Alman Araştırma Vakfı (DFG) için mali destek (grant Nr. RO2414/5-1 KR olarak) için sana şükrediyoruz.

<ol>
	<li>Day, R. N., Davidson, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fluorescent+protein+palette:+tools+for+cellular+imaging.">The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging.</a> Chem Soc Rev. 38 (10), 2887-2921 (2009).</li><li>Ishikawa-Ankerhold, H. C., Ankerhold, R., Drummen, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+fluorescence+microscopy+techniques--FRAP,+FLIP,+FLAP,+FRET+and+FLIM.">Advanced fluorescence microscopy techniques--FRAP, FLIP, FLAP, FRET and FLIM.</a> Molecules. 17 (4), 4047-4132 (2012).</li><li>Koestler, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arp2/3+complex+is+essential+for+actin+network+treadmilling+as+well+as+for+targeting+of+capping+protein+and+cofilin.">Arp2/3 complex is essential for actin network treadmilling as well as for targeting of capping protein and cofilin.</a> Mol Biol Cell. 24 (18), 2861-2875 (2013).</li><li>Steffen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rac+function+is+crucial+for+cell+migration+but+is+not+required+for+spreading+and+focal+adhesion+formation.">Rac function is crucial for cell migration but is not required for spreading and focal adhesion formation.</a> J Cell Sci. 126, 4572-4588 (2013).</li><li>Lai, F. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arp2/3+complex+interactions+and+actin+network+turnover+in+lamellipodia.">Arp2/3 complex interactions and actin network turnover in lamellipodia.</a> EMBO J. 27 (7), 982-992 (2008).</li><li>Dimchev, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiency+of+lamellipodia+protrusion+is+determined+by+the+extent+of+cytosolic+actin+assembly.">Efficiency of lamellipodia protrusion is determined by the extent of cytosolic actin assembly.</a> Mol Biol Cell. 28 (10), 1311-1325 (2017).</li><li>Koppel, D. E., Axelrod, D., Schlessinger, J., Elson, E. L., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+fluorescence+marker+concentration+as+a+probe+of+mobility.">Dynamics of fluorescence marker concentration as a probe of mobility.</a> Biophys J. 16 (11), 1315-1329 (1976).</li><li>Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+photoactivatable+GFP+for+selective+photolabeling+of+proteins+and+cells.">A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells.</a> Science. 297 (5588), 1873-1877 (2002).</li><li>McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bright+and+photostable+photoconvertible+fluorescent+protein.">A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein.</a> Nat Methods. 6 (2), 131-133 (2009).</li><li>Gurskaya, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+of+a+monomeric+green-to-red+photoactivatable+fluorescent+protein+induced+by+blue+light.">Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light.</a> Nat Biotechnol. 24 (4), 461-465 (2006).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Patterson, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivatable+fluorescent+proteins+for+diffraction-limited+and+super-resolution+imaging.">Photoactivatable fluorescent proteins for diffraction-limited and super-resolution imaging.</a> Trends Cell Biol. 19 (11), 555-565 (2009).</li><li>Kremers, G. J., Piston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoconversion+of+purified+fluorescent+proteins+and+dual-probe+optical+highlighting+in+live+cells.">Photoconversion of purified fluorescent proteins and dual-probe optical highlighting in live cells.</a> J Vis Exp. (40), (2010).</li><li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+slides+and+coverslips+for+microscopy.">Preparation of slides and coverslips for microscopy.</a> CSH Protoc. 2008, 4988 (2008).</li><li>Small, J. V., Rottner, K., Carlier, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Actin-based Motility. , (2010).</li><li>Kaverina, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enforced+polarisation+and+locomotion+of+fibroblasts+lacking+microtubules.">Enforced polarisation and locomotion of fibroblasts lacking microtubules.</a> Curr Biol. 10 (12), 739-742 (2000).</li><li>Small, J., Rottner, K., Hahne, P., Anderson, K. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualising+the+actin+cytoskeleton.">Visualising the actin cytoskeleton.</a> Microsc Res Tech. 47 (1), 3-17 (1999).</li><li>Mikhailov, A. V., Gundersen, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Centripetal+transport+of+microtubules+in+motile+cells.">Centripetal transport of microtubules in motile cells.</a> Cell Motil Cytoskeleton. 32 (3), 173-186 (1995).</li><li>Rottner, K., Behrendt, B., Small, J. V., Wehland, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VASP+dynamics+during+lamellipodia+protrusion.">VASP dynamics during lamellipodia protrusion.</a> Nat Cell Biol. 1 (5), 321-322 (1999).</li><li>Svitkina, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+filopodia+initiation+by+reorganization+of+a+dendritic+network.">Mechanism of filopodia initiation by reorganization of a dendritic network.</a> J Cell Biol. 160 (3), 409-421 (2003).</li><li>Small, J. V., Isenberg, G., Celis, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarity+of+actin+at+the+leading+edge+of+cultured+cells.">Polarity of actin at the leading edge of cultured cells.</a> Nature. 272 (5654), 638-639 (1978).</li><li>Dang, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibitory+signalling+to+the+Arp2/3+complex+steers+cell+migration.">Inhibitory signalling to the Arp2/3 complex steers cell migration.</a> Nature. 503 (7475), 281-284 (2013).</li><li>Anderson, K. I., Cross, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contact+dynamics+during+keratocyte+motility.">Contact dynamics during keratocyte motility.</a> Curr Biol. 10 (5), 253-260 (2000).</li><li>Burnette, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+role+for+actin+arcs+in+the+leading-edge+advance+of+migrating+cells.">A role for actin arcs in the leading-edge advance of migrating cells.</a> Nat Cell Biol. 13 (4), 371-381 (2011).</li><li>Humphries, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clathrin+potentiates+vaccinia-induced+actin+polymerization+to+facilitate+viral+spread.">Clathrin potentiates vaccinia-induced actin polymerization to facilitate viral spread.</a> Cell Host Microbe. 12 (3), 346-359 (2012).</li><li>Riedl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifeact:+a+versatile+marker+to+visualize+F-actin.">Lifeact: a versatile marker to visualize F-actin.</a> Nat Methods. 5 (7), 605-607 (2008).</li><li>Kage, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FMNL+formins+boost+lamellipodial+force+generation.">FMNL formins boost lamellipodial force generation.</a> Nat Commun. 8, 14832 (2017).</li><li>Peckham, M., Miller, G., Wells, C., Zicha, D., Dunn, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+changes+to+the+mechanism+of+cell+locomotion+induced+by+overexpression+of+beta-actin.">Specific changes to the mechanism of cell locomotion induced by overexpression of beta-actin.</a> J Cell Sci. 114, 1367-1377 (2001).</li><li>Salmon, E. D., Waterman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+we+discovered+fluorescent+speckle+microscopy.">How we discovered fluorescent speckle microscopy.</a> Mol Biol Cell. 22 (21), 3940-3942 (2011).</li><li>Machan, R., Wohland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+applications+of+fluorescence+correlation+spectroscopy+in+live+systems.">Recent applications of fluorescence correlation spectroscopy in live systems.</a> FEBS Lett. 588 (19), 3571-3584 (2014).</li><li>Becker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+lifetime+imaging--techniques+and+applications.">Fluorescence lifetime imaging--techniques and applications.</a> J Microsc. 247 (2), 119-136 (2012).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Burada bu makale ve nasıl onlar farklı deneysel koşullarda uygulama için optimize açıklanan teknikleri kritik adımları tartışmak.
Mikroenjeksiyon hücrelerde tanıtan eksojen proteinler, inhibitörleri veya uyuşturucu üzerinden anlık etkilerini izlemek için uygulanan bir yöntemdir. Proteinler arasında zor işlevlerini belirlemek için özellikle yararlı olabilir hücre tipleri transfect için ya da uzun vadeli ifade değil istendiğinde durumlarda. Hayatta kalma belirli hücre tiplerinin üzerinde seribaşı hücre dışı matriks bağlı olarak değişir dikkat edilmelidir. En endotel, epitelyal veya fibroblast benzeri hücre tipleri, hatta küçük olanlar (bkz: Dang vd. balık keratocytes gibi. 21 ve Anderson ve çapraz22) başarılı bir şekilde enjekte edilebilir. Ancak, hücre göç bir mükemmel model sistemi oluşturur, ancak bilinmeyen bir nedenle bu tür terkedilemeyen bir enjeksiyon ile uyumsuz laminin üzerinde seribaşı B16-F1 hücreleri gibi özel durumları vardır. NIH3T3 fibroblast hücreler için düzenli olarak enjeksiyonları fibronektin terkedilemeyen ve ek photomanipulation teknikleri sıkı BAĞLAMAK (hatta photoactivation ile; B16-F1 hücrelerin burada gösterilen) gibi eşit derecede iyi bu fibroblastlar (bkz: gerçekleştirilebilir gerçekleştiriyoruz Örneğin, Köstler vd. 3). aynı zamanda işlevsel özellikleri ve deney hedeflerine göre farklı proteinler zaman saniye arasında değişen saat için değişiklikler neden farklı miktarda sürebilir kabul gerekir. Bir teknik eksojen Ajan dozaj/konsantrasyonu daha doğru daha örneğin, tek hücre düzeyinde plazmid transfection kullanırken denetlenebilir avantajdır. Buna ek olarak, bir protein flüoresan etiketleme eşzamanlı çok kanallı görselleştirme fluorescently öğesini diğer proteinlerin gerekliyse esneklik artırabilir hücrenin varlığını güvence altına almak için bir zorunluluk değil. Mikroenjeksiyon anlık etkileri spesifik proteinlerin veya protein karışımları hücre morfolojisi veya (Örneğin, Dang ve ark. sitoiskeleti dinamik değişiklikler üzerinde analiz etmek için özellikle yararlı olabilir 21 Arp2/3 karmaşık inhibitörü Arpin tarafından geçiş anında efektleri bir örneğin). Teknik hücre hasarı çıkarabilir veya hücre morfolojisi etkilemek onun invasiveness dezavantajdır. Bu nedenle, önemli bir göz microinjections işlemi sırasında hücre canlılığı izlemektedir. Burada tanıtılan yöntem üzerinde el ile işleme dayanıyor. Fibroblastlar fibronektin terkedilemeyen üzerinde büyüyen gibi başarılı enjeksiyonları ile uyumlu olacak şekilde test koşullarında bir çevre % 100 başarı oranı burada açıklanan el ile enjeksiyon Protokolü sağlar; Bu yaklaşım video mikroskobu veya sıkı BAĞLAMAK, daha önce yayımlanmış3olarak da dahil olmak üzere karmaşık ve zaman alıcı izleme denemeleri ile birleştirirken esastır. Bu arada sırada dışlamaz, tek tek hücreler güvenli bir şekilde ani değişiklikler, kontrast çekirdeği ve sitoplazma hücre kenar retraksiyon tarafından takip, kabul edilebilir bir mikroenjeksiyon olay muzdarip. Bu tür deneysel nadiren hariç ve böylece daha fazla analizler için kabul edilmez.
