Bu eser nöro-Bio Ltd. tarafından finanse edildi Dr. Giovanni Ferrati ve doktor Sergio Rotondo (nöro-BIO) teşekkür etmek onların yorum ve tavsiyeler el yazması için istiyoruz.

Tüm hayvan çalışmaları onaylı protokolleri altında gerçekleştirilmiş.
Not: Bu bölümde ana aşamadan dizisi deneysel işlem sırasında gerçekleştirilen ve önerilen zaman aralığı (şekil 1) sağlanır. Ayrıca, protokol, adım adım açıklamasını kritik eylemler doku homojenizasyon kuluçka dönemi (Şekil 2) sonra beyin kaldırılması arasında gösterilen açıklayıcı bir panel tarafından desteklenmiştir. Yukarıda açıklanan22ile ilgili malzeme ve cihazları ve sonraki aşama WB analiz için oluşturmak için yönergeleri ayrıntılardır.
1. cerrahi aletler, Vibratome ayarları ve tedavi hazırlık
Not: deneysel bir işlem başlatmadan önce aşağıdaki adımları yürütün:
<ol><li>İki farklı yapay serebrospinal sıvı (aCSFs), bir beyin Dilimleme için kullanılan hazırlamak ve diğer kuluçka adım için daha önce29açıklandığı gibi. Kısaca, "Dilimleme" aCSF için iki aCSFs (içinde mmol) çalışma konsantrasyonları şunlardır: 120 NaCl, 5 KCl, 20 NaHCO3, 2.4 CaCl2, 2 MgSO4, 1.2 KH2PO4ve 10 glikoz; 6,7 HEPES tuz ve 3.3 HEPES asit; pH: 7.1. "Kayıt" aCSF süre: 124 NaCl, 3.7 KCl, 26 NaHCO3, 2 CaCl2, 1.3 MgSO4, 1.3 KH2PO4ve 10 glikoz; pH: 7.1.</li>
	<li>Mix iyi çözümleri ve buza koy ve dilimleme aCSF için bu soğuk beyin ve sonraki kesit kaldırma sırasında oksijen. Oda sıcaklığında (RT) ve tedarik oksijen kayıt aCSF tutun.</li>
	<li>Diseksiyon başlık altında aletleri işten çıkarma ve beyin kaldırma, Yani, giyotin, cerrahi disseksiyon seti (makas, pens, bıçaklar) ve spatula için yerleştirin.</li>
	<li>Vibratome parametreleri dilim kalınlığı (Bu hazırlık 300 µm) ve 7 frekans ve 6 hızda seçerek ayarlayın. Vibratome odası uygun, boşluk ve buz ile surround.</li>
	<li>"Dilimleme" (aCSF) beyin kesit sırasında oksijen carbogen (% 95'i O2, % 5 CO2) Vanayı aç. 2 mL/dk civarında en düşük akış hızı seçin.</li>
	<li>Test etmek için koşulları hazırlamak için iki 15 mL tüp al. Ekle bir tüp 10 mL "kayıt" aCSF yalnız (kontrol grubu) ve diğer, "kayıt" aCSF 10 mL 2 µM (tedavi grubu) bir konsantrasyon T30 ile zenginleştirilmiş. Girdap hem tüpler ve kullanımları kurulum hazırlama aşaması (Bölüm 3) kadar buz üzerinde tutun.</li>
</ol>2. anestezi, beyin çıkarma ve dilimleme
Not: Bu çalışmada, 9 vahşi türü P14 erkek Wistar rats kullanılmıştır. Onlar hızlı bir şekilde (10 dk içinde) önlemek veya en az doku dejenerasyonu süreçleri yavaşlatmak için gerçekleştirilmesi gereken bu yana beyin ayıklama ve sonraki Dilimleme protokolün kritik bir parçası oluşturur.
