Bu çalışmada, kısmen ya da bütün olarak, Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Çin (31472187 ve 31672550) ve tarım bilim ve teknoloji yenilik programı Çin Tarımsal Bilimler Akademisi tarafından desteklenen.

Tüm hayvan deneyleri Yerel Etik Komite Shanghai veteriner Araştırma Enstitüsü, Çin Tarımsal Bilimler Akademisi tarafından kabul edildi (izin numarası: SHVRIAU-14-0101).
1. Schistosomes in Vitro kültür
Not: Schistosomes bir biohazard temsil eder. İşçi hepsini ne zaman işleme solucanlar, schistosomal süspansiyonlar veya diğer biyolojik malzemeler ilgili kez lateks eldiven giymek gerekir. Yeni Zelanda tavşanları ~ 2.000 cercariae yolu ile karın pozlama ile bulaşmış. Schistosomes karaciğer aşamada tavşan S. japonicum cercariae 28 gün sonrası enfeksiyon, karaciğer ve mezenterik damarların perfüzyon tarafından enfekte üzerinden toplanmıştır. Solucan koleksiyonu yordamlar önceki yayınlarda fareler18çalışmalarda raporlama başvuru.
<ol><li>Parazitleri bir 500 mL ölçek toplamak. Onları iyice yıkayın ve yavaşça 3 x 200 mL ile (37 ° C) PBS (pH 7,4) ısıtılmış.</li>
	<li>Her 90 mm Petri kabına için ~ 200 solucan çiftleri ayırmak. Parazitler iyice yıkayın ve hafifçe 2 x 50 mL ile (37 ° C) RPMI-1640 Kültür 100 U penisilin ve 100 mg/mL streptomisin içeren orta ısıtılmış.</li>
	<li>Parazitler olmadan antibiyotik altında %5 CO2 ~ 5 solucan çiftleri /mL 2 90 mm Petri s için yoğunluğu, çanak 37 ° C'de ısıtılmış RPMI-1640 kültür ortamının 40 ml korumak. Notlar: RPMI 1640 orta serum içermemesi gerekir, aksi takdirde eksojen ekstraselüler vezikül tanıtılacaktır.</li>
</ol>2. tedavi ön koşulu medya
<ol><li>Kültür orta toplamak ve 2.000 × g yumurta kaldırıp tegmental enkaz solucan 30 dk için 4 ° C'de orta santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Süpernatant aktarmak için taze bir tüp ve 0,22 µm şırınga filtre kullanarak çözüm filtre uygulayabilirsiniz.</li>
	<li>Filtre uygulanmış çözüm diyaliz çantaya toplamak (moleküler ağırlık kesme: 3.5kD) ve gecede 4 ° C'de % 8 ' PEG8000 çözüm kullanarak çözüm diyaliz. Notlar: SjEVs yalıtım verimi artırmak için SjEVs zenginleştirmek önemli bir adımdır.</li>
</ol>3. SjEVs yalıtım
<ol><li>Diyaliz çözüm için yeni bir tüp aktarmak ve toplam eksozom yalıtım reaktif 0.5 birimleri ekleyin.</li>
	<li>Çözüm de tarafından vortexing veya yukarı ve aşağı polimerlerin çözüm sağlamak için pipetting karıştırın.</li>
	<li>2 ° C-8 ° C karisimin gecede kuluçkaya.</li>
	<li>2 ° c ile 8 ° c 1 h için 15.000 × g karisimin santrifüj kapasitesi</li>
	<li>Aspire edin ve süpernatant atın. Notlar: EVs (görünmeyen Olguların çoğunda) tüp alt Pelet bulunur.</li>
	<li>EVs Pelet 2 mL PBS resuspend ve daha fazla çözümleme kadar EVs çözüm-80 ° C'de depolayın.</li>
</ol>4. Western blot tarafından EVs karakterizasyonu
<ol><li>Örneğin, BCA tahlil tarafından SjEVs örnek protein konsantrasyonu belirlemek.</li>
	<li>10-20 µg EVs 22.5 µL RIPA arabelleği, hazır olun. Sonra arabellek ve ısı 95 ° C'de 5 min için yükleme x 4 7,5 µL ekleyin</li>
	<li>Ayrı SjEVs proteinler tarafından % 12 SDS-sayfa jel.</li>
	<li>PVDF membran proteinleri aktarmak ve anti-tavşan IgG-HRP ile (1:5, 000 seyreltme) sondalama tarafından takip anti-CD63 antikorlar (1:1, 000 seyreltme), ile sonda.</li>
	<li>ECL algılama reaktif membran geliştirme için kullanın ve görüntüleme sistemi Kemiluminesan tarafından sinyalleri tespit.</li>
</ol>5. EVs transmisyon elektron mikroskobu ile karakterizasyonu
<ol><li>İzole SjEVs 2 µL 200 mesh formvar kaplamalı ızgaralar için ekleyin ve sonra oda sıcaklığında kurumasını bekleyin.</li>
	<li>Phosphotungstic asit, 1 dk. için %2 ile leke ve sonra oda sıcaklığında kurumasını bekleyin.</li>
	<li>Izgaralar transmisyon elektron mikroskobu örnek sahibinin üzerine yük ve bir 80 kV elektron ışını görüntü yakalama için maruz.</li>
</ol>6. SjEVs PKH67 ve hücre alımı tahlil etiketle
Notlar: Tüm sonraki adımları ortam sıcaklığında (20-25 ° C), aksi belirtilmedikçe yapıldı.
<ol><li>5 µg SjEVs çözüm Konik alt polipropilen boru aktarmak ve 12 ml RPMI 1640 orta ekleyerek ses seviyesini.</li>
	<li>SjEVs cips için SjEVs 110.000 × g 4 ° C'de 90 dk için de santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Santrifüjü sonra dikkatle süpernatant Aspire edin. Not: Bu türdeş olmayan boyama ve azaltılmış hücre canlılığı neden gibi PKH67 ethanolic boya SjEV Pelet doğrudan, eklenmelidir değil.</li>
	<li>2 x EV süspansiyon çözüm SjEV Pelet Dilüent c 1 mL ekleyerek hazırlamak; tam dağılım sağlamak için nazik pipetting ile resuspend.</li>
	<li>Dilüent C boyama önce taze bir 2 x boya çözüm PKH67 ethanolic boya çözüm 2 µL Dilüent C 1 mL polipropilen santrifüj tüpü içinde ekleme ve de dağıtmak için karıştırma hazırlayın.</li>
	<li>Hızlı bir şekilde EV süspansiyon (adım 6.4) 2 x boya çözüm (adım 6.5) ve hemen 1 ml örnek pipetting tarafından mix 2 x 1 mL ekleyin.</li>
	<li>Karışımı, oda sıcaklığında 4 dk için kuluçkaya.</li>
	<li>4 mL FBS ekleyerek boyama durdurmak ve 1 dk. için kuluçkaya.</li>
	<li>RPMI1640 orta 12 ml ses seviyesini ve 110.000 × g 90 dk 4 ° C'de, santrifüj kapasitesi için ekleyin.</li>
	<li>Süpernatant kaldırın ve RPMI1640 orta SjEV granül etiketli PKH67 resuspend ekleyin.</li>
	<li>Bir kez yıkama ve PBS SjEVs granül resuspend eklemek için 90 dakika için 4 ° C'de 110.000 × g, santrifüj kapasitesi.</li>
</ol>7. SjEVs hücre alımı tahlil
<ol><li>Tohum memeli hücreleri NCTC gibi clone 1469 hücreleri ya da 6-şey plaka (2 × 105 hücreleri de başına) hücrelerde HEK293T ve hücreleri gecede kültür.</li>
	<li>5 µg PKH67 etiketli SjEVs ekleyin ve 2-4 h için 37 ° C'de hücreler kültür.</li>
	<li>Kuluçka sonra orta kaldırmak ve PBS hücrelerle iki kez yıkayın.</li>
	<li>%4 formaldehit solüsyonu 15dk için hücreleri tamir ve iki kez PBS ile daha fazla yıkadım.</li>
	<li>Hücre çekirdeği ' 4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ile leke.</li>
