a> European Neuropsychopharmacology. 21 (9), 655-679 (2011).</li><li>Traynelis, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+receptor+ion+channels:+structure,+regulation,+and+function.">Glutamate receptor ion channels: structure, regulation, and function.</a> Pharmacological Reviews. 62 (3), 405-496 (2010).</li><li>Mony, L., Kew, J. N., Gunthorpe, M. J., Paoletti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+modulators+of+NR2B-containing+NMDA+receptors:+molecular+mechanisms+and+therapeutic+potential.">Allosteric modulators of NR2B-containing NMDA receptors: molecular mechanisms and therapeutic potential.</a> British Journal of Pharmacology. 157 (8), 1301-1317 (2009).</li><li>Lau, C. G., Zukin, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptor+trafficking+in+synaptic+plasticity+and+neuropsychiatric+disorders.">NMDA receptor trafficking in synaptic plasticity and neuropsychiatric disorders.</a> Nature Reviews Neuroscience. 8 (6), 413-426 (2007).</li><li>Zhou, Q., Sheng, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptors+in+nervous+system+diseases.">NMDA receptors in nervous system diseases.</a> Neuropharmacology. 74, 69-75 (2013).</li><li>Paoletti, P., Bellone, C., Zhou, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptor+subunit+diversity:+impact+on+receptor+properties,+synaptic+plasticity+and+disease.">NMDA receptor subunit diversity: impact on receptor properties, synaptic plasticity and disease.</a> Nature Reviews Neuroscience. 14, 383 (2013).</li><li>Sanz-Clemente, A., Nicoll, R. A., Roche, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversity+in+NMDA+receptor+composition:+many+regulators,+many+consequences.">Diversity in NMDA receptor composition: many regulators, many consequences.</a> Neuroscientist. 19 (1), 62-75 (2013).</li><li>Neyton, J., Paoletti, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relating+NMDA+receptor+function+to+receptor+subunit+composition:+limitations+of+the+pharmacological+approach.">Relating NMDA receptor function to receptor subunit composition: limitations of the pharmacological approach.</a> Journal of Neuroscience. 26 (5), 1331-1333 (2006).</li><li>Hunt, D. L., Castillo, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+plasticity+of+NMDA+receptors:+mechanisms+and+functional+implications.">Synaptic plasticity of NMDA receptors: mechanisms and functional implications.</a> Current Opinion in Neurobiology. 22 (3), 496-508 (2012).</li><li>Huganir, R. L., Nicoll, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPARs+and+synaptic+plasticity:+the+last+25+years.">AMPARs and synaptic plasticity: the last 25 years.</a> Neuron. 80 (3), 704-717 (2013).</li><li>Shimomura, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycine+plays+a+crucial+role+as+a+co-agonist+of+NMDA+receptors+in+the+neuronal+circuit+generating+body+movements+in+rat+fetuses.">Glycine plays a crucial role as a co-agonist of NMDA receptors in the neuronal circuit generating body movements in rat fetuses.</a> Neuroscience Research. 97, 13-19 (2015).</li><li>Tajima, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+NMDA+receptors+and+the+mechanism+of+inhibition+by+ifenprodil.">Activation of NMDA receptors and the mechanism of inhibition by ifenprodil.</a> Nature. 534 (7605), 63-68 (2016).</li><li>Mayer, M. L., Westbrook, G. L., Guthrie, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-dependent+block+by+Mg2++of+NMDA+responses+in+spinal+cord+neurones.">Voltage-dependent block by Mg2+ of NMDA responses in spinal cord neurones.</a> Nature. 309 (5965), 261-263 (1984).</li><li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+NMDA+Receptor+Inhibition+and+Activation.">Mechanism of NMDA Receptor Inhibition and Activation.</a> Cell. 165 (3), 704-714 (2016).</li><li>Yildiz-Unal, A., Korulu, S., Karabay, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroprotective+strategies+against+calpain-mediated+neurodegeneration.">Neuroprotective strategies against calpain-mediated neurodegeneration.</a> Neuropsychiatric Disease and Treatment. 11, 297-310 (2015).</li><li>Gascon, S., Sobrado, M., Roda, J. M., Rodriguez-Pena, A., Diaz-Guerra, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excitotoxicity+and+focal+cerebral+ischemia+induce+truncation+of+the+NR2A+and+NR2B+subunits+of+the+NMDA+receptor+and+cleavage+of+the+scaffolding+protein+PSD-95.">Excitotoxicity and focal cerebral ischemia induce truncation of the NR2A and NR2B subunits of the NMDA receptor and cleavage of the scaffolding protein PSD-95.</a> Molecular Psychiatry. 