Hayvan hademe ENI'ın hayvan tesisi üreme ile ilgili yardım ve Dr Nuno Raimundo el yazması yararlı yorumlar için teşekkür ediyoruz. Sohbet ortak araştırma merkezi SFB-889 (proje A8) aracılığıyla Alman Araştırma Vakfı (DFG) ve SFB-1190 (proje P02) ve Emmy Noether Genç Araştırmacı ödülü gelen hibe tarafından desteklenmektedir (1702/1). C.M.R. sinir, Biyofizik ve moleküler Biosciences (GGNB) için bursu Göttingen Enstitü tarafından desteklenmektedir.

Rapor burada tüm hayvan deneyleri için hayvan refah Avrupa esaslarına göre yürütülmektedir (2010/63/AB) Niedersächsisches Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit (LAVES), kayıt numarası 14 tarafından onayı ile / 1701.
1. tasarım üzerinde çalışmaya
<ol><li>Hayvan davranışları iş dikkatli planlama gerektirir gibi deney tasarımı sırasında aşağıdaki parametreleri göz önünde bulundurun.<ol>
<li>Grup gerekli hayvan sayısı.<ol>
<li>İstatistiksel bir yazılım (Örneğin, PASS, EDA veya GPower) gerekli Grup boyutunu hesaplamak için kullanın. Not: Hayvanlar ve fenotip şiddeti arasında varyasyon Grup boyutu bağlıdır. Kinematik yürüyüş analizi için fare sayısı genellikle grup başına 10-20 dir.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Deneysel hayvan seks.<ol>
<li>Östrojen düzeyleri etkisi deneme, hayvan zorlanma bağlı olarak göz önünde bulundurun. Not: Birçok davranış çalışma östrojen düzeyleri etkisi deneme önlemek için erkekler üzerinde odaklanın. Bu etkilerden hayvan arka plan zorlanma bağlı olarak daha fazla veya daha az güçlü.</li>
			<li>Her iki cinsiyette kullanılacaksa, seks etkisi için test etmek ve değerlendirmek iki cinsiyetten bağımsız olarak gerekli olduğunda.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Deneysel hayvan çağı.<ol>
<li>Eğer sadece tek seferlik noktası gereklidir Yetişkin hayvanlar (2 ay yaş, ve üstü) kullanın.</li>
			<li>İlerleyen yaş ile motor davranış değişikliği belirlenmesi için birkaç saat noktaları seçin. En kısa zamanda 1 ay sonra fareler annelerinden sütten kesmek noktasıdır. Hayvanlar düzenli aralıklarla, Örneğin, 1, 2 veya 3 ayda sınayın.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hayvan davranış testleri gerçekleştirmek için yerel yetkililerden yetkilendirme için geçerlidir.</li>
	<li>Test hayvanları tedarik için planlar yapmak.<ol>
<li>Bir üreme planı yapın ya da yeterli deneysel hayvan deneyleri ne zamandan beri günde kullanılabilir bir hayvan distribütörü zamanında ulaşın.</li>
		<li>Deneyler sırasında yeni bir oda/mekana koymanındaha bir hafta boyunca alıştırmak hayvan izin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. video kaydı
Not: kinematik yürüyüş analizi kullanımını göstermek için burada bir piyasada bulunan görüntüleme sistemi ( Tablo reçetesigörmek) eşlik eden görüntüleme ve analiz yazılımı ile kullanılır.
<ol><li>Belgili tanımlık bilgisayar ve belgili tanımlık imge bilgisayar yazılımı başlatın.</li>
	<li>Ev onun kafes içinde gözlemleyerek ve bir denge üzerinde ağırlık sağlık durumu ve her hayvan refahı belirler.</li>
	<li>Gerektiğinde, hafifçe kırmızı parmak boya hayvanın pençeleri bir fırça ile uygulanır. ~ 5 dk içinde yedek temiz kafes için kuru boya izin. Not: boya pençeleri ve vücut arasındaki kontrastı arttırmak için kullanılır gibi hayvanın karın boyama kaçının. Siyah parmak boya düzeltmeler için kullanışlı yararlıdır. Kahverengi kürklü hayvanlar için bu adım gerekli veya kimlik için durumda pençeleri dövme. Bir hayvan pençeleri boyamak için seçilen, tüm hayvanlarda aynı grubu ve kontrol grubu de boyalı gerekir.</li>
	<li>Koşu bandı cihazları sağ üst panelde hızını; Birden fazla çalışan hızlı uygulanacaksa, en yavaş hızı ile ilk başlar.</li>
	<li>Hayvan test odasında yerleştirin (odası kapatırken kuyruğu ya da pençe sıkma önlemek). Karanlık bir bezle odası kapsar ve 1-2 min için ayarlamak her hayvan olanak sağlar.</li>
	<li>Test odası ışıkta koşu bandı ışık döner anahtarı "on" konumuna çevirerek açın. "Koşu başlatmak için iletmek için" koşu bandı çevirmeli anahtar açmak, sonra Imager yazılımındaki "kayıt" düğmesini tıklatın. Not: koşu bandı çalışırken, bu hayvan performans dikkatle ve sürekli gözlemlemek önemlidir: hayvan koşu bandı hız ile devam edemez koşu bandı hemen durdurmak veya ilgili olmayan hareket için ikincil belirtiler gösterir (Örneğin, epileptik nöbetler). Test koşulları ayarlamalara gidilmesi gerekir.</li>
	<li>Hayvan stabil çalıştığında (taraf, ön veya arka hiçbir hızlı kaçar), kayıt için en az 5 koşu bandı durdurmadan önce s. Imager yazılım "Dur"'ı tıklatarak kaydı durdurmak ve koşu bandı çevirmeli anahtar yeniden "off" konumuna açın. Not: hayvanların kararsız çalışmasını önlemek için bu birkaç saniye için izin veya diğer yönde ("ileri" yerine "tersine çevirmek için" koşu bandı çevirmeli anahtar çevirerek) çalışmasına izin vermek yararlı olabilir.</li>
	<li>Başlangıç ve bitiş noktası (analiz için kullanılmak üzere) video bölümü ayarlanabilir bir menüyü açmak için ımager yazılımındaki "işleme" düğmesini tıklatın. Bunu yapmak için video aracılığıyla gitmek için ekranın altındaki kaydırıcıyı kullanın.</li>
	<li>Geçerli saati başlangıç veya bitiş noktası olarak seçmek amacıyla tıklatın "dan çerçeve #" ve "Kime" sırasıyla. Bölüm en az 7 adımlar/pençe (Toplam 14 adım) stabil sabit bir hızda çalışan hayvanın içerdiğinden emin olun.</li>
	<li>Hayvan kimlik, Doğum tarihi, ağırlık ve seks girin. Verileri bilgisayara veya sunucuya istediğiniz bir konuma kaydedin. "Kamera" kayıt arabirimine dönmek için tıklatın.</li>
	<li>Birden çok çalışan hızları kaydedilmesi gereken, 2.6-2,10 istenen çalışan hızları ile yineleyin. Sonraki videoyu kaydetmeden önce kırmızı boya pençe, aksi takdirde tekrar adım 2.3 hala mevcut olduğundan emin olun.</li>
	<li>Kaydettikten sonra ev onun kafes için hayvan serbest bırakın. Bir hayvan kaldırdıktan sonra koşu bandı kemeri iyice deneysel hayvan için hazırlamak için dezenfektan ardından sabunlu su ile temizleyin.</li>
</ol>3. video işleme
<ol><li>Analiz yazılımı başlatın ve "çalışma seçin, klasör" tıklatın kaydedilen videoları ile klasörü seçmek için.</li>
	<li>Bir video veya art arda işlenebilir ve "git" tıklayın birkaç video seçin</li>
	<li>Fare çalıştığı alanı seçmek için "çizmeye" işlevini kullanın; Bu bölüm yalnızca fare ve beyaz arka plan içermelidir.</li>
	<li>"Ters" koşu bandı işlevi daha önce kullandıysanız, seçin "ilgilinin burun sağa doğru olup olmadığını kontrol edin >>>" yazılım sadece sola çalışan hayvanlar analiz için tasarlanmış bu yana video ayna için. "Devam etmek için kabul et"'i tıklatın.</li>
	<li>Bkz: varsayılan maskesi ve yazılım algılar Yazdır pençe için "Yenile" işlevini kullanın. Not: Orijinal video sol tarafta görüntülenir ve önerilen pati izlerini bir siyah beyaz görüntü hakkıdır.</li>
	<li>Analiz için hayvan burnu kırmızı çevresi hariç maskesini değiştirmek için "uzunluk" ve "Genişlik" kutularına değerler girin; renk belgili tanımlık paws için benzer olduğu için o bölgede maskeleme değil yanlışlıkla bir pençe olarak burun alan sınıflandırma yazılım neden olabilir.</li>
