Yazarlar Becky Marquez, klinik Koordinatörü Sentara Bariatric Merkezi, eleme ve açıklanması kabul etmiş hasta süreci ile yardımını kabul etmek istiyorum. Bu araştırma için Anca ö Dobrian R15HL114062 tarafından desteklenmiştir.

Kurumsal teftiş kurulu Derneği Doğu Virginia Tıp Fakültesi, araştırma ve çalışmada kullanılan insan yağ doku örnekleri toplanması onayladı. Bilinçli yazılı izni hastalardan toplanmıştır.
1. hazırlanması arabellekleri, medya ve aletleri
<ol><li>Krebs Ringer Bicarbonate-Buffered çözüm (KRBBS) hazırlamak: 135 mM sodyum klorür, 5 mM potasyum klorür, 1 mM magnezyum sülfat, 0.4 mM potasyum fosfat dibasic, 5.5 mM glikoz, 1 mM Adenozin, % 0,01 antibiyotik/antimycotic mix (50 µg/mL penisilin, 50 µg/mL streptomisin, gentamisin 30 µg/mL, amfoterisin 15 ng/mL) ve 10 mM HEPES (pH 7.4 =). Bu çözüm doku toplama ve sindirim için her zaman taze hazırlanır.</li>
	<li>Taze collagenase çözüm hazırlamak: 1 mg/mL collagenase, tip 1, KRBSS; 3 mL/g yağ olun. Doku sindirim önce su banyosunda 37 ° C'de collagenase çözüm önceden ısıtmak.</li>
	<li>CD34 hücre izolasyon arabellek hazırlamak: % 2 fetal Sığır serum (FBS) ve 1 mM EDTA steril fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS).</li>
	<li>Adipogenesis ortam hazırlamak: DMEM/F12, % 5 FBS, 50 µg/mL penisilin/streptomisin, 1,25 µL/mL (5 µg/mL veya 144 mU/mL) insan insülin ve 0,36 µL/mL 2.8 mM rosiglitazone (1 µM).</li>
	<li>%0,3 yağ kırmızı O (ORO) hisse senedi çözüm (ağırlık/hacim) ORO 0.3 g isopropanol 100 mL içine çözülerek hazırlayın.</li>
</ol>2. yağ Stromal vasküler kesir yalıtım
Not: Morbid obez tip 2 diyabetik (T2D) ve Sentara metabolik ve kilo kaybı cerrahi Merkezi'nde (Sentara Medikal Grubu, Norfolk, VA) obezite cerrahisi uygulanan diyabetik olmayan konular, 18-65 yaş arası kesitsel bir kohort çalışma dahil. Dışlama kriterleri bir otoimmün hastalığı tip 1 diyabet, kronik immünsüpresif tedavi, Anti-inflamatuar ilaçlar, thiazolinendiones, etkin tütün kullanımı, kronik veya akut enfeksiyonlar veya bir geçmiş gerektiren koşullar da dahil olmak üzere dahil Son 12 ay içinde tedavi malignite. T2D 126 mg/dL veya daha büyük bir açlık plazma glukoz, 200 mg/dL veya daha büyük 2 h glikoz tolerans testi sonra bir glukoz veya antidiyabetik ilaçların kullanımı tanımlanmıştır.
<ol><li>İnsan omental (OM) ve subkutan (SC) Yağ dokusundan (AT) insan denekler obezite cerrahisi uygulanan toplamak.</li>
	<li>OM ve SC AT hemen doku çıkarma sonra Hank tamponlu tuz solüsyonu ile 50 µg/mL penisilin/streptomisin, oda sıcaklığında içeren ayrı şişeleri tutun.</li>
	<li>Dikkatli bir şekilde temiz ve fibrotik ve dağlanmış bölümleri doku örneği laboratuarda doku çıkarma sonra geldiğinde % 70 etanol makas örnek aldım ve cımbız kullanarak kaldırın.</li>
	<li>Yağ dokusu tartmak ve BT 5 g (veya daha az) aliquots collagenase sindirim için bölüm.</li>
	<li>İnce iki çift makas kullanarak at 5 ml collagenase çözüm oda sıcaklığında bir mercek şişe içinde 5 g kıyma.</li>
	<li>15 mL toplam için kıyılmış doku için ek bir 10 mL collagenase çözeltisi ekleyin.</li>
	<li>Sürekli titriyor ile bir su banyosu içinde 37 ° C'de 1 h için örnekleri sindirmek.</li>
	<li>Künt bir son yapmak için bir 20 mL şırınga ihbar kesti.</li>
	<li>250 µm kafes üzerinden 9 cm x 9 cm kare şeklinde bir kesik ve künt son şırınga kullanarak 50 mL konik tüp yarıya kadar itin.</li>
	<li>Örnekleri 20 mL künt son şırınga ve 250 µm naylon mesh adiposit ve stromal damar hücreleri sindirilmemiş dokusundan ayırmak için 50 mL konik tüp içine filtreden içine dökün. Not: mesh aşırı fibrotik sindirilmemiş malzeme nedeniyle tıkanmış olsun AT 5 g 50 mL konik Tüp, başına birden fazla kullanmayın.</li>
	<li>KRBBS 10 mL ile mercek şişe dışarı yıkama ve kalan hücreleri toplamak için filtreden dök.</li>
	<li>Filtre uygulanmış örnekleri, oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya. Not: Adipositler float tüp üstünde ve bazı stromal damar hücreleri tüpün dibinde yerleşmek için izin vermek bu adım önemlidir.</li>
	<li>20 mL şırınga ve bir 20 G x 6'pipetting iğne stromal vasküler kesir katmanı kaldırın ve temiz 50 mL konik tüp aktarmak için kullanmak.</li>
	<li>KRBBS 10 mL ekleyin ve oda sıcaklığında 5 min için bankta oturmak örnekleri sağlar.</li>
	<li>2.12-2,14 adımları iki kez tekrarlayın. Not: Aşağıdaki adımları hiçbir kirlenme ile kayan adiposit stromal vasküler hücre olduğundan emin olun.</li>
	<li>Aşağıdaki adımlarda açıklandığı gibi her iki depoları için daha fazla alay, buzda stromal vasküler kesirler tutmak. Not: Bu hücre canlılığı üzerinde bir etkiye sahip gibi hücreleri daha 1 h, buz üzerinde terk etmeyin. Adiposit deneyler için taze kullanılan ya da flash donmuş sıvı azot uzun süreli depolama için olabilir.</li>
</ol>3. yağ dokusu endotel hücre izolasyon
<ol><li>500 x g 4 ° C'de 5 min için de stromal vasküler kesirler (SVF) spin</li>
	<li>Örnekler santrifüj kaldır ve dikkatle süpernatant dökün; SVF hücreleri içeren pelet tutun.</li>
	<li>Yavaşça hücre topakları PBS 5 mL resuspend. Not: bir AT depo daha--dan 5 g (bkz. Adım 2.4) birden çok aliquots işlendiyse, hücre topakları birlikte havuz.</li>
	<li>Örnekleri 500 x g 4 ° C'de 5 min için de spin</li>
	<li>Süpernatant kaldırmak, PBS 1 mL hücrelerde resuspend ve hücreleri saymak. Not: Burada, bir otomatik hücre sayaç hücre sayımı için kullanıldı. Hücre canlılığı 12 µL hücre süspansiyon, akridin turuncu/propidium iyodür (AO/PI) çözümünü 12 µL ile karıştırılarak elde edildi ( Tablo malzemelerigörmek). Hücreleri her depo için at gram başına ortalama sayısı: (a) OM depo: 1,69 x 105 ± 4.51 x 104; (b) SC depo: 1,24 x 105 ± 6.45 x 104. Her iki depoları hücrelerden canlılığı yapıldı > % 90.</li>
	<li>Örnekleri 500 x g 4 ° C'de 5 min için de cips Not: CD34 immunomagnetic seçim Protokolü ( Tablo malzemelerigörmek) adımlar için 3.7-3.15 uyarlanmıştır.</li>
	<li>Pelet CD34 yalıtım arabellek 100 µL içinde resuspend. Not: Toplam hücre sayısı aşağıdaki re-süspansiyon birimleri gerektirir: (a) < 2 x 107 hücreleri: Pelet 100 µL; resuspend (b) 2 x 108–5 x 108 hücreleri: pelet 1 mL resuspend. 3.9-3,16, adımda kullanılan reaktifler hacimleri için küçülttüm < 2 x 107 hücreleri.</li>
	<li>CD34 kokteyl 10 µL ekleyin ve 15 dakika oda sıcaklığında örnek kuluçkaya.</li>
	<li>Manyetik boncuklar 5 µL ekleyin ve örnek oda sıcaklığında 10 dakika için kuluçkaya.</li>
	<li>CD34 yalıtım arabellek 2.5 mL her örnek için ekleyin ve oda sıcaklığında 5 min için mıknatıs örnekleri yerleştirin.</li>
	<li>Mıknatıs 5 için ters çevir'i s yalıtım tampon dökün.</li>
	<li>Örnekler mıknatıs kaldırmak ve 3.10 ve 3,11 4 x arasındaki adımları yineleyin.</li>
	<li>Tüp mıknatıs kaldır ve CD34 yalıtım arabellek 2 mL ekleyin.</li>
	<li>Hücreleri 500 x g 4 ° C'de 5 min için de cips</li>
	<li>Hücre topakları 1 mL CD34 yalıtım arabellek resuspend ve hücreleri saymak. Not: İşte, at gram başına ortalama sayısı: (a) OM depo: 4,75 x 104 ± 3,36 x 104; (b) SC depo: 1,06 x 104 ± 9,53 x 103. Bir CD31 plastik immunobead iletişim kuralı için adımları 3,16-3,34 ( Tablo malzemelerigörmek) uyarlanmıştır.</li>
	<li>Hücreleri 500 x g 5 min için de cips ve Pelet arabellek b 250 µL ve yıkama arabelleği 250 µL'resuspend.</li>
	<li>İyice CD31 boncuk vortexing tüp tarafından resuspend.</li>
	<li>20 µL CD31 boncuk ekleyin. Not: Toplam hücresini nedeniyle sayar > 1 x 106, birimin üreticinin giriş göre küçültülmüş.</li>
	<li>Oda sıcaklığında 30 dakika sallanan ile örnek kuluçkaya.</li>
	<li>Bir süzgeç steril 50 mL konik tüp takın. Not: Süzgeç büyük açılış üstte olması gerekir.</li>
	<li>Önce hücre ayırma, yıkama arabelleği süzgeç equilibrate 1 mL ekleyin. Süzgeç 3,16 adıma altında oluşturulan karışımı uygulamak.</li>
	<li>Dairesel bir hareketle toplam hacmi 20 mL için süzgeç yıkama arabelleği 5 mL ile yıkayın. Bağlayıcı bir steril 50 mL konik tüp takmak ve radarı kilit kapatın.</li>
	<li>Süzgeç konektöre takın. Yıkama arabellek süzgeç duvar boyunca 1 mL ekleyin. Süzgeç duvar boyunca aktif arabellek D 1 mL ekleyin. Örnek hafifçe girdap ve oda sıcaklığında 10 dakika için kuluçkaya.</li>
	<li>Yıkama arabellek 1 mL ekleyin. Yukarı ve aşağı 10 x pipetting tarafından boncuk ayrı hücreler. Not: hava kabarcıkları oluşturulmasını engellemek.</li>
	<li>Radarı-kilidi açmak ve 50 mL konik tüp içine akmaya müstakil hücreleri izin vermek. Süzgeç 10 yıkama yıkama arabelleği her zaman 1 mL x.</li>
	<li>Bağlayıcı ve süzgeç atmak ve 300 x g 4 ° C'de 10 dakika için de örnekler santrifüj kapasitesi Hücre Pelet komple EGM-2 Medya kültürü için 2 ml resuspend. Not: Hücreler bu noktada at gram başına ortalama sayısıdır: (a) OM depo: 5.92 x 103 ± 4.27 x 103; (b) SC depo: 4.12 x 103 ± 2.1 x 103. Her iki depoları hücrelerden canlılığı üzerinde % 90 oldu.</li>
</ol>4. indüksiyon Adipogenesis izole endotel hücrelerinde
<ol><li>6-iyi doku kültürü tedavi plakaları hücrelerde bir 37 ° C'de % 5 CO2 kuluçka komple EGM-2 medya ile büyümek. Ortamı her 3-4 hücreleri % 80 – 90 izdiham ulaşana kadar gün değiştirin. Not: 2-3 gün arasında nüfus katlama olduğunu.</li>
	<li>100 mm Petri yemekler üzerinde kaplama tarafından hücreleri genişletin ve 1:3 kez hücreleri bölme. Bu aşamada, geçiş 2 hücrelerdir.</li>
	<li>(Bkz. Tablo reçetesi) otomatik bir hücre kullanarak hücreleri counter Count.</li>
	<li>Tohum yaklaşık 100-200.000 hücrelere 6-şey plakaları her depo ve onları buna 2 gündür EGM-2 medya tamamlandı kültür için yinelenen wells sağlanması.</li>
	<li>Aspire herhangi bir büyüme medya ve DMEM/F12 2 mL % 5 ile onun yerine FBS ve 50 µg/mL penisilin/streptomisin denetim için hücreleri ve 2 mL (bkz. Adım 1.4) Adipogenesis medya için tedavi hücreleri ile değiştirin.</li>
	<li>Hücreleri oksijen %5 37 ° C'de kuluçkaya ilgili medya her 3-4 gün yerine CO2 kuluçka 13 gündür. Not: Hücreleri tedavi 4 gün sonra lipidler toplamaya başlayacaktır.</li>
	<li>ORO ve Nil yayınlanan yöntemleri15-17göre boyama kırmızı yürütmek.</li>