<ol><li>% 100 w/w isoflurane 1,5 mL bir pamuk katmanda indüksiyon odasına ekleyin, hayvan içine yerleştirin ve kapağını kapatın. Hayvan derinden pedal refleks, yokluğunda teyit anestezi kadar bekleyin ve Giyotin kullanarak hayvan başını kesmek.</li>
	<li>Buz gibi baş hayvan içeren bir kap içinde aCSF beyin kaldırma adımı sırasında Dilimleme tutmak (şekil 2A -C).</li>
	<li>Cilt üzerinde kafatası, cerrahi bıçak deşmek sonra kafatasının orta hat posterior bölümünden takip makas kullanarak kesmek ve anteriorly kemik OBs (şekil 2A) yukarıda erişene dek devam edin.</li>
	<li>Beyin (şekil 2B) erişim sağlamak için bir çift forseps kullanarak kafatası yan yana iki tarafına çek. Bir spatula ventrally beyin için eklemek, yavaşça dışarı ve buz gibi "Dilimleme" aCSF için yaklaşık 5 dk (şekil 2C) içinde nemli tutmak Kepçe.</li>
	<li>Beyin filtre kağıdı üzerine atın ve bir bıçak (şekil 2B) kullanarak beyincik kesti. Dikey olarak vibratome disk beyin tutkal ve parça odası ekleyin, buz gibi "Dilimleme" aCSF ile doldurun ve oksijen (şekil 2E) sağlar.</li>
	<li>Kesme aralığını ayarlamak ve beyin (şekil 2F) kesit ile devam edin. Medial septum (MS), Broca (DBB) ve gözlemliyorum innominata (SI), çapraz grup gibi ilgi bölge içeren bölümler yukarıda açıklanan22toplamak. Yukarıdan-aşağıya üç dilim rostral (R), orta (I) ve (Şekil 2 g) BF Kaudal (C) bölümünü içerir.</li>
	<li>Orta çizgi her bölüm küçük makasla bölmek tek tek kontrol ve tedavi durum aynı anatomik uçağı olarak kullanılan iki aynasal hemislices (Resim 2 H), alma.</li>
	<li>Hemisections 5-10 dakika vibratome odasında tutmak, o zaman onlara bir cam pipet ile kayıt aCSF içeren bir kabarcıklanma pota transfer. Yeniden elde etmek için yaklaşık 30 dakika RT devam et.</li>
	<li>Bu arada, üç cam şişeleri ile kayıt aCSF yalnız 3 (Adım 1.6 kontrol grubu için önceden hazırlanmış) mL ve T30 (1.6 adımda önceden hazırlanmış) ile tedavi grubu için zenginleştirilmiş aCSF 3 mL ile üç şişeleri doldurun.</li>
</ol>3. Kurulum hazırlama
<ol><li>Hemisections kontrol grubu (yeşil çerçeve, şekil 2J) (rostral, ara ve Kaudal BF bölge dahil) üç ardışık hemislices için karşılık gelen cam şişe (şekil 2I) aktarmak ve onların tedavi grubu (kırmızı çerçeve, şekil 2J) için meslektaşları eşleştirme.</li>
	<li>Koşullar arasında herhangi bir kontaminasyonu önlemek için iki farklı fırçalar, bir denetim hemislices ve başka için tedavi meslektaşları ile beyin dokusu aktarın.</li>
	<li>Her cam şişe oxygenating iğne (21 G) (şekil 2J) sunma karşılık gelen kapak ile kapatın. Cihazları ana tüp carbogen kaynak (Şekil 2 K) bağlayın. Deneme sırasında beyin dokusu ve mekanik zarar herhangi bir hareketi önlemek için hemislices 2 mL/dak bir minimum akış hızı ile kuluçka süresi boyunca için oksijen sağlamak. 5 h kuluçka başlatın. 5 dakika içinde 3.1-3.3 adımları yürütün. Not: Onay sık (her 15-20 dk) oksijen tüpleri sağlanan ve akışını aşağıdan doku kıpırdamıyor.</li>
</ol>4. örnek homojenizasyon
<ol><li>Kuluçka sonra oksijen akışını durdurmak ve tüpleri tüm kapakları kaldırın. 250 µL üzerine buz (Şekil 2 L) boruları Bakımı lizis tamponunun içeren 1,5 mL tüpler içine uygun fırçalar kullanarak hemislices aktarın. Arabellek, PBS 1 mix lizis yapmak x fosfataz ve proteaz inhibitörleri kokteyller ile hem 1: 100 seyreltilmiş ve doku örnekleri arasında önlemek amacıyla farklı dibekler ile homojenize. 10-15 dk içinde bu eylemleri tamamlayın.</li>
	<li>1000 x g 4 ° C'de 5 min için de lysate beyin santrifüj kapasitesi Süpernatant yeni tüpler içine aktarmak ve örnekleri-80 ° C'de tutmak</li>
</ol>5. okuma Protein konsantrasyonu ve Western Blot analizi
<ol><li>Her örnek protein konsantrasyonu belirlemek ve daha sonra yukarıda açıklanan22olarak Western blot analizi için aliquots hazırlamak.</li>
	<li>Protein ifadesi üzerinde tedavinin etkilerini değerlendirmek için istatistiksel çözümleme gerçekleştirme.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Braak, H., Braak, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuropathological+stageing+of+Alzheimer-related+changes.">Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes.</a> Acta Neuropathologica. 82 (4), 239-259 (1991).</li><li>Schliebs, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+forebrain+cholinergic+dysfunction+in+Alzheimer's+disease--interrelationship+with+beta-amyloid,+inflammation+and+neurotrophin+signaling.">Basal forebrain cholinergic dysfunction in Alzheimer's disease--interrelationship with beta-amyloid, inflammation and neurotrophin signaling.