	<li>Floresans mikroskobu kullanarak hücreleri gözlemlemek.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Tetta, C., Ghigo, E., Silengo, L., Deregibus, M. C., Camussi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+as+an+emerging+mechanism+of+cell-to-cell+communication.">Extracellular vesicles as an emerging mechanism of cell-to-cell communication.</a> Endocrine. 44 (1), 11-19 (2013).</li><li>Abels, E. R., Breakefield, X. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+to+Extracellular+Vesicles:+Biogenesis,+RNA+Cargo+Selection,+Content,+Release,+and+Uptake.">Introduction to Extracellular Vesicles: Biogenesis, RNA Cargo Selection, Content, Release, and Uptake.</a> Cell Mol Neurobiol. 36 (3), 301-312 (2016).</li><li>Riaz, F., Cheng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome-like+vesicles+of+helminths:+implication+of+pathogenesis+and+vaccine+development.">Exosome-like vesicles of helminths: implication of pathogenesis and vaccine development.</a> Ann Transl Med. 5 (7), 175 (2017).</li><li>Zhang, H. G., Grizzle, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+cancer:+a+newly+described+pathway+of+immune+suppression.">Exosomes and cancer: a newly described pathway of immune suppression.</a> Clin Cancer Res. 17 (5), 959-964 (2011).</li><li>Colombo, M., Raposo, G., Thery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biogenesis,+secretion,+and+intercellular+interactions+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles.">Biogenesis, secretion, and intercellular interactions of exosomes and other extracellular vesicles.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 30, 255-289 (2014).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circular+RNA+is+enriched+and+stable+in+exosomes:+a+promising+biomarker+for+cancer+diagnosis.">Circular RNA is enriched and stable in exosomes: a promising biomarker for cancer diagnosis.</a> Cell Res. 25 (8), 981-984 (2015).</li><li>Marcilla, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+in+parasitic+diseases.">Extracellular vesicles in parasitic diseases.</a> J Extracell Vesicles. 3, 25040 (2014).</li><li>Cwiklinski, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Extracellular+Vesicles+of+the+Helminth+Pathogen,+Fasciola+hepatica:+Biogenesis+Pathways+and+Cargo+Molecules+Involved+in+Parasite+Pathogenesis.">The Extracellular Vesicles of the Helminth Pathogen, Fasciola hepatica: Biogenesis Pathways and Cargo Molecules Involved in Parasite Pathogenesis.</a> Mol Cell Proteomics. 14 (12), 3258-3273 (2015).</li><li>Buck, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+secreted+by+nematode+parasites+transfer+small+RNAs+to+mammalian+cells+and+modulate+innate+immunity.">Exosomes secreted by nematode parasites transfer small RNAs to mammalian cells and modulate innate immunity.</a> Nat Commun. 5, 5488 (2014).</li><li>Sotillo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles+secreted+by+Schistosoma+mansoni+contain+protein+vaccine+candidates.">Extracellular vesicles secreted by Schistosoma mansoni contain protein vaccine candidates.</a> Int J Parasitol. 46 (1), 1-5 (2016).</li><li>Nowacki, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+and+small+non-coding+RNA-enriched+extracellular+vesicles+are+released+by+the+pathogenic+blood+fluke+Schistosoma+mansoni.">Protein and small non-coding RNA-enriched extracellular vesicles are released by the pathogenic blood fluke Schistosoma mansoni.</a> J Extracell Vesicles. 4, 28665 (2015).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome-like+vesicles+derived+by+Schistosoma+japonicum+adult+worms+mediates+M1+type+immune-+activity+of+macrophage.">Exosome-like vesicles derived by Schistosoma japonicum adult worms mediates M1 type immune- activity of macrophage.</a> Parasitol Res. 114 (5), 1865-1873 (2015).</li><li>Koh, Y. Q., Almughlliq, F. B., Vaswani, K., Peiris, H. N., Mitchell, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosome+enrichment+by+ultracentrifugation+and+size+exclusion+chromatography.">Exosome enrichment by ultracentrifugation and size exclusion chromatography.</a> Front Biosci (Landmark Ed). 23, 865-874 (2018).</li><li>Safdar, A., Saleem, A., Tarnopolsky, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+of+endurance+exercise-derived+exosomes+to+treat+metabolic+diseases.">The potential of endurance exercise-derived exosomes to treat metabolic diseases.</a> Nat Rev Endocrinol. 12 (9), 504-517 (2016).</li><li>Livshits, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+exosomes+by+differential+centrifugation:+Theoretical+analysis+of+a+commonly+used+protocol.">Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol.</a> Sci Rep. 5, 17319 (2015).</li><li>Zhu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Release+of+extracellular+vesicles+containing+small+RNAs+from+the+eggs+of+Schistosoma+japonicum.">Release of extracellular vesicles containing small RNAs from the eggs of Schistosoma japonicum.</a> Parasit Vectors. 9 (1), 574 (2016).</li><li>Zhu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+characterization+of+S.+japonicum+exosome-like+vesicles+reveals+their+regulatory+roles+in+parasite-host+interactions.">Molecular characterization of S. japonicum exosome-like vesicles reveals their regulatory roles in parasite-host interactions.</a> Sci Rep. 6, 25885 (2016).</li><li>Lewis, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Schistosomiasis.">Schistosomiasis.</a> Curr Protoc Immunol. , 11 (2001).</li><li>Cheng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+miRNAs:+roles+in+cancer+diagnosis,+prognosis+and+therapy.">Circulating miRNAs: roles in cancer diagnosis, prognosis and therapy.</a> Adv Drug Deliv Rev. 81, 75-93 (2015).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