Ancak, bir yarı-otomatik yaklaşım da yaygın, örneğin hızlı istihdam kullanılır (< 300 ms) iğne sadece ilgili önce her hücrenin üstündeki konumlandırılmış olması böylece makine kontrollü iğne enjeksiyon basınç artışı ile çakışık düşürücü enjeksiyon. Tanımı sadece yukarıda açıklanan el ile bir yaklaşım daha alt tarafından yarı-otomatik enjeksiyon başarı oranı olduğunu hız için optimize edilmiştir çünkü başarıyla bu tedavi; hayatta birden çok hücre analizi tarafından takip Böylece tek bir hücre başarılı enjeksiyon dayanmaz. Bu nedenle, tek hücre analizi aksine, yarı-otomatik enjeksiyon daha birkaç yüz hücreleri, Örneğin, video mikroskobu düşük büyütmede veya hücre fiksasyon ve boyama üzerine tarafından enjeksiyon etkilerini çözümlemek için uygundur. İstihdam detaylı yaklaşım ne olursa olsun mikroenjeksiyon bir son nokta tahlil anlamına gelmez, ama teknikleri sıkı BAĞLAMAK veya photoactivation3de dahil olmak üzere, çeşitli ile kombine edilebilir.
Sıkı BAĞLAMAK tarafından protein Ciro oranı belirlerken, lazer yoğunluğunu, mikroskop kurulum ve görüntüleme koşullarına bağlı olarak optimize edilmiş olması gerekir (büyütme, hedefleri, vb, yanı sıra hücre tipi, yapısı ve floresan protein photobleaching). En iyi lazer güç, etkili beyazlatma ile en olası duyarlilik, büzülme önlemek veya geri çekme analizi (Örneğin, lamellipodia veya filopodia) veya hücresel düzeyde bile zarar altında yapısının tamamlamak için birleştirilmiştir olduğunu unutmayın. Tam beyazlatma göre hangi durumda, % 50 üstünde bir şey de kabul edilebilir olabilir protein, son derece hızlı cirosu engel, ancak ideal olarak, en az 70-%80 verimliliği ağartma, elde edilmelidir. En iyi beyazlatma güç verilen yapısı ve floresan boya için deneysel olarak test edilmelidir, bir düşük lazer güç başlayan tarafından aşamalı onun artış izledi. Tabii ki, herhangi bir floresan boya tanımı gereği ile lazer ışığı uyarma zirveye yakın ağartılmış (488 nm FITC veya EGFP gibi sık kullanılan yeşil boyalar için). Ancak, lazerler ile UV yakınındaki lazerler gibi daha kısa dalga boyları daha büyük güce teslim ve böylece aynı zamanda verimli yaygın olarak kullanılan Boyar maddeler beyazlatma için kullanılabilir. Biz rutin bir 405 nm diode lazer istihdam (120 mW) (ikinci veri gösterilmez) halinde de olsa biraz daha düşük verimlilik ile EGFP ve kırmızı floresan boyalar (örneğin mCherry), beyazlatma için. 405 nm diyot PA-GFP (aşağıya bakın) photoactivation için de kullanılabilir gibi maksimum esneklik ile bu sistem endows.
B16-F1 hücre yapıları ve floresan proteinler photobleached burada için 65-100 mW arasındaki 405 nm lazer güçler uygulandı. Photobleached bölge analiz ederken verilen yapı özgün şekli zaman dilimi üzerinde analiz korunup korunmayacağını dikkate almak önemlidir. Lamellipodia eğimi önemli ölçüde zaman içinde değişmiş olup olmadığını analiz bölgesi/kontur yoksa eğriliği değişimler yanlış sonuçlara neden Örneğin, ciro lamellipodia ucunda proteinlerin analiz ederken bakım alınmalıdır tam olarak ölçülen her çerçeve yapısında tamamını kapsayacak. Buna ek olarak, lamellipodia, microspikes gibi içine gömülü demetleri floresan yoğunluğu sapmalar neden olabilir unutulmamalıdır. Şekil 2b (9 s süre içinde beyaz ok) gösterildiği gibi microspike benzeri yapıda ölçülen photobleached bölgesi yanındaki yer almaktadır ama kişiliğiniz dışarıdaki kişiliğinizden ölçüm süresi kalır ve böylece herhangi bir neden olmaz yanlışlık. Protein ciro analizi için onların Floresans zaman içinde önemli ölçüde hücre morfolojisi veya faktörler değişiklikleri diğer--dan sert önlemek için akıttıkları ki konumunu ve boyutunu seçme bölgeleri analiz zaman önemli konusu önem taşır satın alma photobleaching. Örneğin, çözümlenen yapısı önemli kantitatif katkı sağlayan yapıları çözümlemesi sırasında dışarı ölçülen bölge taşımamalısınız; Ayrıca, ilgisiz, floresan varlıklar protein çekmek veziküler yapıları gibi ilgilendiğiniz alanı Çözümleme sırasında girmeniz gerekir değil. Bu güçlü sonuçlarının doğruluğunu etkileyecek gibi lamellipodial aktin polimerizasyon hızı belirlemek için hiçbir geri veya karıştırmaktan (yukarı katlanırYani ) lamellipodia olduğunu analiz, özen gösterilmelidir. Buna ek olarak, lamellipodial bölgelerin retraksiyon hızlı arkadaki translocation görünebilir potansiyel olarak lamellipodial aktin polimerizasyon oranları tahmindi için lider. Bir ek dikkate (edinme photobleaching düzeltilmesi için başvuru pozisyon olarak alınan) hücre içi normalleştirme bölgeler photobleaching, gerçek konumdan hangi-meli var olmak doğrudan önlemek için büyük mesafesindedir photobleached alanına göre etkiler.
PA GFP öğesini yapıları photoactivation için optimal koşullar kadar ayarlarken, anlık photoactivation sırasında ağartma önlemek için özen gösterilmelidir. Çalışmamızda, lazer güçlerle en iyi sonuçlar elde 5 - 10 kat daha normalde EGFP beyazlatma için istihdam düşük. İçin resim alma photoactivated moleküllerin çekim hızı ve çerçeveler arasındaki zaman aralığını olmalı bölgeler ve photoactivated olmak için yapıları boyutunu göz önünde bulundurarak en iyi duruma getirilmiş ve analiz, photoactivated potansiyel hareketliliğini yanı sıra proteinler hücre altı başka konumlara. Floresans görüntüleme her türlü gelince, bakım hücre canlılık fizyolojik alakalı sonuçları elde etmek için önemlidir.
Prensip olarak, yeşil kırmızı photoconversion mEos veya Dronpa modelleri12 gibi floresan proteinlerin eşit derecede güçlü bir yöntem aşağıdaki dinamikler ve ciro lamellipodium gibi hücre altı yapıları kabul ettiğiniz anlamına gelir ( Örneğin, bkz: Burnette vd. 23). PA-GFP aksine ikinci yöntemin avantajı önce ve sonra dönüştürme, ortak bir ek kırmızı floresan protein hızlı gerek kalmadan iki ayrı renk ile protein dynamics takip imkanı olacaktır. Ancak, bizim ön deneyler, kontrast değişim ölçüde ve PA-GFP photoactivation elde floresan sinyal şiddeti belki yeşil kırmızı karşı üstün spektral özellikleri nedeniyle photoconverted probları ile karşılaştırıldığında daha büyük Floresan problar (veri gösterilmez). Her durumda, aktin filaman devir oranı, lamellipodia veya vaksinia virüs kaynaklı aktin kuyrukları gibi hücre kenar çıkıntılar ayrıntılı çalışmalar defa sadece PA-GFP türevleri5,6,24kullanarak yayınlanmıştır.
Photoactivation analiz etmek için hangi hücre bölge dikkate alınarak, çeşitli faktörler dikkate, hangi (aktin monomerleri sitozol etkinleştirme üzerine cep kenarında birleşme), burada gösterilen belirli örnekte kullanarak ele alınmıştır alınması gereken ama Kesinlikle benzer çeşitli bilimsel sorunlara yaygınlaştırılması. İlk olarak, ne zaman cytosolically photoactivated proteinler, örneğin, lamellipodial birleşme oranı ayrı deneysel koşullarda (Dimchev ve ark. içinde gösterildiği gibi ölçülür 6), sitozolik bölgeler ve uzaklıkları lamellipodial kenarlarına boyutları deneysel grupları arasında yakın olabilir. Photoactivating sitozolik bölgeler, hücre kalınlığı çekirdeğine yakın konumlarda büyük olduğunda bu dikkate almak önemlidir. Verilen bu proteinin aktif olması için dağıtım rastlanılmaması sitozol içinde dağıtılır daha kalın hücresel bölgeler aktive aktive protein, yüksek miktarda neden olabilir. Son olarak, ifade düzeyleri proteinin aktif olması için kesinlikle tek tek hücreleri son derece değişken olabilir. Konuları değişkenlik nedeniyle birleşme seviyeleri hücre etkinleştirme belirli bölgelerde üzerine elde edilen toplam Floresans göre başka bir yerindeki cytosolically aktif proteinlerin karşılaştırmak önemlidir.
Biz nasıl mikroenjeksiyon proteinler hücre morfolojisi üzerindeki etkilerini araştıran için bir araç olarak kullanılabilir ve bu güçlü indüksiyon fibroblast hücreleri microinjected ile NIH3T3 lamellipodial yapıların göstererek örneği tarif var küçük GTPazlar Rac1. Hücrelerdeki yara/WAVE3C-terminal WCA etki alanı ile microinjected Arp2/3 fonksiyonlu müdahale için bu tekniği daha önce başvurdum. Microinjected hücrelerdeki çeşitli parametreler sıkı BAĞLAMAK veya photoactivation gibi diğer deneyleri tarafından çözümlenebilir. Nasıl sıkı BAĞLAMAK ve photoactivation hücre altı dinamikleri ve aktin monomerleri hareketliliğini soruşturma için istihdam edilebilir anlatmıştık. Sıkı BAĞLAMAK grubumuz tarafından kullanılan gibi VASP, Abi, cortactin, cofilin, lamellipodia için yerelleştirme ve protein kapatma proteinlerin veya Fokal yapışıklıklar huzurunda bileşenlerinde ciro elucidating için ciro araştırmak için daha önce5 ve4sinyal Rac yokluğu. Ayrıca, aktin polimerizasyon oranları ölçme photobleaching EGFP öğesini β-aktin5tarafından yapılabilir ama alternatif yöntemler adlı biri yok. Lifeact25gibi hücresel aktin filamentleri etiketleme canlı hücre görüntüleme uyumlu probları tarafından görüldüğü gibi floresan inhomogeneities izlemek de istihdam6,26olabilir. Burada β-aktin overexpression, hangi artan hücre kenar çıkıntı ve geçiş yapabilir ve böylece potansiyel olarak özel tahlil veya deneysel soru ile müdahale önlenebilir olduğunu avantajdır (bkz: Örneğin, Kage vd. 26; Peckham vd. 27). Lifeact hücrelerdeki tarafından etiketli aktin filaman yapıların ağartma bilgiler sadece sonda ciro, böylece Ancak, Lifeact sonda ayrı bir dezavantajı onun hızlı açık/kapalı Kinetik aktin filamentleri için Binding kabul ettiğiniz anlamına gelir değil için bu25bağlar aktin filamentleri ciro ama. Floresan inhomogeneities izleme önce6,istihdam26 pratik bir uzlaşma sağlamak, Floresans speckles yaygın olarak kullanılan izleme çok benzer ipliksi içine hücre iskeleti dahil (bkz: Örneğin, somon ve Waterman28) yapıları, ama kullanmak için olabildiğince düz ön ve sıkı BAĞLAMAK EGFP öğesini F-aktin yapıları olarak kesin olmayabilir. Photoactivation tarafımızdan lamellipodia yanı sıra deneysel olarak ayarlanmış sitozolik F-aktin düzeyleri6bağlamında sitozol boyunca kabiliyeti çıkıntılı içine monomeric aktin birleşme oranlarının tahmin etmek için uygulanmıştır. Hareketlilik ve dağıtım proteinlerin incelenmesi sitozolik bölgeleri gibi nispeten geniş alanlardan elde edilen teknik yararlıdır. Ancak, dağıtım proteinlerin incelenmesi nispeten küçük photoactivated yapılardan türetilmiş; Örneğin, büyüme koniler aktif floresan moleküllerinin düşük sayılar, zayıf sinyaller ve duyarlılık eksikliği nedeniyle böylece zor olabilir. Photoactivation veya photoconversion floresan (yukarı bakın), potansiyel alternatif teknikleri ters photobleaching üzerinde uzak floresan moleküllerinin hareketliliği takip ederek takip yatırım Getirisi dışında tüm hücre dayanır sıkı BAĞLAMAK içerebilir Bu bölge. Teknik photoactivatable sürümleri proteinlerin overexpressing gerektirmez, ama her zaman potansiyel olarak istenmeyen yan etkileri duyarlilik gibi neden lazer gücünün normalden daha yüksek bir doza maruz içerecektir.
Açıkça, photoactivation ve sıkı BAĞLAMAK proteinler monomerleri, dimer veya hatta küçük reaksiyonlar hareket ediyor ve ek bağlama ortakları ile birlikte hareket ayırt edemez. Bu tür bilgileri yerine Floresans korelasyon spektroskopi teknikleri29 veya FLIM-perde30, alternatif olarak, elde edilebilir. Yine de, sıkı BAĞLAMAK ve photoactivation doğrudan yerel ve küresel protein dynamics hücrelerdeki protein faiz, hücre altı konumu veya okudu hücre tipi ne olursa olsun değerlendirmek için basit yaklaşım oluşturmaktadır.