</a> Neurochemical Research. 30 (6-7), 895-908 (2005).</li><li>Schmitz, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basal+forebrain+degeneration+precedes+and+predicts+the+cortical+spread+of+Alzheimer's+pathology.">Basal forebrain degeneration precedes and predicts the cortical spread of Alzheimer's pathology.</a> Nature Communications. 7, 13249 (2016).</li><li>Fjell, A. M., McEvoy, L., Holland, D., Dale, A. M., Walhovd, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+normal+in+normal+aging?+Effects+of+aging,+amyloid+and+Alzheimer's+disease+on+the+cerebral+cortex+and+the+hippocampus.">What is normal in normal aging? Effects of aging, amyloid and Alzheimer's disease on the cerebral cortex and the hippocampus.</a> Progress in neurobiology. 117, 20-40 (2014).</li><li>Kov&#225;cs, T., Cairns, N. J., Lantos, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Olfactory+centres+in+Alzheimer's+disease:+olfactory+bulb+is+involved+in+early+Braak's+stages.">Olfactory centres in Alzheimer's disease: olfactory bulb is involved in early Braak's stages.</a> Neuroreport. 12 (2), 285-288 (2001).</li><li>Winblad, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defeating+Alzheimer's+disease+and+other+dementias:+a+priority+for+European+science+and+society.">Defeating Alzheimer's disease and other dementias: a priority for European science and society.</a> The Lancet Neurology. 15 (5), 455-532 (2016).</li><li>Herrup, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+case+for+rejecting+the+amyloid+cascade+hypothesis.">The case for rejecting the amyloid cascade hypothesis.</a> Nat Neurosci. 18 (6), 794-799 (2015).</li><li>De Strooper, B., Karran, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cellular+Phase+of+Alzheimer's+Disease.">The Cellular Phase of Alzheimer's Disease.</a> Cell. 164 (4), 603-615 (2016).</li><li>Scheltens, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease.">Alzheimer's disease.</a> Lancet. 388 (10043), 505-517 (2016).</li><li>Arendt, T., Br&#252;ckner, M. K., Lange, M., Bigl, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+acetylcholinesterase+and+butyrylcholinesterase+in+Alzheimer's+disease+resemble+embryonic+development-A+study+of+molecular+forms.">Changes in acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase in Alzheimer's disease resemble embryonic development-A study of molecular forms.</a> Neurochemistry International. 21 (3), 381-396 (1992).</li><li>Auld, D. S., Kornecook, T. J., Bastianetto, S., Quirion, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's+disease+and+the+basal+forebrain+cholinergic+system:+relations+to+&#946;-amyloid+peptides,+cognition,+and+treatment+strategies.">Alzheimer's disease and the basal forebrain cholinergic system: relations to &#946;-amyloid peptides, cognition, and treatment strategies.</a> Progress in Neurobiology. 68 (3), 209-245 (2002).</li><li>Arendt, T., Bruckner, M. K., Morawski, M., Jager, C., Gertz, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+neurone+loss+in+Alzheimer's+disease:+cortical+or+subcortical?.">Early neurone loss in Alzheimer's disease: cortical or subcortical?.</a> Acta Neuropathol Commun. 3, 10 (2015).</li><li>Mesulam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cholinergic+Lesion+of+Alzheimer's+Disease:+Pivotal+Factor+or+The+Cholinergic+Lesion+of+Alzheimer's+Disease:+Pivotal+Factor+or+Side+Show?.">The Cholinergic Lesion of Alzheimer's Disease: Pivotal Factor or The Cholinergic Lesion of Alzheimer's Disease: Pivotal Factor or Side Show?.</a> Learn Mem. , 43-49 (2004).</li><li>Schliebs, R., Arendt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cholinergic+system+in+aging+and+neuronal+degeneration.">The cholinergic system in aging and neuronal degeneration.</a> Behavioural Brain Research. 221 (2), 555-563 (2011).</li><li>Mesulam, M. M., Mufson, E. J., Wainer, B. H., Levey, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+cholinergic+pathways+in+the+rat:+An+overview+based+on+an+alternative+nomenclature+(Ch1-Ch6).">Central cholinergic pathways in the rat: An overview based on an alternative nomenclature (Ch1-Ch6).</a> Neuroscience. 10 (4), 1185-1201 (1983).