	<li>Bir RNA çıkarılması için hücreleri izole etmek için 6-iyi indüksiyon plakalar medyayı çıkarın ve 1 mL steril PBS ile yıkayın.</li>
	<li>Guanidium thiocyanate-fenol-kloroform çözüm 350 µL ekleyin (her şey ve oda sıcaklığında 5-10 dk için kuluçkaya Malzemeler tablobkz:).</li>
	<li>Hücreleri kullanarak bir hücre sıyırıcı plaka kapalı kazımak ve hücreleri bir 1.5 mL microcentrifuge tüp aktarın. Not: Örnekleri RNA çıkarma ve daha sonraki bir tarihte işlenmesi için-80 ° C dondurucuda saklanabilir.</li>
	<li>MRNA adapte bir RNA ayıklama kullanarak örnekleri ayıklamak ( Tablo malzemelerigörmek) protokol.</li>
	<li>Bir gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) gen ifade aşağıdaki problar kullanarak değerlendirmek için gerçekleştirmek: adiponektin, UCP-1 ve CIDEA (bkz: Malzemeler tablo). Not: Burada, RT-PCR yordamlar aşağıdaki standart protokolü kullanılarak yapılmıştır: denatürasyon (95 ° C; 15 s), tavlama ve uzantısı (60 ° C; 1 dk) 40 döngüleri için. CT değerleri ile gen ifade örnekleri > 35 belirlenemeyen kabul.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Tang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=White+fat+progenitor+cells+reside+in+the+adipose+vasculature.">White fat progenitor cells reside in the adipose vasculature.</a> Science. 322 (5901), 583-586 (2008).</li><li>Lee, Y. H., Petkova, A. P., Granneman, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+an+adipogenic+niche+for+adipose+tissue+remodeling+and+restoration.">Identification of an adipogenic niche for adipose tissue remodeling and restoration.</a> Cell Metabolism. 18 (3), 355-367 (2013).</li><li>Min, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+'brite/beige'+adipocytes+develop+from+capillary+networks,+and+their+implantation+improves+metabolic+homeostasis+in+mice.">Human 'brite/beige' adipocytes develop from capillary networks, and their implantation improves metabolic homeostasis in mice.</a> Nature Medicine. 22 (3), 312-318 (2016).</li><li>Gupta, R. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zfp423+expression+identifies+committed+preadipocytes+and+localizes+to+adipose+endothelial+and+perivascular+cells.">Zfp423 expression identifies committed preadipocytes and localizes to adipose endothelial and perivascular cells.</a> Cell Metabolism. 15 (2), 230-239 (2012).</li><li>Tran, K. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vascular+endothelium+of+the+adipose+tissue+gives+rise+to+both+white+and+brown+fat+cells.">The vascular endothelium of the adipose tissue gives rise to both white and brown fat cells.</a> Cell Metabolism. 15 (2), 222-229 (2012).</li><li>Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+white+adipocyte+progenitor+cells+in+vivo.">Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo.</a> Cell. 135 (2), 240-249 (2008).</li><li>Scott, M. A., Nguyen, V. T., Levi, B., James, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+methods+of+adipogenic+differentiation+of+mesenchymal+stem+cells.">Current methods of adipogenic differentiation of mesenchymal stem cells.</a> Stem Cells and Development. 20 (10), 1793-1804 (2011).</li><li>Macotela, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsic+differences+in+adipocyte+precursor+cells+from+different+white+fat+depots.">Intrinsic differences in adipocyte precursor cells from different white fat depots.</a> Diabetes. 61 (7), 1691-1699 (2012).</li><li>Lee, Y. H., Petkova, A. P., Mottillo, E. P., Granneman, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+identification+of+bipotential+adipocyte+progenitors+recruited+by+beta3-adrenoceptor+activation+and+high-fat+feeding.">In vivo identification of bipotential adipocyte progenitors recruited by beta3-adrenoceptor activation and high-fat feeding.</a> Cell Metabolism. 15 (4), 480-491 (2012).</li><li>Xue, Y., Xu, X., Zhang, X. Q., Farokhzad, O. C., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preventing+diet-induced+obesity+in+mice+by+adipose+tissue+transformation+and+angiogenesis+using+targeted+nanoparticles.">Preventing diet-induced obesity in mice by adipose tissue transformation and angiogenesis using targeted nanoparticles.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (20), 5552-5557 (2016).</li><li>Villaret, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+endothelial+cells+from+obese+human+subjects:+differences+among+depots+in+angiogenic,+metabolic,+and+inflammatory+gene+expression+and+cellular+senescence.">Adipose tissue endothelial cells from obese human subjects: differences among depots in angiogenic, metabolic, and inflammatory gene expression and cellular senescence.</a> Diabetes. 59 (11), 2755-2763 (2010).</li><li>Miranville, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+postnatal+neovascularization+by+human+adipose+tissue-derived+stem+cells.">Improvement of postnatal neovascularization by human adipose tissue-derived stem cells.</a> Circulation. 110 (3), 349-355 (2004).</li><li>Sengenes, C., Lolmede, K., Zakaroff-Girard, A., Busse, R., Bouloumie, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preadipocytes+in+the+human+subcutaneous+adipose+tissue+display+distinct+features+from+the+adult+mesenchymal+and+hematopoietic+stem+cells.">Preadipocytes in the human subcutaneous adipose tissue display distinct features from the adult mesenchymal and hematopoietic stem cells.</a> Journal of Cellular Physiology. 205 (1), 114-122 (2005).</li><li>Moller, D. E., Flier, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+resistance--mechanisms,+syndromes,+and+implications.">Insulin resistance--mechanisms, syndromes, and implications.</a> The New England Journal of Medicine. 325 (13), 938-948 (1991).</li><li>Pittenger, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilineage+potential+of+adult+human+mesenchymal+stem+cells.">Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells.</a> Science. 284 (5411), 143-147 (1999).</li><li>Novikoff, A. B., Novikoff, P. M., Rosen, O. M., Rubin, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organelle+relationships+in+cultured+3T3-L1+preadipocytes.">Organelle relationships in cultured 3T3-L1 preadipocytes.</a> The Journal of Cell Biology. 87 (1), 180-196 (1980).</li><li>Satish, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+analysis+of+human+adipose-derived+stem+cells+during+in+vitro+differentiation+to+an+adipocyte+lineage.">Expression analysis of human adipose-derived stem cells during in vitro differentiation to an adipocyte lineage.</a> BMC Medical Genomics. 8 (41), (2015).</li><li>Gimbrone, M. A., Cotran, R. S., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+vascular+endothelial+cells+in+culture.+Growth+and+DNA+synthesis.">Human vascular endothelial cells in culture. Growth and DNA synthesis.</a> The Journal of Cell Biology. 60 (3), 673-684 (1974).</li><li>Burridge, K. A., Friedman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Environment+and+vascular+bed+origin+influence+differences+in+endothelial+transcriptional+profiles+of+coronary+and+iliac+arteries.">Environment and vascular bed origin influence differences in endothelial transcriptional profiles of coronary and iliac arteries.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 299 (3), H837-H846 (2010).</li><li>Paruchuri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+pulmonary+valve+progenitor+cells+exhibit+endothelial/mesenchymal+plasticity+in+response+to+vascular+endothelial+growth+factor-A+and+transforming+growth+factor-beta2.">Human pulmonary valve progenitor cells exhibit endothelial/mesenchymal plasticity in response to vascular endothelial growth factor-A and transforming growth factor-beta2.</a> Circulation Research. 99 (8), 861-869 (2006).</li><li>Hewett, P. W., Murray, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+microvessel+endothelial+cells:+isolation,+culture+and+characterization.">Human microvessel endothelial cells: isolation, culture and characterization.</a> In Vitro Cellular &amp; Development Biology. 29 (11), 823-830 (1993).</li><li>Hewett, P. W., Murray, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+lung+microvessel+endothelial+cells:+isolation,+culture,+and+characterization.">Human lung microvessel endothelial cells: isolation, culture, and characterization.</a> Microvascular Research. 46 (1), 89-102 (1993).</li><li>Hewett, P. W., Murray, J. C., Price, E. A., Watts, M. E., Woodcock, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+microvessel+endothelial+cells+from+human+mammary+adipose+tissue.">Isolation and characterization of microvessel endothelial cells from human mammary adipose tissue.</a> In Vitro Cellular &amp; Development Biology. 29 (4), 325-331 (1993).</li><li>Xiao, L., McCann, J. V., Dudley, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+expansion+of+tumor-specific+endothelial+cells.">Isolation and culture expansion of tumor-specific endothelial cells.</a> Journal of Visualized Experiments. (105), e53072 (2015).</li><li>Berry, R., Rodeheffer, M. S., Rosen, C. J., Horowitz, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose+tissue+residing+progenitors+(adipocyte+lineage+progenitors+and+adipose+derived+stem+cells+(ADSC).">Adipose tissue residing progenitors (adipocyte lineage progenitors and adipose derived stem cells (ADSC).</a> Current Molecular Biology Reports. 1 (3), 101-109 (2015).</li><li>Zhou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+evaluation+of+endothelial+progenitor+cells+from+adipose+tissue+as+potential+angiogenic+cell+sources+for+bladder+angiogenesis.">In vitro evaluation of endothelial progenitor cells from adipose tissue as potential angiogenic cell sources for bladder angiogenesis.</a> PLoS One. 10 (2), e0117644 (2015).