	<li>Ayarlamak belgili tanımlık sürgü "gürültü filtresi" ve "kürk ve karanlık yamalar" filtre"siyah ve beyaz pençe baskı optimize etmek için. ~ 800-950 Siyah hayvanlar için ve ~ 700-800 bağlı olarak hayvan tam kürk rengi kahverengi ya da beyaz hayvanlar için "gürültü" filtre"kaydırıcıyı ayarlayın. "Ayarları tatmin edici are ok" seçin. Not: "Kürk ve karanlık yamalar" filtre"kaydırıcıyı bağlıdır üzerinde nasıl"kırmızı"pençe olduğunu. Boyalı paws için genellikle yaklaşık değerdir 100-120 ve pençeleri olmayan boyaması için en iyi değeri civarındadır 50-100. Bu ayarlar, kürk ve pençeleri renk gölgeleme bağlıdır ve her hayvan için optimize edilmiş olması gerekir. Siyah ve beyaz pençe baskı ile belgili tanımlık paws temiz gösterimleri mümkün olduğunca küçük arka plan gürültü olarak olması gerekir.</li>
	<li>İlk ayarlama geçirilen bir veya daha fazla videolar seçin (etiketlenmiş "@" video adından önce) ve bu videolar Analizi başlatmak için "git" işlevini seçin. Not: Analiz video başına 2-5 dakika sürer. Bu adımı yok girişten deneyci gerektirdiğinden gecede birkaç video analizi çalıştırmak mümkündür.</li>
	<li>Analiz bir video seçin (etiketli "@@@") ve "git" tıklayın Not pençe bölgede (cm2) zaman (yürüyüş dynamics) için ayrı her pençe içinde kemer ile temas şimdi görülebilir. Orijinal video ve hesaplanan pençe seçili alan için yazdırma karşılaştırmak için "video oynatma" işlevini kullanın.</li>
	<li>Yazılım tarafından yapılan küçük hataları düzeltmek için aşağıdaki (üç) araçlarını kullanın.<ol>
<li>Yanlış bir sinyal, karşılık gelen pençe kemer ile temas olmadığı halde bir sinyal yazılım kayıtları ne zaman Örneğin, silmek için "doğru" seçeneğini kullanın. İlgili alanına yakınlaştırma için bir kez tıklatın ve ikinci tıklatmayla kaldırmak için nesnenin sol kenarlığını ve üçüncü tıklama ile sağ kenarlık işaretleyin.</li>
		<li>İki sinyal, pençe kemer ile temas olmasına rağmen sinyal için birkaç kare kaydedildiğinde Örneğin, birleştirmek için "bağlamak" seçeneğini kullanın. İlgili alanına yakınlaştırma ve birleştirmek için iki nesne ortasında çift tıklatın için bir kez tıklatın.</li>
		<li>Zaman puan analiz tamamen kaldırmak için "Sil" seçeneğini kullanın. Yalnızca hata "doğru" veya işlev, sol forelimb pençe bir sinyal sol arka bacak pençe için yanlışlıkla kaydedildiğinde Örneğin, "connect" ile sabit olamaz, bu seçeneği kullanın. İlgili alanına yakınlaştırma için bir kez tıklatın ve ikinci tıklatmayla kaldırmak için alan sol kenarlığı ve üçüncü tıklama ile sağ kenarlık işaretleyin. Not: Araçlar sadece küçük hataları düzeltmek için kullanılabilir; (bir pençe sinyalini son derece zayıf olsaydımesela ) sistematik hatalar düzeltilmiş olamaz: video analizinden çıkarılmalıdır ve ilgili hayvan kayıt tekrarladı, mümkün olduğunda. Not "video oynatma" seçeneği artık "sonra" temin doğruluğundan emin, "connect" veya "Sil" seçeneği kullanılmıştır ve "geri al" düğmesini tıklatarak tüm 3 düzenleme araçları sıfırlamak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>"Sonraki uzuv" seçin 4 bacaklarda; devam etmek için "sonraki bacak" son pençe sonra tıklandığında, yazılım analiz tamamlar ve 4 ekranlarda bu hayvan için sonuçları gösterir.</li>
</ol>4. yürüyüş analizi
<ol><li>Ne zaman tüm videoları bir deneme analiz edilir, tüm videoları seçin ve "sonuçları yeniden düzenlemek" tıklatın sonuçlar (elektronik tablo dosyalarını parametrelerinde listesi) vermek için.</li>
	<li>İle bitiş "reorganized_stride_info" dosyasını açın ve bu elektronik tabloda bulunmayan bilgi ekleyin: grup bilgilerini (Örneğin, genotip, tedavi), yaş ve diğerinde kaydedilir ölçüleri hayvan uzunluğu ve genişliği elektronik tablo dosyası ile bitiş "SFI_TFI_PFI_reorganized_stride_info."</li>
	<li>Gerekli hallerde, hayvan genişliği veya uzunluğu için yürüyüş parametreleri normalize Örneğin, SL hayvan uzunluğunu ve SW için hayvan genişliği için.</li>
	<li>Sonuçlarına göre grup, yaş ve çalışan hızlı sıralama: bağımsız olarak tüm bu koşulları analiz. Not: Farklı yaş veya çalışan hızları aynı grup içinde birlikte kullanılamaz.</li>
	<li>Ortalama (Ortalama) değerler, standart sapma ve her parametre için tüm deneysel koşullar için Ortalama, standart hata hesaplamak.</li>
	<li>Deneysel tasarım göre istatistiksel analiz yapmak, Örneğin, bir 2 kuyruklu tkullanın-mutant/tedavi hayvan bir vahşi türüne (WT) karşılaştırmak için test / kontrol veya ANOVA çeşitli bağımsız gruplar karşılaştırmak için.</li>
	<li>Bak hiç ölçülen parametreler: daha iyi sonuçları görmek için her parametre çizmek yardımcı olur. Belirli bir parametre istatistiki farklılıkları varsa, bağımlı diğer parametreleri buna bağlı olarak değiştirmek kontrol edin. Not: SL belirli bir test grubu içinde önemli ölçüde azalır, (çalışan hızlı aynı olduğu için), bu da daha yüksek bir adım frekans neden olur ve artan bir SW (duruş istikrarı korumak için) neden olabilir.</li>
	<li>Bir model için en uygun olan ve/veya insan hastalığında gözlemler karşılaştırılabilir parametreleri seçin. Bir sunuda, her grup için temsilcisi videoları oluşturmak ve onları ince yürüyüş değişiklikler sık sık videolardan açık değildir bu yana göstergesi ilgili parametreleri için gösterilen grafik tarafından tamamlıyor.</li>
</ol>5. sorun giderme
Not: Bazı hayvanlar, özellikle fare modelleri bir anksiyete fenotip ile bir koşu bandı üzerinde çalışan gibi bile basit bir görevi gerçekleştirmek için zorluklar olabilir. Alt anksiyete düzeyleri için çekilen ve çalışmasını teşvik adımları şunlardır:
<ol><li>Habituation ve olumlu zorlama.<ol>
<li>Doğumdan 2-3 gün önce ilk test test odasında fareyi getirin, karanlık bir bezle kapak ve ışık devre dışı bırakın. Olumlu bir dernek kurulmuş ~ 5 dk. Ekle chow için yeni ortam veya çikolata/fındık ezmesi (Örneğin, Nutella) test odası'na ayarlamak fare izin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hava puffs/arka sınır tarafından olumsuz zorlama.<ol>
<li>Fareler hava puffs veya bir hareketi arkalarındaki sevmiyorum ve karışıklık uzak çalışır. Çalışan motive etmek için hafif hava puffs veya ritmik çubuğunun hareketi, test odası ön kısmını doğru çalıştırmak için fareyi teşvik etmek için test odası, arka sınır oluşturan esnek kullanın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Yavaş başlamak.<ol>
<li>Hızlı çalışan test ederken hızı, daha düşük bir hızda koşu bandı başlatın ve sonra yavaş yavaş istenen sınama koşulu doğru koşu bandı hızını artırmak.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Serbest dolaşımı en aza indirmek.<ol>
<li>Test odası uzunluğu ön ve arka iki ayarlanabilir barlarda ile sınırlıdır. Bir test hayvan ile çalışan hızlı devam ederse ancak giderek çalışmaz, odası 's uzunluğu daha istikrarlı çalışan neden sınırlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Yukarıda belirtilen ölçüler başarılı olmazsa, ertesi gün çalışan kaydetmek. Hayvan hala üç gün sonra test çalışmasına kabul etmiyorsa, bu bulgu olarak kaydetmek ve daha fazla test hayvan hariç. Not: İyi kalite video kaydı yürüyüş analizi sonuçlarını bağlıdır. Eğer videoları dikkatle kaydetmiş olduğunuz videoları çözümleme sırasında bırakmak bir sebebi yok. Video kalitesi yetersiz ise, dijital pençe baskı oluşturulması için parametreleri belirlendiğinde bu 3,6 adımı sırasında belli olacak. Pençeleri ve burun dışında diğer vücut parçası kırmızı görünür (Örneğin, cinsel organ veya parmak boya sprinklings karın üzerinde etrafında eksik kürk nedeniyle), kalitesi önemli ölçüde düşer. 3.6. adımda ayarlamaları yalnızca küçük sorunları düzeltmek izin ve bu bir kabul edilebilir sinyal/noise oranı video getiremezsek, video analizinden dışlanmaları gerekir ve kayıt tekrarlanması gerekiyor. Böylece, bu yakında kayıtları gerçekleştirilir sonra videolar analiz etmek için tavsiye edilir.</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının bildirin.