</li><li>Mesulam, M., Mufson, E. J., Levey, A. I., Wainer, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholinergic+innervation+of+cortex+by+the+basal+forebrain:+cytochemistry+and+cortical+connections+of+the+septal+area,+diagonal+band+nuclei,+nucleus+basalis+(substantia+innominata),+and+hypothalamus+in+the+rhesus+monkey.">Cholinergic innervation of cortex by the basal forebrain: cytochemistry and cortical connections of the septal area, diagonal band nuclei, nucleus basalis (substantia innominata), and hypothalamus in the rhesus monkey.</a> J Comp Neurol. 214 (2), 170-197 (1983).</li><li>Greenfield, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovering+and+targeting+the+basic+mechanism+of+neurodegeneration:+The+role+of+peptides+from+the+C-terminus+of+acetylcholinesterase:+Non-hydrolytic+effects+of+ache:+The+actions+of+peptides+derived+from+the+C-terminal+and+their+relevance+to+neurodegenerat.">Discovering and targeting the basic mechanism of neurodegeneration: The role of peptides from the C-terminus of acetylcholinesterase: Non-hydrolytic effects of ache: The actions of peptides derived from the C-terminal and their relevance to neurodegenerat.</a> Chemico-Biological Interactions. 203 (3), 543-546 (2013).</li><li>Garcia-Rat&#233;s, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=(I)+Pharmacological+profiling+of+a+novel+modulator+of+the+&#945;7+nicotinic+receptor:+Blockade+of+a+toxic+acetylcholinesterase-derived+peptide+increased+in+Alzheimer+brains.">(I) Pharmacological profiling of a novel modulator of the &#945;7 nicotinic receptor: Blockade of a toxic acetylcholinesterase-derived peptide increased in Alzheimer brains.</a> Neuropharmacology. 105, 487-499 (2016).</li><li>Eimerl, S., Schramm, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+quantity+of+calcium+that+appears+to+induce+neuronal+death.">The quantity of calcium that appears to induce neuronal death.</a> Journal of neurochemistry. 62 (3), 1223-1226 (1994).</li><li>Greenfield, S., Vaux, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Commentary+Parkinson's+Disease,+Alzheimer's+Disease+and+Motor+Neurone+Disease:+Identifying+a+Common+Mechanism.">Commentary Parkinson's Disease, Alzheimer's Disease and Motor Neurone Disease: Identifying a Common Mechanism.</a> Science. 113 (3), 485-492 (2002).</li><li>Badin, A. S., Morrill, P., Devonshire, I. M., Greenfield, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=(II)+Physiological+profiling+of+an+endogenous+peptide+in+the+basal+forebrain:+Age-related+bioactivity+and+blockade+with+a+novel+modulator.">(II) Physiological profiling of an endogenous peptide in the basal forebrain: Age-related bioactivity and blockade with a novel modulator.</a> Neuropharmacology. 105, 47-60 (2016).</li><li>Brai, E., Stuart, S., Badin, A. -. S., Greenfield, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Ex+Vivo+Model+to+Investigate+the+Underlying+Mechanisms+in+Alzheimer's+Disease.">A Novel Ex Vivo Model to Investigate the Underlying Mechanisms in Alzheimer's Disease.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 291 (2017).</li><li>Cho, S., Wood, A., Bowlby, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+slices+as+models+for+neurodegenerative+disease+and+screening+platforms+to+identify+novel+therapeutics.">Brain slices as models for neurodegenerative disease and screening platforms to identify novel therapeutics.</a> Current neuropharmacology. 5 (1), 19-33 (2007).</li><li>Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+brain+slice+cultures:+A+review.">Organotypic brain slice cultures: A review.</a> Neuroscience. 305, 86-98 (2015).</li><li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamp+techniques+for+studying+ionic+channels+in+excitable+membranes.">Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes.</a> Annual review of physiology. 46, 455-472 (1984).</li><li>Jensen, M. S., Lambert, J. D. C., Johansen, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophysiological+recordings+from+rat+hippocampus+slices+following+in+vivo+brain+ischemia.">Electrophysiological recordings from rat hippocampus slices following in vivo brain ischemia.</a> Brain Research. 554 (1-2), 166-175 (1991).</li><li>Ferrati, G., Martini, F. J., Maravall, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presynaptic+Adenosine+Receptor-Mediated+Regulation+of+Diverse+Thalamocortical+Short-Term+Plasticity+in+the+Mouse+Whisker+Pathway.">Presynaptic Adenosine Receptor-Mediated Regulation of Diverse Thalamocortical Short-Term Plasticity in the Mouse Whisker Pathway.</a> Frontiers in Neural Circuits. 10, 1-9 (2016).