Lütfen proje, verimli tartışmalar ve büyük denetleme oynadığı için Prof. Dr. Lothar Willmitzer kabul etmek istiyoruz. Bize proteomik MS ölçümleri ile yardımcı olduğunuz için Dr. Daniel Veyel için minnettarız. Bayan Änne Michaelis kim bize çok değerli teknik yardım LC-MS ölçümleri ile sağladığı için teşekkür ederiz. Ayrıca, Dr Monika Kosmacz ve Dr. Ewelina Sokołowska Weronika Jasińska için onların yardım ve orijinal el yazması ve çalışma katılımı için teknik destek için teşekkür etmek istiyorum.

<ol>
	<li>Li, X., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolites+as+global+regulators:+A+new+view+of+protein+regulation.">Metabolites as global regulators: A new view of protein regulation.</a> Bioessays. 33 (7), 485-489 (2011).</li><li>Jacob, F., Monod, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+regulatory+mechanisms+in+the+synthesis+of+proteins.">Genetic regulatory mechanisms in the synthesis of proteins.</a> Journal of Molecular Biology. 3 (3), 318-356 (1961).</li><li>Schlattner, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+Function+of+Mitochondrial+Nm23-H4+Protein+in+Phosphotransfer+and+Intermembrane+Transfer+a+cardiolipin-dependent+switch.">Dual Function of Mitochondrial Nm23-H4 Protein in Phosphotransfer and Intermembrane Transfer a cardiolipin-dependent switch.</a> Journal of Biological Chemistry. 288 (1), 111-121 (2013).</li><li>Ram&#237;rez, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GTP+binding+regulates+cellular+localization+of+Parkinson's+disease-associated+LRRK2.">GTP binding regulates cellular localization of Parkinson's disease-associated LRRK2.</a> Human Molecular Genetics. , ddx161 (2017).</li><li>Jung, H. J., Kwon, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+deconvolution+of+bioactive+small+molecules:+the+heart+of+chemical+biology+and+drug+discovery.">Target deconvolution of bioactive small molecules: the heart of chemical biology and drug discovery.</a> Archives of Pharmacal Research. 38 (9), 1627-1641 (2015).</li><li>Harding, M. W., Galat, A., Uehling, D. E., Schreiber, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+receptor+for+the+immunosuppressant+FK506+is+a+cis-trans+peptidyl-prolyl+isomerase.">A receptor for the immunosuppressant FK506 is a cis-trans peptidyl-prolyl isomerase.</a> Nature. 341 (6244), 758-760 (1989).</li><li>Lomenick, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target+identification+using+drug+affinity+responsive+target+stability+(DARTS).">Target identification using drug affinity responsive target stability (DARTS).</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (51), 21984-21989 (2009).</li><li>Manabe, Y., Mukai, M., Ito, S., Kato, N., Ueda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FLAG+tagging+by+CuAAC+and+nanogram-scale+purification+of+the+target+protein+for+a+bioactive+metabolite+involved+in+circadian+rhythmic+leaf+movement+in+Leguminosae.">FLAG tagging by CuAAC and nanogram-scale purification of the target protein for a bioactive metabolite involved in circadian rhythmic leaf movement in Leguminosae.</a> Chemical Communications. 46 (3), 469-471 (2010).</li><li>Pantoliano, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-density+miniaturized+thermal+shift+assays+as+a+general+strategy+for+drug+discovery.">High-density miniaturized thermal shift assays as a general strategy for drug discovery.</a> Journal of Biomolecular Screening. 6 (6), 429-440 (2001).</li><li>Li, X., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+In+vivo+Metabolite-Protein+Interactions+by+Large-Scale+Systematic+Analyses.">Analyzing In vivo Metabolite-Protein Interactions by Large-Scale Systematic Analyses.</a> Current Protocols in Chemical Biology. , 181-196 (2010).</li><li>Maeda, K., Poletto, M., Chiapparino, A., Gavin, A. -. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+generic+protocol+for+the+purification+and+characterization+of+water-soluble+complexes+of+affinity-tagged+proteins+and+lipids.">A generic protocol for the purification and characterization of water-soluble complexes of affinity-tagged proteins and lipids.</a> Nature Protocols. 9 (9), 2256-2266 (2014).</li><li>Li, X., Gianoulis, T. A., Yip, K. Y., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+in+vivo+metabolite-protein+interactions+revealed+by+large-scale+systematic+analyses.">Extensive in vivo metabolite-protein interactions revealed by large-scale systematic analyses.</a> Cell. 143 (4), 639-650 (2010).</li><li>Veyel, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=System-wide+detection+of+protein-small+molecule+complexes+suggests+extensive+metabolite+regulation+in+plants.">System-wide detection of protein-small molecule complexes suggests extensive metabolite regulation in plants.</a> Scientific Reports. 7, (2017).</li><li>Luzarowski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity+purification+with+metabolomic+and+proteomic+analysis+unravels+diverse+roles+of+nucleoside+diphosphate+kinases.">Affinity purification with metabolomic and proteomic analysis unravels diverse roles of nucleoside diphosphate kinases.</a> Journal of Experimental Botany. , (2017).</li><li>Van Leene, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+interactomics+reveals+a+complex+core+cell+cycle+machinery+in+Arabidopsis+thaliana.">Targeted interactomics reveals a complex core cell cycle machinery in Arabidopsis thaliana.</a> Molecular systems biology. 6 (1), 397 (2010).</li><li>Giavalisco, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elemental+formula+annotation+of+polar+and+lipophilic+metabolites+using+13C,+15N+and+34S+isotope+labelling,+in+combination+with+high-resolution+mass+spectrometry.">Elemental formula annotation of polar and lipophilic metabolites using 13C, 15N and 34S isotope labelling, in combination with high-resolution mass spectrometry.</a> The Plant Journal. 68 (2), 364-376 (2011).</li><li>Van Leene, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+transcription+factor+complexes+from+Arabidopsis+cell+suspension+cultures+by+tandem+affinity+purification.">Isolation of transcription factor complexes from Arabidopsis cell suspension cultures by tandem affinity purification.</a> Plant Transcription Factors: Methods and Protocols. , 195-218 (2011).</li><li>Van Leene, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tandem+affinity+purification-based+technology+platform+to+study+the+cell+cycle+interactome+in+Arabidopsis+thaliana.">A tandem affinity purification-based technology platform to study the cell cycle interactome in Arabidopsis thaliana.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 6 (7), 1226-1238 (2007).</li><li>Olsen, J. V., Ong, S. -. E., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypsin+cleaves+exclusively+C-terminal+to+arginine+and+lysine+residues.">Trypsin cleaves exclusively C-terminal to arginine and lysine residues.</a> Molecular &amp; Cellular Proteomics. 3 (6), 608-614 (2004).