</li><li>Curat, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+blood+monocytes+to+adipose+tissue-resident+macrophages:+induction+of+diapedesis+by+human+mature+adipocytes.">From blood monocytes to adipose tissue-resident macrophages: induction of diapedesis by human mature adipocytes.</a> Diabetes. 53 (5), 1285-1292 (2004).</li><li>Sidney, L. E., Branch, M. J., Dunphy, S. E., Dua, H. S., Hopkinson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Concise+review:+evidence+for+CD34+as+a+common+marker+for+diverse+progenitors.">Concise review: evidence for CD34 as a common marker for diverse progenitors.</a> Stem Cells. 32 (6), 1380-1389 (2014).</li><li>Traktuev, D. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+population+of+multipotent+CD34-positive+adipose+stromal+cells+share+pericyte+and+mesenchymal+surface+markers,+reside+in+a+periendothelial+location,+and+stabilize+endothelial+networks.">A population of multipotent CD34-positive adipose stromal cells share pericyte and mesenchymal surface markers, reside in a periendothelial location, and stabilize endothelial networks.</a> Circulation Research. 102 (1), 77-85 (2008).</li><li>Frontini, A., Giordano, A., Cinti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells+of+adipose+tissues:+a+niche+of+adipogenesis.">Endothelial cells of adipose tissues: a niche of adipogenesis.</a> Cell Cycle. 11 (15), 2765-2766 (2012).</li><li>Sengenes, C., Miranville, A., Lolmede, K., Curat, C. A., Bouloumie, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+endothelial+cells+in+inflamed+adipose+tissue.">The role of endothelial cells in inflamed adipose tissue.</a> Journal of Internal Medicine. 262 (4), 415-421 (2007).</li><li>Ong, W. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+specific+cell-surface+markers+of+adipose-derived+stem+cells+from+subcutaneous+and+visceral+fat+depots.">Identification of specific cell-surface markers of adipose-derived stem cells from subcutaneous and visceral fat depots.</a> Stem Cell Reports. 2 (2), 171-179 (2014).</li><li>Ong, W. K., Sugii, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adipose-derived+stem+cells:+fatty+potentials+for+therapy.">Adipose-derived stem cells: fatty potentials for therapy.</a> The International Journal of Biochemistry &amp; Cell Biology. 45 (6), 1083-1086 (2013).</li><li>Tchkonia, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abundance+of+two+human+preadipocyte+subtypes+with+distinct+capacities+for+replication,+adipogenesis,+and+apoptosis+varies+among+fat+depots.">Abundance of two human preadipocyte subtypes with distinct capacities for replication, adipogenesis, and apoptosis varies among fat depots.</a> American Journal of Physiology-Endocrinoloy and Metabolism. 288 (1), E267-E277 (2005).</li><li>van de Vyver, M., Andrag, E., Cockburn, I. L., Ferris, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiazolidinedione-induced+lipid+droplet+formation+during+osteogenic+differentiation.">Thiazolidinedione-induced lipid droplet formation during osteogenic differentiation.</a> Journal of Endocrinology. 223 (2), 119-132 (2014).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Yalıtım, genişleme ve Adipojenik indüksiyon CD34 + CD31 + visseral ve subkutan depoları insan yağ dokusunun endotel hücrelerden bir metodoloji sağlamak için bu kağıt odak noktasıdır.
Metodolojisi kemirgenler veya öncelikle teknikleri fluorescently etiketli veya manyetik boncuklar-18, birleştiğinde CD31 antikorları kullanarak dahil insanlar çeşitli vasküler yatak endotel hücrelerinin yalıtım için bildirilmiştir 19 , 20 , 21 , 22 , 23. heterojenite farklı yataklarda vasküler endotel hücre nüfusun ve fibroblast ve vasküler duvar hücreleri ile kirlenme riski yüksek bu izolasyon teknikleri evrensel kullanımı için büyük bir sorun olduğunu. Ancak, böyle contaminations önlemek için yalıtım teknikleri ayrıntılandırmaları bildirilen24olmuştur. Bu tekniklerin kullanımı, çoğunlukla olgun endotel hücreleri dokulardan izole edilmiştir. Yağ dokusu kök/progenitor hücreler endotel ataları25,26da dahil olmak üzere, büyük bir depo var. Birkaç kağıt CD34 + ve CD31 + antikor11,27' in birleşimiyle insan Yağ dokusundan endotel hücreleri arıtma bildirdi. İki işaretleri hızlı olgun endotel hücreleri ve endotel ataları11,28,29karışık bir nüfusa hücrelerdir. Birkaç son seminal kağıtları endotel (CD31 +) ya da duvar (PDGFRβ +) hücrelerinde yağ damarlara küçük bir alt kümesini adipocyte ataları5,30zengin bir kaynak olduğunu bildirin. Adipojenik potansiyel ile vasküler bu hücreler hem beyaz veya kahverengi/bej adiposit üretebilir ve etkin angiogenez adipose damarlara5ile ilişkili. Bu bulgular obezite metabolik performansını artırmak için ve/veya vasküler ataları beyaz ve/veya termojenik adiposit oluşturarak kilo kaybı teşvik için yeni tedavi edici fırsatlar sağlayabilir. Bu nedenle, kolay ve ekonomik yalıtım, genişleme ve vasküler endotel hücreleri insan Yağ dokusundan Adipojenik potansiyelinin değerlendirilmesi için bir metodoloji tanımlamak için ilgi olduğunu.
CD34 + CD31 + insan subkutan ve omental visseral yağ dokusu depoları hücrelerden daha önce anjiogenik potansiyellerini, inflamatuar aracılar üretimi, onların yaşlanma işaretleri ve diğer işlevleri11 dayalı karakterize , 31. ancak, böyle hücrelerinin Adipojenik potansiyel için yayımlanmış hiçbir kanıt yoktur. Ayrılmış CD34 + CD31 + manyetik boncuklar kullanarak hücreleri önceki yayınları çok sayıda konular (10 veya daha fazla)11havuza alınan hücrelerden veri raporu. Bu kağıt için bir protokolü başarılı yalıtım ve genişleme CD34 + CD31 + deri altı ve omental depoları tek insan bağış hücrelerden ilk kez bildirir. Biz izole ve hücreleri gibi 2-3 g yağ dokusunun küçük genişlettik. CD34 + CD31 + hücreleri 3-%5 Toplam SVF hücre temsil ve görüntülenen > % 90 canlılığı yalıtım sonra. Bu hücreler son derece proliferatif ve çok çeşitli bir vitro stimülasyon rosiglitazone ve insülin ile takip Adipojenik farklılaşma doğru yanıt gösterdi. Önceki çalışmalarda sadece yağ kök hücreleri veya toplam stromal vasküler kesir insan Yağ dokusundan Adipojenik yanıt-e doğru4,32,33,34sınamak için kullanılır. Bir son çalışmada insan yağ dokusunun microvasculature üzerinden tek hücre süspansiyonlar kullanılmış ama farklılaştırılmış adiposit duvar veya doğa3endotel olup belirsizdir.
CD34 + CD31 + hücreleri akış sitometresi kullanarak ek immunophenotyping CD45 ve CD24 işaretleri kendi depo menşei ne olursa olsun onların eksikliği gösterdi. Önemlisi, biz gösterdi ki kültür, 3 pasajlar sonra CD31 + CD34 + hücre acetylated LDL birikmesi ve 3D matris bir vitro tüp oluşumu gösterdiği onların endotel işlevselliğini korur. Ayrıca, farklılaştırılmış adiposit nüfus dayalı onların morfolojisi ve moleküler işaretleyiciler UCP-1 protein ifadesi de dahil olmak üzere, beyaz ve bej/kahverengi hücrelerinin temsil. Önceki çalışmalarda farelerde yağ dokusu damarlara hem beyaz bir kaynağı olabilir ve kahverengi adiposit5,30 ve daha yeni veriler beyaz ve işlevsel farklılaşma ile ilgili olarak benzer bir sonuç gösterdi gösterdi termojenik bej hücreleri insan yağ damarlara3.
Adipocyte farklılaşma ataları vitrobir dizi için birden fazla maddeler içeren Adipojenik kokteyller kullanılan çoğu yayınları, biz rosiglitazone ve insülin gerekli ve yeterli Adipojenik için bulundu İndüksiyon CD34 + CD31 + hücreler. Biz o rosiglitazone yalnız bir lipid birikimi olmayan yağ hücreleri35, pan-adipocyte ve kahverengi/bej adipocyte işaretleri için moleküler imza tetikleyebilir farkında olmakla birlikte, UCP-1 protein de dahil olmak üzere ifade select hücrelerdeki onaylar Olgun Adipocyte fenotip bazı farklılaştırılmış hücrelerin. Bizim iki madde Adipojenik kokteyl yordam Protokolü basitleştirir ve daha düşük maliyetli hale getirir.
Önemli bir gözlem CD34 + CD31 + hücrelerinin Adipojenik yanıt verici konu ve yağ deposu ile son derece değişken idi. Yanıt yağ kök hücreleri veya stromal vasküler ataları olmuştur Adipojenik depo özgü farklılıkları daha önce32,34rapor ise böyle bir tepki konu değişkenliği roman bir gözlem. Dışarı 20 insan örnekleri analiz, 3 SC ve 7 OM hücrelerinin Adipojenik indüksiyon için cevap vermedi. En sağlam yanıt gösterdi > ilginç OM 4 örnekleri için indüksiyon için SC den ve 2 örnekleri için duyarlı hücrelerin % 90, Biz bulundu yanıt olumsuz HbA1c ile ilişkilidir ve yanıt olarak bir ile ilişkili değil in vitro farklılaşmamış hücreleri insülin uyarım. Tartışıyoruz yanıt farklılığı nedeniyle tekniği tekrarlanabilirlik zavallı değil ama oldukça bireysel parmak izi vivo yanıtları taklit hücrelerinin yansıtır. Bu fark yanıt korunması, daha fazla doğrulama gerektirir ve temsil nispeten kolay tarama yöntemi tedaviler için duyarlılık için hedef alan adipogenesis vivo içindeteşvik etmek. Daha fazla potansiyel Adipojenik bireysel değişkenlik kaynağını anlamak için ek immunophenotyping belirli adipocyte atası işlevi ayı hücre altgrupları CD34 + CD31 + nüfus içinde tanımlamak gereklidir.
Bu iletişim kuralı sınırlamaları bazıları hücre popülasyonlarının eksik bir karakterizasyonu şunlardır; nispeten uzun genişleme ve farklılaşma kez (2 hafta + 2 hafta); insan örnekleri ve taze toplanan dokuların hemen işleme için gereken erişim sınırlamaları potansiyel; ve farklılaştırılmış hücrelerin fonksiyonel verisi geçerli olmadığı. Bu metodolojinin bir tekrarlanabilir ve değil emek yoğun iletişim kuralı içeren bir çok avantajı vardır; hücreler bu büyük olasılıkla onların içinde vivo fenotip parmak izi korumak; çok az miktarda nispeten düşük maliyetlerle dokuların hücreleri genişlemesi; hücreleri cryopreserve ve yeniden kültür takip onların Adipojenik imza muhafaza imkanı; ve gelecekteki tarama veya başka amaçlar için kullanılabilir böylece depoları bu hücreler oluşturma seçeneği.
Bu iletişim kuralı ve CD34 + CD31 + bir sonuç elde edilen hücreleri translasyonel bir platform olarak Mekanik araştırmalar ve amaçlar süzmek için kullanabilirsiniz.