</li><li>Grinvald, A., Hildesheim, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VSDI:+a+new+era+in+functional+imaging+of+cortical+dynamics.">VSDI: a new era in functional imaging of cortical dynamics.</a> Nature Reviews Neuroscience. 5 (11), 874-885 (2004).</li><li>Badin, A. S., John, E., Susan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+spatio-temporal+bioactivity+of+a+novel+peptide+revealed+by+optical+imaging+in+rat+orbitofrontal+cortex+in+vitro:+Possible+implications+for+neurodegenerative+diseases.">High-resolution spatio-temporal bioactivity of a novel peptide revealed by optical imaging in rat orbitofrontal cortex in vitro: Possible implications for neurodegenerative diseases.</a> Neuropharmacology. 73, 10-18 (2013).</li><li>Greenfield, S. A., Badin, A. S., Ferrati, G., Devonshire, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+the+rat+brain+suggests+a+previously+missing+link+between+top-down+and+bottom-up+nervous+system+function.">Optical imaging of the rat brain suggests a previously missing link between top-down and bottom-up nervous system function.</a> Neurophotonics. 4, 31213 (2017).</li><li>Opitz-Araya, X., Barria, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+hippocampal+slice+cultures.">Organotypic hippocampal slice cultures.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (48), (2011).</li><li>Gong, C. -. X., Lidsky, T., Wegiel, J., Grundke-Iqbal, I., Iqbal, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolically+active+rat+brain+slices+as+a+model+to+study+the+regulation+of+protein+phosphorylation+in+mammalian+brain.">Metabolically active rat brain slices as a model to study the regulation of protein phosphorylation in mammalian brain.</a> Brain Research Protocols. 6 (3), 134-140 (2001).</li></ol>

Yazarlar rakip mali çıkarlarının bildirin. Susan A. Greenfield nöro-Bio Limited, özel sektöre ait bir şirket ve şirket tutar hisseleri kurucusu ve başkanıdır. Emanuele Brai ve Antonella Cogoni nöro-Bio Ltd. çalışanları olan

Bu iletişim kuralı, köklü ex vivo beyin tekniğine dayalı asıl yönünü zaman uyumlu olarak belirli bir uygulama sonra onların yanıt izleme aynı anatomik uçak elde edilen iki aynasal hemislices test etmek için izin verir Koşul (kontrol veya tedavi); Bu nedenle deneysel bir paradigma olarak sıkı mümkün olduğunca kontrol sunuyor. Bir saat, doz ve nöronal bozukluğu için ilgili siteye özgü şekilde farklı fizyolojinin nörodejeneratif olaylar22sırasında görüldüğü gibi değerlendirilmesi olasılığı önemli bir özelliği temsil eder. Bu yöntem bir vivo içinde fizyolojik ortam avantajları bu doğruluk bölgesi faiz elde etmek ve ideal hücre dışı içerik oluşturma gibi vitro hazırlıkları ile bağlar. Bu iletişim kuralını temsil eden bir uyum ex vivo Elektrofizyolojik kayıtlar25,26,27 ve optik görüntüleme28, için yaygın olarak kullanılan bir yordam Dilimleme ortak beyin 29,30, ya da her iki yapısal ve sinaptik organizasyon23,24 korunması sağlayarak daha yakın bir vivo içinde durum simülasyonu vitro organotypic dilimleri ,31,32.
Ayrıca, bu yordamı kısmen bir vivo içindeçoğaltır bu yana davranış çalışmalarda kullanılan hayvan sayısını azaltmak için yardımcı olabilir- vitro veri, hücre kültürü gibi onaylamak için kabul durum gibi ve immunohistokimyasal analizi ve in vivo deneyler tahmin.
Önerilen metodoloji bölüm kalınlığı ve değil uygun olduğunda, nihai sonucu değiştirebilirsiniz hangi bütünlüğü gibi bazı sınırlamalar da sunar. Kontrol grubu ve tedavi olan arasında karşılaştırma etkisi bu yana kuluçka süresi de bu teknik temel bileşenidir. Buna ek olarak, yordam veya teknik sorunları bir dizi iletişim kuralı, tüm adımları uyguladığınızda aşağıdaki gibi karşılaşılan olabilir: ayıklama veya hassas ve yumuşak doku; işleyerek önlenebilir beyin kesit (1) mekanik hasar (2) nedeniyle oxygenating iğne dokunursa mekanik olarak doku zarar verebilir bir aşırı oksijen akışı, kuluçka sırasında hemislices yüzen böylece bütünlüğünü etkileyen aCSF içinde sular altında. Bu-ebilmek var olmak önlemek için minimum oranı köpüren ayarlayarak; ve (3) devamsızlık veya kararsız oksijen akışı, hangi boş teneke kutu, hasar veya bağlantı kesme için tüp sistemi, oxygenating iğne bir fiş içinde ilgili olabilir ya da ne zaman bu düzgün aCSF içinde batırılır değil. Bu iletişim kuralı en önemli yönlerinden biri sürekli oksijenlenme ve prosedür boyunca akışını temsil ettiği sık incelenen gruplar arasında homojen bir durumu korumak için tüm bu parametreleri izlemek önemlidir.
