Bu tekniğin en büyük avantajı, stimülasyondan önce hücrelerin eşit olarak dağılması ve daha sonra tandem hücre yapışmasında eşit olarak uyarılmasıdır. Prosedürü gösteren Azuma Kimura, bizim laboratuvardan bir lisansüstü öğrenci olacaktır. Bu prosedüre başlamak için, altı mililitre RPMI 1640'ı buz üzerinde dört santigrat dereceye soğutulmuş bir tüpe aktarın.
Soğutulmuş bir mililitre pipet uçları kullanarak, iki miligram bazal membran matris ekleyin. Mililitre başına 0,33 miligram konsantrasyonu ile bir bodrum membran matris yapmak için nazik pipetleme tarafından iyice karıştırın. Daha sonra, seyreltilmiş bazal membran matris iki mililitre altı iyi hücre kültür plaka her kuyuya aktarmak için bir pipet kullanın.
Plakayı 37 derecede 60 ila 90 dakika kuluçkaya yatırın. Bundan sonra, kullanım alakadar, üç saate kadar oda sıcaklığında plaka tutun. İlk olarak, kullanılan orta aspire ve her kuyuya 0,5 milimolar EDTA iki mililitre eklemek için bir pipet kullanın altı kuyu plaka kültürlü hPCSs yıkamak için.
Sonra, kuyulardan EDTA aspire ve her kuyuya taze 0.5 milimolar EDTA iki mililitre ekleyin. Plakayı 37 derecede beş dakika kuluçkaya yatırın. Bundan sonra, her kuyudan EDTA aspire.
Oda sıcaklığında bir mililitre hPSC bakım ortamı ekleyin, her kuyuya 10 mikromolar Y27632 ile desteklenir. Pipet yavaşça ama hızlı bir şekilde plaka üzerinde bağlı hücreleri uçurmak ve tek hücrelere herhangi bir kümelenmiş hücreleri ayırmak için. Hücre süspansiyonuna, her kuyuda 10 mikromolar Y27632 ile desteklenen dört mililitre hPSC bakım ortamı içeren 50 mililitrelik bir santrifüj tüpte aktarın ve pipetleme ile karıştırın.
Daha sonra, tüpte 15 mikrolitre trypan mavisi ile 15 mikrolitre hücre süspansiyonu karıştırın. Seyreltilmiş hücre süspansiyonunun 10 mikrolitresini hücre sayma slaytlarına aktarmak için 10 mikrolitrelik bir pipet kullanın. Otomatik bir hücre sayacı kullanarak, hücre numarasını sayın ve hücre süspansiyonundaki hücre yoğunluğunu hesaplayın.
Her bir kuyunun kullanılması için hücre süspansiyonuna bir ila bir buçuk milyon hücre yoğunluğunda 50 mililitrelik bir tüpe ayırın. Tüpü 200 kez G'de ve oda sıcaklığında beş dakika santrifüj edin. Bundan sonra, supernatant aspire etmek ve sahne 1A orta iyi bir mililitre kullanarak hücreleri yeniden askıya almak için bir pipet kullanın.
Yavaşça hücre süspansiyon pipet ve sonra sahne başka bir mililitre ekleyin 1A iyi başına orta. 1000 mikrolitrelik pipet kullanarak, daha önce hazırlanmış hücre kültürü plaka kuyularından seyreltilmiş bazal membran matris aspire. Hemen pipet tüpün süspansiyon yavaşça ve altı iyi plaka her kuyuiçine iki mililitre aktarın.
Plakayı ışıktan korumak için alüminyum folyo ile kaplayın ve tabağı oda sıcaklığında 10 ila 15 dakika boyunca temiz bir tezgahın üzerine yerleştirin. Bundan sonra, plakayı %5 karbondioksit ve 24 saat boyunca nemlendirilmiş bir atmosferle 37 santigrat derecede bir kuvöze dikkatlice aktarın. İlk olarak, yavaşça plaka sallamak ve kullanılan orta aspire etmek için bir pipet kullanın.