EVs üzerinde son yıllarda yapılan çalışmalarda EVs ana bilgisayar-patojen etkileşimleri3,9,12,16' önemli bir rol oynamaktadır bu paraziti gösterdi. Daha fazla adrese düzenleyici işlevleri, EVs schistosomes yalıtmak için gerekli olduğunu. Burada, SjEV yalıtım için alternatif bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem SjEVs, geniş Aralık boyutunu 100 verimleri nm 400 nm, Yetişkin S. japonicum. Aşağıdaki hücre alımı tahlil altında açıklanan protokol izole EVs başarıyla alıcı hücreleri tarafından içselleştirilmiş ve onların ilişkili miRNAs potansiyel olarak düzenleyici rol17oyun belirtti.
EVs, birçok farklı türde hücreleri tarafından salgılanan, ayrıca vücut sıvıları19çeşitli mevcuttur. Sonuç olarak, yapay olarak SjEV yalıtım işlemi sırasında eksojen EVs tanıtımı için önlemek önemlidir. Örneğin, kültür orta serum içermemesi gerekir. Vitro kültür solucan dansitesi potansiyel stres tepkisi en aza indirmek ve solucanlar mortalite oranları düşürmek için makul olmalıdır. Buna ek olarak, schistosomes veya solucanlar farklı aşamalarında farklı bilgisayarlardan farklı EVs takdim unutulmamalıdır. Sonuç olarak, bu parazitler ana ortamı yakından benzer vitro ortamlarda korumak için zorunludur ve koşullar altında hangi SjEV yalıtım gerçekleştirilir tutarlı olmalıdır. Ayrıca, kültür stresin neden SjEVs ilgili sapma olasılığını ekarte edemiyoruz vardır.
Burada, SjEVs izolasyonu yetişkin schistosomes için 2 h vitro Kültür medya için bir iletişim kuralı mevcut. Bu protokol kısa kültür zaman fizyolojik olmayan EV salgı neden olabilir stres için parazitler maruz kalır, en aza indirir avantajlıdır. Buna ek olarak, bu protokol için açıklandığı gibi izole SjEVs bu SjEVs biyolojik olarak aktif17olabilir düşündüren alıcı hücreler tarafından içselleştirilmiş bulduk. Genel olarak, mevcut protokol SjEVs verimli yalıtım yetişkin gelen Standart laboratuvar donanımları kullanarak solucanlar ve western Blot kullanarak karakterizasyonu ve hücre alımı tahlil sağlar sağlar. İzole EVs daha fazla ana bilgisayar-patojen etkileşimleri karakterize etmek için kullanılabilir.