İletişim kuralı diğer kritik adımları temsil edilir her eylemi gerçekleştirmek için gereken zaman windows tarafından hangi ne zaman takip edecek mümkün bütünlüğü ve doku işlevselliğini kadar korumak. Buna ek olarak, bu parametreler değerlendirmek için immunohistokimyasal analiz belirli işaretleri nöronal canlılığı ve Elektrofizyolojik kayıtlar ile ilgili yukarıda açıklanan23,29algılamak için gerçekleştirilebilir.
Burada açıklanan sonuçlar, bu yöntem tasarlanmış özel özel araştırmalar için olabilir. Örneğin, için uygulanabilir: (1) monitör ve karşılaştırın birkaç farklı bileşiklerin etkinliği beyin alanları, onları aCSF veya Neurobasal orta; gibi seçili çözümü ile kuluçka (2) oksijen akışını seçerek her hemisection kontrol edilebilir olduğundan hipoksi üzerinde çalışmalar gerçekleştirmek; (3) beyin doku özellikleri farklı hastalıkların transgenik hayvan modellerinden araştırmak; (4) aynı anda, aynı anatomik düzeyinde vivo içinde tek taraflı beyin enjeksiyonları etkilerini araştırmak ve onları kontrol Yarımküre ile karşılaştırın; ve (5) diğer organ veya doku özellikleri, bu nedenle potansiyel olarak kolaylaştırmak ve denemeler eleme uyuşturucu uzunluğunu azaltmak keşfetmek.

Kronik bir patoloji entorhinal korteks (EC), BF, Hipokampus (HC) ve olfaktör ampul gibi farklı beyin bölgeleri etkileyen kademeli nörodejeneratif bozukluğu (OB)1,2,3ile karakterize reklamdır, 4,5. Reklam gelişimin geç yaklaşık % 70'ini tüm durumlarda6muhasebe demans en sık görülen bu hastalık yapma ilerici bir bilişsel gerileme yol. Reklam neden ilk etap anlamak için yoğun girişimlerine rağmen bir şey yok şu anda tanımlanmış bir deneysel gösterge onları elucidating. Reklam pathobiology, ne de etkili7,8 kanıtlamıştır bir ilaç hedef açıklayan tam bir profil sağlamaz beri Ayrıca, en popüler teori - "amiloid hipotezi" - giderek sorgulanmaktadır ,9.
Ateş sırasında meydana gelen ilk mekanizmaları nöronal küme reklam3,10,11 ' öncelikle duyarlı ilişkili artan ilgi alma alternatif bir teori önerir , 12 , 13 , 14. bu türdeş olmayan hücresel Merkez AK, HC ve OB15,16gibi birden çok bölgeye BF, orta ve beyin sapı, projeler içinde kapsıyordu. Nöronal morfoloji ve nörotransmitter sentez çeşitliliği rağmen bu çekirdek hücrelerin enzimatik olmayan işlev17,18de içerebilir ağrısı ifade içinde ortak bir özelliği paylaşır. Molekül trofik veya toksik olayları ile ilgili olarak Ca2 + doz, kullanılabilirlik ve nöronal yaş17,18 geçirmek için nöronlar kalsiyum (Ca2 +) akışına aracılık sinyal bir roman olarak klasik olmayan bu rolü , 19.
Ateş sırasında gözlenen hücresel kaybı bu nedenle ağrısı C-terminus i ciddi bir 30mer peptid (T30) atfedilebilecek olduğu bu enzimatik olmayan işlev17,18,20' ye, ilişkili olabilir 20. hücre kültürü ve optik görüntüleme18,21 hazırlıklar, önceki sonuçları doğrultusunda biz, ex vivo sıçan beyin dilimleri T30 indüklenen BF yapıları içeren dayalı yeni bir yaklaşım ile gösterdi bir reklam gibi profil22. Özellikle, birçok anatomik devre koruma için bir zaman penceresi saat de olsa için arasında değişen bir sağlam doku özelliklerini korur beri bu yeni yöntem daha fizyolojik bir senaryo hücre kültürü daha sunuyor. Biz ateş, erken aşamalarında yer alan olayları keşfetmek için bu iletişim kurallarını T30 başvurusu üzerine akut yanıt izleme uygulanır.