Son kanıtlar hem fareler ve insanlar, yağ dokusu damarlara ikamet eden hücre alt grubunu beyaz veya bej/kahverengi adiposit1,2,3Ayrıştırılan gösterir. Bu tür hücrelerin fenotip tartışmalara, endotel hücreleri, düz kas/pericyte veya ara fenotipleri4,5,6,7bir spektrum destekleyen kanıt ile bir konudur. Bu metodoloji geliştirme kapsam CD34 + CD31 + endotel hücreleri obez insanlar farklı yağ depoları dan izole Adipojenik potansiyelini test etmek için yapıldı. Diğer çalışmalar literatürde potansiyel toplam stromal vasküler fraksiyonunun veya bilinen adipocyte ataları2,8,9Adipojenik üzerinde duruluyor. Şu anda mevcut teknolojilerin özellikle yağ dokusu endotel hücreleri ilaç teslim10için hedef olabilir olduğundan, potansiyel böyle hücrelerinin Adipojenik geçmesi anlama indüksiyon beyaz veya bej adiposit doğru için önemlidir gelecekte hedefli tedaviler.
Farklı gruplar CD31 ve CD34 işaretleri arada insan yağ dokusu11,12,13endotel hücreleri izole etmek için vekilleri olarak bildirdi. Genellikle, yalıtım iki sıralı adımları ve manyetik boncuklar kullanarak pozitif seçimi kullanılarak gerçekleştirilir. Bu raporda, CD31 plastik boncuk ile kombine CD34 + manyetik bir boncuk kullanarak immunoseparation kullanılmıştır. Bu teknik sıralı manyetik immunoseparation tipik Arnavut kaldırımlı endotel morfoloji korunması ile ilgili olarak daha üstün bulduk. Ayrıca, 1-2 g yağ gibi küçük başlangıç genişleme ve Adipojenik indüksiyon için gerekli yeterince hücre oluşturmak başardık. Küçük örnek biyopsi subkutan yağ hücreleri aşağı akım uygulamaları için gerekli miktarı üretmek için yeterli olacaktır. Bu açıdan özellikle bu yöntem insan denekler Adipojenik indüksiyon bir kavramaları için tarama için kullanılacaktır, potansiyel olarak önem kazanır.
Literatürde bildirilen diğer sistemlerin aksine, bu yöntem CD34 + CD31 + hücrelerinin Adipojenik indüksiyon için sadece iki malzemeler kullanır: bir PPARγ agonist — rosiglitazone — ve insan insülin. Önemlisi, insanlar14post-absorptive insülin dolaşan normal/yüksek Aralık içinde kullanılan insülin miktarı düşer. Akt fosforilasyon tarafından ölçülen hücreleri vitro, insülin duyarlılık derecesini indüksiyon kokteyl tepki yeteneğini kendi ile ilişkili değil. İlginçtir, bu indüksiyon kokteyl ve deneysel koşullar kullanarak, beyaz ve bej/kahverengi hücreleri bir karışımı elde edilen boyutu ve sayıda hücre içi lipid damlacıkları ve moleküler işaretleyicilerin görünümünü ifade tarafından belirlendiği gibi. Bu basit ve maliyet-etkin indüksiyon Protokolü (bej beyaz vs. ) Yanıtlayıcı hücrelerinin fenotip kantitatif değerlendirilmesi ile birlikte potansiyel olarak farklılaştırılmış bej dengesini değiştirebilir ajanlar bir tarama için izin verir : beyaz adiposit.
Bu yöntem aynı zamanda insan yağ dokusu içinde vasküler endotel ataları adipogenesis temel mekanizmaları anlamak için translasyonel bir yaklaşım sağlar. Bu özel yalıtım/farklılaşma tekniği kullanarak, müfettişler çeşitli yolları yalın ve obez insanlarda çeşitli yağ depoları dan adipogenesis vasküler endotel hücre alt grubunu içinde sorumlu sorguya çekebiliriz.