</li><li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MaxQuant+enables+high+peptide+identification+rates,+individualized+p.p.b.-range+mass+accuracies+and+proteome-wide+protein+quantification.">MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification.</a> Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).</li><li>Cox, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Andromeda:+A+peptide+search+engine+integrated+into+the+MaxQuant+environment.">Andromeda: A peptide search engine integrated into the MaxQuant environment.</a> Journal of Proteome Research. 10 (4), 1794-1805 (2011).</li><li>Tyanova, S., Temu, T., Cox, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MaxQuant+computational+platform+for+mass+spectrometry-based+shotgun+proteomics.">The MaxQuant computational platform for mass spectrometry-based shotgun proteomics.</a> Nature Protocols. 11 (12), 2301 (2016).</li><li>Hooper, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUBAcon:+a+consensus+algorithm+for+unifying+the+subcellular+localization+data+of+the+Arabidopsis+proteome.">SUBAcon: a consensus algorithm for unifying the subcellular localization data of the Arabidopsis proteome.</a> Bioinformatics. 30 (23), 3356-3364 (2014).</li><li>Katajamaa, M., Ore&#353;i&#269;, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+processing+for+mass+spectrometry-based+metabolomics.">Data processing for mass spectrometry-based metabolomics.</a> Journal of Chromatography A. 1158 (1-2), 318-328 (2007).</li><li>Szklarczyk, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STITCH+5:+augmenting+protein-chemical+interaction+networks+with+tissue+and+affinity+data.">STITCH 5: augmenting protein-chemical interaction networks with tissue and affinity data.</a> Nucleic Acids Research. 1277, (2015).</li><li>Tanaka, K. -. i., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dipeptidyl+compounds+ameliorate+the+serum-deprivation-induced+reduction+in+cell+viability+via+the+neurotrophin-activating+effect+in+SH-SY5Y+cells.">Dipeptidyl compounds ameliorate the serum-deprivation-induced reduction in cell viability via the neurotrophin-activating effect in SH-SY5Y cells.</a> Neurological Research. 34 (6), 619-622 (2012).</li><li>Smith, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=METLIN:+A+metabolite+mass+spectral+database.">METLIN: A metabolite mass spectral database.</a> Therapeutic Drug Monitoring. 27, 747-751 (2005).</li><li>Bhattacharyya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+protein-protein+interactions+perturb+E.+coli+metabolome+and+cause+gene+dosage+toxicity.">Transient protein-protein interactions perturb E. coli metabolome and cause gene dosage toxicity.</a> Elife. 5, (2016).</li><li>Rigaut, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+generic+protein+purification+method+for+protein+complex+characterization+and+proteome+exploration.">A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration.</a> Nature Biotechnology. 17 (10), 1030-1032 (1999).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Sunulan Protokolü hedef protein s ve PM kompleksleri paralel kimliği sağlar. Sonuçlar için klonlama üzerinden deneme az 8-12 hafta olarak tamamlanabilir. Tam AP yaklaşık 4-6 h 12-24 örnekleri, bir dizi için bizim protokol orta üretilen iş analizi için uygun işleme alır.
İletişim kuralının rağmen varlık genel olarak basit bir dizi kritik adım vardır. (i) yeterli miktarda giriş protein ve benzeşme boncuk metaboliti algılama dinamik bir dizi ulaşmak çok önemlidir. Etkin hücre lizis bu nedenle yordamı çok önemli bir adımdır. Zavallı protein verimleri yetersiz pulverizasyon malzeme veya suboptimal lizis-tampon/malzeme oranı bir sonucu olabilir. (ii) kullanılan reaktifler MS-dostu olduğunu özen gösterilmelidir. MS algılama ile müdahale güçlü deterjanlar, gliserol veya aşırı miktarda tuz kaçınılmalıdır. (iii) özel boncuk adımları yıkama sırasında aşırı kuru olmamalı, ve bir vakum manifold kullanırken bu şekilde değil boncuk yok veya karmaşık istikrar etkilemek için bir yavaş akış hızı uygulamak önemlidir.
Bazı önemli olası değişiklikler için sunulan Protokolü vardır: (i) kurucu CaMV35S organizatörü yem protein miktarı en üst düzeye çıkarmak için kullanıyoruz. Overexpression, çok yararlı olsa da, hücre homeostazı28 üzerinde ciddi etkiler ve fizyolojik alakasız etkileşimleri oluşumuna yol. İfade tagged proteinlerin kullanarak yerel rehberleri ve nerede mümkün bir işlev kaybı arka planda gerçek biyolojik interactors almak için üstün olarak kabul edilir. Bitki hücre kültürleri içinde normalde proteinlerin için bitki arka plan ilgili interactors tanımlamak gerekli olabilir. (ii) zar proteinleri ile çalışırken, bir MS uyumlu deterjan ile takıma girecek lizis arabelleği gerektiriyor. (iii) ikinci bir benzeşme arıtma adım getirilmesi yanlış-mutlak gerçek pozitif oranı geliştirmek ve EV denetimleri29ihtiyacını ortadan kaldırmak. Bir roman tandem etiketi iki bağımsız proteaz-bölünme site ile zahmetli ve zaman alıcı tarafından Maeda vd. 201411, ekledi boyut-dışlama Kromatografi adım için cazip bir alternatif sunar.
AP'nin en ciddi sıkıntıları yanlış pozitif yüksek oranıdır. Nedenleri çoktur. Bünye overexpression zaten belirtilmiştir. Başka bir kaynak fizyolojik alakasız etkileşimlerin izole organelleri ile çalışma sürece bütün hücreli lysates karışımları proteinler ve metabolitleri üzerinden farklı hücre altı bölmeleri içeren hazırlıktır. Hücre altı yerelleştirme için doğru interactors süzmek için kullanılır. Yine de, yanlış mutlak çoğunluğu özel reçineler ve proteinler arasında belirsiz bağ neden. İkinci bir arıtma adım giriş yukarıda açıklandığı gibi sorunun en iyi çözümü sunmaktadır, ancak zaman ve işlem hacmi pahasına geliyor. Ayrıca, protokol uzatır gibi zayıf etkileşim kaybolabilir. AP'nin başka bir uyarı sağladığı hakkında kapsamlı bilgi hedef protein rağmen interactome, baited protein doğrudan ve dolaylı hedefler arasında differentiating mümkün olmadığı. Hedeflenen bimolecular yaklaşımlar etkileşimleri onaylamak için ihtiyaç vardır.
MS tabanlı metabolomics ile birleştiğinde AP protein-kompleksleri S. cerevisiae12. çalışırdım Benzer şekilde lipidler için polar ve yarı polar bileşikleri hücresel lysates izole protein kompleksleri bağlı kalmasını, bizim daha önceki gözlem13 ile birlikte bu iş için sunulan iletişim kuralı kavramsal zemin sağladı. Bizim iletişim kuralı tarafından üç benzersiz noktaları ile karakterize: (i) buna karşılık12Maya için iş, AP sadece hidrofobik ama aynı zamanda hidrofilik protein ligandlar almak için uygun olduğunu gösterir. (ii) üç tek ayıklama Protokolü tanıtarak, tek bir AP protein ve metaboliti interactors yem protein eğitim için kullanılabilir. (iii) Biz hücreleri bitki Protokolü uyarlanmış.
Gelecekteki çabalar bir roman tandem etiketi ile iki bağımsız proteaz-bölünme site oluşturmaya özen gösterin. Ayrıca bitki hormonları gibi düşük-bereket küçük moleküllere protokol uygunluğu keşfetmek istiyorsunuz.