Motor koordinasyon eğitim modelleri özellikle içinde ciddi motor koordinasyon etkilenir PD gibi hastalıklar için nörodejeneratif hastalıkların karakterizasyonu yararlı bir yaklaşımdır. Kinematik yürüyüş analizi fonksiyonel tahlil yardımıyla, zayıf ateş ve dolayısıyla nispeten mütevazı fenotip ile yürüyüş hayvanların hareket sorunları başlangıcı veya modelleri ince değişiklikleri belirlemek için. Fenotipleri çeşitli küçük yürüyüş anormallikleri ve ağır hareket bozuklukları kapsar nörodejeneratif hastalıkların çeşitli modelleri göz önüne alındığında, bu yöntem yürüyüş parametreleri hayvanın yaşı ve hareket yeteneği dayalı değerlendirmek için de uygundur. Ciddi bir şekilde zarar görür hayvanlar bir yokuş yukarı çalışan Engelli daha az modelleri kaydedilebilir iken uçak koşu bandı veya yüksek hızda yokuş aşağı vasıl a alçak hız yürüyüş kaydedilebilir. Bu hayvanlar overexerting olmadan nörodejeneratif modeli, littermate denetimi arasındaki yürüyüş farklılıkları ortaya çıkarabilir.
Bu iletişim kuralıyla, farelerde yaşlanma ile motor bozuklukları gelişimini izlemek için VPI yöntemi adequateness göstermektedir. Yaşları ilerledikçe test WT fareler birden fazla zaman noktalarda yaş bağımlı yürüyüş anormallikleri tanımlamak ve nasıl onlar yaşlanma ile ilerleme karakterize bize sağladı. Ayrıca, fare modelleri için ateş işlerken kez sunan bu motor davranış (Örneğin, anksiyete, apati, öğrenme güçlükleri), ilgili olmayan belirtiler nedeniyle çıkıştır bile basit bir gerçekleştirmek için istekli hayvan görev çalışan gibi motor, azalır. Burada, biz yöntemi değişiklikleri ve fare satırları nörodejeneratif değişiklikler ile yaşlanma için kinematik yürüyüş analizi başarıyla uygulamak yararlı olabilir ışıklı Motorlu Koşu bandı üzerinde çalışan teşvik etmek için motivasyon araçları öneririz. Ayrıca, hayvanın pençeleri ve önemli ölçüde kaydedilen verilerin kalitesini artırmak için yardımcı olabilir göstermek için parmak boya uygulanması basit bir hile kullanın. İyi video kayıtları elde etmek olduğunu yürüyüş analizi en kritik adım: analiz başarısı, her otomatik veya yarı otomatik analizi görüntülere veya videolara gibi ham veri kalitesine bağlı. Düşük kaliteli videolar analiz sonraki adımlarında, geliştirilmiş olamaz ve genellikle Analizi işleminden dışlanması gerekir.
Sistematik olarak yürüyüş ve duruş WT ve birkaç endophilin mutant hatları 18 ay span üzerinden okurken, biz bile WT fareler ve fareler hiçbir açık hareket/running sorunları (Yani, endophilin 1KO-WT-WT), ile göstermek içinde değişiklikler fark ettim çeşitli yürüyüş ve duruş parametreleri aşamalı bir şekilde (Şekil 2 ve Şekil 3A) ilerleyen yaş ile. İlginçtir ki, biz de anormallikleri endophilin mutantlar yaşlanma gözlenen çeşitli yürüyüş ve duruş parametrelerinin aynı yönde geliştirmek ve yamaç WT/denetim hayvanlar olduğu gibi iken, diğerleri yok fark ettim (Şekil 3). Son olarak, yaşlı WT fareler ve Genç endophilin mutantlar herhangi bir açık hareket, yürüyüş ve göz tarafından gözlenen duruş kusurları bile görüntülenmiyorsa, seçici yürüyüş ve duruş Parametrelerindeki değişiklikler bu yaklaşım ile algılanabilir unutmamak gerekir.
Fare motor davranış testleri bir fare modeli önemli yönü bir insan durumun bildirimlerini göstermek için en kapsamlı yollarından biridir. Sonuç olarak, bir dizi testler motor davranış çeşitli yönlerini değerlendirmek için geliştirilmiştir. Bu testler açık alan testi (genel lokomotor aktivite), rotarod (motor koordinasyon, ataksi) dahil, kavrama gücü tel testi (dayanıklılık), görev (ince motor koordinasyon, yürüyen merdiven ışın asılı tekerlek (etkinlik), çalışan (kas gücü), sensorimotor beceri), yürüyüş analizi (hareket, bacak koordinasyon) ve diğerleri (Wahlstein36özetlenmiştir). Farklı testler belirli avantajları ve dezavantajları ve onların okuma genellikle sınırlı motor davranış adresine tasarlanmıştır boy (veya yönleri) vardır. Bu nedenle, bu alan ana yönlerini kapsayacak şekilde motor davranış testi gerçekleştirmek için yaygın bir uygulama haline gelmiştir.
Yürüyüş analizi bu piller kısmen nedeniyle bir rapor Guillot al. tarafından bulunmaz kez 37, yürüyüş analizi motor açıkları hayvan modellerinde PD ve ALS ve kısmen zahmetli yöntemi ve sınırlı çıkış nedeniyle algılamaz bulundu. Ancak, Guillot ve ark. rapor çalışma tasarım38bazı sınırlamaları adresleri research tarafından itiraz edildi. Ateş ile fare modellerinde yürüyüş analizi bu yöntemde yararlılığı son yayınlar10,11,12,39,40 bir dizi tarafından gösterilmiştir da bizim iş13dahil olmak üzere ,41,42,43,.
VPI kayıtları pençeleri ile mürekkep boyama ve kağıt44beyaz bir levha üzerinde çalıştırmak fare icar geleneksel yöntem çeşitli avantajlar ile gel. En belirgin birkaç yürüyüş parametreleri1üzerinde güçlü bir etkisi vardır Motorlu Koşu bandı ile çalışan hızlı hayvan kontrol edilir, gerçek şu ki. Buna ek olarak, bazı yürüyüş anormallikleri sadece ne zaman zorlu bir yüksek hız ve/veya bir eğim/gönüllü çalışan görülen değil düşüş, hayvan çalışır tespit haline. Ayrıca, ayrıntılı analizi el ile bir yarı otomatik, yüksek üretilen iş analizi ile değiştirilir. Bu nedenle, her grupta test hayvan sayısı, hangi sırayla yaşayan hayvanlarda kaçınılmazdır değişkenliği nedeniyle etkisini azaltır artırılabilir. Özetle, ateş ve/veya yaşlanma kemirgen modellerinde motor bozuklukları analizi tamamlamak üzere standart motor test piller VPI yürüyüş analizi değiştirilmiş versiyonu dahil öneririz.