isolation, expansion, and adipogenic induction of cd34+cd31+ endothelial cells from human omental and subcutaneous adipose tissue

Obezite bir geniş yağ dokusu adipocyte hipertrofisi ile öncelikle remodeling tarafından eşlik ediyor. Aşırı adipocyte büyüme insülin, yerel hipoksi ve inflamasyon zavallı bir yanıt sonuçlanır. Tarafından ataları gelen fonksiyonel beyaz adiposit farklılaşma uyarıcı, radikal hipertrofisi adipocyte nüfusun önlenebilir ve sonuç olarak, yağ dokusu metabolik sağlık bir azalma ile birlikte geliştirilebilir iltihap. Ayrıca, bej/kahverengi adiposit bir farklılaşma uyararak, toplam vücut enerji harcaması, kilo kaybına kaynaklanan artırılabilir. Bu yaklaşım obezite komorbiditeler tip 2 diyabet ve kardiyovasküler hastalık gibi gelişimini engelleyebilir.
Bu kağıt yalıtım, genişleme ve beyaz ve bej adiposit CD31 ve CD34 işaretleri Co hızlı insan yağ dokusu endotel hücre alt grubunu üzerinden farklılaşma açıklanmaktadır. Yöntem nispeten ucuzdur ve emek yoğun değil. İnsan yağ dokusu erişimi gerektirir ve subkutan depo örnekleme için uygundur. Bu iletişim kuralı için taze yağ doku örnekleri morbid obez bir konu [vücut kitle indeksi (VKİ) > 35] Bariatrik cerrahi prosedürler sırasında toplanır. Stromal vasküler kesir üzerinden sıralı bir immunoseparation kullanarak, yeterince hücre gibi 2-3 g yağ küçük üretilmektedir. Bu hücreler kültür-ebilmek var olmak genişlemek 10-14 gün içinde cryopreserved ve geçiş kadar 5-6 passaging ile onların Adipojenik özellikleri korurlar. Hücreleri bir Adipojenik insan insülin bir arada ve PPARγ agonist-rosiglitazone kullanarak kokteyl ile 14 gün için kabul edilir.
Bu yöntem-ebilmek var olmak kullanılmış yağ endotel hücrelerinde Adipojenik yanıt-e doğru götürmek moleküler mekanizmaları üzerinde kavramı deneyler kanıtı elde etmek için veya Adipojenik artırabilir yeni ilaçlar eleme için yanıt ya beyaz doğru yönetmen ya da bej/kahverengi adipocyte farklılaşma. Küçük subkutan biyopsi kullanarak, Bu metodoloji Yanıtlayıcı olmayan konular için klinik çalışmalarda bej/kahverengi ve beyaz adiposit komorbiditeler ve obezite tedavisi için teşvik etmek amaçlı dışarıda için kullanılabilir.