13 (1), 99-114 (2008).</li><li>Uttara, B., Singh, A. V., Zamboni, P., Mahajan, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+stress+and+neurodegenerative+diseases:+a+review+of+upstream+and+downstream+antioxidant+therapeutic+options.">Oxidative stress and neurodegenerative diseases: a review of upstream and downstream antioxidant therapeutic options.</a> Current Neuropharmacology. 7 (1), 65-74 (2009).</li><li>Hansen, K. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implementation+of+a+fluorescence-based+screening+assay+identifies+histamine+H3+receptor+antagonists+clobenpropit+and+iodophenpropit+as+subunit-selective+N-methyl-D-aspartate+receptor+antagonists.">Implementation of a fluorescence-based screening assay identifies histamine H3 receptor antagonists clobenpropit and iodophenpropit as subunit-selective N-methyl-D-aspartate receptor antagonists.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 333 (3), 650-662 (2010).</li><li>Bettini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+novel+NMDA+receptor+antagonists+selective+for+NR2A-+over+NR2B-containing+receptors.">Identification and characterization of novel NMDA receptor antagonists selective for NR2A- over NR2B-containing receptors.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 335 (3), 636-644 (2010).</li><li>Feuerbach, D., Loetscher, E., Neurdin, S., Koller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+pharmacology+of+the+human+NMDA-receptor+subtypes+R1-2A,+R1-2B,+R1-2C+and+R1-2D+using+an+inducible+expression+system.">Comparative pharmacology of the human NMDA-receptor subtypes R1-2A, R1-2B, R1-2C and R1-2D using an inducible expression system.</a> European Journal of Pharmacology. 637 (1-3), 46-54 (2010).</li><li>Hansen, K. B., Brauner-Osborne, H., Egebjerg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmacological+characterization+of+ligands+at+recombinant+NMDA+receptor+subtypes+by+electrophysiological+recordings+and+intracellular+calcium+measurements.">Pharmacological characterization of ligands at recombinant NMDA receptor subtypes by electrophysiological recordings and intracellular calcium measurements.</a> Combinatorial Chemistry and High Throughput Screening. 11 (4), 304-315 (2008).</li><li>Guo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+NMDA-receptor+calcium+influx+assay+sensitive+to+stimulation+by+glutamate+and+glycine/D-serine.">A NMDA-receptor calcium influx assay sensitive to stimulation by glutamate and glycine/D-serine.</a> Scientific Reports. 7 (1), 11608 (2017).</li><li>Hackos, D. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+Allosteric+Modulators+of+GluN2A-Containing+NMDARs+with+Distinct+Modes+of+Action+and+Impacts+on+Circuit+Function.">Positive Allosteric Modulators of GluN2A-Containing NMDARs with Distinct Modes of Action and Impacts on Circuit Function.</a> Neuron. 89 (5), 983-999 (2016).</li><li>Romero-Hernandez, A., Furukawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Mode+of+Antagonist+Binding+in+NMDA+Receptors+Revealed+by+the+Crystal+Structure+of+the+GluN1-GluN2A+Ligand-Binding+Domain+Complexed+to+NVP-AAM077.">Novel Mode of Antagonist Binding in NMDA Receptors Revealed by the Crystal Structure of the GluN1-GluN2A Ligand-Binding Domain Complexed to NVP-AAM077.</a> Molecular Pharmacology. 92 (1), 22-29 (2017).</li><li>Auberson, Y. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=5-Phosphonomethylquinoxalinediones+as+competitive+NMDA+receptor+antagonists+with+a+preference+for+the+human+1A/2A,+rather+than+1A/2B+receptor+composition.">5-Phosphonomethylquinoxalinediones as competitive NMDA receptor antagonists with a preference for the human 1A/2A, rather than 1A/2B receptor composition.</a> Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters. 12 (7), 1099-1102 (2002).</li><li>Danysz, W., Parsons, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycine+and+N-methyl-D-aspartate+receptors:+physiological+significance+and+possible+therapeutic+applications.">Glycine and N-methyl-D-aspartate receptors: physiological significance and possible therapeutic applications.</a> Pharmacological Reviews. 50 (4), 597-664 (1998).</li><li>Liu, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Topoisomerase+II+Inhibitors+Can+Enhance+Baculovirus-Mediated+Gene+Expression+in+Mammalian+Cells+through+the+DNA+Damage+Response.">Topoisomerase II Inhibitors Can Enhance Baculovirus-Mediated Gene Expression in Mammalian Cells through the DNA Damage Response.</a> International Journal of Molecular Science. 17 (6), (2016).</li></ol>