Yöntem tanımlamak burada amaçları çevre -In-vivo hücresel lysate koşullar seçtiğiniz bir proteinin metaboliti ve protein ortak tanımlaması. Bu bugün karakterize daha çok daha fazla metabolitleri önemli düzenleyici fonksiyonu1var spekülasyonlar. Metabolitleri etkinlik, işlevsellik ve/veya onların reseptör proteinler2,3,4yerelleştirme değiştirme biyolojik anahtarları hareket edebilir. Son on yılda birkaç atılım Yöntem, kimlik PMI vivo içinde veya çevre -In-vivo koşullarda etkinleştirme Gelişmiş5olmuştur. Mevcut yaklaşımları iki gruba ayrılabilir. İlk grup roman protein ortakları tuzak için bilinen-metaboliti yem ile başlatmanız teknikleri kapsar. Benzeşme Kromatografi6, uyuşturucu benzeşme duyarlı hedef-istikrar tahlil7, kemoterapi-proteomik8ve termal Proteom9profil oluşturma yöntemleri içerir. İkinci grup küçük molekül ligandlar10,11tanımlamak için bilinen bir protein ile başlayan tek bir yöntemi içerir.
MS tabanlı lipidomics ile birleştiğinde AP protein-lipid kompleksleri Saccharomyces cerevisiae12. çözümlemeye Bir başlangıç noktası olarak maya suşları 21 enzimler içinde biyosentezi ergosterol dahil ifade yazarlar kullanılan ve 103 kinaz bir tandem-benzeşme saflaştırma (TAP) etiket erimiş. enzimlerin % 70 ve kinazlar % 20'si ışık karmaşık protein-lipid etkileşim ağı akıtan farklı hidrofobik ligandlar bağlamak için bulunamadı.
Daha önce benzer şekilde lipidler için polar ve yarı polar bileşikleri de hücresel lysates13izole protein kompleksleri bağlı kalmasını, göstermek olabilir. Bu bulgulara dayanarak, AP optimize etmek karar yöntemi daha önce bitki hücreleri ve hidrofilik bileşikler14için10,11 yayınlandı. Bu amaçla, biz dokunun vektörel çizimler başarıyla kullanılan bitki PPI çalışmaları15Van Leene ve ark. 2010, tarafından açıklanan kullanılır. Transgenik hatlarını edinmeniz gereken süreyi kısaltmak için Arabidopsis hücre kültürleri üzerinde karar verdi. Çalıştırmaya başladık bir tek adımlı metil tert-butil eter, tek bir protein (Pelet), lipitler (Organik faz) ve hidrofilik metabolitleri (sulu faz)16 karakterizasyonu izin (MTBE) / metanol/su ekstraksiyon yöntemi, benzeşme arıtma deney. EV kontrol şeritleri yanlış pozitif, Örneğin tek başına etiket bağlayıcı proteinler dışlamak için kullanılmaya başlanmıştır. Biz üç (beş) öğesini kavram kanıtı olarak nükleozit nükleotittir kinaz mevcut Arabidopsis genom (NDPK1-NDPK3). Diğer bulgular arasında biz NDPK1 glutatyon Sile etkileşim göstermek olabilir-transferaz ve glutatyon. Sonuç olarak NDPK1 glutathionylation14' e tabi olduğunu kanıtlayabilir.
Özetlemek gerekirse, sunulan Protokolü protein-protein ve protein-küçük-molekül etkileşim ağları karakterize için önemli bir araçtır ve varolan yöntemleri üzerinde büyük bir ilerleme oluşturmaktadır.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Murashige and Skoog Basal Salts with minimal organics</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-Naphthylacetic acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N1641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kinetin solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>K3253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10708976001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2189.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>3609</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6776</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E-64 protease inhibitor</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E3132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9599</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na3VO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S6508</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AcTEV Protease</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>12575015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotiphorese&#160;Gel 30 (37,5:1)</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>3029.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>2367.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PageRuler Prestained Protein Ladder</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>26616</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SBP Tag Antibody (SB19-C4)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-101595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-mouse IgG-HRP</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-2005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bradford Reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B6916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec Grade</td>
			<td>Promega&#160;</td>
			<td>V5071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Urea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>U5128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiourea</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>9830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I1149</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MTBE&#160;</td>
			<td>Biosolve</td>
			<td>138906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol&#160;</td>
			<td>Biosolve</td>
			<td>136806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water</td>
			<td>Biosolve</td>
			<td>232106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Biosolve</td>
			<td>12006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid&#160;</td>
			<td>Biosolve</td>
			<td>202341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid&#160;</td>
			<td>Biosolve</td>
			<td>69141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Unimax 2010 Platform Shaker</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td>5421002000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nylon Mesh (Wire diameter 34 &#181;M, thickness 55 &#181;M, open area 14%)</td>
			<td>Prosepa</td>
			<td>Custom order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Funnel, 47 mm, 300 ml</td>
			<td>Restek</td>
			<td>KT953751-0000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter Bottle Top 500 mL 0,2 &#181;M Pes St</td>
			<td>VWR International GmbH</td>
			<td>514-0340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mixer Mill MM 400</td>
			<td>Retsch GmbH</td>
			<td>207450001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgG Sepharose 6 Fast Flow</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td>17-0969-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mobicol &#34;&#34;Classic&#34;&#34; with 2 different screw caps without filters</td>
			<td>MoBiTec GmbH</td>
			<td>M1002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter (small) 35 &#181;M pore size, for Mobicol M 1002, M1003, M1050 &#38; M1053</td>
			<td>MoBiTec GmbH</td>
			<td>M513515</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Variable Speed Tube Rotator SB 3</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>Y550.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary dishes for rotators SB 3</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>Y555.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resprep 24-Port SPE Manifolds</td>
			<td>Restek&#160;</td>
			<td>26080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Finisterre C18/17% SPE Columns 100mg / 1ml</td>
			<td>Teknokroma</td>
			<td>TR-F034000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autosampler&#160;Vials</td>
			<td>Klaus Trott Chromatographie-Zubeh&#246;r</td>
			<td>40 11 01 740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acclaim PepMap 100 C18 LC Column</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>164534</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EASY-nLC 1000 Liquid Chromatograph</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>LC120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q Exactive Plus Hybrid Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>IQLAAEGAAPFALGMBDK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acquity UPLC system&#160;</td>
			<td>Waters&#160;</td>
			<td>Custom order</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACQUITY UPLC HSS C18 Column, 100A, 1.8 &#181;M, 2.1 mM X 100 mM, 1/pkg</td>
			<td>Waters&#160;</td>
			<td>186003533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-power ultrasonic cleaning baths for aqueous cleaning solutions</td>
			<td>Bandelin</td>
			<td>RK 31</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Genedata Expressionist</td>
			<td>Genedata</td>
			<td>NaN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xcalibur Software</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>NaN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MaxQuant</td>
			<td>NaN</td>
			<td>NaN</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