Proteinler ve canlı hücreler diğer molekülleri kronolojik zamanmekansal dinamiklerini izleme hücre ve Moleküler Biyoloji alanında pek çok gerekli bir araç haline gelmiştir. Floresans mikroskobu teknikleri Floresans rezonans enerji transferi (FRET) ve (FRET-FLIM) görüntüleme FRET-floresan ömür boyu da dahil olmak üzere Gelişmiş veya sıkı BAĞLAMAK, Floresans kaybına photobleaching (fiske VURMAK) ve photoactivation gibi diğerleri izin zamansal ve mekansal protein-protein etkileşimler, konformasyon değişiklikleri izleme gibi Difüzyon kinetik ve yerelleştirme hücre1,2farklı proteinlerin belirlenmesi için. Sıkı BAĞLAMAK ve photoactivation teknikleri, özellikle, aktin sitoiskeleti ve hücre göç düzenleyiciler incelenmesi için yaygın olarak uygulanabilir. Bu teknikler tek başına veya mikroenjeksiyon3gibi ek Embriyolardan teknikleri ile birlikte uygulanabilir ve proteinlerin fluorescently etiketli ifade içerir. Onlar protein Derneği aktin zengini yapılarına Kinetik tahminine yer filopodia veya lamellipodia, Fokal yapışıklıklar4, proteinlerin ciro gibi hücre geçiş izin veya aktin ağlar5dallı. Ayrıca lamellipodial aktin polimerizasyon fiyatlar, sitozol, aktin filamentleri çıkıntılı olarak polymerizing için hücre altı aktin monomer translocation oranı içinde monomeric aktin dağılım değerlendirilmesi belirlenmesi olanağı lamellipodia6ve diğer parametreleri.
Sıkı BAĞLAMAK görselleştirme ve proteinler ilk olarak 1970'lerde Axelrod7tarafından geliştirilen canlı hücrede hareketliliğini miktarının bir yöntemdir. Faiz (ROI) fluorescently etiketli proteinler ile doldurulan bir hücrede bulunan bir bölge geçici bir lazer yüksek yoğunluk, bu bölgede mevcut bir verilen kısa dönemde fluorophore moleküllerinin ağartma neden yeterli maruz kalmaktadır. Fluorescently beyazlatma sırasında yatırım Getirisi dışında bulunan protein etiketli Ryslampa diffüz ve ağartılmış bölgeye bağlı olarak photobleached moleküller öteleme zamanla neden onların kronolojik zamanmekansal dynamics sızmak. Tabii onun devir hızı içinde sözde ağartılmış yapısı ilişkili ve ağartılmış bölgelerde Floresans kurtarma oranı boyutu ve belirli bir molekül Difüzyon oranı da dahil olmak üzere çeşitli faktörlere bağlıdır. Böylece, çözünür proteinler Floresans sıkıca odak yapışıklıklar gibi yapıları ile ilişkili proteinler ise Difüzyon yoluyla hızla ağartılmış ROI içinde kurtarma aracılık, onların Floresans kurtarma gibi-ecek-si olmak uzun ciro süreleri, hem yapısı ilişkili kesir protein ve ayrılma-dernek Kinetik çözünür kısmını Difüzyon üzerinde bağlıdır. Floresans kurtarma genellikle satın aldı ve floresan yoğunluğu öncesi çamaşır suyu başlangıç düzeyi ulaşılana kadar sayılabilir. Difüzyon tarafından doldurulan değiştiremiyor sözde hareketsiz kesir ait olduğu veya mobil oluşan moleküller çoğunluğu ile karşılaştırıldığında çok yavaş hesaplı Yenileyici ilk floresan yoğunluğu bir parçası, ancak, bu oluşmaz kesir. Protein Ciro oranı belirlemek için sıkı BAĞLAMAK eğrileri, Floresans kurtarma ölçüde zaman içinde temsil eden oluşturulur. Bu kurtarma eğrileri ortalama buçuk kat protein kurtarma hesaplanabilir. Eğri uygun ortalama sıkı BAĞLAMAK veri ve dolayısıyla matematiksel analizler oluşturarak, mobil kesir ortalama Ciro oranı bileşik moleküllerinin homojen bir nüfusun oluşturan veya bu oluşur anlamak mümkündür iki veya daha fazla altgrupları diferansiyel oranları teslim molekülleri. Kantitatif yaklaşımlar tarafından protein ciro oranları tahmin ek olarak lamellipodia bölgelerde photobleached kurtarma izleme da retrograd akışı, çıkıntı gibi lamellipodial motilite parametreleri doğru miktar için izin verebilirsiniz, ve aktin polimerizasyon oranları. Bu nedenle, sıkı BAĞLAMAK yaşam hücre yapıları içinde çeşitli parametreleri değerlendirmek için uygulanacak çok yönlü bir araç teşkil etmektedir.
Photoactivation Difüzyon ve proteinler veya belirlenmiş bir hücresel konumundan kaynaklanan molekül hareketliliğini izlemek için kullanılan bir yöntemdir. Tekniği kullanır, örneğin, bir değişken başlangıçta son derece maruz kalma üzerine arttırılması onun Floresans sağlar bir şekilde mutasyona Patterson ve Lippincott-Schwartz8tarafından geliştirilen vahşi tipi yeşil flüoresan protein (GFP), ultraviyole (UV) ışık (yaklaşık 400 nm; burada, 405 nm). Patterson ve arktarafından açıklandığı gibi., vahşi tipi GFP kromofor mevcut nüfus tarafsız fenoller ve yaklaşık 397 büyük Absorbans zirvesinde üretmek Anyonik phenolates olarak nm ve küçük bir 475, nm, anılan sıraya göre. Işınlama UV ışığıyla proteinin nüfus photoconversion, iyonik formu doğru kayması uğrar. 488 tarafından heyecanlı zaman nm, photoconverted/photoactivated protein Floresan, ayrım arasında aktif ve sigara-harekete geçirmek GFP yüksek iç arka plan Floresans nedeniyle uygulamada yetersiz içinde 3 kat artış gösteriyor. Ancak, arka plan yoğunluğu azalmasına GFP sıra (203 konumundaki histidin ikame) içine bir tek amino asit mutasyon getirerek elde edilmiştir. Elde edilen T203H mutant, photoactivatable-GFP (PA-GFP) bunun üzerine ışınlama UV ışığı ile neredeyse 100-fold 488 nm ışık tarafından daha sonra heyecanlı zaman artar küçük tepe Absorbans önemli bir azalma ile karakterize olarak da bilinir. Bu nedenle, overexpression PA GFP öğesini proteinlerin Difüzyon belirlenmesi ve motilite moleküllerin hücrenin sağlar yaygın olarak kullanılan bir yaklaşım olacaktır. Daha önce sadece keşif çıkıntılı içine onların hareketlilik sitozol, aynı zamanda onların birleşme oranı içinde izin PA GFP öğesini aktin aktin monomerleri sitozolik bölgeler, uzak dağılım oranını belirlemek için uyguladığınız lamellipodial aktin ağ6. Daha yeni edebiyat da prensip olarak benzer bir biçimde kullanılabilmesi için roman, fotoğraf-Cabrio proteinler açıklar ama zaten fotoğraf-dönüştürmeden önce görünür olmasını olası avantajı yataklık. Bu grubun floresan proteinlerin örnekler9,10,11,12Dendra2 ve mEos2.
Bu makalede, biz proteinlerin microinjecting hücrelerle metodolojisi açıklar. Daha ne kadar bu teknik ile sıkı BAĞLAMAK, photobleaching proteinlerin aktin sitoiskeleti yönetmelik ve hareketliliği, dahil tarafından birleştirilebilir ve nasıl sıkı BAĞLAMAK eğrileri ve yarı zamanlı mobil kesirler kurtarma elde edilebilir açıklamak. Buna ek olarak, biz ne kadar sıkı BAĞLAMAK teknik aktin polimerizasyon hızı lamellipodial ağlar için kullanılabilir bir örnek sağlar. Ayrıca yönergeleri ve monomeric aktin sitozolik hareketliliğini ve lamellipodia içine aktin şirketleşme oranları belirlemek için kullanılan photoactivation deneyler gerçekleştirmek ipuçları sağlar. Tabii ki, bu teknikleri değildir sadece sınırlı aktin sitoiskeleti bileşenleri izleme, ama potansiyel olarak gerekli orta adaptasyon veya en iyi duruma getirme üzerine, yaygın olarak diğer hücre tipleri için veya farklı proteinler, yapıları, araştırmak için uygulanabilir ve parametreleri.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1617px;" width="1615">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">B16-F1 mouse skin melanoma cells&#160;</td>
			<td style="width:575px;">American Type Culture Collection, Manassas, VA</td>
			<td style="width:167px;">CRL-6323</td>
			<td style="width:511px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">NIH-3T3 cells</td>
			<td>American Type Culture Collection, Manassas, VA</td>
			<td>CRL-1658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM 4.5g/L glucose&#160;</td>
			<td>Life Technologies, Thermno Fisher Scientific, Germany</td>
			<td style="width:167px;">41965-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ham&#8217;s F-12 medium</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:167px;">N8641</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal calf serum&#160; (FCS)</td>
			<td>PAA Laboratories, Linz, Austria</td>
			<td style="width:167px;">A15-102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>F7524</td>
			<td>Lot054M3396</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MEM Non essential amino acids&#160;</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher Scientific, Germany</td>
			<td style="width:167px;">11140035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Glumatine 200mM (100x)</td>
			<td>Life Technolgies</td>
			<td style="width:167px;">25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pen-Strep 5000 U/mL</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td style="width:167px;">15070063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Pyruvate (100 mM)</td>
			<td>Gibco, ThermoFisher Scientific, Germany</td>
			<td style="width:167px;">11360-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laminin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L-2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laminin coating buffer&#160;</td>
			<td style="width:575px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>Self-made: 50mM Tris ph7.4, 150mM NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fibronectin from human plasma&#160;</td>
			<td>Roche Diagnostics, Mannheim, Germany</td>
			<td style="width:167px;">11 051 407 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Jetpei</td>
			<td>Polyplus Transfection, Illkirch, France</td>
			<td style="width:167px;">101-10N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">JetPei buffer</td>
			<td>Polyplus Transfection, Illkirch, France</td>
			<td style="width:167px;">702-50</td>
			<td>150mM NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PA-GFP-actin plasmid DNA&#160;</td>
			<td style="width:575px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>described in Koestler et al.2008</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">pEGFP-actin plasmid DNA</td>
			<td>Clontech, Mountain View, CA, USA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Rac1 protein for microinjection</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>Purified as GST-tagged version, and cleaved from GST prior to injection</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:365px;">Microinjection buffer</td>
			<td></td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>Self-made: 100mM NaCl, 50mM Tris-HCl ph7.5, 5mM MgCl2, 1mM DTT</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:365px;">Dextran, Texas Red, 70,000 MW, Lysine Fixable</td>
			<td>Molecular Probes, Thermno Fisher Scientific, Germany</td>
			<td style="width:167px;">D1864</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope circular cover glasses 15mm, No.1&#160;</td>
			<td>Karl Hecht, Aisstent, Sondheim, Germany</td>
			<td style="width:167px;">1001/15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Eppendorf Femtotips Microloader Tips</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td style="width:167px;">5242 956 003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:365px;">Eppendorf Femtotip Microinjection Capillary Tips</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td style="width:167px;">930000035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silicone Grease&#160;</td>
			<td>ACC Silicones, Bridgewater, England</td>
			<td style="width:167px;">SGM494</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Aluminium Open Diamond Bath Imaging Chamber</td>
			<td>Warner instruments</td>
			<td style="width:167px;">RC-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Automatic temperature controller</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>TC-324B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Microscope: Axio Observer&#160;</td>
			<td>Carl Zeiss, Jena, Germany</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CoolSnap-HQ2 camera&#160;</td>
			<td>Photometrics, Tucson, AZ</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lambda DG4 light source&#160;</td>
			<td>Sutter Instrucment, Novato, CA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laser source&#160;</td>
			<td>Visitron Systems</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Eppendorf FemtoJet microinjector&#160;</td>
			<td>Eppendorf, Hamburg, Germany</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td>With built-in compressor for pressure supply</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Nikon Narishige Micromanipulator system</td>
			<td style="width:575px;">Nikon Instruments, Japan</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Visiview software v2.1.4</td>
			<td>Visitron Systems, Puchheim, Germany</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Metamorph software v7.8.10</td>
			<td>Molecular Devices, Sunnyvale, CA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:365px;">Sigma Plot v.12</td>
			<td style="width:575px;">Systat Software Inc.</td>
			<td style="width:167px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