Nörodejeneratif hastalıklar ve hastalar, aileler ve toplum üzerinde önemli bir yük empoze daha büyük endişe yaşam beklentisi artış olarak olacak ve dünya nüfusunun yaş için devam ediyor. Nörodejeneratif hastalıkların en sık görülen belirtiler bir denge sorunu vardır. Böylece, karakterizasyonu yaşlanma memeli (Örneğin, kemirgen) motor davranış modelleri ve/veya nörodejeneratif fenotipleri, gösterilen modelleri olduğunu in vivo alaka belirli hayvan model (ler), ya da tedavi göstermek için değerli bir araç Bu hastalık belirtileri geliştirmek amacı tedavileri. Nörodejeneratif hastalıkları tedavi etmek için hemen hemen her yaklaşım sonuçta hayvan modelinde bir klinik insanlarda inisiyasyon önce sınama gerektirir. Bu nedenle, bir vitro modelde potansiyel gösterdi, bir aday ilaç olabilir sağlamak için sürekli olarak yaş ilerlemesi, boyunca hastalık ilgili fenotipleri ölçmek için kullanılabilir güvenilir ve tekrarlanabilir davranış testleri önemlidir etkili bir şekilde yaşayan hayvan fenotip iyileştirmek.
Bir motor davranış değerlendirme Rodents VPI (Ayrıca denilen ventral uçak videografisi)1,2tarafından gerçekleştirilen kinematik yürüyüş analizi yönüdür. Kurulan bu yöntem bir şeffaf ve Motorlu Koşu bandı kemer1,2,3,4yürüyüş kemirgenler alt sürekli kayıt capitalizes. Video veri akışı analizi "dijital pençe izleri" dinamik ve güvenilir bir şekilde özetlemek kemirgen 's yürüyen desen, özgün olarak Kale ve ark. tarafından açıklandığı gibi bütün dört ekstremitelerin oluşturur 2 ve Amende vd. 3.
Zamanla, her bireysel pençe için koşu bandı kemeri ile temas pençe alanı ölçmek için görüntüleme tabanlı yürüyüş analizi prensibidir. Her duruş pençe alanının (fren faz) ve pençe alanındaki bir düşüş (itiş aşamasında) bir artış ile temsil edilir. Bu sinyal tespit salıncak aşaması gelir. Salıncak ve duruş birlikte bir adım oluşturuyor. Yürüyüş dynamics parametrelerin yanında, duruş parametreleri de kayıtlı videolardan elde edilebilir. Örnek parametreleri ve bunların tanım Tablo 1 ' de listelenen ve duruş genişliği (SW; burun-kuyruk eksen ön veya arka paws kombine mesafe) dahil, uzunluğu (SL; aynı pençe iki adımlar arasındaki ortalama uzaklığı) stride veya yerleşim pençe açı (pençe çizgisi burun-kuyruk eksen için). Duruş ve yürüyüş dynamics veri (duruş parametreleri ve onların değişkenlik birkaç adım üzerinden tarafından) hayvan denge ve koordinasyon (tarafından yürüyüş dynamics parametreleri) üzerinde sonuç çıkarmayı sağlar. Ataksi katsayısı ([tarafından (maks. hesaplanan SL değişkenliği gibi diğer parametreleri SL−min. SL) / SL demek]), arka bacak duruş süresi (time) her iki arka bacaklarda kemer ile temas halinde olan, paylaşılan veya pençe sürükle (Ümumi sahəsi kemer üzerinden tam duruş kalkış pençe pençe) de elde edilebilir ve çeşitli nörodejeneratif di değiştirilecek bildirilmiştir sease modelleri5,6,7,8 (bkz. Tablo 1).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Parametre</td>
			<td>Birim</td>
			<td>Tanımı</td>
		</tr>
<tr>
<td>salıncak zamanı</td>
			<td>MS</td>
			<td>süre belgili tanımlık pençe kemer ile temas halinde değil</td>
		</tr>
<tr>
<td>duruş zamanı</td>
			<td>MS</td>
			<td>zaman pençe kemer ile temas süresi</td>
		</tr>
<tr>
<td>% fren</td>
			<td>duruş zaman %</td>
			<td>belgili tanımlık paws fren aşamasındadır duruş zamanın yüzdesi</td>
		</tr>
<tr>
<td>% itmek</td>
			<td>duruş zaman %</td>
			<td>belgili tanımlık paws itiş aşamasındadır duruş zamanın yüzdesi</td>
		</tr>
<tr>
<td>duruş genişliği</td>
			<td>cm</td>
			<td>burun-kuyruk eksenine uzaklığı ön veya arka paws</td>
		</tr>
<tr>
<td>adım uzunluğu</td>
			<td>cm</td>
			<td>aynı pençe iki adımlar arasındaki ortalama uzaklığı</td>
		</tr>
<tr>
<td>adım frekans</td>
			<td>adımlar/s</td>
			<td>tam adımlar saniyede sayısı</td>
		</tr>
<tr>
<td>pençe yerleşim açı</td>
			<td>değ</td>
			<td>pençe ile ilgili olarak hayvan burnu-kuyruk ekseninin açısı</td>
		</tr>
<tr>
<td>ataksi katsayısı</td>
			<td>yapıyordum</td>
			<td>SL SL değişkenlik hesaplanan [(max SL-min SL)/demek]</td>
		</tr>
<tr>
<td>% Paylaşılan duruş</td>
			<td>duruş %</td>
			<td>Hind paylaşılan bacak duruş zaman; Her iki arka bacaklarda kemer ile temas halinde aynı zamanda çoğu zaman</td>
		</tr>
<tr>
<td>pençe sürükle</td>
			<td>mm2
</td>
			<td>Ümumi sahəsi kemer üzerinden tam duruş kalkış pençe pençe</td>
		</tr>
<tr>
<td>bacak yükleme</td>
			<td>cm2
</td>
			<td>MAX dA/dT; pençe alan değişim en son aşamasında maksimal oranı</td>
		</tr>
<tr>
<td>adım açısı değişkenlik</td>
			<td>değ</td>
			<td>Standart sapma hind arasındaki açının SL ve SW bir fonksiyonu olarak paws</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1. Ventral uçak görüntüleme tarafından test edilecek anahtar yürüyüş parametreleri tanımı.
Kemirgen modelleri nörodejeneratif hastalıklar için motor davranışını değerlendirme belirli bir modeli fenotip önem bağlı olarak belirli bir yaşta zor olabilir. Çeşitli hastalıklar, en belirgin PD, gösteri güçlü motor davranış (hareket) açıkları, hem hastaların hem de hayvan modellerinde. PD dört anahtar semptomlar biridir bradikinezi, yaşlanma ile ilerler ve şiddetli yürüyüş bozuklukları içinde zaten PD9erken dönemlerinde ortaya çıkar. Akut PD modelinin kemirgenler (MPTP), 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin ile tedavi çalışmaları zaten VPI yürüyüş analizi10,11,12kullandık. Ancak, bu model akut doğası göz önüne alındığında, bu çalışmalar motor açıkları yaşa bağlı ilerlemesini gidermez. Birkaç son yıllarda yapılan çalışmalarda ilerleyen yaş ile hastalık ilerleme anlama alaka vurgulayan örneğin13,14,15, yürüyüş analizi ile nörodejeneratif değişiklikler, yaşlı farelerde yaptık .
Ek olarak motor açıkları, nörodejeneratif hastalıkların hayvan modelleri genellikle muayene görevler üzerinde odaklanan zorluklar ve belirgin bilişsel bozuklukları, özellikle ilerleyen yaş ile göstermek. Böyle bir fenotip motor davranış testleri sonucu etkileyebilir. Yani, bir motor açıkları, rotarod test16, incelemek için en çok kullanılan testlerin biliş, dikkat ve stres17,18dayanmaktadır. Motorlu Koşu bandında yürümek için istekli, Ayrıca bu etmenlere bağlı iken, daha standart bir özellik olduğu kaydedilen eşleştirmeyi çalışıyor ve çok daha az tarafından değiştirilmiş biliş etkilemiştir. Stres ve dikkat etkileri stres ve dikkat19,20SL swing/duruş zamanı gibi belirli parametreleri ama genel çalışan yetenek görülebilir.
Kinematik yürüyüş analizi yaklaşımı daha fazla mücadele kemirgen modelleri için ayarlamak için size seçenekler sahip olmanın avantajı sunmaktadır. Koşu Bandı ayarlanabilir açı ve hızlı hız 0.1 - 99.9 cm yürüyüş sağlar/s, böylece kemirgenler şiddetli yürüme bozukluğu olan hala yavaş bir hızda çalıştırmak mümkün olabilir (~ 10 cm/s). Sigara Engelli hayvanlar ölçülen hızı daha hızlı çalışan (30 - 40 cm/s). Olup olmadığını test hayvanları belli bir hızda çalıştırmak mümkün gözlem sonucunda kendiliğinden sağlar. Ayrıca, kemirgen Ayrıca bir eğim yukarı veya aşağı bir düşüş, koşu bandı için istenen açıda bir Gonyometre yardımıyla devirme ya da fare ya da sıçan hind bacaklarda ağırlıklı bir kızak ekleyerek çalıştırmak için meydan okunabilir.
Yanı sıra çok sayıda çalışma hastalarda mutasyona tek proteinlerin bir son artan farkındalık arızalı endositoz süreci ve ateş13,21,22arasında bağlantılar var, 23,24,25,26,27,28. Fare modelleri düşük seviyelerde olduğu endophilin-A (bundan böyle endophilin), her iki clathrin-aracılı endositoz13,21,29,30,31 yılında önemli bir oyuncu , 32 , 33 , 45 ve clathrin bağımsız endositoz34, ateş ve yaş bağımlı bozuklukları lokomotor aktivite13,21' göstermek için bulunmuştur. Üç genler kodlamak endophilin proteinlerin aile: endophilin 1, endophilin 2 ve endophilin 3. Özellikle, endophilin proteinler tükenmesi kaynaklanan fenotip büyük ölçüde bağlı olarak numarası değişir endophilin genler13,21eksik. Üçlü knock-out (KO) tüm endophilin genlerin sadece birkaç saat sonra Doğum ve her iki endophilin 1 ve 2 başaramamak-e doğru gelişmek ve doğumdan sonra 3 hafta içinde ölmek olmadan fare öldürücü olmakla birlikte, herhangi bir üç endophilins için tek KO için test hiçbir belirgin fenotip gösterir koşullar21. Diğer endophilin mutant genotip sınırlı ömrü göstermek ve yaş13artan motor bozuklukları geliştirmek. Örneğin, endophilin 1KO-2HT-3KO fareler ekran yürüyüş değişiklikler ve (test kinematik yürüyüş analizi ve rotarod gibi) motor koordinasyon problemleri 3 ay-in yaş, onların littermates, süre de zaten endophilin 1KO-2WT-3KO hayvanlar, görüntülemek önemli bir Yaş1315 aylıkken sadece motor koordinasyon azalma. Fenotipleri bu modellerinde geniş çeşitlilik nedeniyle, tanımlamak ve yaş yanı sıra hayvanın motorlu ve biliş yetenekleri karşılık gelen sorunlar çeşitli entegre edebilirsiniz bir testi uygulamak gereklidir. Burada, başlangıç ve motor nörodejeneratif değişiklikler (Yani, endophilin mutantlar) gösterir bir fare modeli Kullan Kullan r arabirimnin ilerlemesini değerlendirmek için kinematik yürüyüş analizi yararlanmak deneysel prosedürler ayrıntılı. Bu yürüyüş parametreleri çeşitli yaş ve hareket bozuklukları farklı severities ölçme içerir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="684">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">DigiGait</td>
			<td style="width:123px;">Mouse Specifics, Inc., Framingham, Massachusetts, USA</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:224px;">DigiGait Imager and Analysis Software are included with the hardware</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">non-transparent blanket or dark cloth</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:224px;">cover the test chamber to reduce the animal&#39;s feeling of exposure/stress</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">balance</td>
			<td style="width:123px;">e.g. Satorius</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:224px;">balance with 0.1 g accuracy and a maximum load of at least 100 g</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">red finger paint</td>
			<td style="width:123px;">e.g. Kreul or Staedtler</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td>for increasing the contrast between paws and animal&#8217;s body</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">small paint brush</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:224px;">soft brush to apply finger paint to the animal paws</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">diluted detergent</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:224px;">for cleaning</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">disinfectant, e.g. Meliseptol or 70% ethanol</td>
			<td style="width:123px;">e.g. B.Braun</td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:224px;">for desinfection</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gait analysis of age-dependent motor impairments in mice with neurodegeneration