2 in 1: one-step affinity purification for the parallel analysis of protein-protein and protein-metabolite complexes

Hücresel proteinler, metabolitleri ve nükleik asitler gibi biyolojik moleküller arasındaki etkileşimler tarafından düzenlenmektedir. Protein-protein etkileşimleri (PPI) soruşturma yok yenilik olmakla birlikte, endojen protein-metaboliti etkileşimleri (PMI) karakterize amaçlayan deneysel yaklaşımlar oldukça yeni bir gelişme oluşturmaktadır. Burada, biz aynı anda karakterizasyonu PPI ve PMI yem olarak anılacaktır seçtikleri bir proteinin sağlayan bir protokol mevcut. Arabidopsis hücre kültürleri ve benzeşme arıtma (AP) birleştirir bizim iletişim kuralı (MS) kütle spektrometresi ile optimize edildi-protein ve metaboliti algılama dayalı. Kısacası, bir benzeşme etiketi için erimiş yem protein ifade transgenik Arabidopsis satırları ilk yerel hücresel özü elde etmek için lysed. Anti-etiket antikorlar yem protein protein ve metaboliti ortakları çekmek için kullanılır. Benzeşme saf kompleksleri bir tek adımlı metil tertkullanarak ayıklanır-bütil eter (MTBE) / metanol/su yöntemi. Kutup veya hidrofobik faz metabolitleri ayrı iken, proteinler Pelet içinde bulunabilir. Metabolitleri ve proteinler ultra performanslı sıvı kromatografi-kütle spektrometresi tarafından (UPLC-MS veya UPLC-MS/MS) analiz edilir. Boş-vektör (EV) kontrol şeritleri yanlış pozitif dışlamak için kullanılır. Bizim Protokolü en büyük avantajı fizyolojik şartlarda (hücresel lysate) paralel bir hedef protein protein ve metaboliti ortakların kimlik sağlar olduğunu. Sunulan yöntemi basit, hızlı ve kolayca bitki hücre kültürleri dışındaki biyolojik sistemleri için adapte edilebilir.