micromanipulation techniques allowing analysis of morphogenetic dynamics and turnover of cytoskeletal regulators

Zamanmekansal dynamics proteinlerin incelenmesi çeşitli bağlamlarda fonksiyonel önemi ortaya çıkarabilir. Bu makalede, öyle sonra photobleaching (sıkı BAĞLAMAK) ve photoactivation teknikleri ele nasıl flüoresan kurtarma proteinler hücre altı yerlerde kronolojik zamanmekansal dinamiklerini incelemek için kullanılabilir. Biz de nasıl bu teknikler çeşitli parametreler aktin hücre iskeleti yönetmelik ve hücre hareketliliği için bağlı basit belirlenmesi olanaklı kılmak göstermek. Ayrıca, hücre mikroenjeksiyon Ayrıca (potansiyel olarak önceki veya söz konusu photomanipulation teknikleri tamamlayan) alternatif tedavi tetikleyici anlık etkileri translocated proteinler hücre için anlatılan morfoloji ve işlev. Embriyolardan protein enjeksiyon veya yerel uygulama plazma membran geçirgen uyuşturucu veya hücre iskeleti inhibitörleri gibi tedavisinde belirli bir hücre davranış tek hücre ve hücre altı üzerine hemen sonuçları kaydetmek için güçlü bir araç olarak hizmet verebilir düzeyi. Bu burada lamellipodial hücre kenar çıkıntı hemen indüksiyon tarafından rekombinant Rac1 protein, iğne ile bir çeyrek yüzyıl önce belirlenen örneklenir. Ayrıca, Gelişmiş yeşil flüoresan protein (EGFP) ciro belirlemek için bir protokol sağlar-VASP, belirgin B16-F1 hücrelerinin lamellipodial ipuçları biriken bir aktin filaman polimeraz sıkı BAĞLAMAK istihdam ve dahil olmak üzere ilgili veri analiz ve eğri uydurma. Ayrıca lamellipodial aktin ağ polimerizasyonu, oranları tahmin etmek için yönergeleri EGFP öğesini β-aktin ifade hücreleri tarafından olarak mevcut. Son olarak, nasıl aktin monomer hareketlilik photoactivation kullanılarak hızlı filaman derleme, lamellipodia, çıkıntılı ipuçları gibi sitelerde aktin birleşme tarafından takip hücre sitoplazma içinde oranları araştırmak talimatlar verilmiştir yaklaşıyor. Bu protokoller hiçbiri bileşenleri veya aktin sitoiskeleti düzenleyiciler için sınırlı, ama kolayca benzer moda kronolojik zamanmekansal dynamics ve çeşitli farklı hücre altı yapıları veya fonksiyonel proteinlerin işlevi keşfetmek için uzatılabilir bağlamlarda.