Hücre dışı veziküller (EVs) küçük membran bağlı veziküller çeşitli proteinler, lipidler ve nükleik asitler ile kapsüllü bir nüfusu vardır. Son yıllarda yapılan çalışmalarda EVs hücre-hücre iletişim çok önemli bir rol oynamaktadır ve hücre gelişimini, bağışıklık düzenlemesi, anjiogenez ve hücre geçiş2de dahil olmak üzere çok sayıda fizyolojik süreçlerin yönetmelikte yer gösterdi, 3,4,5. Delil biriktiriyor EVs, exosomes ve onların miRNA kargo dolaşan bazı hastalıklar6potansiyel biyolojik temsil ettiğini gösterir.
Trikomonas vajinalis, Trypanosoma cruzive LEISHMANIA sppgibi birkaç protozoa., EVs; salgılar edebilmek için gösterilen archlar Ayrıca bulundu EVs yaşam içine salgılaması için7ev sahipliği yaptı. Paraziter EVs enfeksiyon, patojen8ve bağışıklık Yönetmeliği9bakım dahil olduğu gösterilmiştir. Son schistosomes içinde her iki Schistosoma mansoni (S. mansoni) 10,11 çalışmalar ve S. japonicum12 yetişkin schistosomes olabilir eksozom benzeri veziküller salgılar belirtilmiştir var Belirli biyolojik süreçlerin fonksiyonel Yönetmeliğinde yer.
Bugüne kadar çeşitli yöntemler ultrasantrifüj, Ultrafiltrasyon13, polimer esaslı reaktifler, boyut-dışlama Kromatografi ve immunoaffinity yalıtım kullanımı gibi hücre dışı veziküller izole etmek için kullanılmıştır. Bu farklı yöntemler kendi avantajları ve sınırlamalar14bulunur. Genel olarak, ultrasantrifüj vezikül yalıtım için altın standart yöntem olarak kabul edilir. Ancak, bu yöntem potansiyel EV toplama14sınırlama uğrar.
Schistosomes, yöntemleri bir çift EV yalıtımı için bildirilmiştir: Bu ultrasantrifüj11,12,10 ve çeşitli aşamalarında (yumurta16, ticari EV yalıtım Seti16 kullanımını içerir schistosomula11, Yetişkin schistosomes10,12,17). Microvesicles birkaç yüz nanometre boyutundan bin nanometre için geniş bir göz önüne alındığında olduğuna göre biz tezgah santrifüj, Ultrafiltrasyon ve üzerinden EVs yalıtmak için ticari bir EV izolasyon kit kullanımı ile birleştiren alternatif bir yöntem geliştirdi Yetişkin Schistosoma japonicum. İzole EVs genellikle 100-400 nm çapında sahip ve başarıyla alıcı hücreleri tarafından içselleştirilmiş.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Material&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Total Exosome Isolation Reagent (from cell culture media)</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>4478359</td><td>For isolating S. japonicum extracellular vesicles</td></tr><tr><td>PKH67</td><td>Sigma-aldrich</td><td>MINI67</td><td>For labeling Evs</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>11875119</td><td>For parasite culture</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>ThermoFisher SCIENTIFIC</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>0.22&amp;mu;m syringe filter</td><td>Merck</td><td>SLGP033RB</td><td></td></tr><tr><td>SnakeSkin Dialysis Tubing</td><td>Thermo SCIENTIFIC</td><td>68035</td><td></td></tr><tr><td>PEG8000</td><td>Sangon Biotech</td><td>A100159&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>RIPA</td><td>Beyotime</td><td>P0013B</td><td></td></tr><tr><td>EMD Millipore&amp;trade; Immobilon&amp;trade; Western Chemiluminescent HRP Substrate (ECL)</td><td>Fisher scientific</td><td>WBKLS0100&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>4083</td><td></td></tr><tr><td>BCA kit</td><td>Beyotime</td><td>P0010</td><td></td></tr><tr><td>CD63 antibodies</td><td>Sangon Biotech</td><td>D160973-0025</td><td></td></tr><tr><td>PVDF</td><td>Bio-Rad</td><td>1704273</td><td></td></tr><tr><td>Formvar/Carbon 400 mesh</td><td>Ted Pella</td><td>01754-F</td><td></td></tr><tr><td>Phosphotungstic Acid</td><td>Ted Pella</td><td>19402</td><td></td></tr><tr><td>anti-mouse IgG-HRP</td><td>CWBIO</td><td>CW0102</td><td></td></tr><tr><td>NCTC clone 1469 cells</td><td>ATCC</td><td>ATCC&amp;reg; CCL-9.1&amp;trade;</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>HyClone</td><td>SV30087.02</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipments&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GE chemoluminescance imaging system</td><td>GE</td><td>ImageQuant LAS4000mini</td><td></td></tr><tr><td>Transmission electron microscopy</td><td>Hitachi</td><td>H-7600</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q water</td><td>Milli-Q</td><td>Milli-Q Elix</td><td></td></tr><tr><td>Eppendor Centrifuge&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>Centrifuge 5804R</td><td></td></tr><tr><td>Zetasizer Nano</td><td>Malvern</td><td>Zetasizer Nano ZS&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuge</td><td>Beckman</td><td>Optima L-100 XP Ultracentrifuge</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>ESCO</td><td>CCL-107B</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss Axin Observer Z1</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and characterization of extracellular vesicles from adult schistosoma japonicum