Motor davranış testleri genellikle bir kemirgen modelinin fonksiyonel uygunluğu belirlemek için kullanılır ve bu hayvanların tedavilerde yeni test etmek için geliştirilmiştir. Özellikle yürüyüş analizi recapturing hastalığı özellikle Parkinson hastalığı (PD), Alzheimer hastalığı (Ah), amyotrofik gibi motor yeteneklere etkiler nörodejeneratif hastalıklarda insan hastalarda gözlenen ilgili fenotipleri sağlar lateral skleroz (ALS) ve diğerleri. Bu hat boyunca erken çalışmalarda, yürüyüş parametrelerinin ölçüm zahmetli ve kontrol etmek zor faktörlere bağlıydı (koşma hızı,Örneğin, sürekli çalışan). Ventral uçak görüntüleme (VPI) sistemlerinin geliştirilmesi mümkün yapım bu yöntemi motor davranış değerlendirilmesi için yararlı bir araç kemirgen bir büyük ölçekli, yürüyüş analizi gerçekleştirmek için yapılmış. Burada, ateş fare modelleri içinde motor açıkları yaş bağımlı ilerleme incelemek için kinematik yürüyüş analizi kullanmak hakkında derinlemesine bir iletişim kuralı mevcut; fare satırları azalan endophilin, hangi nörodejeneratif hasar giderek yaş ile artar düzeyde bir örnek olarak kullanılır.