Beyin kullanma edebiyatının büyük beden rağmen moleküler yolları araştırmak için dilimler nöronal hasar örtük veya neurogenesis23,24, bu protokolü ilk kez daha acil sağlar ve okumak duyarlı karşılaştırıldığında organotypic dilimleri yaygın kullanımı için. Beyin bölümleri organotypic için olduğu gibi Ancak, bu akut dilim yordamı da değerlendirilmesi nöroprotektif veya Nörotoksik molekülleri, belirli bir süreç içinde birincil moleküler değişimleri keşfi gibi çeşitli amaçlar için kabul edilebilir, immunohistokimyasal analizleri ve merkezi sinir sistemi için farmakolojik deneyleri patolojiler ilgili.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>S7653</td>
			<td>Reagent for aCSF preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>P9333</td>
			<td>Reagent for aCSF preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate (NaHCO3)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>S5761</td>
			<td>Reagent for aCSF preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulphate heptahydrate (MgSO4 (7H2O))</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>63138</td>
			<td>Reagent for aCSF preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic (KH2PO4)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>P5655</td>
			<td>Reagent for aCSF preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>H7006</td>
			<td>Reagent for aCSF preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Reagent for aCSF preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>G7528</td>
			<td>Reagent for aCSF preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dehydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, Germany</td>
			<td>223506</td>
			<td>Reagent for aCSF preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T30 peptide</td>
			<td>Genosphere Biotechnologies, France</td>
			<td></td>
			<td>AChE-derived peptide tested</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical dissecting kit</td>
			<td>World Precision Instruments, USA</td>
			<td>Item #: MOUSEKIT</td>
			<td>Brain removal step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical blades</td>
			<td>Swann-Morton, UK</td>
			<td>BS 2982</td>
			<td>Brain removal step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter paper</td>
			<td>Fisher Scientific, USA</td>
			<td>11566873</td>
			<td>Brain preparation for slicing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glue</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Brain preparation for slicing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica, Germany</td>
			<td>VT1000 S</td>
			<td>Slicing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brushes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Tissue handling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen canister</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sectioning and incubation phase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x Phosphate buffer saline (PBS)</td>
			<td>Fisher Scientific, USA</td>
			<td>BP2438-4</td>
			<td>Homogenization step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphatase inhibitors</td>
			<td>Fisher Scientific, USA</td>
			<td>1284-1650</td>
			<td>Homogenization step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitors</td>
			<td>Roche complete PIC, USA</td>
			<td>4693116001</td>
			<td>Homogenization step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pestles</td>
			<td>Starlab, UK</td>
			<td>I1415-5390</td>
			<td>Homogenization step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce 660 nm Protein Assay</td>
			<td>Thermo Scientific, USA</td>
			<td>22660</td>
			<td>Protein concentration</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an alternative approach to study primary events in neurodegeneration using ex vivo rat brain slices

Hangi birincil yansıtan temel ateş işler güvenilir hayvan modelleri geliştirmek için çalışan çok sayıda çalışma rağmen çok az yaygın olarak kabul etmiştir. Burada, biz daha yakın vivo içindesunan iyi bilinen ex vivo beyin dilim tekniği, uyarlanmış yeni bir yordam teklif- vitro hücre dejenerasyonu, uyarının harekete geçirilmesine karşılık olarak erken olayları araştıran için hazırlıklar, daha senaryo gibi Alzheimer hastalığı içinde (Ah) görülmektedir. Bu varyasyon seçili beyin bölgesi ve yerel işlevselliğini fizyolojik ortamında bir anatomik cytoarchitecture korunması etkinleştirme basit ve kolayca tekrarlanabilir adımlar oluşur. Farklı anatomik alanlarda birden fazla deneyler söz konusu tedavileri ile bir site-, doz- ve saat-bağımlı bir şekilde gerçekleştirmek için fırsat sağlayan aynı beyin elde edilebilir. Bu metodoloji ile ilgili sonuçları etkileyebilecek potansiyel sınırlamalar doku, Yani, anatomik bütünlüğünü sırasında dilimleme ve kuluçka adımları ve bölüm kalınlık bakımından korunması için ile ilgili hangi biyokimyasal ve immunohistokimyasal analiz etkileyebilir. Bu yaklaşım moleküler mekanizmaları fizyolojik ve patolojik koşulları, uyuşturucu tarama veya doz-yanıt deneyleri dahil keşfetmek gibi farklı amaçlar için istihdam edilebilir. Son olarak, bu iletişim kuralını da hayvan davranış çalışmalarda istihdam sayısını azaltabilir. Rapor burada uygulama son zamanlarda açıklanan ve ex vivo sıçan beyin dilimler içeren bir reklam öncelikle etkilenen beyin bölgelerinden biri olan Bazal ön (BF), tarihinde ilk kez test. Asetilkolinesteraz (AChE) C-terminus elde edilen zehirli bir peptid yönetim tetikleme, BF, antero-posterior ekseni boyunca farklı bir ifade bir reklam gibi profil sor kanıtlanmıştır özellikle, Reklamda, alpha7 nikotinik reseptör (α7-nAChR), gibi değişmiş proteinlerin Tau (p-Tau) ve amiloid beta (Aβ) fosforile.