Sonra, her kuyuya iki mililitre DPBS ekleyin. Plakayı tekrar hafifçe sallayın ve kullanılan DPBS'yi aspire edin. Her kuyuya önceden ısıtılmış 1B orta evre dört mililitre ekleyin, 37 santigrat derece, her.
Plakayı %5 karbondioksit ve nemlendirilmiş atmosferi 48 saat boyunca kültüre aktarın. Bundan sonra, yavaşça plaka sallamak ve kullanılan orta aspire. Her kuyuya iki mililitre DPBS ekleyin.
Bu aspirasyon ve DPBS ek bir kez daha tekrarlayın. Plakayı hafifçe sallayın ve kullanılan DPBS'yi aspire edin. Her kuyuya önceden ısıtılmış 1B orta evre dört mililitre ekleyin, 37 santigrat derece, her.
Plakayı %5 karbondioksit ve nemlendirilmiş atmosferle 37 derecede nisbeten 24 saat boyunca kültüre aktarın. İlk olarak, yavaşça plaka sallamak ve kullanılan orta aspire. Altı kuyulu plakanın her kuyuya iki mililitre DPBS ekleyin.
Daha sonra, yavaşça plaka sallamak ve kullanılan DPBS aspire. Her kuyuya önceden ısıtılmış 2. Plakayı %5 karbondioksit ve nemlendirilmiş atmosferi ile 37 dereceden bir kuvöze dikkatlice dört gün boyunca kültüre aktarın.
Yavaşça plaka sallamak ve kullanılan orta aspire. Her kuyuya iki mililitre DPBS ekleyin. DPPS'yi bir kez daha azarlama ve ekleme işlemini tekrarlayın.
Bundan sonra, yavaşça plaka sallamak ve kullanılan DPBS aspire. Her kuyuya önceden ısıtılmış 37 santigrat dereceye kadar ısıtılmış üç etap orta dört mililitre ekleyin. Plakayı %5 karbondioksit ve nemlendirilmiş atmosferle 37 dereceden bir kuvöze dikkatlice üç gün boyunca kültüre aktarın.
Bu çalışmada, yayılan hIPSE'ler yoğunlaştırılmış ve farklılaşmaya uygun homojen bir monolayer oluşturmuşlardır. Farklılaşmamış hIPSE'ler ayrıştırılır ve düşük hücre yoğunluklarında tek hücre olarak yeniden tohumlanır. Bir saat içinde hücreler tabağa bağlanır ve çıkıntı göstermeye başlar.
İlk gün, hücreler çoğalır ve yüzey alanının %80 ila %90'ını kapsayacak şekilde iyi dağıtılır. Üçüncü ve dördüncü günlerde, hücreler parke taşı görünümü olarak tanımlanabilecek homojen bir tek katmanlı tabaka oluştururlar. Bu noktada, çoğu hücre farklılaşmamış hücreler için bir belirteç olan SOX2'yi ifade etmeyi durdurur ve bunun yerine %90'dan fazla SOX17-pozitif hücreNIN FOXA2'yi ifade ettiği kesin bir endoderm belirteci olan SOX17'yi ifade eder.
Sonra hücreler ilkel goptupe belirteçleri ifade etmeye başlar, HNF1-beta ve HNF4-alfa, ve sonunda bir posterior foregrate pankreas atası belirteci ifade, PDX1, fazla 90%PDX1-pozitif hücre indüksiyon başka bir hIPSE hattı, 1231A3, ve bir hESE hattı, Kh-3. Evre belirteçlerin MRNA ekspresyonunun QRTPCR sonuçları immünboyama ile uyumludur ve PDX1'in MRNA ekspresyonu üçüncü aşamada belirgindir ve sonrasında önemli ölçüde artar. Farklılaşmamış ESIPS hücreleri koloniler halinde büyüdüğünden, tek tek hücreler yerel olarak farklı bir durumdadır.
Bu protokol, seçilen farklılaşma için hücreleri eşit olarak uyarmak için bir yol sağlar.