Hücre dışı veziküller (EVs) membranöz veziküller hücreler çeşitli hücre dışı microenvironment içine tarafından yayımlanan vardır. EVs heterojen veziküller, nüfusu 40 ve 1000 nm arasında bağlantı boyutu aralığı temsil eder. Birikmiş kanıt EVs patojen-host etkileşimlerde önemli düzenleyici rol oynarlar belirtti. Paraziti EVs derin bir anlayış anlayışlar paraziti-ana etkileşimler, şistozomiyazis karşı yeni strateji geliştirme sağlayan temel mekanizmaları sağlamalıdır. Burada, daha fazla yetişkin Schistosoma japonicum (S. japonicum) yalıtım ve EVs karakterizasyonu için bir protokol sunarak schistosomes işlevlerinde EVs çalışma hedefliyoruz. EVs vitro kültür bir ticari eksozom izolasyon kiti ile kombine Santrifüjü kullanarak ortamdan izole edildi. İzole S. japonicum EVs (SjEVs) genellikle 100-400 nm çapında sahip ve iletim elektronik mikroskobu ve western Blot ile karakterizedir. SjEVs boya etiketli PKH67 kullanımını SjEVs alıcı hücreleri tarafından içselleştirilmiş göstermiştir. Genel olarak, bizim iletişim kuralı EVs yetişkin schistosomes izole için alternatif bir yöntem sağlar; izole SjEVs fonksiyonel analiz için uygun olabilir.

İzole SjEVs açıklanan protokolünü kullanarak verimini ölçmek için biz BCA protein tahlil izole SjEVs protein konsantrasyonu 28 günlük yetişkin schistosomes erişmek için kullanılır. Tablo 1' de gösterildiği gibi SjEV protein konsantrasyonu 208 µg Orta (Tablo 1) 100 mL başına 250 µg arasında değişiyordu. İzole SjEVs 100 değişiyordu Malvern nanopartikül analiz, belirlenen partikül büyüklüğü belirtilen 400 nm nm ile en yüksek nüfus yaklaşık 220 nm boyutunda (Şekil 1). Daha fazla SjEVs transmisyon elektron mikroskobu ile karakterizasyonu yaklaşık 100-200 Nm çapında (Şekil 2) yuvarlak veziküller olmak EVs saptandı. Western blot Analizi izole SjEVs CD63 antikorlar, kullanarak tipik bir EV marker (Şekil 3) olduğu kabul belirtti. Floresans mikroskobu gözlem PKH67 etiketli SjEVs NCTC klon 1,469 hücreleri tarafından içselleştirilmiş ve SjEVs (Şekil 4) alıcı hücrelerin sitoplazma içinde ağırlıklı olarak dağıtıldı göstermiştir.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Örnekleri</td>
			<td>EVs / 100ml kültür orta</td>
		</tr>
<tr>
<td>#1</td>
			<td>250 µg</td>
		</tr>
<tr>
<td>#2</td>
			<td>208 µg</td>
		</tr>
<tr>
<td>#3</td>
			<td>220 µg</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: SjEVs protein elde edilen kültür ortamından; ~ 500 solucan çiftlerini içeren BCA tahlil kültür ortamının 100 mL başına tarafından erişilen SjEVs miktarı gösterilir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57514/57514fig1.jpg"> Resim 1 : Boyut SjEVs izole dağılımı kültürlü ortamdan. SjEVs çözümün 20 µL 1000 µL PBS ile seyreltilmiş; sonra karışımı bir yüksek performanslı iki açı parçacık ve moleküler boyutu Çözümleyicisi kullanarak analiz edildi. Gösterilen sonuç üç bağımsız izolasyonların verilerden bir temsilcisidir. <a href="/files/ftp_upload/57514/57514fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57514/57514fig2.jpg"> Resim 2 : SjEVs transmisyon elektron mikroskobu ile karakterizasyonu. <a href="/files/ftp_upload/57514/57514fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57514/57514fig3.jpg"> Şekil 3 : Western blot Analizi CD63 antikorlar karşı izole SjEVs. <a href="/files/ftp_upload/57514/57514fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57514/57514fig4.jpg"> Şekil 4 : SjEVs memeli hücreleri tarafından alımını. SjEVs etiketli PKH hücre çekirdeği mavi renkle gösterilir iken yeşil renkle gösterilir. <a href="/files/ftp_upload/57514/57514fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum at JoVE.com

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Yalıtım ve yetişkin Schistosoma japonicum üzerinden ekstraselüler veziküller karakterizasyonu

Burada, Yetişkin Schistosoma japonicum vitro kültür ortamından izolasyonda ekstraselüler veziküller (EVs) açıklamak için bir iletişim kuralı mevcut.

Extracellular vesicles (EVs) are membranous vesicles released by a variety of cells into the extracellular microenvironment. EVs represent a population of ...

isolation-characterization-extracellular-vesicles-from-adult

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

7.8K Görüntüleme.  Ministry of Agriculture. Burada, Yetişkin Schistosoma japonicum vitro kültür ortamından izolasyonda ekstraselüler veziküller (EVs) açıklamak için bir iletişim kuralı mevcut.