Kinematik yürüyüş analizi kullanımını göstermek için biz yürüyüş analizi ile yaş, aynı zamanda birden fazla endophilin mutasyona uğramış satır, ilerleyen WT C57BL/6J fareler üzerinde ticari araçları ve yazılım kullanarak gerçekleştirdiyseniz ( tablo için bakınız, Malzemeler). Bu kurulum, yüksek hızlı kamera şeffaf bir koşu bandı altında çalışan bir fare (Şekil 1A) kaydeder. Yazılım daha sonra kırmızı renkli pençeleri ve beyaz ya da siyah kürk arasındaki kontrast tanır. Deneysel hayvanlarımızı koyu kahverengi kürk renk olmadığından, belgili tanımlık paws tüm konuların kırmızı parmak boya ile boyanmış. Deneysel hayvan çalışan farklı hızlarda test ettik: (10 cm/s) yürüyüş, (20 cm/s) ve hızlı (30 cm/s) çalıştıran. Saat koşu bandı üzerinde ve havadaki pençeleri vardı ve temas bölgesinin ölçüldü. Bu bilgileri, yürüyüş ritmi (Örneğin, swing/duruş zaman, fren/itiş) veya duruş (Örneğin, pençe açı, SW) özetlemek parametreler vardı (Şekil 1B) hesaplanır.
Biz yürüyüş analizi birkaç motor davranış testi bir parçası olarak gerçekleştirilen. Kavrama gücü (GS), hind (HLC), clasping uzuv değerlendirildi yürüyüş ve hızlandırılmış rotarod performans (ARR). Motor davranış önceki deneyim ve deneysel testleri olarak etkilenen değil gibi olsa da, örneğin, biliş, bu her hayvan testleri aynı sırada ve aynı yaşta aynı pil tabi hala önemlidir. Sipariş önceki deneyler etkilerden geçerli test en aza indirmek hayvan için yüksek düşük zorluk üzerinden gitmek gerekir.
Endophilin mutantlar için kaç üç endophilin allelleri eksik bağlı olarak bu çalışmada beri seçmiş olduğunuz, elde edilen fenotip yok fenotip tek İstanköy hafif nörodejeneratif fenotip genç endophilin 1KO-2HT-3KO içinde değişir yaşlanma ile ilerler fareler. Bu nedenle, bu hayvan satırları yalnızca hayvanlar yaşta geliştirmek ince değişiklikleri incelemek için yeterli bir modeli mevcut. Çoğu endophilin mutantlar sınırlı bir ömrü göstermek olduğunu göz önüne alındığında, biz 18 (18 aylık süresi noktası bile güçlü görüntüler endophilin 1KO-2HT-3KO satırı farelerde beri seçildi ay boyunca endophilin mutantlar motor davranışını inceledik fenotip, felç yok). Yürüyüş analizi sekiz saat noktalarda bir 18 aylık bir süre içinde (Şekil 1 c) gerçekleştirildi. 18 aylıkken hayvanlara ötenazi ve biyokimyasal ve/veya histolojik analiz için korunmuş.
Fare koloni bakım:
Heterozigoz ve homozigoz farelerin endophilin 1, 2 ve 3 gen için başlangıçta Miloseviç ve arkiçinde bulunduğu rapor edilmiştir. 21 C57BL/6J fareler littermate fareler yanı sıra kontrolleri olarak kullanılmıştır. Fareler yiyecek ve su gruplar halinde en fazla 5 hayvanlar, ad libitum ulaşabilen açık kafesleri bir 12-h açık/koyu döngüsünde yer alan. Sadece erkek fareler bu çalışmada kadın döngüsü bağlı değişimler etkileri dışlamak için kullanılmıştır.
Genotipleme Endophilin A1, A2 ve A3 fare modelleri:
Genotipleme endophilin mutant fare kuyruğu ya da kulak yumruk çıkarılan genomik DNA'yı kullanarak polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) amplifikasyon tarafından gerçekleştirildi. Üç endophilin-A genler için PCR ile ilgili astar gerçekleştirilen: endophilin-A1: ileri astar 5' CCACGAACGAACGACTCCCAC3' ve ters astar 5'-CGCACCTGCACGCGCCCTACC-3' için WT, 5'-TCATAGCCGAATAGCCTCTCC-3' için KO; endophilin-A2: ileri astar 5'-CTTCTTGCCTTGCTGCCTTCCTTA-3' için WT; 5'-CCTAGGGGCTTGGGTTG-TGATGAGT-3' KO ve ters astar 5'-GCCCCACAACCTTCTCGCTGAC-3' için WT, 5'-CGTATGCAGCCGCCGCATTGCATC-3' için KO; endophilin-A3: ileri astar 5'-CTCCCCATGGTGGAAAGGTCCATTC-3' ve ters astar 5'-TGTGACAGTGGTGACCACAG-3' için WT, 5-'CAACGGACAGACGAGAG-ATTC-3' KO için. Elde edilen PCR ürünleri farklı grup boyutları WT ve KO gen için verimli bir % 1'özel jel üzerinde çalıştırılan: endophilin-A1 WT ~ 384 bit/sn, KO ~ 950 bps; endophilin-A2 WT ~ 1,280 bps, KO ~ 1000 bps; endophilin-A3 WT ~ 325 bps, KO ~ 465 bit/sn. PCR ürünleri WT ve KO şeritli Heterozigoz (HT) hayvan gösterir.
Sonuçlar:
Yürüyüş ve duruş WT farelerde ilerleyen yaş ile karakterize etmek için biz kinematik yürüyüş analizi bu hayvanlar (Şekil 2; gerçekleştirdiyseniz Film 1). Süre bazı parametreler, örneğin SW (ortalama arasındaki mesafe ön plana veya hind hayvan genişliği için normalleştirilmiş ekstremitelerde; Ayrıca bkz. Tablo 1), ilerleyen yaş ile WT hayvanlarda değişmeden kalır, diğer parametreleri aşamalı olarak değiştirmek (Şekil 2A- C). örnek olarak, arka bacak çift kişilik destek (zaman her iki arka bacaklarda aynı zamanda zemin ile temas halinde olan duruş süresi göreli) 38'den % 18 ay (Şekil 2B) % 55 1 ay artırır. Bu parametre kez duruş istikrarsızlık35ile ilişkilidir. Ayrıca, bacak yükleme (en son aşamasında pençe çevrenin değişim maksimal oranı) 59 cm2/s 1 ay 18 ay (Şekil 2C) 38 cm2/s artar. Hızlı yavaşlama azaltılmış kas gücü için bir göstergesi olarak yorumlanabilir. Genel çalışan yetenek (%94 30 cm/s 18 ayda, Şekil 3Açalıştırmak mümkün) WT hayvanlarda etkilenmez. Etkilenmemiş kalır veya yaş WT farelerde ilerleyen ile aşamalı olarak değiştiren yürüyüş ve duruş parametreleri karakterize ek olarak, biz VPI kullanarak kinematik yürüyüş analizi hafif değişiklikler yaşa bağlı eğitim için uygun bir yöntem olduğunu belgeledi yürüyüş ve duruş.
Genel çalışan yetenek WT hayvanlarda değil etkilenir, birkaç endophilin mutant satırları Murdoch ve ark. bildirildiği gibi yürümek veya çalıştırmak Motorlu Koşu bandı (Şekil 3A), değiştirilmiş yetenek göster 13 tarihinde daha küçük veri kümesi. 1 ayda bütün endophilin 1KO-2HT-3KO fareler her 30 cm/s çalıştırmak mümkün olmakla birlikte, özellikle, 18 ayda aynı hayvanların % 81'i çalıştırmak mümkün değildir (Şekil 3A, Not daha büyük tabur 13' te daha önce rapor olanlardan daha analiz edildi). İlginçtir, daha az endophilin allelleri (Yani, endophilin 1KO-2HT-3WT) eksikliği endophilin mutantlar da etkilenir, ama daha düşük derecede (Şekil 3A).
Endophilin 1KO-2HT-3KO mutantlar ilerleyen yaş13ile ağır motor bozuklukları göstermek olsa bile, birkaç yürüyüş parametre WT denetim ile karşılaştırıldığında da 18 ay yaşında değişmez. Örneğin, adım açısı değişkenliği (adım açısı standart sapması) değişmeden (Şekil 3B) kalır. Özellikle, diğer pek çok parametre, örnek itmek için süre (belgili tanımlık paws itiş aşamasındadır duruş süresi yüzdesini), 1 ayda farklı değildir, ama giderek yaşlanma ile daha kötü hale (Şekil 3 c; Ayrıca Film 2bakınız). Bu hem yaş bağımlı parametreleri hem de nörodejeneratif mutant özel değişkenleri kinematik yürüyüş analizi yaklaşımı ile okudu olabilir göstermektedir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57752/57752fig1.jpg"> Şekil 1. Ventral uçak görüntüleme kurulum ve prensip. (A)fotoğraf ve şematik bir yürüyüş analizi kurulumu çizim. (B) analiz yazılım ilkesi: şeffaf bir koşu bandı üzerinde çalışan bir fare kaydedilen alt--dan belgili tanımlık bilgisayar yazılımı dijital pençe izleri hesaplar. Onların dynamics koşma sırasında alanı boyutu zaman içinde pençe gibi ölçülür ve bu yürüyüş ritmi hesaplamak ve parametreleri duruş için temel olarak kullanılır. (C) zaman ders yürüyüş analiz deneme endophilin mutantlar üzerinde gerçekleştirilen. Hareket ve yürüyüş 1, 2, 3, 6, 9, 12, 15 ve 18 aylıkken değerlendirildi. Resimleri endophilin 1KO-2HT-3KO fare 2, 12 ve 18 ay göster. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57752/57752fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57752/57752fig2.jpg"> Şekil 2. Yürüyüş analizi ilerleyen yaş ile vahşi tipi farelerde. 1, 2, 3, 6, 9, 12, 15 ve 18 aylıkken hareket ve yürüyüş WT (C57BL/6J) farelerde değerlendirildi. (A) duruş genişliği WT hayvanlar hayvan genişliği için normalleştirilmiş ilerleyen yaş ile değişmez. (B) hind uzuv çift kişilik destek yaş WT hayvanlarda oranda artar. Grafik, her iki arka bacaklarda yere aynı anda vardır duruş süresi yüzdesini gösterir. Bu parametre bir artış yürüyüş istikrarsızlık yansıtır. (C) (maksimal oran en son aşamasında pençe çevrenin değişimi) yükleme uzuv yaş WT hayvanlarda oranda artar. Daha hızlı yavaşlama azaltılmış kas gücü bir göstergesi olabilir. Tüm grafikler ortalama değer ± SEM temsil eder; p değerleri 2 kuyruklu thesaplanan-testleri karşı 1 - eski ay WT ve olarak gösterilir * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57752/57752fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57752/57752fig3.jpg"> Şekil 3. Yürüyüş endophilin mutantlar ilerleyen yaş ile analizde. (A) çalışan hızlı endophilin mutant 1, 12 ve 18 ay, Murdoch vd ile karşılaştırıldığında bir genişletilmiş veri kümesi hesaplanan 13 bar renkler hayvanlar 30 (koyu mavi), 20 (mavi) veya 10 cm/s (açık mavi) Motorlu Koşu bandı üzerinde çalıştırmak veya (gri) Kur'u reddetme yüzdesini yansıtır. Tüm test hayvanları 30 m/s 1 ay çalıştırabilirsiniz iken, onlar yaş olarak açıkları çalışan endophilin mutantlar geliştirmek. (B-C) Adım değişkenlik açı ve zaman içinde WT (siyah), endophilin 1KO-2WT-3WT (turquois), endophilin 1KO-2HT-3WT (koyu mavi) ve endophilin 1KO-2HT-3KO (kahverengi) fareler itmek. Adım açısı değişkenlik WT hayvanlar yaşlanma veya WT ve endophilin mutantlar arasında hiçbir fark gösterir. Uskur saat (gibi duruşu yüzdesi) önemli ölçüde endophilin mutantlar ve WT arasında 1 ay değiştirilmez ancak endophilin mutantlar fareler yaş azaltır. Tüm grafikler ortalama değer ± SEM temsil eder; p değerleri 2 kuyruklu thesaplanan-yaş eşlemeli WT karşı test eder ve olarak gösterilir * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57752/57752fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Movie 1" src="/files/ftp_upload/57752/57752video1.jpg"> Film 1. Yürüyüş analizi vahşi-türü (C57BL/6J) Mouse 3 (solda) ve 18 ay-in yaş (sağda). Orijinal video (üst) bir "dijital pençe baskı" video (alt) çevrilir. Böylece ayrıntıları daha iyi takdir edilebilir video hızlı aşağı 5 kez yavaşladı. 18 aylık zaman noktada, sağ arka pençe (dijital pençe baskı kırmızı) tereddüt ~ 2 Not s ve sağ ön pençe (mavi dijital pençe baskı olarak) ~ 4, s. Video hızı 10 katına yavaşladı. Bu videoyu izlemek için <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57752/video_1_-_3_months_and_18_months_DigiGait.avi" target="_blank">lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)</a>
<img alt="Movie 2" src="/files/ftp_upload/57752/57752video2.jpg"> Film 2. Endophilin 1KO-2WT-3WT (denetim; sol) endophilin 1KO-2HT-3KO (sağda) fareler karşı analizde 18 ayda yürüyüş. Ayrıntılar daha iyi takdir yüzden video hızlı 5 katına yavaşladı. Endophilin 1KO-2HT-3KO fare daha az görülebilir yürüyüş değişiklikler görüntüler istikrarlı koşma hayvan. Bu videoyu izlemek için <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57752/Movie_2_-KOWTWT_vs_KOHTKO_18_m_30_cm-s.avi" target="_blank">lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)</a>