Bizim iletişim kuralı CD34 + CD31 + insan yağ dokusunun farklı depoları damar hücreleri Adipojenik potansiyelini belirlemek için bir vitro yaklaşım sunmayı amaçlamaktadır. Basitleştirilmiş akış diyagramı Şekil 1Aile gösterilir. CD34 hücreleri ifade olumlu bir seçim kullanarak ilk adım > %95 CD34 + hücre nüfus taze izole hücre (Şekil 1A) sonuçlanır. Önemlisi, bu işareti hücreleri birkaç pasajlar için kültürlü sonra kaybolur. CD34 çeşitli hematopoetik ve hematopoetik sigara ataları için ortak bir işaret olduğu için endotel ataları ayrılması için gereken aşağıdaki adım CD31 + hücreleri (Şekil 1A) CD34 + hücre nüfus olumlu seçimidir. CD31 kalem endotel hücreleri için olsa da, ayrıca hematopoetik hücrelerin alt kümeleri üzerinde bulunabilir. Akış Sitometresi tarafından birkaç hazırlıklar omental ve subkutan yağ analiz ve tutarlı bir şekilde CD34 + CD31 + hücreleri CD45 marker (1B rakam, üst panelleri) ifade yok bulundu. Genellikle, < hücrelerin % 1 Toplam hücresini nüfus dışında CD45 pozitifliği gösterdi. Bu sonuç büyük olasılıkla bir hazırlık hematopoetik ataları neredeyse ücretsiz elde ipuçlarına göre yol açtı. Hücreleri adipocyte kök hücre işaretçisi CD24 hızlı Eğer belirlemek için omental ve subkutan depoları hücrelerden analiz ve hemen hemen hiçbir hücre omental depo (1B biçim, alt paneller) ve % 5'den az CD24 işaretleyicisinde ifade bulundu hücreleri (gösterilmez) Subkutanöz depo işaretleyicisinde dile getirdi. Sonuç olarak, bu ayrılık metodoloji kullanarak biz CD34 + CD31 + CD45 CD24 hücreleri obez konular omental ve subkutan depoları elde.
Plastik Boncuk kullanarak Birleşik CD31 antikor ile Arnavut kaldırımı endotel morfoloji görüntülenen bir CD31 antikor ile Birleşik manyetik boncuklar kullanılarak ayrılmış hücreleri aksine erken geçişleri sırasında gösterilen hücreleri elde edilen bir seklinde mezenkimal fenotip hemen sonra ayrılık (Şekil 2A). Daha fazla CD34 + CD31 + hücreler endotel kimliğini kanıtlamak için biz iki fonksiyonel deneyleri gerçekleştirilen: bir alımını dıı-Ac-LDL ve bir membran matris (matris bu andan anılacaktır) oluşumu içinde vitrotüp. CD34 + CD31 + hücreleri dıı-Ac-LDL ile inkübe ve hücreler büyük çoğunluğu (Şekil 1 c) alımı için olumlu idi. Pozitif kontrol, biz piyasada bulunan bir insan yağ dokusu mikrovasküler endotel birincil hücre satır (HAMVEC) kullanılır (bkz: Malzemeler tablo ve Şekil 1 c). CD34 + CD31 + hücreler endotel işlevlerine 3D Matrix'te kendiliğinden gemi benzeri yapıları vitro, oluşturmak için yetenek böyle hücre belirlenerek kültür sonra korumak olup olmadığını da test ettik. 3 geçişler sonra CD31 + CD34 + formlar gemi benzeri yapılar bir matris bir HAMVEC birincil insan endotel hücre satırı (Şekil 1 d) ile karşılaştırılabilir.
2-3 pasajlar için hücreleri genişletme sonra biz EGM-2 tam medya %5 FBS, rosiglitazone (1µM) ve insülin (144 mU/mL) ile desteklenmiş DMEM/F12 medya içine pro-anjiogenik büyüme faktörleri içeren hücrelerden açık. EGM-2 hücreleri medya önemli ölçüde tamamlandı korumak onların Adipojenik farklılaşma azaltılmış. Ayrıca, deksametazon ve 3-isobuthyl-1-methylxanthine medya için bir ek oranı değişmedi ve lipid birikimi kapsamını ve indometazin ekleme azaltılacağını lipid birikimi (veri gösterilmez). Bu ön deneyler üzerinde bağlı olarak, biz Adipojenik indüksiyon için rosiglitazone ve insülin sadece kullanmaya karar verdi. 14 gün sonra Adipojenik medya kültürünün, hücreleri sabit ve yağ kırmızı O ile lekeli veya Nil kırmızı ve çekirdekleri DAPI (Şekil 2B) ile counterstained. Rakamlar, temsili resim eşleştirilmiş subkutan (SC) (2B şekil, üst panelleri) ve 37-45 kg/m2arasında bir BMI ile üç insan deneklerin omental (OM) (2B şekil, alt paneller) Yağ dokusundan izole hücre gösterilir. Lütfen indüksiyon yanıtı konuları arasında aynı konuda depoları arasında yaygın olarak değiştiğini unutmayın. 2B şekil, üniloküler (kırmızı oklar) ve multilocular (beyaz ok) karışık bir nüfusa floresan görüntüde görülen olarak lipid içeren hücrelerin yanı sıra lipidler (sarı ok) birikir değil hücreleri genellikle mevcut. Bu hücreler sayı arasındaki oranı da çok konu ve menşe depo ile değişkendir. Bir miktar lipid içeren yüzdesi (yağ kırmızı O pozitifliği üzerinde dayalı) hücreleri (çekirdeklerin DAPI lekeli dayalı) Toplam hücrelere gösterdi aynı SC ve OM depoları arasında anlamlı bir fark bireysel, SC depo hücrelerden Adipojenik İndüksiyon (Şekil 2C) daha duyarlı olmak. Heterojenite yanıt konular ve aynı konuda depoları arasında açıklanabilecek açık değildir. Ancak, biz büyük olasılıkla yalıtım protokolünde vivo içinde fenotip/çevre ve değişkenlik nedeniyle değil parmak izi taşıyan hücre nüfus içsel doğası ilişkili, spekülasyon.
Pan-adipocyte işaretçisi adiponektin ve kahverengi/bej işaretleri UCP-1 ve CIDEA hücrelerde gen ifadesi Adipojenik indüksiyon göre 13 gün sonra şiddetindeydi hücreleri adiposit olgun farklılaşma uygulandı onaylamak için un indüklenen kontrol hücreleri. Adiponektin ifade ilâ 10,000-fold (Şekil 2B) kontrollere göre farklılaştırılmış hücrelerin artış. CIDEA ve UCP1 gen ifadesi yalnızca Adipojenik stimülasyon (2D rakam) takip hücrelerde algılanabilir. Özellikle, UCP-1 ifade son derece değişken, beyaz: kahverengi farklı oranlarda yansıtan / bej hücreleri hücre nüfus içinde. Oda temizliği gene RPL27 ifade örnekleri ile 18-20 döngüleri arasında değişen CT değerleri arasında son derece tutarlı ve hiçbir önemli farklılıklar Adipojenik farklılaşma uygulandı hücreler arasında bulundu ve tedavi edilmemiş kontrol eder. Ayrıca çok locular fenotip, mitokondrial yerelleştirme (Şekil 2E) öneriyor punctated bir desende görüntülenir hücrelerdeki UCP-1 protein ifade algıladı. UCP-1 protein algılanabilir değildi lipidler birikir değil hücre veya hücreleri birden çok, adipositler (Şekil 2E) tam olarak büyük olasılıkla yer almayan çok küçük damlacıklar Ayrıştırılan.
Bizim gözlem CD34 + CD31 + hücrelerinin Adipojenik potansiyelini depo özeldir ve son derece değişken farklı konular arasında bize BMI, yaş ve HbA1c ile olası korelasyonlar için aramaya istenir. Test 28 örnekleri arasında biz did değil bulmak Adipojenik potansiyel ve yaş ve BMI arasında önemli herhangi bir korelasyon; Ancak, HbA1c ve lipid birikimi arasında önemli bir negatif ilişki OM depo (Şekil 3A) hücrelerden içinde bulduk. Bu bulgu kronik hiperglisemik çevre ile potansiyel bir bağlantı gösterir ve gelecekteki soruşturma hak ediyor. Bu da CD34 + CD31 + hücreler büyük olasılıkla bir Adipojenik indüksiyon tepki yeteneğini kendi içinde vivo imzası taşıdığını göstermektedir. Biz de bu hücreler Akt fosforilasyon vitro insülin stimülasyon takip çeşitli düzeyleri görüntülemek gösterir (Şekil 3B, üst). Ancak, yanıt bu değişkenlik de yeteneklerini petrol kırmızı O (Şekil 3B, alt) eşleşen örnekleri resimleri boyama tarafından gösterildiği gibi bir Adipojenik farklılaşma geçmesi ile ilişkili değil.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57804/57804fig1.jpg"> Şekil 1: ayrılık ve CD34 + CD31 + insan yağ dokusu hücreleri karakterizasyonu. (A) Bu akış diyagramı gösterir tecrit ve farklılaşma önemli adımlar. CD34 manyetik boncuklar, kullanarak pozitif seçimden sonra > ikinci seçim adım önce taze izole hücrelerinin % 95 olan CD34 +. (B) Bu temsilcisi akış sitometresi bir ileri gösterir dağınık Arsa geçişli canlı hücre nüfus için; bir günahı örnek FITC (BluFl2) Kanal; ve üstte temsilcisi omental örneği CD45 boyama. Alt üst, ama CD24 (Alexafluor 647-etiketli) hücrelerden, omental örnek gösterildiği gibi aynı sırada gösterilir. (C) bunlar temsilcisi filmler göstermek bir alımını dıı-Ac-LDL (kırmızı) CD34 + CD31 + 4 h, vitro kuluçka (üst panel) takip hücreleri tarafından. Benzer bir alımını bir insan yağ dokusu mikrovasküler endotel hücre birincil hücre çizgi (HAMVEC) (alt paneli) bulundu. Çekirdeklerin DAPI tarafından mavi gösterilir. (D) temsilcisi bu filmler bir vitro tüp oluşumu CD34 + CD31 + 3D matris içinde seribaşı hücreleri gösterir. CD34 + CD31 + hücreleri (Bölüm 3) 24-şey tabak boyama FITC-calcein ile takip, tohumlari ve tam endotel hücre medya 4 h için inkübe. Hücreleri ters bir floresan mikroskop kullanarak görüntüsü. Aynı yoğunluk tohumlari HAMVEC, karşılaştırma için kullanıldı. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57804/57804fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57804/57804fig2.jpg"> Şekil 2: Adipojenik indüksiyon ve işaretleri CD34 + CD31 + hücre. (A) Bu temsilcisi filmler Haritayı CD31 + manyetik vs CD31 + plastik boncuk ile olumlu bir seçim kullanarak CD34 + CD31 + hücreleri morfolojik farklılıkları izole. Hücreleri geçiş 1 sonra yalıtım görüntüsü. Kullanılan büyütme 100 X var. (B) bu paneller petrol kırmızı lekeli CD34 + CD31 + hücreleri eşleştirilmiş subkutan (SC) ve 3 farklı konularda omental visseral (OM) örnekleri o temsilcisi filmler vardır. Hücreleri için 2-3 pasajlar EGM-2 tam medya kültürlü olsaydı, o zaman DMEM/F12 medya % 5 ile açık FBS ve insülin (144 mU/mL) ve rosiglitazone (1 µM) ile 14 gün, 3 günde değişti medya ile tedavi. Kullanılan büyütme 100 X var. Temsilcisi floresan görüntü adipo kırmızı lipid damlacıkları (yeşil) ve DAPI nükleer (mavi) boyama gösterir. Üniloküler lipidler (kırmızı ok), multilocular lipid damlacıkları (beyaz ok) ve hiçbir lipid birikimi (sarı ok) gösteren hücreleri içeren hücre karışımı unutmayın. Kullanılan büyütme 200 X, ölçek çubuğu olduğunu 50 µm Bu panel gösterir Adipojenik bir miktar potansiyel olarak petrol kırmızı O (pozitif hücrelerinin toplam DAPI lekeli çekirdekler için normalleştirilmiş ORO) dile getirdi. (C) =. CD34 + CD31 + OM ve SC depoları aynı konuda hücrelerden göstermek Adipojenik önemli bir fark potansiyel bir öğrenci t-testi ile (n = 7). (D) olgun adipocyte gen ekspresyonu işaretleri (adiponektin, UCP-1 ve CIDEA) RT-PCR Adipojenik indüksiyon 14 gün sonra hücreleri ve kontrol hücreleri tarafından ölçülen. Verileri adiponektin gen ekspresyonu için kat-değişiklik olarak ifade edilir. CIDEA ve UCP-1 ifadesi kontrol örnekleri tespit değildi. Değerleri RPL27 olarak temizlik gen için normalleştirilmiş ΔCt temsil eder. RLP27 CT değerlerini Analize dahil tüm örneklerini devredir 18 – 20 arasında olduğunu (n = 3 – 5 konular). Verileri ± SD demek olarak ifade edilir Bir öğrenci t-test verileri bir istatistiksel analiz için kullanıldı. p < 0,05 boş varsayımı reddeder. (E) Bu panel CD34 + CD31 içinde protein ifade UCP-1 gösterir + indüksiyon insülin ve rosiglitazone ile 13 gün sonra hücreleri. Bir insan poliklonal UCP-1 antikor kullanarak Immunocytochemistry UCP-1 seçici bir ifade içinde çok locular adiposit gösterdi. Algılama bir ikincil antikor (kırmızı) rodamine Birleşik ve DAPI çekirdeği (mavi) için boyama kullanarak sağlanır. İlave büyük büyütme UCP-1'e (kırmızı ok) birden fazla lipid damlacıkları farklı boyutlarda çevreleyen hücre çekirdeği (N) yanı sıra (LD) karşılık gelen punctated kırmızı sinyal gösterir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57804/57804fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57804/57804fig3.jpg"> Şekil 3: Adipojenik farklılaşma, HbA1c ve vitro insülin sinyal arasında korelasyon. (A)Spearman (parametrik olmayan) ve OM ve SC hücreler için Pearson (parametrik) korelasyon katsayıları sırasıyla, kullanılan HbA1c ve lipid birikimi arasındaki ilişkiyi belirlemek için (n = 20). Boş varsayımı p için reddedildi < 0,05. (B) üst kısmında bir western Blot fosforile Akt (yeşil) gösterir ve CD34 + CD31 + hücreleri toplam Akt (kırmızı) ifadesinde vitro Adipojenik indüksiyon öncesinde 30 dk için 5 nM insülin ile uyarılmış (n = 8). Alt kısmında bir yağ kırmızı O aynı hücrelerinin Adipojenik indüksiyon 14 gün boyunca takip boyama gösterilir. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57804/57804fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Isolation, Expansion, and Adipogenic Induction of CD34+CD31+ Endothelial Cells from Human Omental and Subcutaneous Adipose Tissue at JoVE.com

Isolation, Expansion, and Adipogenic Induction of CD34+CD31+ Endothelial Cells from Human Omental and Subcutaneous Adipose Tissue

Yağ dokusu vasküler ataları gelen beyaz ve bej adiposit farklılaşma obezite metabolik iyileştirme için potansiyel taşımaktadır. CD34 + CD31 + insan yağı endotel hücre izolasyon ve bir sonraki vitro genişleme ve farklılaşma beyaz ve bej adiposit içine iletişim kurallarını açıklar. Birkaç aşağı akım uygulamaları ele alınmıştır.

Yalıtım, genişleme ve Adipojenik indüksiyon CD34 + CD31 + insan Omental ve deri altı yağ dokusu endotel hücrelerden

Obesity is accompanied by an extensive remodeling of adipose tissue primarily via adipocyte hypertrophy. Extreme adipocyte growth results in a poor ...

isolation-expansion-adipogenic-induction-cd34-cd31-endothelial-cells

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.7K Görüntüleme.  Eastern Virginia Medical School. Yağ dokusu vasküler ataları gelen beyaz ve bej adiposit farklılaşma obezite metabolik iyileştirme için potansiyel taşımaktadır. CD34 + CD31 + insan yağı endotel hücre izolasyon ve bir sonraki vitro genişleme ve farklılaşma beyaz ve bej adiposit içine iletişim kurallarını açıklar. Birkaç aşağı akım uygulamaları ele alınmıştır.