Yazarlar hiçbir çıkar çatışmaları ve ifşa etmek bir şey yok.

Bu tahlil başarısı büyük ölçüde kullanılan HEK hücre sağlık üzerinde bağlıdır. Hücreleri üstel büyüme geçiyor ve düşük geçiş numarası ile kullanılmalıdır. Bu tahlil birçok transferleri içerir ve eklemeler çözümleri, çok dikkatli kullanarak sonuçları daha yüksek doğruluk sağlayacaktır. Bileşikler ve diğer kimyasalları konsantrasyonları da çapraz-hatalarını en aza indirmek için kontrol olmalıdır. Böylece hücreleri değil ayırmak hücre medya kalsiyum akı tahlil için tahlil arabelleği ile değiştirirken, plaka hafifçe eğik. Son olarak, bu iletişim kuralını poli-D-lizin kaplı levha kullanımı hücreleri ek plaka artırır.
NMDAR ifade farklılıkları ve virüs iletim zaman bağlı olarak geçiş sayısı ve fitness HEK293 hücre alt birimi ifade için gerekli miktarda olabilir. Ayrıca, baculovirus altı aydan bir yıla kadar uzanan kısa bir raf ömrüne sahiptir. Bu nedenle, virüs kalitesini bu tahlil için önemli bir parametredir. Standart ayirt tahlil algılamak ve ifade düzeyleri ve yerelleştirme daha fazla deney24önce NMDAR birimlerinin onaylamak için kullanılabilir. Diğer hücre hatları bu iletişim kuralını kullanan NMDA reseptör eğitim için kullanılabilir. Ancak, hoşgörü ve baculovirus kullanarak NMDARs ifade protokolü ile devam etmeden önce onaylanmalıdır; Aksi halde, beklenmedik sonuçlar oluşabilir. Ayrıca, bileşikler topoizomeraz II inhibitörleri gibi baculovirus ifade29etkinliğini artırmak için rapor edilmiştir. Bu alternatifler test ve kullanıcının tercihlerine göre en iyi duruma getirilmiş.
Orijinal hücre tipi farklı bir hücre tür biyolojik süreçleri çalışmanın bilimsel topluluk içinde soru yükseltir. Bu testin bir sınırlama ionotropic glutamat reseptör NMDAR çalışmaya modeli sistemi böbrek hücre hatları (HEK 293) kullanımıdır. HEK hücreleri depolarized nöronlar için benzer depolarized membran potansiyeli nedeniyle kullanılmıştır. Buna ek olarak, NMDARs beyin ve bizim modeli arasındaki benzerliği ek çalışmalarımız tarafından onaylanır. Olumlu allosteric modülatörler GNE-8324 gibi ifenprodil gibi olumsuz modülatörler ve kanal blokerleri ketamin gibi aktivite, hem de NMDAR, gerilim bağımlılığı tüm doğruladı bizim modeli22,23 ' te ,24. Ayrıca, bizim yetenek NR1 ve NR2A alt birimleri için virüs miktarını ayarlamak için en uygun işlev ifade düzeyleri sağlar.
Düşük verimlilik, yüksek maliyet ve en az başarı sonucu nedeniyle, bireysel reseptörleri ve kendi benzersiz Farmakoloji karakterizasyonu Şu anda düşük işlem hacmi el ile yama-kelepçe deneyleri22,23' yaptı. Stabil kullanarak hücreleri, transfected fonksiyonel NMDARs overexpression hücre medya18serbest bırakılır ligandlar (glutamat ve glisin/D-serin) nedeniyle zararlı olduğundan öte yandan, excitotoxicity büyük bir engel olarak kalır. Daha güçlü bir alternatif olarak, excitotoxicity üstesinden gelir ve hızlı, titratable ifade reseptörlerinin verir baculovirus-aracılı ifadesi, fonksiyonel NMDARs, bizim tahlil kullanır. Kanal blokerleri yapışkan doğası gereği ile sınırlı olmak yerine, bu tahlil de zayıf ligand bağlayıcı siteleri antagonistleri yararlanır. Bu antagonistleri endojen ligandlar medya ile rekabet ve ligand bağlayıcı siteleri korumak. Bu nedenle, sonra silinerek geçiş antagonistleri, duyarlılık exogenously eklendi ligandlar glutamat ve glisin/D-serin-bağlayıcı siteleri için geri yüklenir.
Moleküler biyoloji gibi CRISPR, son gelişmeler ile birlikte bu tahlil, hedef yardımcı olacak ve NMDAR ifade ve işlev roman düzenleyiciler karakterize. Aynı anda, bu tahlil NMDAR faaliyet sağlam hücre hatları, böylece genetik ve küçük molekül bazlı ekranlar ile uyumluluk sağlayan oluşturmak için gerek kalmadan doğrudan veya dolaylı olarak modüle küçük moleküller tanımlanmasına yardımcı olacak.