Watch this Scientific Journal Video about Gait Analysis of Age-dependent Motor Impairments in Mice with Neurodegeneration at JoVE.com

Gait Analysis of Age-dependent Motor Impairments in Mice with Neurodegeneration

Bu çalışmada, biz ventral uçak motor koordinasyon yanı sıra ateş fare modelleri (Örneğin, endophilin mutant çağda ilerleyen ile ilerleme ince değişiklikleri izlemek için Imaging temel kinematik yürüyüş analizi kullanımını göstermektedir fare hat).

Yaş bağımlı Motor bozuklukları ile ateş farelerde, yürüyüş analizi

Motor behavior tests are commonly used to determine the functional relevance of a rodent model and to test newly developed treatments in these animals. ...

gait-analysis-age-dependent-motor-impairments-mice-with

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

11.8K Görüntüleme.  European Neuroscience Institute (ENI). Bu çalışmada, biz ventral uçak motor koordinasyon yanı sıra ateş fare modelleri (Örneğin, endophilin mutant çağda ilerleyen ile ilerleme ince değişiklikleri izlemek için Imaging temel kinematik yürüyüş analizi kullanımını göstermektedir fare hat).

Video: Gait Analysis of Age-dependent Motor Impairments in Mice with Neurodegeneration

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

Evans Blue Dye ile Zebra balığı Larva İskelet Kası Bütünlüğü Analizi

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Gelişim Biyolojisi

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple cellular and developmental processes principally via activation of ERK, the terminal kinase of the pathway. Tight regulation of ERK activity is essential for normal development and homeostasis; overly active ERK results in excessive cellular proliferation, while underactive ERK causes cell death. C. elegans is a powerful model system that has helped characterize the function and regulation of RTK-RAS-ERK signaling pathway during development. In particular, the RTK-RAS-ERK pathway is essential for C. elegans germline development, which is the focus of this method. Using antibodies specific to the active, diphosphorylated form of ERK (dpERK), the stereotypical localization pattern can be visualized within the germline. Because this pattern is both spatially and temporally controlled, the ability to reproducibly assay dpERK is useful to identify regulators of the pathway that affect dpERK signal duration and amplitude and thus germline development. Here we demonstrate how to successfully dissect, stain, and image dpERK within the C. elegans gonad. This method can be adapted for spatial localization of any signaling or structural protein in the C. elegans gonad, provided an antibody compatible with immunofluorescence is available.

Spatial and Temporal Analysis of Active ERK in the C. elegans Germline

We present an immunofluorescence&#160;imaging-based method for spatial and temporal localization of active ERK in the dissected C. elegans gonad. The protocol described here can be adapted for visualization of any signaling or structural protein in the C. elegans gonad, provided a suitable antibody reagent is available.

Aktif ERK Mekansal ve Zamansal Analizi<em&gt; C. elegans</em&gt; Germline

The evolutionarily conserved&#160;extracellular signal transducing RTK-RAS-ERK pathway is an important kinase-signaling cascade that controls multiple ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the cells are located. Specifically, they have been developed to analyze the electrical activity of excitable cells, such as spinal neurons. In such a scenario, it is crucial to preserve the integrity of the spinal cell, but it is also important to preserve the anatomy and physiological shape of the systems involved. Indeed, the comprehension of the manner in which the nervous system-and other complex systems-works must be based on a systemic approach. For this reason, the live zebrafish embryo was chosen as a model system, and the spinal neuron membrane voltage changes were evaluated without interfering with the physiological conditions of the embryos. 
Here, an approach combining the employment of zebrafish embryos with a FRET-based biosensor is described. Zebrafish embryos are characterized by a very simplified nervous system and are particularly suited for imaging applications thanks to their transparency, allowing for the employment of fluorescence-based voltage indicators at the plasma membrane during zebrafish development. The synergy between these two components makes it possible to analyze the electrical activity of the cells in intact living organisms, without perturbing the physiological state. Finally, this non-invasive approach can co-exist with other analyses (e.g., spontaneous movement recordings, as shown here).

Protocols described here allow for the study of the electrical properties of excitable cells in the most non-invasive physiological conditions by employing zebrafish embryos in an in vivo system together with a fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based genetically encoded voltage indicator (GEVI) selectively expressed in the cell type of interest.

Canlı Zebra balığı Embriyolarında Biosense Motor Nöron Membranı Potansiyeli

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

Correlative Super-resolution and Electron Microscopy to Resolve Protein Localization in Zebrafish Retina

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and scanning electron microscopy. The sub-diffraction limit resolution capabilities of super-resolution light microscopes allow improving the accuracy of the correlated data. Briefly, 110 nanometer thick cryo-sections are transferred to a silicon wafer and, after immunofluorescence staining, are imaged by super-resolution light microscopy. Subsequently, the sections are preserved in methylcellulose and platinum shadowed prior to imaging in a scanning electron microscope (SEM). The images from these two microscopy modalities are easily merged using tissue landmarks with open source software. Here we describe the adapted method for the larval zebrafish retina. However, this method is also applicable to other types of tissues and organisms. We demonstrate that the complementary information obtained by this correlation is able to resolve the expression of mitochondrial proteins in relation with the membranes and cristae of mitochondria as well as to other compartments of the cell.

This protocol describes the necessary steps to obtain subcellular protein localization results on zebrafish retina by correlating super-resolution light microscopy and scanning electron microscopy images.

Bağdaşık süper çözünürlük ve elektron mikroskobu Zebra balığı Retina Protein yerelleşme gidermek için

We present a method to investigate the subcellular protein localization in the larval zebrafish retina by combining super-resolution light microscopy and ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the Notch receptor with ligands from neighboring cells induces activation of the signaling pathway (trans-activation), while interaction with ligands from the same cell inhibits signaling (cis-inhibition). Proper balance between trans-activation and cis-inhibition helps establish optimal levels of Notch signaling in some contexts during animal development. Because of the overlapping expression domains of Notch and its ligands in many cell types and the existence of feedback mechanisms, studying the effects of a given post-translational modification on trans- versus cis-interactions of Notch and its ligands in vivo is difficult. Here, we describe a protocol for using Drosophila S2 cells in cell-aggregation assays to assess the effects of knocking down a Notch pathway modifier on the binding of Notch to each ligand in trans and in cis. S2 cells stably or transiently transfected with a Notch-expressing vector are mixed with cells expressing each Notch ligand (S2-Delta or S2-Serrate). Trans-binding between the receptor and ligands results in the formation of heterotypic cell aggregates and is measured in terms of the number of aggregates per mL composed of &#62;6 cells. To examine the inhibitory effect of cis-ligands, S2 cells co-expressing Notch and each ligand are mixed with S2-Delta or S2-Serrate cells and the number of aggregates is quantified as described above. The relative decrease in the number of aggregates due to the presence of cis-ligands provides a measure of cis-ligand-mediated inhibition of trans-binding. These straightforward assays can provide semi-quantitative data on the effects of genetic or pharmacological manipulations on the binding of Notch to its ligands, and can help deciphering the molecular mechanisms underlying the in vivo effects of such manipulations on Notch signaling.

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Complexity of in vivo systems makes it difficult to distinguish between the activation and inhibition of Notch receptor by trans- and cis-ligands, respectively. Here, we present a protocol based on in vitro cell-aggregation assays for qualitative and semi-quantitative evaluation of the binding of Drosophila Notch to trans-ligands vs cis-ligands.