Video: Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles from Adult Schistosoma japonicum

Cercarial Transformation and in vitro Cultivation of Schistosoma mansoni Schistosomules

Schistosome parasites are the causative agents of schistosomiasis, a chronically debilitating disease that affects over 200 million people globally and ranks second to malaria among parasitic diseases in terms of public health and socio-economic impact (1-4). Schistosome parasites are trematode worms with a complex life cycle interchanging between a parasitic life in molluscan and mammalian hosts with intervening free-swimming stages. Briefly, free-swimming cercariae infect a mammalian host by penetrating the skin with the aid of secreted proteases, during which time the cercariae lose their tails, transforming into schistosomules. The schistosomules must now evade the host immune system, develop a gut for digestion of red blood cells, and migrate though the lungs and portal circulation en route to their final destination in the hepatic portal system and eventually the mesenteric veins (for S. mansoni) where male and female worms pair and mate, producing hundreds of eggs daily. Some of the eggs are excreted from the body into fresh water, where the eggs hatch into free-swimming miracidia (5-10). The miracidia infect specific snail species and transform into mother and daughter sporocysts, which in turn, produce infective cercariae, completing the life cycle. Unfortunately, the entire schistosome life cycle cannot be cultured in vitro, but infective cercariae can be transformed into schistosomules, and the schistosomules can be cultured for weeks for the analysis of schistosome development in vitro or microarray analysis. In this protocol, we provide a visual description of cercarial transformation and in vitro culturing of schistosomules. We shed infectious cercariae from the snail host Biomphalaria glabrata and manually transform them into schistosomules by detaching their tails using an emulsifying double-ended needle. The in vitro cercarial transformation and schistosomules culture techniques described avoid the use of a mammalian host, which simplifies visualization of schistosomes and facilitates the collection of the parasite for experimental analysis. in vitro transformation and culturing techniques of schistosomes have been done for years (11, 12), but no visual protocols have been developed that are available to the entire community.

Cercarial Transformation and in vitro Cultivation of Schistosoma mansoni Schistosomules

We describe an in vitro method for culturing schistosomula of the flatworm parasite Schistosoma mansoni, via the harvesting and transformation of infective cercariae from the fresh water snail intermediate host Biomphalaria glabrata.

Cercarial Dönüşüm ve In vitro Yetiştiriciliği Schistosoma mansoni Schistosomules

Schistosome parasites are the causative agents of schistosomiasis, a chronically debilitating disease that affects over 200 million people globally and ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Using Eggs from Schistosoma mansoni as an In vivo Model of Helminth-induced Lung Inflammation

Schistosoma parasites are blood flukes that infect an estimated 200 million people worldwide 1. In chronic infection with Schistosoma, the severe pathology, including liver fibrosis and splenomegaly, is caused by the immune response to the parasite eggs rather than the parasite itself 2. Parasite eggs induce a Th2 response characterized by the production of IL-4, IL-5 and IL-13, the alternative activation of macrophages and the recruitment of eosinophils. Here, we describe injection of Schistosoma mansoni eggs as a model to examine parasite-specific Th2 cytokine responses in the lung and draining lymph nodes, the formation of pulmonary granulomas surrounding the egg, and airway inflammation. 
Following intraperitoneal sensitization and intravenous challenge, S. mansoni eggs are transported to the lung via the pulmonary arteries where they are trapped within the lung parenchyma by granulomas composed of lymphocytes, eosinophils and alternatively activated macrophages 3-6. Associated with granuloma formation, inflammation in the broncho-alveolar spaces, expansion of the draining lymph nodes and CD4 T cell activation can be observed. Here we detail the protocol for isolating Schistosoma mansoni eggs from infected livers (modified from 7), sensitizing and challenging mice, and recovering the organs (broncho-alveolar lavage (BAL), lung and draining lymph nodes) for analysis. We also include representative histologic and immunologic data and suggestions for additional immunologic analysis. 
Overall, this method provides an in vivo model to investigate helminth-induced immunologic responses in the lung, which is broadly applicable to the study of Th2 inflammatory diseases including helminth infection, fibrotic diseases, allergic inflammation and asthma. Advantages of this model for the study of type 2 inflammation in the lung include the reproducibility of a potent Th2 inflammatory response in the lung and draining lymph nodes, the ease of assessment of inflammation by histologic examination of the granulomas surrounding the egg, and the potential for long-term storage of the parasite eggs.

Using Eggs from Schistosoma mansoni as an In vivo Model of Helminth-induced Lung Inflammation

Schistosoma mansoni eggs are potent stimulators of the T helper type 2 (Th2) immune response, characteristic of parasite infection, asthma and allergic inflammation. This protocol utilizes S. mansoni egg injection to generate a CD4 Th2 cytokine-induced inflammatory response in the lung, characterized by lung granuloma formation around the egg, eosinophilia and macrophage alternative activation.

Gelen Yumurta kullanma<em&gt; Schistosoma mansoni</em&gt; Bir şekilde<em&gt; In vivo</emHelmint bağlı Akciğer iltihabı ve&gt; Model

Schistosoma parasites are blood flukes that infect an estimated 200 million people worldwide 1. In chronic infection with Schistosoma, the severe ...

Mass Isolation and In Vitro Cultivation of Intramolluscan Stages of the Human Blood Fluke Schistosoma Mansoni

Human blood flukes, Schistosoma spp., have a complex life cycle that involves asexual and sexual developmental phases within a snail intermediate and mammalian final host, respectively. The ability to isolate and sustain the different life cycle stages under in vitro culture conditions has greatly facilitated investigations of the cellular, biochemical and molecular mechanisms regulating parasite growth, development and host interactions. Transmission of schistosomiasis requires asexual reproduction and development of multiple larval stages within the snail host; from the infective miracidium, through primary and secondary sporocysts, to the final cercarial stage that is infective to humans. In this paper we present a step-by-step protocol for mass hatching and isolation of Schistosoma mansoni miracidia from eggs obtained from livers of infected mice, and their subsequent introduction into in vitro culture. It is anticipated that the detailed protocol will encourage new researchers to engage in and broaden this important field of schistosome research.