Orijinal çalışmada, üç A. thaliana NDPK genler PSB-L hücre süspansiyon kültürlerinde bünye 35S organizatörü14 (Şekil 1) kontrol altına overexpressed. Tandem benzeşme etiket carboxy - veya amino-terminal bir ucunu bir yem protein için erimiş. Benzeşme saf kompleksleri MTBE/metanol/su ekstraksiyon16için tabi tutuldu. Proteinler ilgi çekti ve küçük moleküller MS (Tablolar S2 ve S3) kullanarak tespit edilmiştir.
Yanlış pozitif olarak düzeltmek için küçük molekül kirletici kimyasallar ve laboratuvar sarf malzemeleri dışlamak için boş örnekleri kullanılmıştır. Ayrıca, metabolitleri ve ya bir benzeşme etiketi bağlamak veya yalnız reçine proteinler EV kontrol şeritleri kullanarak sorumluydu. Gerçek pozitif durumlar, iki kuyruklu sigara eşleştirilmiş öğrenci t-testi ve Benjamini & Hochberg yanlış bulma oranı almak için düzeltme metabolitleri (Tablo S4) ve önemli ölçüde NDPKs AP zenginleştirilmiş proteinler (Tablo S5) tanımlamak için uygulanan (N - ve C-ölümcül NDPKs öğesini) deneyler ile karşılaştırıldığında EV kontrol şeritleri (FDR < 0,1). Önceki çalışma, biz devamsızlık/varlığı ölçüt protein ve küçük molekül interactors betimlemek için kullandığını unutmayın.
Temsilcisi sonuçları için NDPK1, dipeptides, bizim grupta okudu küçük molekül düzenleyiciler roman bir sınıfın metaboliti veri odaklanmak süre verilir. Proteomik çözümleme NDPK1 26 sözde protein ortaklarının ortaya. Co NDPK1 aynı hücre altı yerde lokalize proteinler için daha fazla filtreleme tarafından (sitozol), listenin 13 sözde protein interactors aşağı daralmış. Glutatyon Sarasında saptanan proteinler vardı-transferaz, iki uzama başlama faktörleri, tübülin ve aconitate hidrataz. Metabolomic çözümleme ortaya dört dipeptides Val-Leu, Ile-Glu, Leyi-Ile ve Ile-bu özellikle birlikte eluted Phe NDPK1 ile (Şekil 2). Tüm dört dipeptides onların N-terminus paylaşılan bağlama özgüllük düşündüren, hidrofobik bir kalıntı paylaşmak unutmayın.
Bakmak için bilinen protein-protein ve protein-metaboliti kompleksleri için biz sorgulanan 13 proteinler ve dikiş veritabanı25 (Şekil 3) karşı dört dipeptides tespit edilmiştir. Birkaç gözlemler yapılmış olabilir: (i) interactors hiçbiri daha önce NDPK1 için bildirildi. (II) APX1 ortholog aldehid dehidrojenaz aile üyesi ALDH7B4, çeviri başlatma faktörü FBR12 faktörle gen AT2G40290 tarafından kodlanmış başka bir çeviri başlatma sırasında etkileşimli olarak bildirildi. (iii) tanımlanan dipeptides Hayır protein ortakları bildirdi. Ortak eluted dipeptides daha önce herhangi bir erişim tarihi bitki proteini ilişkili rapor değil. Ancak, diğer canlılar arasında önemli rol oynarlar: Leu-Ile, Örneğin, bir insan hücre satırı26' neurotrophin harekete geçirmek bir etkisi vardır. Not deneme sistemi tam topolojisi tanımlama izin vermez. Örneğin, bir dipeptid NDPK1 ile doğrudan etkileşim olabilir ama herhangi bir ortak saf protein de ilgili olabilir.
Birlikte ele alındığında, bizim sonuçları AP kütle spektrometresi ile birlikte istihdam kurulan yordamı protein-protein ve protein-küçük-molekül interactors tanımlaması kolaylaştırır ve yardımcı olur hakkında geniş bilgi oluşturmak göster hedef protein interactome.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57720/57720fig1.jpg"> Şekil 1. AP-MS iş akışı şeması. (A) bir yerel çözünür kesir bitki hücre kültürü üzerinden hazırlanması. (B) AP yordam sonraki adımda. Örnek sütuna yükledikten sonra bir dokunun etiketi erimiş faiz (POI) protein üzerinde özel boncuk immobilize IgG antikor bağlar. Çamaşır sütun ilişkisiz proteinler ve metabolitleri kaldırılmasını kolaylaştırır. AcTEV bölünme gerçekleştirdikten sonra POI protein-metaboliti kompleksleri eluted. Kompleksleri (C) ayrılması protein ve metaboliti kesir yarı kantitatif MS Analizi tarafından takip içine. Bu rakam bir parçası tekrar Luzarowski ve ark. 201714oluşturulur. <a href="/files/ftp_upload/57720/57720fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57720/57720fig2.jpg"> Şekil 2. Özellikle NDPK1 ile birlikte eluting dipeptides. Dört dipeptides Val-Leyi (A), Ile-Glu (B), Leyi-Ile (C)ve Ile-Phe (D) AP deneyde ölçülen ortalama yoğunluklarda çizildi. Tüm dört dipeptides NDPK1 örnekleri EV denetimine göre önemli zenginleştirme göstermek (yıldız işareti temsil FDR < 0,1). Hata çubukları temsil eden 6 ölçümler için standart hata (N-3 çoğaltır ve 3 / C-ölümcül proteinler öğesini). <a href="/files/ftp_upload/57720/57720fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57720/57720fig3.jpg"> Şekil 3. Tüm molekülleri NDPK1 ile birlikte eluting etkileşim ağı yalnızca önceki göz önünde bulundurarak dikiş veritabanında sorgulanan deneysel ve veritabanı delilleri (güven > 0,2). Daha yüksek güven daha yüksek etkileşim olasılığını gösterir ve yatırılan veriler temel alınarak hesaplanır. <a href="/files/ftp_upload/57720/57720fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
Tablo S1. MaxQuant tablo "parameters.txt" çıktı. Tablo tanımı ve miktar gibi kullanılan veritabanları hakkında bilgi için eşik değerlerini içerir. <a href="/files/ftp_upload/57720/Table_S1.xlsx">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>
Tablo S2. Bilgi MaxQuant dan çıkış tablo "proteinGroups.txt". Tablo tüm saptanan protein grupları, yoğunluklarda ve benzersiz peptidler ve puan sayısı gibi ek bilgileri listesini içerir. <a href="/files/ftp_upload/57720/Table_S2.xlsx">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>
Tablo S3. Kutup metabolitleri analizini içeren çıkış dosyası. Tablo tüm tanımlanan kitle özellikleri belirli m/z, RT ve yoğunluğu ile karakterize bir listesini içerir. <a href="/files/ftp_upload/57720/Table_S3.xlsx">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>
Tablo S4. Dipeptides hangi NDPK1, NDPK2 veya NDPK3 yem olarak kullanılan AP örnekleri buldum. Dipeptides boş örnekleri mevcut listeden dışlanan. Her NDPK için iki bağımsız çizgi (ya da N - veya C-terminus öğesini) nüsha işletilmiştir. Öğrenci t-test ve daha fazla pdüzeltilmesi-Benjamini kullanarak değer & Hochberg yöntemi NDPKs önemli ölçüde zenginleştirilmiş interactor ortakları belirlemek için kullanılmıştır (FDR < 0,1). Verilen ΔRT başvuru bileşikleri ve Δppm kitle Metlin27' verilen monoisotopic ile ilgili olarak ilgili olarak hesaplanır. <a href="/files/ftp_upload/57720/Table_S4.xlsx">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>
Tablo S5. NDPK1 ile birlikte saf protein. Her NDPK için iki bağımsız çizgi (ya da N - veya C-terminus öğesini) nüsha çalıştırmak. Öğrenci t-test ve daha fazla pdüzeltilmesi-Benjamini kullanarak değer & Hochberg yöntemi NDPKs önemli ölçüde zenginleştirilmiş interactor ortakları belirlemek için kullanılmıştır (FDR < 0,1). <a href="/files/ftp_upload/57720/Table_S5.xlsx">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about 2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes at JoVE.com

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

2 in 1: tek adımlı benzeşme arıtma paralel analizi için Protein-Protein ve Protein-metaboliti kompleksleri

Protein-protein ve protein-metaboliti etkileşimler tüm hücresel fonksiyonları için önemlidir. Burada, biz seçim bir protein ile bu etkileşimlerin paralel analiz sağlayan bir protokol tanımlamak. Bizim iletişim kuralı bitki hücre kültürleri için optimize edildi ve benzeşme arıtma kütle spektrometresi tabanlı protein ve metaboliti algılama ile birleştirir.

