Bu protokolün genel amacı, baskılı glikan dizi tabanlı bir teknoloji kullanarak küçük hayvanların serumunda dolaşan anti-glikan antikorlarının profilini incelemektir. Bu yaklaşım, glikan yapılarına karşı antikorların önemli rol oynadığı bazı patolojik durumlarda erken tanı ve doğru tedavi potansiyeline sahiptir. Bu tekniğin en büyük avantajı, aynı deneysel ayarda yüzlerce glikan hedefini çok yüksek hassasiyetle ölçme imkanıdır.
Mikro diziyi hazırlamak için temassız bir robot dizileyici kullanın. Altı adet 50 milimolar glikan ve mililitre polisakkarit başına 10 mikrogram ve 300 milimolar PBS, pH 8.5'i n-hidroksi 6 cinnamik türevi cam slaytlara yazdırır. Her slayt altı kez tekrarlanan alt diziler dört farklı blok içerir.
Her bir alt dizi kontroller de dahil olmak üzere 112 farklı glikan noktalar oluşur. Bir saat oda sıcaklığında bir nem kutusunda slaytlar kuluçka. Mikro dizileri engellemek için, oda sıcaklığında tampon engelleme ile 11/2 saat boyunca slaytlar kuluçka.
Daha sonra glikol çipini ultra saf suyla yıkayın ve havaile kurulayın. Metin protokolünde açıklandığı gibi arabellek dört üzerinden arabellek bir hazırlayın. Glikol yongaları ve numuneleri hazırlamak için, oda sıcaklığına ulaşana kadar slaytlar ile saklama kutusunu masaya koyun.
Kutuyu açın ve glikol çipini, nem haznesinin içinde sabit tutmak için ıslak filtre kağıdıyla koşullandırılmak üzere zaten şartlandırılmalı olan kuluçka odasına aktarın. Bu arada, 1.5 mililitre tüpler tampon bir ile fare serum seyreltmek. Bir girdap karıştırıcı ile beş saniye boyunca serum çözeltisi homojenize.
Homojenizasyondan sonra, seyreltilmiş serumu 37 santigrat derecede 10 dakika su banyosunda inkünojene edinve immünglobulin agregasyonunu önleyin. Sonra tüpleri 10, 000 kez G ve 25 derece santigrat derecede üç dakika santrifüj edin. Supernatant toplamak ve herhangi bir çökelti malzeme atın.
Glikol çipini dikkatlice kuluçka odasına yerleştirin. Glikol çipinin yüzeyindekalan maddeleri ortadan kaldırmak için bir mililitre tampon üç ile kuluçkaya yatırın. 15 dakika boyunca, 25 santigrat derecede.
Glikol yongasını dikey bir pozisyonda tutun ve plastik bir pastör pipet kullanarak tampon üç bazı damla ile yeniden yıkayın. Daha sonra, filtre kağıdı kullanarak glikol yonga yüzeyinden tamponu dikkatlice çıkarın. Glikol çipini kuluçka odasına geri yerleştirin.
Seyreltilmiş serum örneğini mikro pipet kullanarak glikol çipi yüzeyine yayın. Glikol talaş yüzeyinin tüm kuru alanlarının pipetucu ucu kullanılarak seyreltilmiş serum numunesi ile kaplandığından emin olun. 37 derecede 37 derecede 1,5 saat boyunca orbital ajitasyon la kuluçkaya yat.
Kuluçkadan sonra, herhangi bir fazla örnek çıkarın ve 25 santigrat derece tampon üç beş dakika boyunca glikol çipi batırın. Glikol çipini tampon dörtlü bir kaba geçirin ve son olarak glikol yongasını ultra saf suyla yıkayın. Glikol çipini 175 kez G ve 25 santigrat derecede bir dakika santrifüj edin ve sıvıyı çıkarın.
Glikol çipini kuluçka odasına geri yerleştirdikten sonra, glikol yonga yüzeyine biotin konjuge keçi anti-fare çözeltisi yayıldı. Bir saat boyunca 37 derecede yörüngesel ajitasyonla kuluçkaya yat. Bağlanmamış fraksiyonu çıkarın ve yıkama adımlarını tekrarlayın.