Şekil 1 g h faz kontrast görüntüleri önceden NIH3T3 fibroblast hücre ve bir küçük Rho-aile GTPazlar lamellipodia oluşumu karmaşık dalga ile etkileşimi yoluyla ikna yeteneğine sahip olan Rac1, 10 dk sonrası mikroenjeksiyon gösterir. Hücre ilk onun canlılığı ve Morfoloji, Örneğin, lamellipodia eksikliği onaylamak için mikroenjeksiyon (şekil 1g), daha önce görüntülenir. 10 dk sonrası mikroenjeksiyon, hücre açıkça bu tedaviden beklenen ve başarılı enjeksiyon (şekil 1h) gösterir morfolojisi, değişti.
Basitlik ve netlik için biz sonraki değil Ayrıca microinjected hücre analizi sıkı BAĞLAMAK ve photoactivation örnek sonuçları sağlar.
EGFP öğesini VASP lamellipodium ucundaki ciro analizi Şekil 2a-fiçinde gösterilir. VASP Ayrıca doğmakta olan ve odak yapışıklıklar, hücre iç18,19küçük ve uzatılmış noktalar hedefleyen unutmayın. Lamellipodial bölge, ucu açık bir VASP birikmesi ile floresan yoğunluğu ağartılmış ve öncesinde, sırasında ve lamellipodium ileri çıkıntı olarak beyazlatma sonra YG kontur takip ederek her zaman dilimi için ölçülen. Ağartılmış EGFP-VASP proteinler Kastarlamasız molekülleri bu sitelerdeki tarafından dönüştürülüyor gibi Floresans kademeli kurtarma (Şekil 2b) görülmektedir. Bu şekilde elde edilen ve (1 ifade edilir) öncesi çamaşır suyu yoğunluğu için normalleştirilmiş sıkı BAĞLAMAK kurtarma eğrisi Şekil 2cgörülebilir. Photobleaching verimliliği değişebilir ve değeri yaklaşık % 20, t0 değerinden belirlenen bu örnekte, beyazlatma daha önce yapıldı (photobleaching sonra ilk kare). Floresans artış ağartma önce Floresans kabaca % 80 gösterilen örnek bir plato ulaşır. Kurtarma hareketsiz kesir (Eğer, Şekil 2 ' deki kırmızı ok olarak tanımlandıktan sonra bir statik yapısı gibi Fokal adezyon deney saat süresince ön çamaşır suyu yoğunluğu ve Plato Floresans arasındaki farkı ulaştı c, e), Floresans miktarı arasında ağartma ve tam kurtarma zaman kurtarıldı, ancak olarak tanımlanır mobil kesir (yeşil çift başlı ok Şekil 2c, e). EGFP-VASP yoğunluğu buna bağlı Bilindiği gibi burada analiz lamellipodium ucu gibi bir dinamik olarak değişen yapısı, IF ölçüde sadece hareketsiz molekülleri temsil, ancak Ayrıca çıkıntı hızında azalma türetme yapıp yapmayacağınızı unutmayın parametre18. Yarı kurtarma hesaplamak için uygun bir eğri Sigma Arsa (Şekil 2d) üzerinde oluşturuldu. Bu durumda, Denklem 2 çözme çıkarılan "b" parametresinin değeri eşittir 0.0754 için hangi ne zaman Logaritmik fonksiyonu (Denklem 4) tahmini bir yarı-zamanlı sonuçlarını 9,19 kurtarılması uygulanan s (Şekil 2d , sağ paneli), hangi nispeten hızlı bu hücredeki belirli ortalama ile karşılaştırıldığında daha önce5yayımlanır. Kurtarma yarı-kez bazen önemli ölçüde hücre hücre aynı nüfus içinde değişebileceğini belirtmek gerekir. Bu nedenle, temsilci sonuçları elde etmek için en az 15-20 hücrelerden ortalama olarak bu parametre belirleme öneririz. Derece sapma aritmetik ortalamaları EGFP-VASP kurtarma için 15 hücrelerden ortalama olarak göstermek için her zaman-nokta vardı oluşturulan (Şekil 2e) ve oluşturulan ve benzer bir şekilde (Şekil 2 görüntülenen ortalama eğrisi uyuyor f).
Polimerizasyon hızı lamellipodial aktin ağının ileriye doğru ağ çıkıntı ve retrograd akışı toplamı oluşmaktadır. Sıkı BAĞLAMAK aktin polimerizasyon hızı EGFP öğesini β-aktin ve photobleaching çıkıntılı bir lamellipodial bölgesi (Şekil 2g) ile (Bu durumda B16-F1) transfecting hücreleri tarafından ölçmek için uygulanır. Lamellipodial aktin ağ polimerizasyon analiz için EGFP öğesini β-aktin ağartma üzerine Floresans kurtarma zaman içinde değerlendirilir. Aktin monomerleri ilerler (tüm hangi doğru açık20nokta) lamellipodial aktin filamentleri dikenli ucunda polimerizasyon ağ sürekli translocated rearwards ve ileri, ilerliyor hangi oranda kolayca olabilir mi Floresan photobleaching üzerine polarize kurtarılması sırasında elde edilen. En kısa zamanda ağartılmış bölge lamellipodium arka kısmı ve alt yoğunluğu daha fazla yatay düzenlenmiş filaman demetleri tarafından karakterize lamel arasındaki geçiş bölgesi ulaştı lamellipodium floresan Kurtarma tamamlandıktan Ne lamellipodium görülmektedir göre çok daha yavaş teslim. Şekil 2giçinde gösterildiği, Floresans kurtarma kenarı ve geriye doğru çıkıntı ve retrograd akışının (ayrı ayrı temsil edilen mesafeler ölçüm sağlar lamel doğru akan yatay bir çizgi olarak görüntülenmeyecektir Şekil 2g portakal ve kırmızı çift başlı ok olarak sağ panelinde sırasıyla).
Biz de photoactivation aktin monomerleri sitozol içinde hareketliliğini ve lamellipodia çıkıntılı içinde onların birleşme oranı izlemek için PA-GFP-aktin ile transfected B16-F1 hücrelerdeki başvurdum. Şekil 3a, bgösterildiği, sitozolik bir bölge 405 nm lazere maruz photoactivated, görüntüleri üzerinde GFP elde iken her 1.5 kanal s photoactivated aktin GFP Tagged with, dağıtım görüntülenmesi için. Photoactivated GFP-aktin şekil 3bsitozolik bölgede dışarı Difüzyon görülebilir. Floresan yoğunluğu photoactivated sitozolik bölge azalma oranı t0 ilk yoğunlukta yüzdesi olarak gösterilir (ilk çerçeve photoactivation sonra; Şekil 3 c). Photoactivated aktin aynı zamanda entegre lamellipodia, nerede yeni aktin monomerleri aktin filamentleri çıkıntı sırasında elongating büyüyen dikenli uçlarına eklenir ucunda. Lamellipodial birleşme oranını tahmin etmek için iki boyutlu bir kontur/bölgenin yaklaşık 5 mikron genişliği ve yüksekliği 1 µm zamanla floresan yoğunluğu şiddetindeydi; Bölge lamellipodium fırlamıştı olarak ipucu, sürekli yeniden konumlandırılmış. Aktin birleşme floresan yoğunluğu, t0 photoactivated sitozolik bölgesinin yüzdesi olarak temsil edilen (şekil 3d). Aktin filamentleri uzama ilerledikçe yeni aktin monomer lamellipodial ön tarafta dahil edilmiştir. Bu aktin monomerleri bir kısmını stochastically monomer photoactivated neredeydin sitozolik havuzdan elde edildi. Floresan lamellipodia ilk 20 içinde hızlı artış sonuçlanır s photoactivation sonra. Gibi yeni monomer lamellipodial ön, daha önce eklenen aktin monomerleri akışına filamentler lamel doğru retrograd akımını eklenmektedir. Zaman içinde yatırım Getirisini tamamen floresan monomerleri ile doldurulur ve floresan bir plato (şekil 3d) ulaşılır. Floresans kademeli bir düşüş sonra Difüzyon photoactivated monomerleri hücre boyunca ve takip zaman görülmektedir, photoactivated aktin monomerleri giderek lamellipodial önüne yeniden eklenmektedir. Bu azalma Floresans hücrenin tamamını photoactivated ve sigara photoactivated monomerleri arasında bir denge (veri gösterilmez) ulaşıldığında en kısa zamanda ulaşmak mümkün bir yeni Platosu, bulacaksınız.