Tıpta güncel gelişmeler ile yaşam süresi önemli ölçüde artmıştır; Ancak, çok yaşa bağlı hastalıkların yaygınlığı var. Şizofreni, amyotrofik lateral skleroz (ALS), Alzheimer hastalığı ve Parkinson hastalığı, diğerleri arasında gibi merkezi sinir sistemi (MSS) hastalıkları bir istisna vardır ve sonraki on yıl1, artırmak için öngörülen 2 , 3. N-metil-D-aspartat reseptör (NMDAR) bilinen ionotropic glutamat reseptörlerinin arıza Alzheimer hastalığı, şizofreni, travmatik beyin hasarı, felç, diyabet ve yasalar tarafından aksi gerekmekdikçe glokom diğerlerinin yanı sıra, bağlı biyolojilerinin etkili, hastalığı değiştirme tedaviler4,5,6,7gelişimi için çalışması gerekir.
NMDARs dört monomerleri veya alt birimleri4,8,9/ oluşur. NMDAR yapısal kompozisyon içinde beyin7,10gelişimsel ve bölgesel değişkenlik gösterir. NMDARs sinaptik plastisite, biliş ve ritimleri oluşturmak için nefes ve hareket11,12,13katılmaktadırlar. Voltaj bir kanal büyük ölçüde sigara-membran potansiyeli dinlenme iletken (-70 mV) ve daha fazla nüfuz iyonlar önlemek için magnezyum tarafından engellenir. Kanal iki ligandlar, glutamat ve glisin/D-serin bağlama tarafından etkinleştirilir ve sinaptik membran, eşzamanlı bir depolarizasyon AMPA reseptör, ionotropic glutamat reseptörlerinin başka bir alt sınıf tarafından aracılık. Depolarizasyon katyonlar, özellikle kalsiyum14,15,16akını etkinleştirme NMDAR, magnezyum tıkanması kaldırır. NMDAR aktivasyonu hücre hayatta kalmak için gerekli olmasına rağmen aşırı harekete geçirmek hücre ölüm17,18,-19 arası excitotoxicity yol açabilir. Bu, reseptör, karmaşık yapısı ek olarak bu çalışmaları gerçekleştirmek için zorlu etkili tedaviler geliştirmek için gerekli kılar.
NMDAR eğitim için farklı yöntemler geliştirilmiştir. Ancak, her biri uyarılar eşlik vardır. Örneğin, yaygın olarak kullanılan tekniklerden biri NMDAR-aracılı değişimler istikrarlı hücre kültürünü tetrasiklin-indüklenebilir organizatörü (Tet-On)20kontrol altında hücre içi kalsiyum ölçer floresans tabanlı bir tahlil olduğunu. Ancak, bu sistemde gerekli ligandlar supramaximal konsantrasyonları ve NMDAR inhibitörleri ölçüm sırasında mevcut gereksinimi yapar rekabetçi antagonist aktivite tespit etmek neredeyse imkansız. Diğer benzer sistemleri, fonksiyonel reseptör ifade toksisite, kanal blokerleri gibi hücre kültürleri korumak için ketamin21,22 gerektiren neden olur. Bu kanal blokerleri reseptör özünde oturmak ve yıkayayım, özellikle bir plaka tabanlı biçiminde, ki onlar reseptör fonksiyonel çalışmalar ile müdahale etmek zordur. Son olarak, yama sıkma gibi elektrofizyolojik ölçümlerde sınırlı işlem hacmi olduğunu ve çok pahalı23büyük ölçekli çalışmalar vardır. Rağmen yukarıdaki sistemleri glisin uyarmaya duyarsız; Bu nedenle, NMDAR glisin bağımlı etkinliği okuyan bir sorun haline gelmektedir.
Burada tartışılan sınırlamalar üstesinden NMDAR çalışmak için yeni bir yaklaşım açıklar. Bizim teknik baculovirus ifade reseptör alt birimleri en uygun bir oranı ile fonksiyonel düzeyde olduğu kadar az 16 saat içinde hızlı sisteme capitalizes. Ayrıca, geniş bir karakterizasyonu alt türlerinden farklı rekombinant NMDAR sağlayan bir basit ve kombinatorik yaklaşım için baculovirus kullanımına izin verir. Diğer deneyleri, bu iletişim kuralını zayıf antagonistleri kullanımı nedeniyle kanal blokerleri gerektirmez. Yöntemin en güçlü avantajı zayıf antagonisti sonra bu fiyasko, modülasyon bireysel glisin ve glutamat bağlama sitelerin yanı sıra çift modülasyon glisin/D-serin ve glutamat reseptör duyarlıdır-ligand taşıması siteleri. Tahlil NMDAR reseptör bilinen Farmakoloji ve bilinen onun pozitif ve negatif modülatörler etkileri beyannamedir. Son olarak, bu vitro hücresel tahlil nesil aşırı kalsiyum akını tarafından neden olduğu hücresel toksisite üstesinden gelir ve fonksiyonel çalışmalar reseptör NMDAR modülatörler keşifler hızlandırabilir yüksek üretilen iş moda sağlar hastalık durumlarında.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>HEK-293</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-1573</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human NMDA (NR1/NR2A) Receptor Cell Line</td>
			<td>ChanTest Corporation</td>
			<td>CT6120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pFastBac Dual Expression Vector</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10712-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning 384-well Clear Flat Bottom Microplate</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td>3844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FLIPR Calcium 6-QF Assay Kit</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>R8192</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7126</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>49621</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-serine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L701,324</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES Buffer</td>
			<td>Boston Bio Product</td>
			<td>BB-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium Chloride Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>63069</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>E506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Probenecid</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>P36400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12, GlutaMAX media</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10565018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDL105,519</td>
			<td>NIBR</td>
			<td>Synthesized in house</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NVP-AAM077</td>
			<td>NIBR</td>
			<td>Synthesized in house</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CGP070667</td>
			<td>NIBR</td>
			<td>Synthesized in house</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-throughput calcium-flux assay to study nmda-receptors with sensitivity to glycine/d-serine and glutamate

N-metil-D-aspartat (NMDA) reseptörleri (NMDAR) ionotropic glutamat reseptörlerinin sınıflandırılır ve öğrenme ve bellek önemli rollere sahiptir. NMDAR arıza olarak her iki bitti - veya altında - mutasyonlar, değiştirilmiş ifade, kaçakçılığı veya yerelleştirme, neden activity ifade, merkezi sinir sistemi özellikle çok sayıda hastalık katkıda bulunabilir. Bu nedenle, reseptör'ın biyoloji anlama hem de keşif bileşikler ve küçük moleküller kolaylaştırmak nörolojik hastalıklar ile mücadele için devam eden çabaları önemlidir. Reseptör eğitimi için geçerli yaklaşımlar iş hızı düşük, yüksek maliyet ve NMDAR-aracılı excitotoxicity önlemek için işlevsel yetenekleri kanal blokerleri gerekli varlığı nedeniyle çalışmaya yetersizlik de dahil olmak üzere bazı kısıtlamalara sahiptir. Ayrıca, varolan tahlil sistemleri stimülasyon glutamat sadece tarafından duyarlıdır ve glisin, NMDAR, diğer eş ligand stimülasyon duyarlılık eksikliği. Burada, hem eş ligandlar, glutamat ve D-serin/glisin hassasiyetle NMDA reseptör çalışmaya yüksek üretilen iş gücü ile ilk plaka tabanlı tahlil mevcut. Bu yaklaşım farklı NMDAR alt birim besteleri incelenmesi ve fonksiyonel çalışmalar reseptör glisin - ve/veya glutamat duyarlı modlarında izin verir. Ayrıca, yöntem inhibitörleri varlığı ölçümler sırasında gerektirmez. Pozitif ve negatif allosteric modülatörler etkileri bu tahlil ile tespit edilebilir ve NMDAR bilinen Farmakoloji sistemimizde çoğaltılır. Bu teknik ve varolan yöntemleri kısıtlamaları üstesinden maliyet-etkili. Biz bu roman tekniği NMDAR-aracılı patolojiler için terapiler keşfi hızlandıracak inanıyoruz.