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

2-1-one-step-affinity-purification-for-parallel-analysis-protein

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

11.2K Görüntüleme.  Max Planck Institute of Molecular Plant Physiology. Protein-protein ve protein-metaboliti etkileşimler tüm hücresel fonksiyonları için önemlidir. Burada, biz seçim bir protein ile bu etkileşimlerin paralel analiz sağlayan bir protokol tanımlamak. Bizim iletişim kuralı bitki hücre kültürleri için optimize edildi ve benzeşme arıtma kütle spektrometresi tabanlı protein ve metaboliti algılama ile birleştirir.

Video: 2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

Rapid One-step Enzymatic Synthesis and All-aqueous Purification of Trehalose Analogues

Chemically modified versions of trehalose, or trehalose analogues, have applications in biology, biotechnology, and pharmaceutical science, among other fields. For instance, trehalose analogues bearing detectable tags have been used to detect Mycobacterium tuberculosis and may have applications as tuberculosis diagnostic imaging agents. Hydrolytically stable versions of trehalose are also being pursued due to their potential for use as non-caloric sweeteners and bioprotective agents. Despite the appeal of this class of compounds for various applications, their potential remains unfulfilled due to the lack of a robust route for their production. Here, we report a detailed protocol for the rapid and efficient one-step biocatalytic synthesis of trehalose analogues that bypasses the problems associated with chemical synthesis. By utilizing the thermostable trehalose synthase (TreT) enzyme from Thermoproteus tenax, trehalose analogues can be generated in a single step from glucose analogues and uridine diphosphate glucose in high yield (up to quantitative conversion) in 15-60 min. A simple and rapid non-chromatographic purification protocol, which consists of spin dialysis and ion exchange, can deliver many trehalose analogues of known concentration in aqueous solution in as little as 45 min. In cases where unreacted glucose analogue still remains, chromatographic purification of the trehalose analogue product can be performed. Overall, this method provides a &#34;green&#34; biocatalytic platform for the expedited synthesis and purification of trehalose analogues that is efficient and accessible to non-chemists. To exemplify the applicability of this method, we describe a protocol for the synthesis, all-aqueous purification, and administration of a trehalose-based click chemistry probe to mycobacteria, all of which took less than 1 hour and enabled fluorescence detection of mycobacteria. In the future, we envision that, among other applications, this protocol may be applied to the rapid synthesis of trehalose-based probes for tuberculosis diagnostics. For instance, short-lived radionuclide-modified trehalose analogues (e.g., 18F-modified trehalose) could be used for advanced clinical imaging modalities such as positron emission tomography-computed tomography (PET-CT).

Trehalose analogues are emerging as important molecules for bio(techno)logical and biomedical applications. We describe an optimized protocol for enzymatically synthesizing and purifying trehalose analogues that is simple, efficient, fast, and environmentally friendly. Its application to the rapid production and administration of a probe for the detection of mycobacteria is demonstrated.

Hızlı Bir adım enzimatik sentezi ve Trehaloz Analoglarının All-sulu Arıtma

Chemically modified versions of trehalose, or trehalose analogues, have applications in biology, biotechnology, and pharmaceutical science, among other ...

Biyokimya

Method for Identifying Small Molecule Inhibitors of the Protein-protein Interaction Between HCN1 and TRIP8b

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the excitability of neurons. The subcellular distribution of these channels in pyramidal neurons of hippocampal area CA1 is regulated by tetratricopeptide repeat-containing Rab8b interacting protein (TRIP8b), an auxiliary subunit. Genetic knockout of HCN pore forming subunits or TRIP8b, both lead to an increase in antidepressant-like behavior, suggesting that limiting the function of HCN channels may be useful as a treatment for Major Depressive Disorder (MDD). Despite significant therapeutic interest, HCN channels are also expressed in the heart, where they regulate rhythmicity. To circumvent off-target issues associated with blocking cardiac HCN channels, our lab has recently proposed targeting the protein-protein interaction between HCN and TRIP8b in order to specifically disrupt HCN channel function in the brain. TRIP8b binds to HCN pore forming subunits at two distinct interaction sites, although here the focus is on the interaction between the tetratricopeptide repeat (TPR) domains of TRIP8b and the C terminal tail of HCN1. In this protocol, an expanded description of a method for purifying TRIP8b and executing a high throughput screen to identify small molecule inhibitors of the interaction between HCN and TRIP8b, is described. The method for high throughput screening utilizes a Fluorescence Polarization (FP) -based assay to monitor the binding of a large TRIP8b fragment to a fluorophore-tagged eleven amino acid peptide corresponding to the HCN1 C terminal tail. This method allows &#39;hit&#39; compounds to be identified based on the change in the polarization of emitted light. Validation assays are then performed to ensure that &#39;hit&#39; compounds are not artifactual.

The interaction between HCN channels and their auxiliary subunit has been identified as a therapeutic target in Major Depressive Disorder. Here, a fluorescence polarization-based method for identifying small molecule inhibitors of this protein-protein interaction, is presented.

Yöntem HCN1 ve TRIP8b arasında protein-protein etkileşimi küçük molekül önleyicilerinin tespit edilmesi için

Hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated (HCN) channels are expressed ubiquitously throughout the brain, where they function to regulate the ...

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating these studies, reincorporation of detergent-solubilized membrane proteins into liposomes is a stochastic process where protein topology is impossible to enforce. This paper offers an alternative method to these challenging techniques that utilizes a liposome-based scaffold. Protein solubility is enhanced by deletion of the transmembrane domain, and these amino acids are replaced with a tethering moiety, such as a His-tag. This tether interacts with an anchoring group (Ni2+ coordinated by nitrilotriacetic acid (NTA(Ni2+)) for His-tagged proteins), which enforces a uniform protein topology at the surface of the liposome. An example is presented wherein the interaction between Dynamin-related protein 1 (Drp1) with an integral membrane protein, Mitochondrial Fission Factor (Mff), was investigated using this scaffold liposome method. In this work, we have demonstrated the ability of Mff to efficiently recruit soluble Drp1 to the surface of liposomes, which stimulated its GTPase activity. Moreover, Drp1 was able to tubulate the Mff-decorated lipid template in the presence of specific lipids. This example demonstrates the effectiveness of scaffold liposomes using structural and functional assays and highlights the role of Mff in regulating Drp1 activity.