Aktin monomerleri sitozol boyunca hareketliliğini Floresans yoğunluklarda klemple ( şekil 3bir renk kodlu bölgelerde etiketli tarafından üzerinde örneği photoactivated bölgesinden konumlandırılmış eşit büyüklükte bölgelerde ölçerek elde edildi R1-R5). Şekil 3egösterildiği, floresan yoğunluğu her bu bölgede uzak yavaş yavaş azalıyor cytosolically photoactivated bölgesi, photoactivated aktin monomerleri kesir olarak olur giderek seyreltilmiş ile aktif olmayan (Yani, sigara floresan) monomerleri. Ayrıca, daha sonra Floresans zirvesine ulaştı: daha uzak ölçülen photoactivated bölgesinden gelen bu bölgelere yaygın aktin monomer için gerekli uzun zaman bulunduğu bölgedir. Her bölge içine aktin monomer infiltrasyon derecesi için temsil edici bir değer yarı Floresans Yaylası ulaşma miktarının tarafından elde edilebilir. Daha uzak bölge, uzun içine yaygın photoactivated aktin geçen ve böylece daha fazla zaman sonuçta daha yüksek bir t1/2 değeri (şekil 3e) önde gelen ulaşmak, floresan Yaylası için gereklidir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57643/57643fig1.jpg"> Resim 1 : Odası derleme ve mikroenjeksiyon yordamı Imaging. (bir) görüntüleme odası bileşenleri. (b) silikon gres dikkatle plastik mühürleyen açılış etrafında sürülür. (c) coverslip hücre-yüzü yukarı bakacak şekilde açılış görüntüleme odasının ortasına yerleştirilir. (d) güvenli bir mühür coverslip üstüne plastik mühürleyen konumlandırma ve yan kelepçeler sıkma belirlenir. (e) mikroskopi orta odası yuvasına pipetted. (f) görüntüleme odası mikroskop Sahne Alanı'nda yer alıyor, sıcaklık dedektörü ve elektrotlar 37 ° C için önceden ayarlanmış bir Isıtma birimine bağlı ve hücreleri mikroskobu başlatılan önce en az 30 dk için adapte izin verilir. Bu örnekte, mikroskop sahne microinjections gerçekleştirmek için bir micromanipulator ile de donatılmıştır ve mikroenjeksiyon iğne hücre katmanı görüntüleme odasında kapsayan orta içine daldırma. (g) bir NIH3T3 fibroblast hücre mikroenjeksiyon önce faz kontrast mikroskobu tarafından görüntülenmiştir. Kızıl Haç perinükleer yerde hantal çekirdeği yakınlığı nedeniyle yüksek bir sitoplazmik bölgesine karşılık gelen gelecekteki mikroenjeksiyon konumunu gösterir. (h) 10 dk takip mikroenjeksiyon ile Rac1 hücre lamellipodia (yeşil oklarla gösterilen) tüm hücre çevre etrafında belirgin oluşumu tarafından tepki verir. <a href="/files/ftp_upload/57643/57643fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57643/57643fig2.jpg"> Resim 2: Sıkı BAĞLAMAK sağlar protein ciro veya lamellipodial aktin polimerizasyon oranlarının belirlenmesi. (bir) temsilcisi örnek B16-F1 hücre EGFP-VASP lamellipodial bölgesinin photobleaching daha önce belirtildiği gibi ifade etme. Farklı renkli kontür/şekiller hangi bölgelerine Floresans yoğunluk ölçümleri için zaman içinde kabul edildi belirtmek için etiketlenir. Not kırmızı kontur çoklu veziküller ve hücre yüzey katlar içeren bir alanda yer alan bir sitozolik bölgesi etiketleri bir ünlem işareti ile işaretlenmiş. Floresan, potansiyel olarak yanlış sonuçlara neden güçlü kısa süreli dalgalanmalar tarafından karakterize edilmektedir Bu gibi dinamik alanlarda Floresans başvuru, bölgelerinde seçmek için kaçınılmalıdır. EGFP-VASP ifade hücre önce ve photobleaching sonra (b) Lamellipodial bölgesi. Photobleaching mor olarak işaretlenmiş bölge zaman içinde görüntülenir sonra floresan sinyal kurtarma. Ok gösterir VASP için büyük olasılıkla aktin filamentleri yüksek yoğunluk nedeniyle zenginleştirilmiş bir microspike ucu polymerizing orada19. b kırmızı photobleached lamellipodium (mor kontur) floresan yoğunluğu miktarının (c) bir sıkı BAĞLAMAK örneği kurtarma eğri olarak türetilen ve sağdaki yeşil çizgiler, sırasıyla, hareketsiz ve mobil kesirler gösterir. (d) A sıkı BAĞLAMAK kurtarma eğri c (sol paneli) ve kurtarma yarım saat (doğru kapı aynası) türetmek için kullanılan hesaplama yöntemi örneği uygun. (e) bir sıkı BAĞLAMAK kurtarma örneği eğrisi SEM çubuklarla örnek nüfus içinde arasındaki değişkenlik derecesini gösteren Floresans kurtarma eğrileri 15 hücrelerin ortalama türetilmiş. (f) bir eğri uyum sıkı BAĞLAMAK kurtarma eğrisi uyan 15 hücrelerin (sol paneli) ve kurtarma yarım saat (doğru kapı aynası) türetmek için kullanılan hesaplama yöntemi örneği ortalama türetilmiş. lamellipodium önce ve sonra bir lamellipodial bölgesinin beyazlatma belirtildiği gibi Floresans kurtarma lamellipodium içinde zamanla ardından EGFP öğesini β-aktin ifade B16-F1 hücrenin çıkıntılı, hızlandırılmış panelleri (g). Sağ panelde değerleri ölçülen için çıkıntı ve retrograd mesafeler sağlanmaktadır (turuncu ve kırmızı, sırasıyla). Hesaplamalar görüntü panelleri altında ortaya çıkarmak nasıl çıkıntı ve retrograd mesafeleri toplamı polimerizasyon hızı lamellipodial aktin ağının türetmek için kullanılır. <a href="/files/ftp_upload/57643/57643fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57643/57643fig3.jpg"> Şekil 3: PA-GFP-aktin hücre izleme monomer için Photoactivation. (bir) A temsilcisi örnek PA-GFP-aktin photoactivation sitozolik bölge kırmızı daire (PA) tarafından belirtildiği şekilde uyarının harekete geçirilmesine karşılık önce ifade B16-F1 hücre. Farklı renkli kontür hangi bölgelerine Floresans yoğunluk ölçümleri için zaman içinde kabul edildi belirtmek için etiketlenir. (b) zamansal dağıtım PA-GFP-aktin uyamayan bir örnek photoactivation. Photoactivated aktin ondan dağılır floresan photoactivated, sitozolik bölge (kırmızı daire), içinde yavaş yavaş azalma not edin. Açık ve ağ derlemeye kendi Difüzyon nedeniyle photoactivated aktin monomerleri yavaş yavaş lamellipodia (camgöbeği bölgesi) ve bir mesafe ve zaman bağımlı moda sitozol (farklı renk kodlu bölgelerde) boyunca geliştirilmiştir. Floresan photoactivated sitozolik bölgedeki (kırmızı kontur b) (c) temsilcisi, zamansal düşüş. lamellipodial bölge (camgöbeği kontur b) floresan yoğunluğu (d) Temporal değişiklikler. (e) eğrileri floresan yoğunluğu nedeniyle photoactivation alanından değişken mesafelerde konumlandırma sitozolik bölgeler (b renk kodlu) zamansal değişimler temsilcisi. Nasıl floresan ulaşma yarı-kez Plato Not (sağdaki göstergede gösterilen) ile uzaklığı artırmak photoactivation alanına bölge göz önüne alındığında büyük olasılıkla artış ile korele aktin monomerleri Difüzyon için gerekli kez ilgili bölge. <a href="/files/ftp_upload/57643/57643fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Micromanipulation Techniques Allowing Analysis of Morphogenetic Dynamics and Turnover of Cytoskeletal Regulators at JoVE.com

Micromanipulation Techniques Allowing Analysis of Morphogenetic Dynamics and Turnover of Cytoskeletal Regulators

Biz nasıl sıkı BAĞLAMAK ve photoactivation gibi mikro - ve photomanipulation teknikleri hareketliliği parametreleri belirlenmesi etkinleştirmek ve proteinler geçiş içinde kronolojik zamanmekansal dinamikleri hücreleri tanımlamak. Deneysel veriler hücre altı dinamikleri ve ciro hareketliliği düzenleyiciler veya temel aktin sitoiskeleti içerir.