Mass Isolation and In Vitro Cultivation of Intramolluscan Stages of the Human Blood Fluke Schistosoma Mansoni

This article describes a protocol for the large-scale axenic isolation and collection of free-swimming miracidia of the human blood fluke Schistosoma mansoni and their subsequent processing for introduction into in vitro culture.

Kitle yalıtım ve Intramolluscan insan kan Fluke Schistosoma Mansoni aşamalarında Vitro ekimi

Human blood flukes, Schistosoma spp., have a complex life cycle that involves asexual and sexual developmental phases within a snail intermediate and ...

Gelişim Biyolojisi

An Enrichment Method for Small Extracellular Vesicles Derived from Liver Cancer Tissue

Small extracellular vesicles (sEVs) derived from tissue can reflect the functional status of the source cells and the characteristics of the tissue's interstitial space. The efficient enrichment of these sEVs is an important prerequisite to the study of their biological function and a key to the development of clinical detection techniques and therapeutic carrier technology. It is difficult to isolate sEVs from tissue because they are usually heavily contaminated. This study provides a method for the rapid enrichment of high-quality sEVs from liver cancer tissue. The method involves a four-step process: the incubation of digestive enzymes (collagenase D and DNase &#921;) with tissue, filtration through a 70 &#181;m cell strainer, differential ultracentrifugation, and filtration through a 0.22 &#181;m membrane filter. Owing to the optimization of the differential ultracentrifugation step and the addition of a filtration step, the purity of the sEVs obtained by this method is higher than that achieved by classic differential ultracentrifugation. It provides an important methodology and supporting data for the study of tissue-derived sEVs.

Here we describe the enrichment of small extracellular vesicles derived from liver cancer tissue through an optimized differential ultracentrifugation method.

Karaciğer Kanseri Dokusundan Elde Edilen Küçük Hücre Dışı Veziküller İçin Bir Zenginleştirme Yöntemi

Small extracellular vesicles (sEVs) derived from tissue can reflect the functional status of the source cells and the characteristics of the tissue's ...

Kanser Araştırmaları

Size Exclusion Chromatography for Separating Extracellular Vesicles from Conditioned Cell Culture Media

Extracellular vesicles (EVs) are nano-sized lipid-membrane bound structures that are released from all cells, are present in all biofluids, and contain proteins, nucleic acids, and lipids that are reflective of the parent cell from which they are derived. Proper separation of EVs from other components in a sample allows for characterization of their associated cargo and lends insight into their potential as intercellular communicators and non-invasive biomarkers for numerous diseases. In the current study, oligodendrocyte derived EVs were isolated from cell culture media using a combination of state-of-the-art techniques, including ultrafiltration and size exclusion chromatography (SEC) to separate EVs from other extracellular proteins and protein complexes. Using commercially available SEC columns, EVs were separated from extracellular proteins released from human oligodendroglioma cells under both control and endoplasmic reticulum (ER) stress conditions. The canonical EV markers CD9, CD63, and CD81 were observed in fractions 1-4, but not in fractions 5-8. GM130, a protein of the Golgi apparatus, and calnexin, an integral protein of the ER, were used as negative EV markers, and were not observed in any fraction. Further, when pooling and concentrating fractions 1-4 as the EV fraction, and fractions 5-8 as the protein fraction, expression of CD63, CD81, and CD9 in the EV fraction was observed. The expression of GM130 or calnexin was not observed in either of the fraction types. The pooled fractions from both control and ER stress conditions were visualized with transmission electron microscopy and vesicles were observed in the EV fractions, but not in the protein fractions. Particles in the EV and protein fractions from both conditions were also quantified with nanoparticle tracking analysis. Together, these data demonstrate that SEC is an effective method for separating EVs from conditioned cell culture media.

The protocol here demonstrates that extracellular vesicles can be adequately separated from conditioned cell culture media using size exclusion chromatography.

Hücre Dışı Vezikülleri Şartlandırılmış Hücre Kültürü Ortamından Ayırmak için Boyut Dışlama Kromatografisi

Extracellular vesicles (EVs) are nano-sized lipid-membrane bound structures that are released from all cells, are present in all biofluids, and contain ...

Nörobilim

Isolation And Dendritic Cell-Uptake of Small Extracellular Vesicles from Echinococcus granulosus

The secretion of extracellular vesicles by cestodes is crucial for enabling cellular communication not only among parasites but also with host tissues. In particular, small extracellular vesicles (sEVs) act as nano-carriers transferring natural antigens, which are critical in host immunomodulation and parasite survival. This article presents a step-by-step protocol to isolate sEVs from larval stage cultures of Echinococcus granulosus and analyzes their uptake by dendritic cells obtained from murine bone marrow, which acquire adhesion and antigen presentation capacity during their maturation after one week of in vitro culture. This article provides comprehensive information for generating, purifying, and quantifying sEVs using ultracentrifugation alongside parallel analyses of dynamic light scattering and transmission electron microscopy. Additionally, a detailed experimental protocol is outlined for isolating and cultivating mouse bone marrow cells and driving their differentiation into dendritic cells using Flt3L. These dendritic cells can present antigens to na&#239;ve T cells, thereby modulating the type of immune response in vivo. Thus, alternative protocols, including confocal microscopy and flow cytometry analysis, are proposed to check the acquired maturational phenotype of dendritic cells previously exposed to parasitic sEVs. Finally, it is worth noting that the described protocol can be applied as a whole or in individual parts to carry out parasite in vitro culture, isolate extracellular vesicles, generate bone marrow-derived dendritic cell cultures, and perform uptake assays with these cells.