Video: Isolation, Expansion, and Adipogenic Induction of CD34+CD31+ Endothelial Cells from Human Omental and Subcutaneous Adipose Tissue

Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of NK cells and ability to expand in vitro has restricted development of NK cell immunotherapy. Here we describe a method to efficiently expand vast quantities of functional NK cells ex vivo using K562 cells expressing membrane-bound IL21, as an artificial antigen-presenting cell (aAPC).
NK cell adoptive therapies to date have utilized a cell product obtained by steady-state leukapheresis of the donor followed by depletion of T cells or positive selection of NK cells. The product is usually activated in IL-2 overnight and then administered the following day 1. Because of the low frequency of NK cells in peripheral blood, relatively small numbers of NK cells have been delivered in clinical trials.
The inability to propagate NK cells in vitro has been the limiting factor for generating sufficient cell numbers for optimal clinical outcome. Some expansion of NK cells (5-10 fold over 1-2 weeks) has be achieved through high-dose IL-2 alone 2. Activation of autologous T cells can mediate NK cell expansion, presumably also through release of local cytokine 3. Support with mesenchymal stroma or artificial antigen presenting cells (aAPCs) can support the expansion of NK cells from both peripheral blood and cord blood 4. Combined NKp46 and CD2 activation by antibody-coated beads is currently marketed for NK cell expansion (Miltenyi Biotec, Auburn CA), resulting in approximately 100-fold expansion in 21 days.
Clinical trials using aAPC-expanded or -activated NK cells are underway, one using leukemic cell line CTV-1 to prime and activate NK cells5 without significant expansion. A second trial utilizes EBV-LCL for NK cell expansion, achieving a mean 490-fold expansion in 21 days6. The third utilizes a K562-based aAPC transduced with 4-1BBL (CD137L) and membrane-bound IL-15 (mIL-15)7, which achieved a mean NK expansion 277-fold in 21 days. Although, the NK cells expanded using K562-41BBL-mIL15 aAPC are highly cytotoxic in vitro and in vivo compared to unexpanded NK cells, and participate in ADCC, their proliferation is limited by senescence attributed to telomere shortening8. More recently a 350-fold expansion of NK cells was reported using K562 expressing MICA, 4-1BBL and IL159.
Our method of NK cell expansion described herein produces rapid proliferation of NK cells without senescence achieving a median 21,000-fold expansion in 21 days.

Here we describe a method to efficiently expand and purify large numbers of human NK cells and assess their function.

Genişleme, Saflaştırılması, ve İnsan Periferik Kan NK Hücrelerinin Fonksiyonel Değerlendirme

Natural killer (NK) cells play an important role in immune surveillance against a variety of infectious microorganisms and tumors. Limited availability of ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

Most human malaria deaths are caused by blood-stage Plasmodium falciparum parasites. Cerebral malaria, the most life-threatening complication of the disease, is characterised by an accumulation of Plasmodium falciparum infected red blood cells (iRBC) at pigmented trophozoite stage in the microvasculature of the brain2-4. This microvessel obstruction (sequestration) leads to acidosis, hypoxia and harmful inflammatory cytokines (reviewed in 5). Sequestration is also found in most microvascular tissues of the human body2, 3. The mechanism by which iRBC attach to the blood vessel walls is still poorly understood.
The immortalized Human Brain microvascular Endothelial Cell line (HBEC-5i) has been used as an in vitro model of the blood-brain barrier6. However, Plasmodium falciparum iRBC attach only poorly to HBEC-5i in vitro, unlike the dense sequestration that occurs in cerebral malaria cases. We therefore developed a panning assay to select (enrich) various P. falciparum strains for adhesion to HBEC-5i in order to obtain populations of high-binding parasites, more representative of what occurs in vivo.
A sample of a parasite culture (mixture of iRBC and uninfected RBC) at the pigmented trophozoite stage is washed and incubated on a layer of HBEC-5i grown on a Petri dish. After incubation, the dish is gently washed free from uRBC and unbound iRBC. Fresh uRBC are added to the few iRBC attached to HBEC-5i and incubated overnight. As schizont stage parasites burst, merozoites reinvade RBC and these ring stage parasites are harvested the following day. Parasites are cultured until enough material is obtained (typically 2 to 4 weeks) and a new round of selection can be performed. Depending on the P. falciparum strain, 4 to 7 rounds of selection are needed in order to get a population where most parasites bind to HBEC-5i. The binding phenotype is progressively lost after a few weeks, indicating a switch in variant surface antigen gene expression, thus regular selection on HBEC-5i is required to maintain the phenotype.
In summary, we developed a selection assay rendering P. falciparum parasites a more "cerebral malaria adhesive" phenotype. We were able to select 3 out of 4 P. falciparum strains on HBEC-5i. This assay has also successfully been used to select parasites for binding to human dermal and pulmonary endothelial cells. Importantly, this method can be used to select tissue-specific parasite populations in order to identify candidate parasite ligands for binding to brain endothelium. Moreover, this assay can be used to screen for putative anti-sequestration drugs7.

Selection of Plasmodium falciparum Parasites for Cytoadhesion to Human Brain Endothelial Cells

An in vitro model for cerebral malaria sequestration is described1. Plasmodium falciparum infected red blood cells are selected for binding to immortalized human brain microvascular endothelial cells. The selected parasites show a distinct phenotype. The selection process can be applied using various P. falciparum strains and endothelial cell lines.

Seçimi Plasmodium falciparum İnsan Beyninin endotel hücreleri Cytoadhesion için Parazitler

Most human malaria deaths are caused by blood-stage Plasmodium falciparum parasites. Cerebral malaria, the most life-threatening complication of the ...

Expansion of Human Peripheral Blood  &gamma;&delta; T Cells using Zoledronate

Human &gamma;&delta; T cells can recognize and respond to a wide variety of stress-induced antigens, thereby developing innate broad anti-tumor and anti-infective activity.1 The majority of &gamma;&delta; T cells in peripheral blood have the V&gamma;9V&delta;2 T cell receptor. These cells recognize antigen in a major histocompatibility complex-independent manner and develop strong cytolytic and Th1-like effector functions.1Therefore, &gamma;&delta; T cells are attractive candidate effector cells for cancer immunotherapy. V&gamma;9V&#x03B4;2 T cells respond to phosphoantigens such as (E)-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate (HMBPP), which is synthesized in bacteria via isoprenoid biosynthesis;2 and isopentenyl pyrophosphate (IPP), which is produced in eukaryotic cells through the mevalonate pathway.3 In physiological condition, the generation of IPP in nontransformed cell is not sufficient for the activation of &gamma;&delta; T cells. Dysregulation of mevalonate pathway in tumor cells leads to accumulation of IPP and &gamma;&delta; T cells activation.3 Because aminobisphosphonates (such as pamidronate or zoledronate) inhibit farnesyl pyrophosphate synthase (FPPS), the enzyme acting downstream of IPP in the mevalonate pathway, intracellular levels of IPP and sensitibity to &gamma;&delta; T cells recognition can be therapeutically increased by aminobisphosphonates. IPP accumulation is less efficient in nontransfomred cells than tumor cells with a pharmacologically relevant concentration of aminobisphosphonates, that allow us immunotherapy for cancer by activating &gamma;&delta; T cells with aminobisphosphonates. 4 Interestingly, IPP accumulates in monocytes when PBMC are treated with aminobisphosphonates, because of efficient drug uptake by these cells. 5 Monocytes that accumulate IPP become antigen-presenting cells and stimulate V&gamma;9V&delta;2 T cells in the peripheral blood.6 Based on these mechanisms, we developed a technique for large-scale expansion of &gamma;&delta; T cell cultures using zoledronate and interleukin-2 (IL-2).7 Other methods for expansion of &gamma;&delta; T cells utilize the synthetic phosphoantigens bromohydrin pyrophosphate (BrHPP)8 or 2-methyl-3-butenyl-1-pyrophosphate (2M3B1PP).9 All of these methods allow ex vivo expansion, resulting in large numbers of &gamma;&delta; T cells for use in adoptive immunotherapy. However, only zoledronate is an FDA-approved commercially available reagent. Zoledronate-expanded &gamma;&delta; T cells display CD27-CD45RA- effector memory phenotype and thier function can be evaluated by IFN-&gamma; production assay. 7

Expansion of Human Peripheral Blood  &#947;&#948; T Cells using Zoledronate

A method to expand &gamma;&delta; T cells from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) is described. PBMC-derived &gamma;&delta; T cells are stimulated and expanded using zoledronate and interleukin-2 (IL-2). Large scale expansion of &gamma;&delta; T cells can be applied to autologous cellular immunotherapy of cancer.

Zoledronate İnsan Periferik Kan Genişleme γδ T Hücreler

Human &gamma;&delta; T cells can recognize and respond to a wide variety of stress-induced antigens, thereby developing innate broad anti-tumor and ...

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, neutrophils are the first inflammatory cells to migrate to the site of injury. Recruitment of neutrophils to an injury site is a stepwise process that includes first, dilation of blood vessels to increase blood flow; second, microvascular structural changes and escape of plasma proteins from the bloodstream; third, rolling, adhesion and transmigration of the neutrophil across the endothelium; and fourth accumulation of neutrophils at the site of injury2,3. A wide array of in vivo and in vitro methods has evolved to enable the study of these processes4. This method focuses on neutrophil transmigration across human endothelial cells.
One popular method for examining the molecular processes involved in neutrophil transmigration utilizes human neutrophils interacting with primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)5. Neutrophil isolation has been described visually elsewhere6; thus this article will show the method for isolation of HUVEC. Once isolated and grown to confluence, endothelial cells are activated resulting in the upregulation of adhesion and activation molecules. For example, activation of endothelial cells with cytokines like TNF-&alpha; results in increased E-selectin and IL-8 expression7. E-selectin mediates capture and rolling of neutrophils and IL-8 mediates activation and firm adhesion of neutrophils. After adhesion neutrophils transmigrate. Transmigration can occur paracellularly (through endothelial cell junctions) or transcellularly (through the endothelial cell itself). In most cases, these interactions occur under flow conditions found in the vasculature7,8.
The parallel plate flow chamber is a widely used system that mimics the hydrodynamic shear stresses found in vivo and enables the study of neutrophil recruitment under flow condition in vitro9,10. Several companies produce parallel plate flow chambers and each have advantages and disadvantages. If fluorescent imaging is needed, glass or an optically similar polymer needs to be used. Endothelial cells do not grow well on glass.
Here we present an easy and rapid method for phase-contrast, DIC and fluorescent imaging of neutrophil transmigration using a low volume ibidi channel slide made of a polymer that supports the rapid adhesion and growth of human endothelial cells and has optical qualities that are comparable to glass. In this method, endothelial cells were grown and stimulated in an ibidi &mu;slide. Neutrophils were introduced under flow conditions and transmigration was assessed. Fluorescent imaging of the junctions enabled real-time determination of the extent of paracellular versus transcellular transmigration.