Morfogenetik dinamiklerini analiz ve hücre iskeleti düzenleyiciler ciro sağlayan Embriyolardan teknikleri

Examining the spatiotemporal dynamics of proteins can reveal their functional importance in various contexts. In this article, it is discussed how ...

micromanipulation-techniques-allowing-analysis-morphogenetic-dynamics

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

10.0K Görüntüleme.  Technische Universität Braunschweig. Biz nasıl sıkı BAĞLAMAK ve photoactivation gibi mikro - ve photomanipulation teknikleri hareketliliği parametreleri belirlenmesi etkinleştirmek ve proteinler geçiş içinde kronolojik zamanmekansal dinamikleri hücreleri tanımlamak. Deneysel veriler hücre altı dinamikleri ve ciro hareketliliği düzenleyiciler veya temel aktin sitoiskeleti içerir.

Video: Micromanipulation Techniques Allowing Analysis of Morphogenetic Dynamics and Turnover of Cytoskeletal Regulators

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

Nörotoksisite Yüksek İçerik Analizi Nöronal ve Astrosit Hücre Co-Kültür Testi

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Biyoloji

Microiontophoresis and Micromanipulation for Intravital Fluorescence Imaging of the Microcirculation

Microiontophoresis entails passage of current through a micropipette tip to deliver a solute at a designated site within an experimental preparation. Microiontophoresis can simulate synaptic transmission1 by delivering neurotransmitters and neuropeptides onto neurons reproducibly2. Negligible volume (fluid) displacement avoids mechanical disturbance to the experimental preparation. Adapting these techniques to the microcirculation3 has enabled mechanisms of vasodilation and vasoconstriction to be studied at the microscopic level in vivo4,5. A key advantage of such localized delivery is enabling vasomotor responses to be studied at defined sites within a microvascular network without evoking systemic or reflexive changes in blood pressure and tissue blood flow, thereby revealing intrinsic properties of microvessels.
A limitation of microiontophoresis is that the precise concentration of agent delivered to the site of interest is difficult to ascertain6. Nevertheless, its release from the micropipette tip is proportional to the intensity and duration of the ejection current2,7, such that reproducible stimulus-response relationships can be readily determined under defined experimental conditions (described below). Additional factors affecting microiontophoretic delivery include solute concentration and its ionization in solution. The internal diameter of the micropipette tip should be &tilde; 1 &mu;m or less to minimize diffusional 'leak', which can be counteracted with a retaining current. Thus an outward (positive) current is used to eject a cation and a negative current used to retain it within the micropipette.
Fabrication of micropipettes is facilitated with sophisticated electronic pullers8. Micropipettes are pulled from glass capillary tubes containing a filament that 'wicks' solution into the tip of the micropipette when filled from the back end ("backfilled"). This is done by inserting a microcapillary tube connected to a syringe containing the solution of interest and ejecting the solution into the lumen of the micropipette. Micromanipulators enable desired placement of micropipettes within the experimental preparation. Micromanipulators mounted on a movable base can be positioned around the preparation according to the topography of microvascular networks (developed below). 
The present protocol demonstrates microiontophoresis of acetylcholine (ACh+ Cl-) onto an arteriole of the mouse cremaster muscle preparation (See associated protocol: JoVE ID#2874) to produce endothelium-dependent vasodilation. Stimulus delivery is synchronized with digitized image acquisition using an electronic trigger. The use of Cx40BAC-GCaMP2 transgenic mice9 enables visualization of intracellular calcium responses underlying vasodilation in arteriolar endothelial cells in the living microcirculation.

Microiontophoresis entails movement of ions from a micropipette in response to a difference in electrical potential between the inside and outside of the micropipette. Biologically active molecules are thereby delivered in proportion to electrical current. We illustrate acetylcholine microiontophoresis in conjunction with micromanipulation to study endothelium-dependent vasodilation in the microcirculation.

Mikrosirkülasyon intravital Floresans Görüntüleme Microiontophoresis ve Mikromanipülasyon

Microiontophoresis entails passage of current through a micropipette tip to deliver a solute at a designated site within an experimental  preparation. ...

Tracking Morphogenetic Tissue Deformations in the Early Chick Embryo

Embryonic epithelia undergo complex deformations (e.g. bending, twisting, folding, and stretching) to form the primitive organs of the early embryo. Tracking fiducial markers on the surfaces of these cellular sheets is a well-established method for estimating morphogenetic quantities such as growth, contraction, and shear. However, not all surface labeling techniques are readily adaptable to conventional imaging modalities and possess different advantages and limitations. Here, we describe two labeling methods and illustrate the utility of each technique. In the first method, hundreds of fluorescent labels are applied simultaneously to the embryo using magnetic iron particles. These labels are then used to quantity 2-D tissue deformations during morphogenesis. In the second method, polystyrene microspheres are used as contrast agents in non-invasive optical coherence tomography (OCT) imaging to track 3-D tissue deformations. These techniques have been successfully implemented in our lab to studythe physical mechanisms of early head fold, heart, and brain development, and should be adaptable to a wide range morphogenetic processes.

This article describes surface labeling and ex ovo tissue culture in the early chick embryo. Techniques amenable to time-lapse bright field, fluorescence, and optical coherence tomography imaging are presented. Tracking surface labels with high spatiotemporal resolution enables kinematic quantities such as morphogenetic strains (deformations) to be calculated in both two and three dimensions.

Erken Civciv Embriyo morfogenetik Doku deformasyonlar Takibi

Embryonic epithelia undergo complex deformations (e.g. bending, twisting, folding, and stretching) to form the primitive organs of the early embryo. ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene expression, maintenance of genome integrity, parental imprinting, X-chromosome inactivation, regulation of development, aging, and cancer1. Recently, the presence of an oxidized 5-mC, 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC), was discovered in mammalian cells, in particular in embryonic stem (ES) cells and neuronal cells2-4. 5-hmC is generated by oxidation of 5-mC catalyzed by TET family iron (II)/&alpha;-ketoglutarate-dependent dioxygenases2, 3. 5-hmC is proposed to be involved in the maintenance of embryonic stem (mES) cell, normal hematopoiesis and malignancies, and zygote development2, 5-10. To better understand the function of 5-hmC, a reliable and straightforward sequencing system is essential. Traditional bisulfite sequencing cannot distinguish 5-hmC from 5-mC11. To unravel the biology of 5-hmC, we have developed a highly efficient and selective chemical approach to label and capture 5-hmC, taking advantage of a bacteriophage enzyme that adds a glucose moiety to 5-hmC specifically12.
Here we describe a straightforward two-step procedure for selective chemical labeling of 5-hmC. In the first labeling step, 5-hmC in genomic DNA is labeled with a 6-azide-glucose catalyzed by &beta;-GT, a glucosyltransferase from T4 bacteriophage, in a way that transfers the 6-azide-glucose to 5-hmC from the modified cofactor, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). In the second step, biotinylation, a disulfide biotin linker is attached to the azide group by click chemistry. Both steps are highly specific and efficient, leading to complete labeling regardless of the abundance of 5-hmC in genomic regions and giving extremely low background. Following biotinylation of 5-hmC, the 5-hmC-containing DNA fragments are then selectively captured using streptavidin beads in a density-independent manner. The resulting 5-hmC-enriched DNA fragments could be used for downstream analyses, including next-generation sequencing.
Our selective labeling and capture protocol confers high sensitivity, applicable to any source of genomic DNA with variable/diverse 5-hmC abundances. Although the main purpose of this protocol is its downstream application (i.e., next-generation sequencing to map out the 5-hmC distribution in genome), it is compatible with single-molecule, real-time SMRT (DNA) sequencing, which is capable of delivering single-base resolution sequencing of 5-hmC.

Described is a two-step labeling process using &beta;-glucosyltransferase (&beta;-GT) to transfer an azide-glucose to 5-hmC, followed by click chemistry to transfer a biotin linker for easy and density-independent enrichment. This efficient and specific labeling method enables enrichment of 5-hmC with extremely low background and high-throughput epigenomic mapping via next-generation sequencing.