Küçük moleküller etkileri test etmeden önce bir yanı sıra en iyi ligand konsantrasyonu NMDARs en iyi ifade düzeyleri belirlemeniz gerekir. Açıklandığı hücreleri 384-şey plaka bir kuyu başına 10.000 hücre, seribaşı HEK293 huzurunda 5 mikron CGP060667, sonra transduced değişen miktarlarda NR1 ve NR2A virüs. Kuluçka gecede, ligand kaynaklı kalsiyum sonra akı ölçüldü (Şekil 1). Bu deneylerin sonuçlarını en iyi miktar ve her alt birim (Şekil 1, sarı kutu) için kullanmak için virüs oranı ortaya koyuyor.
Bir kez en uygun miktar ve iletim NR1 ve NR2A için oranını tespit edildi, bir ligand titrasyon NMDARs aktivasyonu için en uygun ligand konsantrasyonu belirlemek için gerçekleştirildi. Bunu yapmak için bir eş ligandlar değişik konsantrasyonlarda sabit, diğer eş ligand konsantrasyonları doyurarak eklendi (Şekil 2A-2B). Benzer sonuçlar NMDAR NR1/NR2B ve NR1/NR2D (Şekil 2C) gibi diğer alt birimi birleşimleri için tahlil'ın uygulanabilirliği diğer NMDAR aile üyeleri24gösteren elde edilmiştir. En iyi ifade düzeyleri ve ligand konsantrasyonu belirledikten sonra bir tahlil NMDAR-modülatörler etkileri test ile devam edebilirsiniz.
Yayınlanan raporlar ile tutarlı, glisin ve büyük ölçüde glutamat duyarlılık ile NMDARs çalışmaya ilk bu plaka tabanlı tahlil NMDAR14,25,26bilinen özellikleri veri üretir. Burada, biz iki bileşiklerin etkinliği kullanın [(R)-[(S)-1-(4-bromophenyl)-ethylamino]-(2,3-dioxo-1,2,3,4-tetrahydroquinoxalin-5-yl)-methyl]-phosphonic asit (Long-AAM077), glutamat sitesi antagonisti ve [7-kloro-4-hydroxy-3-(3-phenoxy) fenil-2 (H) kinolon] (L701, 324), tahmin edilen sonuçlar tahlil27,28 (Şekil 3) örneklemek için glisin sitesi antagonisti. Son olarak, her bileşik ilgili doğal ligand bağlayıcı sitenin EC80 test edildi. Ligand konsantrasyonu azalma rekabetçi olmayan inhibitörleri veya gözenek-blokerleri potens üzerinde etkisi için beklenirken antagonistleri, potens artması beklenmektedir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58160/58160fig1.jpg"> Şekil 1: NR1 ve NR2A alt birimleri titrasyon. Virüs NMDAR alt birimleri NR1 ve NR2A kodlamak farklı hacimleri reseptör en uygun işlevsel etkinlik için gerekli miktarını belirlemek için titre. 1:1 (v/v) oranı NR1:NR2A 1 µL kutusunun her (sarı) ile en iyi oranı olarak gözlendi. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58160/58160fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58160/58160fig2.jpg"> Şekil 2: Ligand titrasyon. A. glisin (100 µM) sabit bir konsantrasyon, değişen glutamat konsantrasyonu titre ve kalsiyum akı kaydedildi. Hata çubukları standart sapmayı temsil eder. B. glutamat konsantrasyonu 100 µM kaldı ve D-serin ve glisin farklı konsantrasyonları karşı titre ve kalsiyum akı ölçüldü. Kalsiyum akı glisin ve D-serin arasında bulundu anlamlı bir fark vardı. Hata çubukları standart sapmayı temsil eder. C. NR1 ve NR2D baculovirus ile transduced hücreleri ya 100 µM glutamat ile teşvik ve D-serin konsantrasyonları veya 100 µM D-serin ve değişen konsantrasyonları glutamat ve kalsiyum akı değişen ölçüldü. Hata çubukları standart sapmayı temsil eder. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58160/58160fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58160/58160fig3.jpg"> Şekil 3: ligand bağlayıcı sitesi antagonist aktivite karakterize. Kullanarak önceden belirlenmiş en uygun ligand ve alt birimi ifadeler, glutamat bağlayıcı sitesi antagonisti, Long-AAM077 ve glisin bağlayıcı sitesi antagonisti L701, 324, belirtilen kalsiyum akı tahlil NR1/NR2A için karakterize konsantrasyonları. Glisin veya diğer ligand doyurarak konsantrasyonu (100 µM) huzurunda glutamat EC80 için eşit bir konsantrasyon Long-AAM077 ve L701, 324, eklenmesinden sonra sırasıyla kullanıldı. Hata çubukları standart sapmayı temsil eder. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/58160/58160fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A High-throughput Calcium-flux Assay to Study NMDA-receptors with Sensitivity to Glycine/D-serine and Glutamate at JoVE.com