Santrifüjden sonra, glikol çipini 25 santigrat derecede 45 dakika boyunca tampon ikideki ilgili florokrom etiketli streptavidin çözeltisinin mililitresi başına iki mikrogram ile kuluçkaya yatırın. Bağlanmamış fraksiyonu çıkarmak için karanlıkta çalıştıktan ve yıkama adımlarını tekrarladıktan sonra glikol çipini havayla kurutun. Diziyi tmak için, glikol çipini karanlıkta oda sıcaklığına ulaşana kadar masada bırakın.
Aynı zamanda, slayt tarayıcısını ve lazeri açın. Mikro diziyi tutarak, glikol çipini arkaya değnene kadar yuvaya kaydırın. EasyScan çalıştırarak glikol yongasını tarayıp tif dosyası olarak tcan kaydedin.
ScanArray çözümleme sistemini kullanarak diziyi ölçün. Ana penceredeki yapılandırma ve dosya grubundaki dosyayı tıklatarak önceden taranmış görüntüleri açın. İlgili dizi dosya şablonu, yazdırılan glikanların cam slaytüzerindeki eğilimini temsil eden GAL biçiminde yükleyin.
Diziyi görüntüdeki noktalarla dikkatlice hizalayarak GAL şablonu ayarlayın ve niceliklendirmeyi başlatın. Niceleme türü kolay quant ve quantification yöntemi sabit daire çalıştırın olarak nicelik çevreleri seçin. Otomatik bulma noktaları için tüm seçenekleri açın ve normalleştirme yöntemi için lowess'i seçin.
Ölçülen verileri csv dosyası olarak kaydedin. Bu verileri Microsoft Excel veya başka bir uygun uygulamayı kullanarak ortak bir elektronik tablo dosyasına aktarın. Genetik olarak özdeş fareler, farklı doğal anti karbonhidrat antikorları geliştirdikleri için immünolojik eşdeğerler olarak değerlendirilmemelidir.
Burada gösterildiği gibi, sadece 12 glikan özgüllükkorunmuştur. Burada gösterilen, floresan tarayıcı kullanarak tarama mikro yongaları elde edilen görüntülerin temsili bir örneğidir. Izgara daha sonra her bir alt dizideki noktalara hizalanır.
Florescent's her nokta için algılanır ve sonuçlar ortak bir elektronik tablo dosyasına aktarılır. Fare serumu ile inkübasyon sonrasında, gliko yongaları bir tarama dizisi okuyucu kullanılarak tarandı. Veriler mikro dizi analiz sistemi ile analiz edildi ve sonuçlar Ortanca mutlak sapmanın ortanca artısı olarak RFU ile ifade edildi.
Mavi ve beyaz renkler, 4000 RFU'nun alt arka plan bağlama sinyallerini temsil ediyor. Kırmızı renk, 4000 RFU'dan daha büyük veya eşit pozitif bağlama sinyallerini temsil eder. Glikol yongalarında maruz kalan glikan yapıların çoğu balp C farelerin dolaşan anti glisan antikorlarının repertuvarı tarafından tanınmadı.
Bir kez bu teknik ustalaşılırsa düzgün bir şekilde yapılırsa 5 saat 45 dakika içinde yapılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, repertuar ve serum örneklerinde dolaşan anti karbonhidrat antikorlarının düzeylerini araştırmak için yazıcı glikol dizi teknolojisini nasıl kullanacağınızı iyi anlamak gerekir. Bu prosedürü denerken, gliko çipgözlük ışığının bir alt kısmı tarafından manipüle edilmesi gerektiğini hatırlamak önemlidir.
Barkodun bulunduğu yer. Böylece baskılı glikanlarla temastan kaçınmak için. Ayrıca, gliko çipin tüm kuru alanı nın pipetucunu kullanarak seyreltilmiş serum numunesi ile kaplandığından emin olun.
Gliko çipin tek bir yüzeyini tamamen kaplamak için gereken hacim yaklaşık bir mililitredir. Bu prosedürü takiben, anti glikan antikor profilinin esnek multipleks tespiti ile ilgili ek soruları cevaplamak için mikrosfer baz süspansiyon dizisi gibi diğer yöntemler de yapılabilir. Bu teknik, piyasaya sürülmesinden sonra biyomacral moleküller ve immünoloji alanında araştırmacıların küçük hayvanlar kümesinde protein olmayan glikol etkileşimini keşfetmelerinin önünü açmıştır.