This article first describes a procedure for isolating human endothelial cells from umbilical veins and then shows how to use these cells to examine neutrophil transmigration under flow conditions. By using a low-volume flow chamber made from a polymer with the optical characteristics of glass, live-cell fluorescent imaging of rare cell populations is also possible.

Akış Koşullarında İnsan umbilikal ven endotel hücreleri ve nötrofil Transmigration Çalışmaları Kullanılması İzolasyonu

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

Isolation of Adipose Tissue Immune Cells

The discovery of increased macrophage infiltration in the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an intensification of interest in immune cell contribution to local and systemic insulin resistance. Isolation and quantification of different immune cell populations in lean and obese AT is now a commonly utilized technique in immunometabolism laboratories; yet extreme care must be taken both in stromal vascular cell isolation and in the flow cytometry analysis so that the data obtained is reliable and interpretable. In this video we demonstrate how to mince, digest, and isolate the immune cell-enriched stromal vascular fraction. Subsequently, we show how to antibody label macrophages and T lymphocytes and how to properly gate on them in flow cytometry experiments. Representative flow cytometry plots from low fat-fed lean and high fat-fed obese mice are provided. A critical element of this analysis is the use of antibodies that do not fluoresce in channels where AT macrophages are naturally autofluorescent, as well as the use of proper compensation controls.

Adipose tissue (AT) is a site of intense immune cell activation and interaction. Almost all cells of the immune system are present in AT and their ratios are altered by obesity. Proper isolation, quantification, and characterization of AT immune cell populations are critical for understanding their role in immunometabolic disease.

Yağ Doku Bağışıklık Hücre İzolasyonu

The discovery of increased macrophage infiltration in  the adipose tissue (AT) of obese rodents and humans has led to an  intensification of interest in ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen presenting cell (APC) types found in a normal thymus and it is well established that they play distinct roles during thymic selection. These cells are localized in distinct microenvironments in the thymus and each APC type makes up only a minor population of cells. To further understand the biology of these cell types, characterization of these cell populations is highly desirable but due to their low frequency, isolation of any of these cell types requires an efficient and reproducible procedure. This protocol details a method to obtain cells suitable for characterization of diverse cellular properties. Thymic tissue is mechanically disrupted and after different steps of enzymatic digestion, the resulting cell suspension is enriched using a Percoll density centrifugation step. For isolation of myeloid DC (CD11c+), cells from the low-density fraction (LDF) are immunoselected by magnetic cell sorting. Enrichment of TEC populations (mTEC, cTEC) is achieved by depletion of hematopoietic (CD45hi) cells from the low-density Percoll cell fraction allowing their subsequent isolation via fluorescence activated cell sorting (FACS) using specific cell markers. The isolated cells can be used for different downstream applications.

This protocol details a method to isolate antigen presenting cells from human thymus via different steps of enzymatic digestion of the tissue followed by density centrifugation of the single cell suspension and finally magnetic and/or FACS sorting of the cell populations of interest.

İnsan Thymus ile myeloid dendritik hücreleri ve epitel hücreleri İzolasyonu

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua parietalis). This interface is the anatomical site of contact between maternal and fetal tissues; therefore, it is an immunological site of action during pregnancy. Infiltrating leukocytes at the maternal-fetal interface play a central role in implantation, pregnancy maintenance, and timing of delivery. Therefore, phenotypic and functional characterizations of these leukocytes will provide insight into the mechanisms that lead to&#160;pregnancy disorders. Several protocols have been described in order to isolate infiltrating leukocytes from the decidua basalis and decidua parietalis; however, the lack of consistency in the reagents, enzymes, and times of incubation makes it difficult to compare these results. Described herein is&#160;a novel approach that combines the use of gentle mechanical and enzymatic dissociation techniques to preserve the viability and integrity of extracellular and intracellular markers in leukocytes isolated from the human tissues at the maternal-fetal interface. Aside from immunophenotyping, cell culture, and cell sorting, the future applications of this protocol are numerous and varied. Following this protocol, the isolated leukocytes can be used to determine DNA methylation, expression of target genes, in vitro leukocyte functionality (i.e., phagocytosis, cytotoxicity, T-cell proliferation, and plasticity, etc.), and the production of reactive oxygen species at the maternal-fetal interface. Additionally, using the described protocol, this laboratory has been able to describe new and rare leukocytes at the maternal-fetal interface.

Described herein is a protocol to isolate and further study the infiltrating leukocytes of the decidua basalis and decidua parietalis - the human maternal-fetal interface. This protocol maintains the integrity of cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications as proven by flow cytometry analysis.

İnsan Maternal-Fetal Arabirimi lökosit İzolasyonu

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

Isolation of Viral Replication Compartment-enriched Sub-nuclear Fractions from Adenovirus-infected Normal Human Cells

During infection of human cells by adenovirus (Ad), the host cell nucleus is dramatically reorganized, leading to formation of nuclear microenvironments through the recruitment of viral and cellular proteins to sites occupied by the viral genome. These sites, called replication compartments (RC), can be considered viral-induced nuclear domains where the viral genome is localized and viral and cellular proteins that participate in replication, transcription and post-transcriptional processing are recruited. Moreover, cellular proteins involved in the antiviral response, such as tumor suppressor proteins, DNA damage response (DDR) components and innate immune response factors are also co-opted to RC. Although RC seem to play a crucial role to promote an efficient and productive replication cycle, a detailed analysis of their composition and associated activities has not been made. To facilitate the study of adenoviral RC and potentially those from other DNA viruses that replicate in the cell nucleus, we adapted a simple procedure based on velocity gradients to isolate Ad RC and established a cell-free system amenable to conduct morphological, functional and compositional studies of these virus-induced subnuclear structures, as well as to study their impact on host-cell interactions.

We provide a novel strategy to isolate viral replication compartments (RC) from adenovirus (Ad)-infected human cells. This approach represents a cell-free system that can help to elucidate the molecular mechanisms regulating viral genome replication and expression as well as regulation of viral-host interactions established at the RC.

Adenovirüs ile enfekte Normal İnsan Hücreleri Viral Çoğaltma Bölme zenginleştirilmiş Alt nükleer Kesirler izolasyonu

During infection of human cells by adenovirus (Ad), the host cell nucleus is dramatically reorganized, leading to formation of nuclear microenvironments ...

Isolation of Sertoli Cells and Peritubular Cells from Rat Testes

The testis, and in particular the male gamete, challenges the immune system in a unique way because differentiated sperm first appear at the time of puberty - more than ten years after the establishment of systemic immune tolerance. Spermatogenic cells express a number of proteins that may be seen as non-self by the immune system. The testis must then be able to establish tolerance to these neo-antigens on the one hand but still be able to protect itself from infections and tumor development on the other hand. Therefore the testis is one of a few immune privileged sites in the body that tolerate foreign antigens without evoking a detrimental inflammatory immune response. Sertoli cells play a key role for the maintenance of this immune privileged environment of the testis and also prolong survival of cotransplanted cells in a foreign environment. Therefore primary Sertoli cells are an important tool for studying the immune privilege of the testis that cannot be easily replaced by established cell lines or other cellular models. Here we present a detailed and comprehensive protocol for the isolation of Sertoli cells - and peritubular cells if desired - from rat testes within a single day.

Primary Sertoli cells are required for studying testis-immune privilege, signal transduction during inflammation or infection, and utilization of their immunoprotective properties. Here we describe an enzyme-based protocol for the isolation of highly purified primary Sertoli cells and peritubular cells from rat testes.

Sıçan Testislerindeki Sertoli Hücreleri İzolasyon ve peritübüler Hücreler

The testis, and in particular the male gamete, challenges the immune system in a unique way because differentiated sperm first appear at the time of ...

Isolation of Macrophage Subsets and Stromal Cells from Human and Mouse Myocardial Specimens

Macrophages represent the most heterogeneous and abundant immune cell populations in the heart and are central in driving inflammation and reparative responses after cardiac injury. How various subsets of macrophages orchestrate the immune responses after cardiac injury is an active area of research. Presented here is a simple protocol that our lab performs routinely, for the extraction of macrophages from mouse and human myocardium specimens obtained from healthy and diseased individuals. Briefly, this protocol involves enzymatic digestion of cardiac tissue to generate a single cell suspension, followed by antibody staining, and flow cytometry. This technique is suitable for functional assays performed on sorted cells as well as bulk and single cell RNA sequencing. A major advantage of this protocol is its simplicity, minimal day to day variation and wide applicability allowing investigation of macrophage heterogeneity across various mouse models and human disease entities.

Presented here is a protocol to isolate various subsets of macrophages and other non-immune cells from human and mouse myocardium by preparing a single cell suspension through enzymatic digestion. Gating schemes for flow cytometry based identification and characterization of isolated macrophages are also presented.

Makrofaj Alt Kümelerinin ve Stromal Hücrelerinin İnsan ve Fare Miyokardiyal Örneklerden İzolasyon

Macrophages represent the most heterogeneous and abundant immune cell populations in the heart and are central in driving inflammation and reparative ...