Hücre toplama Trans Drosophila çentikle bağlama değerlendirmek için deneyleri-ligandlar ve onun inhibisyon CIStarafından-ligandlar

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

Three-dimensional Rendering and Analysis of Immunolabeled, Clarified Human Placental Villous Vascular Networks

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that makes up much of the parenchyma of the human placenta. The distal villous capillary network is the terminus of the fetal blood supply after several generations of branching of vessels extending out from the umbilical cord. This network has a contiguous cellular sheath, the syncytial trophoblast barrier layer, which prevents mixing of fetal blood and the maternal blood in which it is continuously bathed. Insults to the integrity of the placental capillary network, occurring in disorders such as maternal diabetes, hypertension and obesity, have consequences that present serious health risks for the fetus, infant, and adult. To better define the structural effects of these insults, a protocol was developed for this study that captures capillary network structure on the order of 1 - 2 mm3 wherein one can investigate its topological features in its full complexity. To accomplish this, clusters of terminal villi from placenta are dissected, and the trophoblast layer and the capillary endothelia are immunolabeled. These samples are then clarified with a new tissue clearing process which makes it possible to acquire confocal image stacks to z- depths of ~1 mm. The three-dimensional renderings of these stacks are then processed and analyzed to generate basic capillary network measures such as volume, number of capillary branches, and capillary branch end points, as validation of the suitability of this approach for capillary network characterization.

This study presents a protocol for the reversible tissue clearing, immunostaining, 3D-rendering and analysis of vascular networks in human placenta villi samples on the order of 1 - 2 mm3.

Üç boyutlu görüntü oluşturma ve çözümleme-in Immunolabeled, açıklık insan plasental Villous damar ağları

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that ...

Cell Cycle Analysis in the C. elegans Germline with the Thymidine Analog EdU

Cell cycle analysis in eukaryotes frequently utilizes chromosome morphology, expression and/or localization of gene products required for various phases of the cell cycle, or the incorporation of nucleoside analogs. During S-phase, DNA polymerases incorporate thymidine analogs such as EdU or BrdU into chromosomal DNA, marking the cells for analysis. For C. elegans, the nucleoside analog EdU is fed to the worms during regular culture and is compatible with immunofluorescent techniques. The germline of C. elegans is a powerful model system for the studies of signaling pathways, stem cells, meiosis, and cell cycle because it is transparent, genetically facile, and meiotic prophase and cellular differentiation/gametogenesis occur in a linear assembly-like fashion. These features make EdU a great tool to study dynamic aspects of mitotically cycling cells and germline development. This protocol describes how to successfully prepare EdU bacteria, feed them to wild-type C. elegans hermaphrodites, dissect the hermaphrodite gonad, stain for EdU incorporation into DNA, stain with antibodies to detect various cell cycle and developmental markers, image the gonad and analyze the results. The protocol describes the variations in the method and analysis for the measurement of S-phase index, M-phase index, G2 duration, cell cycle duration, rate of meiotic entry, and rate of meiotic prophase progression. This method can be adapted to study the cell cycle or cell history in other tissues, stages, genetic backgrounds, and physiological conditions.

Cell Cycle Analysis in the C. elegans Germline with the Thymidine Analog EdU

An imaging-based method is described that can be used to identify S-phase and analyze cell cycle dynamics in the C. elegans hermaphrodite germline using the thymidine analog EdU. This method requires no transgenes and is compatible with immunofluorescent staining.

C. elegans Germline timidin Analog EdU ile hücre döngüsü analizi

Cell cycle analysis in eukaryotes frequently utilizes chromosome morphology, expression and/or localization of gene products required for various phases ...

Controlled Cortical Impact Model of Mouse Brain Injury with Therapeutic Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neural Cells

Traumatic brain injury (TBI) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Disease pathology due to TBI progresses from the primary mechanical insult to secondary injury processes, including apoptosis and inflammation. Animal modeling has been valuable in the search to unravel injury mechanisms and evaluate potential neuroprotective therapies. This protocol describes the controlled cortical impact (CCI) model of focal, open-head TBI. Specifically, parameters for producing a mild unilateral cortical injury are described. Behavioral consequences of CCI are analyzed using the adhesive tape removal test of bilateral sensorimotor integration. Regarding experimental therapy for TBI pathology, this protocol also illustrates a process for transplanting cultured cells into the brain. Neural cell cultures derived from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) were chosen for their potential to show superior functional restoration in human TBI patients. Chronic survival of hiPSCs in the host mouse brain tissue is detected using a modified DAB immunohistochemical process.

This protocol demonstrates methodologies for a mouse model of open-skull traumatic brain injury and transplantation of cultured human induced pluripotent stem cell-derived cells into the injury site. Behavioral and histologic tests of outcomes from these procedures are also described in brief.

Insan kaynaklı pluripotent kök hücre türetilen nöral hücrelerin terapötik transplantasyonu ile fare beyin yaralanması kontrollü Kortiik darbe modeli

Traumatic brain injury (TBI) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Disease pathology due to TBI progresses from the primary mechanical ...

Generation of Induced Neural Stem Cells from Peripheral Mononuclear Cells and Differentiation Toward Dopaminergic Neuron Precursors for Transplantation Studies

Parkinson&#39;s disease (PD) is caused by degeneration of dopaminergic (DA) neurons at the substantia nigra pars compacta (SNpc) in the ventral mesencephalon (VM). Cell replacement therapy holds great promise for treatment of PD. Recently, induced neural stem cells (iNSCs) have emerged as a potential candidate for cell replacement therapy due to the reduced risk of tumor formation and the plasticity to give rise to region-specific neurons and glia. iNSCs can be reprogrammed from autologous somatic cellular sources, such as fibroblasts, peripheral blood mononuclear cells (PBMNCs) and various other types of cells. Compared with other types of somatic cells, PBMNCs are an appealing starter cell type because of the ease to access and expand in culture. Sendai virus (SeV), an RNA non-integrative virus, encoding reprogramming factors including human OCT3/4, SOX2, KLF4 and c-MYC, has a negative-sense, single-stranded, non-segmented genome that does not integrate into host genome, but only replicates in the cytoplasm of infected cells, offering an efficient and safe vehicle for reprogramming. In this study, we describe a protocol in which iNSCs are obtained by reprogramming PBMNCs, and differentiated into specialized VM DA neurons by a two-stage method. Then DA precursors are transplanted into unilaterally 6-hyroxydopamine (6-OHDA)-lesioned PD mouse models to evaluate the safety and efficacy for treatment of PD. This method provides a platform to investigate the functions and therapeutic effects of patient-specific DA neural cells in vitro and in vivo.

The protocol presents the reprogramming of peripheral blood mononuclear cells to induce neural stem cells by Sendai virus infection, differentiation of iNSCs into dopaminergic neurons, transplantation of DA precursors into the unilaterally-lesioned Parkinson&#39;s disease mouse models, and evaluation of the safety and efficacy of iNSC-derived DA precursors for PD treatment.

Periferik mononükleer hücrelerden Indüklenen nöral kök hücrelerin üretimi ve transplantasyon çalışmaları için Dopaminergic neuron precursors doğru farklılaşma

Parkinson&#39;s disease (PD) is caused by degeneration of dopaminergic (DA) neurons at the substantia nigra pars compacta (SNpc) in the ventral ...

Performing Human Skeletal Muscle Xenografts in Immunodeficient Mice

Treatment effects observed in animal studies often fail to be recapitulated in clinical trials. While this problem is multifaceted, one reason for this failure is the use of inadequate laboratory models. It is challenging to model complex human diseases in traditional laboratory organisms, but this issue can be circumvented through the study of human xenografts. The surgical method we describe here allows for the creation of human skeletal muscle xenografts, which can be used to model muscle disease and to carry out preclinical therapeutic testing. Under an Institutional Review Board (IRB)-approved protocol, skeletal muscle specimens are acquired from patients and then transplanted into NOD-Rag1null IL2r&gamma;null (NRG) host mice. These mice are ideal hosts for transplantation studies due to their inability to make mature lymphocytes and are thus unable to develop cell-mediated and humoral adaptive immune responses. Host mice are anaesthetized with isoflurane, and the mouse tibialis anterior and extensor digitorum longus muscles are removed. A piece of human muscle is then placed in the empty tibial compartment and sutured to the proximal and distal tendons of the peroneus longus muscle. The xenografted muscle is spontaneously vascularized and innervated by the mouse host, resulting in robustly regenerated human muscle that can serve as a model for preclinical studies.

Complex human diseases can be challenging to model in traditional laboratory model systems. Here, we describe a surgical approach to model human muscle disease through the transplantation of human skeletal muscle biopsies into immunodeficient mice.

İmmün eksik farelerde İnsan İskelet Kası Ksenogreftlerinin

Treatment effects observed in animal studies often fail to be recapitulated in clinical trials. While this problem is multifaceted, one reason for this ...