Genomik DNA 5-hydroxymethylcytosine seçici Yakalama

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Phosphopeptide Analysis of Rodent Epididymal Spermatozoa

Spermatozoa are quite unique amongst cell types. Although produced in the testis, both nuclear gene transcription and translation are switched off once the pre-cursor round cell begins to elongate and differentiate into what is morphologically recognized as a spermatozoon. However, the spermatozoon is very immature, having no ability for motility or egg recognition. Both of these events occur once the spermatozoa transit a secondary organ known as the epididymis. During the ~12 day passage that it takes for a sperm cell to pass through the epididymis, post-translational modifications of existing proteins play a pivotal role in the maturation of the cell. One major facet of such is protein phosphorylation. In order to characterize phosphorylation events taking place during sperm maturation, both pure sperm cell populations and pre-fractionation of phosphopeptides must be established. Using back flushing techniques, a method for the isolation of pure spermatozoa of high quality and yield from the distal or caudal epididymides is outlined. The steps for solubilization, digestion, and pre-fractionation of sperm phosphopeptides through TiO2 affinity chromatography are explained. Once isolated, phosphopeptides can be injected into MS to identify both protein phosphorylation events on specific amino acid residues and quantify the levels of phosphorylation taking place during the sperm maturation processes.

Proteomic analysis of any cell type is highly dependent on both purity and pre-fractionation of the starting material in order to de-complexify the sample prior to liquid chromatography mass spectrometry (MS). By using back-flushing techniques, pure spermatozoa can be obtained from rodents. Following digestion, phosphopeptides can be enriched using TiO2.

Kemirgen Epididimal Spermatozoa&#39;lar phosphopeptide Analizi

Spermatozoa are quite unique amongst cell types. Although produced in the testis, both nuclear gene transcription and translation are switched off once ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that regulates diverse biological pathways including the hypoxia response, proteostasis, the DNA damage response and transcription.&#160; To better understand how UBLs regulate pathways relevant to human disease, we have compiled a human siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; library consisting of 1,186 siRNA duplex pools targeting all known and predicted components of UBL system pathways. This library can be screened against a range of cell lines expressing reporters of diverse biological pathways to determine which UBL components act as positive or negative regulators of the pathway in question.&#160; Here, we describe a protocol utilizing this library to identify ubiquitome-regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia using a transcription-based luciferase reporter.&#160; An initial assay development stage is performed to establish suitable screening parameters of the cell line before performing the screen in three stages: primary, secondary and tertiary/deconvolution screening. &#160;The use of targeted over whole genome siRNA libraries is becoming increasingly popular as it offers the advantage of reporting only on members of the pathway with which the investigators are most interested.&#160; Despite inherent limitations of siRNA screening, in particular false-positives caused by siRNA off-target effects, the identification of genuine novel regulators of the pathways in question outweigh these shortcomings, which can be overcome by performing a series of carefully undertaken control experiments.

Here, we describe a methodology to perform a targeted siRNA &#8220;ubiquitome&#8221; screen to identify novel ubiquitin and ubiquitin-like regulators of the HIF1A-mediated cellular response to hypoxia.&#160; This can be adapted to any biological pathway where a robust read out of reporter activity is available.

Kültür Memeli Hücrelerde Biyolojik tanımında ubikitin ve Ubiquitin benzeri Sistemi Regülatörleri tanımak siRNA Eleme

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help regulate a diverse range of biological processes. Analysis of EVs using flow cytometry (FCM) has been notoriously difficult due to their small size and lack of discrete populations positive for markers of interest. Methods for EV analysis, while considerably improved over the last decade, are still a work in progress. Unfortunately, there is no one-size-fits-all protocol, and several aspects must be considered when determining the most appropriate method to use. Presented here are several different techniques for processing EVs and two protocols for analyzing EVs using either individual detection or a bead-based approach. The methods described here will assist with eliminating the antibody aggregates commonly found in commercial preparations, increasing signal&#8211;to-noise ratio, and setting gates in a rational fashion that minimizes detection of background fluorescence. The first protocol uses an individual detection method that is especially well suited for analyzing a high volume of clinical samples, while the second protocol uses a bead-based approach to capture and detect smaller EVs and exosomes.

Many different methods exist for the measurement of extracellular vesicles (EVs) using flow cytometry (FCM). Several aspects should be considered when determining the most appropriate method to use. Two protocols for measuring EVs are presented, using either individual detection or a bead-based approach.

Akım Sitometri Kullanımı Ekstrasellüler Veziküller Analizi Teknikleri

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Enhanced Genetic Analysis of Single Human Bioparticles Recovered by Simplified Micromanipulation from Forensic &#8216;Touch DNA&#8217; Evidence

DNA profiles can be obtained from &#8216;touch DNA&#8217; evidence, which comprises microscopic traces of human biological material. Current methods for the recovery of trace DNA employ cotton swabs or adhesive tape to sample an area of interest. However, such a &#8216;blind-swabbing&#8217; approach will co-sample cellular material from the different individuals, even if the individuals&#8217; cells are located in geographically distinct locations on the item. Thus, some of the DNA mixtures encountered in touch DNA samples are artificially created by the swabbing itself. In some instances, a victim&#8217;s DNA may be found in significant excess thus masking any potential perpetrator&#8217;s DNA.
In order to circumvent the challenges with standard recovery and analysis methods, we have developed a lower cost, &#8216;smart analysis&#8217; method that results in enhanced genetic analysis of touch DNA evidence. We describe an optimized and efficient micromanipulation recovery strategy for the collection of bio-particles present in touch DNA samples, as well as an enhanced amplification strategy involving a one-step 5 &#181;l microvolume lysis/STR amplification to permit the recovery of STR profiles from the bio-particle donor(s). The use of individual or few (i.e., &#8220;clumps&#8221;) bioparticles results in the ability to obtain single source profiles. These procedures represent alternative enhanced techniques for the isolation and analysis of single bioparticles from forensic touch DNA evidence. While not necessary in every forensic investigation, the method could be highly beneficial for the recovery of a single source perpetrator DNA profile in cases involving physical assault (e.g., strangulation) that may not be possible using standard analysis techniques. Additionally, the strategies developed here offer an opportunity to obtain genetic information at the single cell level from a variety of other non-forensic trace biological material.

Here we describe an optimized and efficient removal strategy for the collection of bio-particles present in &#8216;touch DNA&#8217; samples, together with an enhanced amplification protocol involving a one-step 5 &#181;l micro-volume lysis/STR amplification, to permit the recovery of short tandem repeat (STR) profiles of the bio-particle donor(s).

Adli &#39;Dokunmatik DNA&#39; Kanıt dan Basitleştirilmiş mikromanipulasyon tarafından Kurtarılan Tek İnsan Bioparticles geliştirilmiş Genetik Analiz

DNA profiles can be obtained from &#8216;touch DNA&#8217; evidence, which comprises microscopic traces of human biological material. Current methods for ...

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells regulate these processes and how genetic mutations impact regulation. The quantification of microtubule dynamics in metazoan models has a number of associated challenges, including a high microtubule density and limitations on genetic manipulations. In contrast, the budding yeast model offers advantages that overcome these challenges. This protocol describes a method to measure the dynamics of single microtubules in living yeast cells. Cells expressing fluorescently tagged tubulin are adhered to assembled slide chambers, allowing for stable time-lapse image acquisition. A detailed guide for high-speed, four-dimensional image acquisition is also provided, as well as a protocol for quantifying the properties of dynamic microtubules in confocal image stacks. This method, combined with conventional yeast genetics, provides an approach that is uniquely suited for quantitatively assessing the effects of microtubule regulators or mutations that alter the activity of tubulin subunits.

Budding yeast is an advantageous model for studying microtubule dynamics in vivo due to its powerful genetics and the simplicity of its microtubule cytoskeleton. The following protocol describes how to transform and culture yeast cells, acquire confocal microscopy images, and quantitatively analyze microtubule dynamics in living yeast cells.

Yüksek çözünürlüklü görüntüleme ve Bireysel Astral Mikrotubul Dynamics Analizi Budding Maya

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...

Simple and Effective Administration and Visualization of Microparticles in the Circulatory System of Small Fishes Using Kidney Injection

The systemic administration of micro-size particles into a living organism can be applied for vasculature visualization, drug and vaccine delivery, implantation of transgenic cells and tiny optical sensors. However, intravenous microinjections into small animals, which are mostly used in biological and veterinary laboratories, are very difficult and require trained personnel. Herein, we demonstrate a robust and efficient method for the introduction of microparticles into the circulatory system of adult zebrafish (Danio rerio) by injection into the fish kidney. To visualize the introduced microparticles in the vasculature, we propose a simple intravital imaging technique in fish gills. In vivo monitoring of the zebrafish blood pH was accomplished using an injected microencapsulated fluorescent probe, SNARF-1, to demonstrate one of the possible applications of the described technique. This article provides a detailed description of the encapsulation of pH-sensitive dye and demonstrates the principles of the quick injection and visualization of the obtained microcapsules for in vivo recording of the fluorescent signal. The proposed method of injection is characterized by a low mortality rate (0-20%) and high efficiency (70-90% success), and it is easy to institute using commonly available equipment. All described procedures can be performed on other small fish species, such as guppies and medaka.

This article demonstrates the principles of a quick, minimally invasive injection of fluorescent microparticles into the circulatory system of small fishes and the in vivo visualization of the microparticles in fish blood.

Basit ve etkili yönetim ve küçük balıklar böbrek enjeksiyon kullanarak dolaşım sistemi içinde Microparticles görselleştirme

The systemic administration of micro-size particles into a living organism can be applied for vasculature visualization, drug and vaccine delivery, ...