A High-throughput Calcium-flux Assay to Study NMDA-receptors with Sensitivity to Glycine/D-serine and Glutamate

NMDA reseptörleri glisin/D-serin ve glutamat duyarlılık ile çalışmak için bir yüksek-den geçerek kalsiyum-flux tahlil

NMDA reseptörleri (NMDAR) çalışma daha büyük ölçekli, kolaylaştırmak ve küçük moleküller düzenleyici etkileri muayene ve tedavi uygulamaları izin vermek için bu iletişim kuralını hedefidir.

N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors (NMDAR) are classified as ionotropic glutamate receptors and have critical roles in learning and memory. NMDAR ...

a-high-throughput-calcium-flux-assay-to-study-nmda-receptors-with

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.1K Görüntüleme.  Novartis Institutes for BioMedical Research. NMDA reseptörleri (NMDAR) çalışma daha büyük ölçekli, kolaylaştırmak ve küçük moleküller düzenleyici etkileri muayene ve tedavi uygulamaları izin vermek için bu iletişim kuralını hedefidir.

Video: A High-throughput Calcium-flux Assay to Study NMDA-receptors with Sensitivity to Glycine/D-serine and Glutamate

A Simple Way to Measure Ethanol Sensitivity in Flies

Low doses of ethanol cause flies to become hyperactive, while high doses are sedating. The sensitivity to ethanol-induced sedation of a given fly strain is correlated with that strain s ethanol preference, and therefore sedation is a highly relevant measure to study the genetics of alcohol responses and drinking. We demonstrate a simple way to expose flies to ethanol and measure its intoxicating effects. The assay we describe can determine acute sensitivity, as well as ethanol tolerance induced by repeat exposure. It does not require a technically involved setup, and can therefore be applied in any laboratory with basic fly culture tools.

A simple assay to measure the sedating effects of ethanol on Drosophila flies, based on the loss of righting reflex, is described.

Sinekler Etanol Hassasiyet Tedbir Basit Yolu

Low doses of ethanol cause flies to become hyperactive, while high doses are sedating. The sensitivity to ethanol-induced sedation of a given fly strain ...

Nörobilim

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge. Gene targeting to generate constitutive or conditional loss of function knockouts remains cost and labor intensive, as well as time consuming. Adding to these challenges, retina expressed genes may have essential roles outside the retina leading to unintended confounds when using a knockout approach. Furthermore, the ability to ectopically express a gene in a gain of function experiment can be extremely valuable when attempting to identify a role in cell fate specification and/or terminal differentiation.
We present a method for the rapid and efficient incorporation of DNA plasmids into the neonatal mouse retina by electroporation. The application of short electrical impulses above a certain field strength results in a transient increase in plasma membrane permeability, facilitating the transfer of material across the membrane 1,2,3,4. Groundbreaking work demonstrated that electroporation could be utilized as a method of gene transfer into mammalian cells by inducing the formation of hydrophilic plasma membrane pores allowing the passage of highly charged DNA through the lipid bilayer 5. Continuous technical development has resulted in the viability of electroporation as a method for in vivo gene transfer in multiple mouse tissues including the retina, the method for which is described herein 6, 7, 8, 9, 10. 
DNA solution is injected into the subretinal space so that DNA is placed between the retinal pigmented epithelium and retina of the neonatal (P0) mouse and electrical pulses are applied using a tweezer electrode. The lateral placement of the eyes in the mouse allows for the easy orientation of the tweezer electrode to the necessary negative pole-DNA-retina-positive pole alignment. Extensive incorporation and expression of transferred genes can be identified by postnatal day 2 (P2). Due to the lack of significant lateral migration of cells in the retina, electroporated and non-electroporated regions are generated. Non-electroporated regions may serve as internal histological controls where appropriate. 
Retinal electroporation can be used to express a gene under a ubiquitous promoter, such as CAG, or to disrupt gene function using shRNA constructs or Cre-recombinase. More targeted expression can be achieved by designing constructs with cell specific gene promoters. Visualization of electroporated cells is achieved using bicistronic constructs expressing GFP or by co-electroporating a GFP expression construct. Furthermore, multiple constructs may be electroporated for the study of combinatorial gene effects or simultaneous gain and loss of function of different genes. Retinal electroporation may also be utilized for the analysis of genomic cis-regulatory elements by generating appropriate expression constructs and deletion mutants. Such experiments can be used to identify cis-regulatory regions sufficient or required for cell specific gene expression 11. Potential experiments are limited only by construct availability.

In vivo Electroporation of Developing Mouse Retina

A method for the incorporation of plasmid DNA into murine retinal cells for the purpose of performing either gain- or loss of function studies in vivo is presented. This method capitalizes on the transient increase in permeability of cell plasma membranes induced by the application of an external electrical field.

Gelişmekte olan Fare Retina in vivo Elektroporasyon olarak

The functional characterization of genes expressed during mammalian retinal development remains a significant challenge.  Gene targeting to generate ...