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

This paper describes a method for assessing the interactions and assemblies of integral membrane proteins in vitro with various partner factors in a lipid-proximal environment.

İskele Lipozomlar kullanarak Lipid-proksimal protein-protein etkileşimleri Sulandırın için<em&gt; İn Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo identification of novel subunits and post-translational modifications. Bacterial systems allow for the expression and purification of a wide variety of single polypeptides and protein complexes. However, this system does not enable the purification of protein subunits that contain post-translational modifications (e.g., phosphorylation and acetylation), and the identification of novel regulatory subunits that are only present/expressed in the eukaryotic system. Here, we provide a detailed description of a novel, robust, and efficient tandem affinity purification (TAP) method using STREP- and FLAG-tagged proteins that facilitates the purification of protein complexes with transiently or stably expressed epitope-tagged proteins from eukaryotic cells. This protocol can be applied to characterize protein complex functionality, to discover post-translational modifications on complex subunits, and to identify novel regulatory complex components by mass spectrometry. Notably, this TAP method can be applied to study protein complexes formed by eukaryotic or pathogenic (viral and bacterial) components, thus yielding a wide array of downstream experimental opportunities. We propose that researchers working with protein complexes could utilize this approach in many different ways.

We describe here a novel, robust, and efficient tandem affinity purification (TAP) method for the expression, isolation, and characterization of protein complexes from eukaryotic cells. This protocol could be utilized for the biochemical characterization of discrete complexes as well as the identification of novel interactors and post-translational modifications that regulate their function.

Ökaryotik Hücrelerde Protein Kompleksleri Tandem Affinity Arıtma

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

A G-quadruplex DNA-affinity Approach for Purification of Enzymatically Active G4 Resolvase1

Higher-order nucleic acid structures called G-quadruplexes (G4s, G4 structures) can form in guanine-rich regions of both DNA and RNA and are highly thermally stable. There are &#62;375,000 putative G4-forming sequences in the human genome, and they are enriched in promoter regions, untranslated regions (UTRs), and within the telomeric repeat. Due to the potential for these structures to affect cellular processes, such as replication and transcription, the cell has evolved enzymes to manage them. One such enzyme is G4 Resolvase 1 (G4R1), which was biochemically co-characterized by our laboratory and Nagamine et al. and found to bind extremely tightly to both G4-DNA and G4-RNA (Kd in the low-pM range). G4R1 is the source of the majority of G4-resolving activity in HeLa cell lysates and has since been implicated to play a role in telomere metabolism, lymph development, gene transcription, hematopoiesis, and immune surveillance. The ability to efficiently express and purify catalytically active G4R1 is of importance for laboratories interested in gaining further insight into the kinetic interaction of G4 structures and G4-resolving enzymes. Here, we describe a detailed method for the purification of recombinant G4R1 (rG4R1). The described procedure incorporates the traditional affinity-based purification of a C-terminal histidine-tagged enzyme expressed in human codon-optimized bacteria with the utilization of the ability of rG4R1 to bind and unwind G4-DNA to purify highly active enzyme in an ATP-dependent elution step. The protocol also includes a quality-control step where the enzymatic activity of rG4R1 is measured by examining the ability of the purified enzyme to unwind G4-DNA. A method is also described that allows for the quantification of purified rG4R1. Alternative adaptations of this protocol are discussed.

G4 Resolvase1 binds to G-quadruplex (G4) structures with the tightest reported affinity for a G4-binding protein and represents the majority of the G4-DNA unwinding activity in HeLa cells. We describe a novel protocol that harnesses the affinity and ATP-dependent unwinding activity of G4-Resolvase1 to specifically purify catalytically active recombinant G4R1.

Enzimatik olarak aktif G4 Resolvase1 saflaştırılması için bir G-dörtlüsü DNA eğilim yaklaşım

Higher-order nucleic acid structures called G-quadruplexes (G4s, G4 structures) can form in guanine-rich regions of both DNA and RNA and are highly ...

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine and remain largely unknown. With recent advances in single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) shedding light on the structural features of agonist binding sites and the activation mechanism of several ion channels, the stage is set for an in-depth dynamic analysis of their gating mechanisms using spectroscopic approaches. Spectroscopic techniques such as electron paramagnetic resonance (EPR) and double electron-electron resonance (DEER) have been mainly restricted to the study of prokaryotic ion channels that can be purified in large quantities. The requirement for large amounts of functional and stable membrane proteins has hampered the study of mammalian ion channels using these approaches. EPR and DEER offer many advantages, including determination of the structure and dynamic changes of mobile protein regions, albeit at low resolution, that might be difficult to obtain by X-ray crystallography or cryo-EM, and monitoring reversible gating transition (i.e., closed, open, sensitized, and desensitized). Here, we provide protocols for obtaining milligrams of functional detergent-solubilized transient receptor potential cation channel subfamily V member 1 (TRPV1) that can be labeled for EPR and DEER spectroscopy.

This article describes specific methods to obtain biochemical quantities of detergent-solubilized TRPV1 for spectroscopic analysis. The combined protocols provide biochemical and biophysical tools that can be adapted to facilitate structural and functional studies for mammalian ion channels in a membrane-controlled environment.

Arıtma ve TRPV1 sulandırma spektroskopik analizi için

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Affinity Purification of Chloroplast Translocon Protein Complexes Using the TAP Tag

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the translocon at the outer (TOC) and inner (TIC) chloroplast membranes. The TOC and TIC complexes are multimeric and probably contain yet unknown components. One of the main goals in the field is to establish the complete inventory of TOC and TIC components. For the isolation of TOC-TIC complexes and the identification of new components, the preprotein receptor TOC159 has been modified N-terminally by the addition of the tandem affinity purification (TAP) tag resulting in TAP-TOC159. The TAP-tag is designed for two sequential affinity purification steps (hence "tandem affinity"). The TAP-tag used in these studies consists of a N-terminal IgG-binding domain derived from Staphylococcus aureus Protein A (ProtA) followed by a calmodulin-binding peptide (CBP). Between these two affinity tags, a tobacco etch virus (TEV) protease cleavage site has been included. Therefore, TEV protease can be used for gentle elution of TOC159-containing complexes after binding to IgG beads. In the protocol presented here, the second Calmodulin-affinity purification step was omitted. The purification protocol starts with the preparation and solubilization of total cellular membranes. After the detergent-treatment, the solubilized membrane proteins are incubated with IgG beads for the immunoisolation of TAP-TOC159-containing complexes. Upon binding and extensive washing, TAP-TOC159 containing complexes are cleaved and released from the IgG beads using the TEV protease whereby the S. aureus IgG-binding domain is removed. Western blotting of the isolated TOC159-containing complexes can be used to confirm the presence of known or suspected TOC and TIC proteins. More importantly, the TOC159-containing complexes have been used successfully to identify new components of the TOC and TIC complexes by mass spectrometry. The protocol that we present potentially allows the efficient isolation of any membrane-bound protein complex to be used for the identification of yet unknown components by mass spectrometry.