Here, we describe in vitro culture conditions, isolation, and increased generation of extracellular vesicles (EVs) from Echinococcus granulosus. The small EVs were characterized by dynamic light scattering and transmission electron microscopy. The uptake by bone marrow-derived dendritic cells and their phenotypic modulation were studied using confocal microscopy and flow cytometry.

Echinococcus granulosus'tan Küçük Hücre Dışı Veziküllerin İzolasyonu ve Dendritik Hücre Alımı

The secretion of extracellular vesicles by cestodes is crucial for enabling cellular communication not only among parasites but also with host tissues. In ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular vesicles (EVs) function outside the cell to regulate global physiological processes by transferring proteins, nucleic acids, metabolites, and lipids between tissues. EVs reflect the physiological state of their cells of origin. EVs are implicated to have fundamental roles in virtually every aspect of human health. Thus, EV protein and genetic cargos are being increasingly analyzed for biomarkers of health and disease. However, the EV field still lacks a tractable invertebrate model system that permits the study of EV cargo composition. C. elegans is well suited for EV research because it actively secretes EVs outside of its body into its external environment, permitting facile isolation. This article provides all the necessary information for generating, purifying, and quantifying these environmentally secreted C. elegans EVs including how to work quantitatively with very large populations of age-synchronized worms, purifying EVs, and a flow cytometry protocol that directly measures the number of intact EVs in the purified sample. Thus, the large library of genetic reagents available for C. elegans research can be tapped into for investigating the impacts of genetic pathways and physiological processes on EV cargo composition.

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

This article presents methods for generating, purifying, and quantifying Caenorhabditis elegans extracellular vesicles.

Arınma ve Caenorhabditis elegans Ekstrasellüler Veziküllerin Analizi

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Biyoloji

<meta charset="utf8"></head><body>Murin Dalak Kaynaklı Eksozom İzolasyonu için Rafine Etme Teknikleri

Isolation and Characterization of Exosomes Derived from Mouse Spleen Tissues

Exosomes (Exo) are lipid-bilayer structures secreted by various cells, including those of animals, plants, and prokaryotes. Previous studies have revealed that Exo derived from humoral or cell-supernatant are promising targets for novel diagnostic or prognostic biomarkers, underscoring their significant role in disease pathogenesis. Tissue-derived Exo (Ti-Exo) have attracted increasing attention due to its ability to accurately reflect tissue specificity and the microenvironment. Ti-Exo, present in interstitial space, play crucial roles in intercellular communication and cross-organ signaling. Despite their recognized value in elucidating disease mechanisms, isolating Ti-Exo remains challenging due to the complexity of tissue matrices and variability in extraction methods. In this study, we developed a practical protocol for isolating exosomes from mice spleen tissue, providing a reproducible technique for subsequent identification analysis and functional studies. We used Type I collagenase digestion combined with differential ultracentrifugation to isolate spleen-derived Exo. The characteristics of isolated Exo were determined through electron microscopy, the nano-flow cytometer, and the western blot. The isolated spleen-derived Exo displayed the typical morphology of lipid bilayer vesicles, with particle sizes ranging from 30 nm to 150 nm. In addition, the expression profile of exosome markers confirmed the presence and purity of exosomes. Taken together, we successfully established a practical protocol for isolating spleen-derived Exo in mice.

<meta charset="utf8"></head><body>Fare Dalak Dokularından Elde Edilen Eksozomların İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Here, we present a protocol to isolate mouse spleen-derived exosomes using a combination of digestion with collagenase type I and ultracentrifugation.

Fare Dalak Dokularından Elde Edilen Eksozomların İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Exosomes (Exo) are lipid-bilayer structures secreted by various cells, including those of animals, plants, and prokaryotes. Previous studies have revealed ...

Yalıtım ve yetişkin Schistosoma japonicum üzerinden ekstraselüler veziküller karakterizasyonu

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Cercarial Dönüşüm ve In vitro Yetiştiriciliği Schistosoma mansoni Schistosomules

Gelen Yumurta kullanma

Kitle yalıtım ve Intramolluscan insan kan Fluke Schistosoma Mansoni aşamalarında Vitro ekimi

Karaciğer Kanseri Dokusundan Elde Edilen Küçük Hücre Dışı Veziküller İçin Bir Zenginleştirme Yöntemi

Hücre Dışı Vezikülleri Şartlandırılmış Hücre Kültürü Ortamından Ayırmak için Boyut Dışlama Kromatografisi

Echinococcus granulosus'tan Küçük Hücre Dışı Veziküllerin İzolasyonu ve Dendritik Hücre Alımı

Arınma ve Caenorhabditis elegans Ekstrasellüler Veziküllerin Analizi

Fare Dalak Dokularından Elde Edilen Eksozomların İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Fare Dalak Dokularından Elde Edilen Eksozomların İzolasyonu ve Karakterizasyonu

Fare Dalak Dokularından Elde Edilen Eksozomların İzolasyonu ve Karakterizasyonu