Light Preference Assay to Study Innate and Circadian Regulated Photobehavior in Drosophila Larvae

Light acts as environmental signal to control animal behavior at various levels. The Drosophila larval nervous system is used as a unique model to answer basic questions on how light information is processed and shared between rapid and circadian behaviors. Drosophila larvae display a stereotypical avoidance behavior when exposed to light. To investigate light dependent behaviors comparably simple light-dark preference tests can be applied. In vertebrates and arthropods the neural pathways involved in sensing and processing visual inputs partially overlap with those processing photic circadian information. The fascinating question of how the light sensing system and the circadian system interact to keep behavioral outputs coordinated remains largely unexplored. Drosophila is an impacting biological model to approach these questions, due to a small number of neurons in the brain and the availability of genetic tools for neuronal manipulation. The presented light-dark preference assay allows the investigation of a range of visual behaviors including circadian control of phototaxis.

Light Preference Assay to Study Innate and Circadian Regulated Photobehavior in Drosophila Larvae

Here we describe a light-dark preference test for Drosophila larva. This assay provides information about innate and circadian regulation of light sensing and processing photobehavior.

Içinde Doğuştan gelen ve sirkadiyen Ayarlı Photobehavior Eğitim ışık tercih Testi<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva

Light acts as environmental signal to control animal behavior at various levels. The Drosophila larval nervous system is used as a unique model to answer ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Glutamat ve GABA hızlı Micro-iyontoforez: Synaptic Entegrasyon Araştırma yararlı bir araç

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the membrane with the co-transport of 3 Na+ and 1 H+ and the counter-transport of 1 K+. The stoichiometric current generated by the transport process can be monitored with whole-cell patch-clamp recordings from astrocytes. The time course of the recorded current is shaped by the time course of the glutamate concentration profile to which astrocytes are exposed, the kinetics of glutamate transporters, and the passive electrotonic properties of astrocytic membranes. Here we describe the experimental and analytical methods that can be used to record glutamate transporter currents in astrocytes and isolate the time course of glutamate clearance from all other factors that shape the waveform of astrocytic transporter currents. The methods described here can be used to estimate the lifetime of flash-uncaged and synaptically-released glutamate at astrocytic membranes in any region of the central nervous system during health and disease.

We describe an analytical method to estimate the lifetime of glutamate at astrocytic membranes from electrophysiological recordings of glutamate transporter currents in astrocytes.

Astrositik Transporter Akımlar bir Dekonvolüsyon Analizi ile Glutamat Gümrükleme gün Dersin türetilmesi

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the ...

Functional Interrogation of Adult Hypothalamic Neurogenesis with Focal Radiological Inhibition

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral delivery or transgenic animals have potential confounds that make interpretation of results from these studies difficult. New radiological tools are emerging, however, that allow one to noninvasively investigate the function of select groups of adult-born neurons through accurate and precise anatomical targeting in small animals. Focal ionizing radiation inhibits the birth and differentiation of new neurons, and allows targeting of specific neural progenitor regions. In order to illuminate the potential functional role that adult hypothalamic neurogenesis plays in the regulation of physiological processes, we developed a noninvasive focal irradiation technique to selectively inhibit the birth of adult-born neurons in the hypothalamic median eminence. We describe a method for Computer tomography-guided focal irradiation (CFIR) delivery to enable precise and accurate anatomical targeting in small animals. CFIR uses three-dimensional volumetric image guidance for localization and targeting of the radiation dose, minimizes radiation exposure to nontargeted brain regions, and allows for conformal dose distribution with sharp beam boundaries. This protocol allows one to ask questions regarding the function of adult-born neurons, but also opens areas to questions in areas of radiobiology, tumor biology, and immunology. These radiological tools will facilitate the translation of discoveries at the bench to the bedside.

The function of adult-born mammalian neurons remains an active area of investigation. Ionizing radiation inhibits the birth of new neurons. Using computer tomography-guided focal irradiation (CFIR), three-dimensional anatomical targeting of specific neural progenitor populations can now be used to assess the functional role of adult neurogenesis.

Odak Radyolojik Geciktiricisinin Erişkin Hipotalamus nöron Fonksiyonel Sorgulama

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During embryonic and postnatal development they actively proliferate and generate myelinating oligodendrocytes. These cells have commonly been studied in primary dissociated cultures, neuron cocultures, and in fixed tissue. Using newly available transgenic mouse lines slice culture systems can be used to investigate proliferation and differentiation of oligodendrocyte lineage cells in both gray and white matter regions of the forebrain and cerebellum. Slice cultures are prepared from early postnatal mice and are kept in culture for up to 1 month. These slices can be imaged multiple times over the culture period to investigate cellular behavior and interactions. This method allows visualization of NG2 cell division and the steps leading to oligodendrocyte differentiation while enabling detailed analysis of region-dependent NG2 cell and oligodendrocyte functional heterogeneity. This is a powerful technique that can be used to investigate the intrinsic and extrinsic signals influencing these cells over time in a cellular environment that closely resembles that found in vivo.

A technique to study NG2 cells and oligodendrocytes using a slice culture system of the forebrain and cerebellum is described. This method allows examination of the dynamics of proliferation and differentiation of cells within the oligodendrocyte lineage where the extracellular environment can be easily manipulated while maintaining tissue cytoarchitecture.