We here present a proven and tested protocol for the purification of chloroplast protein import complexes (TOC-TIC complex) using the TAP-tag. The one-step affinity-isolation protocol can potentially be applied to any protein and be used to identify new interaction partners by mass spectrometry.

Kloroplast Translocon Protein kompleksleri dokunun etiketini kullanarak benzeşme arıtma

Chloroplast biogenesis requires the import of thousands of nucleus-encoded proteins into the plastid. The import of these proteins depends on the ...

Single-step Purification of Macromolecular Complexes Using RNA Attached to Biotin and a Photo-cleavable Linker

For many years, the exceptionally strong and rapidly formed interaction between biotin and streptavidin has been successfully utilized for partial purification of biologically important RNA/protein complexes. However, this strategy suffers from one major disadvantage that limits its broader utilization: the biotin/streptavidin interaction can be broken only under denaturing conditions that also disrupt the integrity of the eluted complexes, hence precluding their subsequent functional analysis and/or further purification by other methods. In addition, the eluted samples are frequently contaminated with the background proteins that nonspecifically associate with streptavidin beads, complicating the analysis of the purified complexes by silver staining and mass spectrometry. To overcome these limitations, we developed a variant of the biotin/streptavidin strategy in which biotin is attached to an RNA substrate via a photo-cleavable linker and the complexes immobilized on streptavidin beads are selectively eluted to solution in a native form by long wave UV, leaving the background proteins on the beads. Shorter RNA binding substrates can be synthesized chemically with biotin and the photo-cleavable linker covalently attached to the 5&#39; end of the RNA, whereas longer RNA substrates can be provided with the two groups by a complementary oligonucleotide. These two variants of the UV-elution method were tested for purification of the U7 snRNP-dependent processing complexes that cleave histone pre-mRNAs at the 3&#39; end and they both proved to compare favorably to other previously developed purification methods. The UV-eluted samples contained readily detectable amounts of the U7 snRNP that was free of major protein contaminants and suitable for direct analysis by mass spectrometry and functional assays. The described method can be readily adapted for purification of other RNA binding complexes and used in conjunction with single- and double-stranded DNA binding sites to purify DNA-specific proteins and macromolecular complexes.

RNA/protein complexes purified using botin-streptavidin strategy are eluted to solution under denaturing conditions in a form unsuitable for further purification and functional analysis. Here, we describe a modification of this strategy that utilizes a photo-cleavable linker in RNA and a gentle UV-elution step, yielding native and fully functional RNA/protein complexes.

Tek adım arıtma RNA bağlı Biotin ve fotoğraf yarilabilir bir bağlayıcı kullanarak makromoleküllerin kompleksleri

For many years, the exceptionally strong and rapidly formed interaction between biotin and streptavidin has been successfully utilized for partial ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis of transcriptome and gene expression by qPCR and RNA sequencing. Comprehensive transcriptome and gene expression analysis of specific cell types in complex tissues and organs will be critical to understand cellular and molecular mechanisms by which genes are regulated and their association with tissue homeostasis and organ functions. In this article, we demonstrate the methodology for isolation of ribosome-bound RNA directly in vivo in the vascular endothelia of animal lungs as an example. The specific materials and procedures for tissue processing and RNA purification will be described, including the assessment of RNA quality and yield as well as real time qPCR for arteriogenic gene assays. This approach, known as translating ribosome affinity purification (TRAP) technique, can be utilized for characterization of gene expression and transcriptome analysis of certain cell types directly in vivo in any specific type in complex tissues.

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP for RNA Isolation from Endothelial Cells In Vivo

We present an approach to purify ribosome-bound mRNA from vascular endothelial cells (ECs) directly in mouse brain, lung and heart tissues via EC-specific genetic tag of enhanced green fluorescence protein (EGFP)in ribosomes in combination with RNA purification.

Endotel hücrelerinden RNA yalıtım için Ribosome affinity arıtma (TRAP) çevirisi In vivo

Many studies have been limited to using in vitro cellular assays and whole tissues or isolating of specific cell types from animals for in vitro analysis ...

Application of Biolayer Interferometry (BLI) for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA is a novel transcription activator found specifically in the obligate intracellular bacterial pathogen Chlamydia. Protein pulldown assays using affinity beads have revealed that GrgA binds two &#963; factors, namely &#963;66 and &#963;28, which recognize different sets of promoters for genes whose products are differentially required at developmental stages. We have used BLI to confirm and further characterize the interactions. BLI demonstrates several advantages over pulldown: 1) It reveals real-time association and dissociation between binding partners, 2) It generates quantitative kinetic parameters, and 3) It can detect bindings that pulldown assays often fail to detect. These characteristics have enabled us to deduce the physiological roles of GrgA in gene expression regulation in Chlamydia, and possible detailed interaction mechanisms. We envision that this relatively affordable technology can be extremely useful for studying transcription and other biological processes.

Application of Biolayer Interferometry BLI for Studying Protein-Protein Interactions in Transcription

Interactions of transcription factors (TFs) with the RNA polymerase are usually studied using pulldown assays. We apply a Biolayer Interferometry (BLI) technology to characterize the interaction of GrgA with the chlamydial RNA polymerase. Compared to pulldown assays, BLI detects real-time association and dissociation, offers higher sensitivity, and is highly quantitative.

Transkripsiyon protein-protein etkileşimlerini Incelemek için Biolayer Interferometri (BLı) uygulaması

A transcription factor&#160;(TF) is a protein that regulates gene expression by interacting with the RNA polymerase, another TF, and/or template DNA. GrgA ...