Organotipik Dilim Kültürler Oligodendrosit Dinamikler ve miyelinasyonun incelemek için

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster

Recently, egg-laying preference of Drosophila has emerged as a genetically tractable model to study the neural basis of simple decision-making processes. When selecting sites to deposit their eggs, female flies are capable of ranking the relative attractiveness of their options and choosing the &#34;greater of two goods.&#34; However, most egg-laying preference assays are not practical if one wants to take a systematic genetic screening approach to search for the circuit basis underlying this simple decision-making process, as they are population-based and laborious to set up. To increase the throughput of studying of egg-laying preferences of single females, we developed custom chambers that each can simultaneously assay egg-laying preferences of up to thirty individual flies as well as a protocol that ensures each female has a high egg-laying rate (so that their preference is readily discernable and more convincing). Our approach is simple to execute and produces very consistent results. Additionally, these chambers can be equipped with different attachments to allow video recording the egg-laying animals and to deliver light for optogenetics studies. This article provides the blueprints for fabricating these chambers and the procedure for preparing the flies to be assayed in these chambers.

High Throughput Assay to Examine Egg-Laying Preferences of Individual Drosophila melanogaster

This protocol describes a high throughput assay for testing egg-laying preferences of Drosophila melanogaster at single-animal resolution. This assay provides a simple, efficient, and scalable platform to identify genes and circuit components that control a simple decision-making process.

Yüksek Verimli Testi Bireyin Yumurta Yumurtlayan Tercihler incelemek için<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Recently, egg-laying preference of Drosophila has emerged as a genetically tractable model to study the neural basis of simple decision-making processes. ...

Correlative Light and Electron Microscopy to Study Microglial Interactions with &#946;-Amyloid Plaques

A detailed protocol is provided here to identify amyloid A&#946; plaques in brain sections from Alzheimer&#39;s disease mouse models before pre-embedding immunostaining (specifically for ionized calcium-binding adapter molecule 1 (IBA1), a calcium binding protein expressed by microglia) and tissue processing for electron microscopy (EM). Methoxy-X04 is a fluorescent dye that crosses the blood-brain barrier and selectively binds to &#946;-pleated sheets found in dense core A&#946; plaques. Injection of the animals with methoxy-X04 prior to sacrifice and brain fixation allows pre-screening and selection of the plaque-containing brain sections for further processing with time-consuming manipulations. This is particularly helpful when studying early AD pathology within specific brain regions or layers that may contain very few plaques, present in only a small fraction of the sections. Post-mortem processing of tissue sections with Congo Red, Thioflavin S, and Thioflavin T (or even with methoxy-X04) can label &#946;-pleated sheets, but requires extensive clearing with ethanol to remove excess dye and these procedures are incompatible with ultrastructural preservation. It would also be inefficient to perform labeling for A&#946; (and other cellular markers such as IBA1) on all brain sections from the regions of interest, only to yield a small fraction containing A&#946; plaques at the right location. Importantly, A&#946; plaques are still visible after tissue processing for EM, allowing for a precise identification of the areas (generally down to a few square millimeters) to examine with the electron microscope.

This article describes a protocol for visualizing amyloid A&#946; plaques in Alzheimer&#39;s disease mouse models using methoxy-X04, which crosses the blood-brain barrier and selectively binds to &#946;-pleated sheets found in dense core A&#946; plaques. It allows pre-screening of plaque-containing tissue sections prior to immunostaining and processing for electron microscopy.

Bağıntılı Işık ve Elektron Mikroskobu β-amiloid plaklarının ile Mikroglial Etkileşimleri Eğitim için

A detailed protocol is provided here to identify amyloid A&#946; plaques in brain sections from Alzheimer&#39;s disease mouse models before pre-embedding ...

Stripe Assay to Study the Attractive or Repulsive Activity of a Protein Substrate Using Dissociated Hippocampal Neurons

Growing axons develop a highly motile structure at their tip, termed the growth cone. The growth cone contacts extracellular environmental cues to navigate axonal growth. Netrin, slit, semaphorin, and ephrins are known guidance molecules that can attract or repel axons upon binding to receptors and co-receptors on the axon. The activated receptors initiate various signaling molecules in the growth cone that alter the structure and movement of the neuron. Here, we describe the detailed protocol for a stripe assay to assess the ability of a guidance molecule to attract or repel neurons. In this method, dissociated hippocampal neurons from E15.5 mice are cultured on laminin-coated dishes processed with alternating stripes of ectodomain of fibronectin and leucine-rich transmembrane protein-2 (FLRT2) and control immunoglobulin G (IgG) fragment crystallizable region (Fc) protein. Both axons and cell bodies were strongly repelled from the FLRT2-coated stripe regions after 24 h of culture. Immunostaining with tau1 showed that ~90% of the neurons were distributed on the Fc-coated stripes compared to the FLRT2-Fc-coated stripes (~10%). This result indicates that FLRT2 has a strong repulsive effect on these neurons. This powerful method is applicable not only for primary cultured neurons but also for a variety of other cells, such as neuroblasts.

Axon guidance molecules regulate neuronal migration and targeted growth-cone navigation. We present a powerful method, the stripe assay, to assess the ability of guidance molecules to attract or repulse neurons. In this protocol, we demonstrate the stripe assay by showing FLRT2's ability to repel cultured hippocampal neurons.