Burada sunulan Protokolü toksik bir peptid, T30, yönetim α7-nAChR, p ifadesi bir site bağlı şekilde modüle gösterir-Tau ve Aβ BF içeren bölümler (şekil 3A) içinde. Nikotinik reseptör denetim muadili karşılaştırıldığında rostral tedavi hemislice önemli bir artış gösterir (dilim 1, p = 0.0310) (ara dilim arasında iki koşul (herhangi bir değişiklik ortaya koymuyor ikenşekil 3B), dilim 2, p 0.1195 =) (şekil 3B). Arka bölümünde belirgin bir şekilde azaltılmasına, Denetim yan tarafa T30 Günese maruz kalan bölümünde mevcuttur (dilimi 3, p 0.0476 =) (şekil 3B). T30 başvuru üzerine, p-Tau düzeyleri önemli ölçüde karşı tarafı eşleşen denetim ön bölgede artırılır (dilim 1, p 0.0158 =) (şekil 3 c). Öte yandan, diğer iki BF-içeren bölümler koşulları arasında anlamlı bir fark gösterme (dilim 2, p 0.1014 =; 3, dilim p 0.6405 =) (şekil 3 c). T30 maruz kaldıktan sonra Aβ önemli ölçüde onların tedavi edilmezse kontralateral bölümleri için karşılaştırıldığında rostral ve ara hemisections içinde Gelişmiş (dilim 1, p 0.0136 =; 2, dilim p 0.0109 =) (şekil 3D). Kaudal dilimi iki tedaviler arasında hiçbir değişiklik yok (dilimi 3, p 0.1231 =) (şekil 3D). P-Tau karşı birincil antikor fosforile Ser202 kalıntı içeren epitope tanır. Aβ karşı birincil antikor Aβ37 Aβ42 için arasında değişen çeşitli izoformlarının algılar. Yukarıda açıklanan22 iki kullanarak eşleştirilmiş tkuyruklu olarak veri analiz-sınar ve SEM N temsil = (hemislices, grup başına fareler) olduğunu (27, 9).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57507/57507fig1.jpg"> Şekil 1: sırası ve ana adımları göstergesi zamanlaması gerçekleştirilen deneysel işlem sırasında. Birinci ve üçüncü adımı tamamlamak için zaman aralığı operatörün deneyim düzeyi ile ilgili olarak değişebilir. <a href="/files/ftp_upload/57507/57507fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57507/57507fig2.jpg"> Şekil 2: iletişim kuralı ilerleme gösteren sıralı adımları. (A-D) Kafatası ve beyincik ayrılması beyin geri kalan beynin çıkarma. (E) eki beyin vibratome disk ve transfer içine buz tarafından çevrili ve soğuk aCSF Dilimleme sırasında sürekli oksijenli dolu diseksiyon odası. (F) Koronal beyin kesit. Rostral (R), orta (Ben) ve Bazal ön Kaudal (C) yapıları içeren dilimleri, (G) koleksiyonu. (H) iki eşleşen hemislices bölümlerde ayrılması. (Ben) her hemisection onun karşılık gelen şişe yerleştirilir. (J) tüpleri aparatı kutusunun içinde destek yerleştirilmiş ve ayrı ayrı kapalı. (K) kuluçka sistemi (Siyah Daire) oksijen kaynağına bağlantı kurulduğunda dönem. Tedavi sonrası (L) homojenizasyon örnekleri. Bu rakam22değiştirilir. <a href="/files/ftp_upload/57507/57507fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57507/57507fig3.jpg"> Şekil 3: T30 aracılı siteye özgü ifade α7-nAChR, p-Tau ve BF rostro Kaudal eksen boyunca Aβ. Beyin koronal dilimleri iki tamamlayıcı porsiyonlar halinde bölünmüş ve farklı koşullara maruz Bazal ön çekirdeği (beyaz noktalı çizgiler), dahil olmak üzere(a)gösterimi. (B) sonra T30 pozlandırmayı, nikotinik reseptör ön alt bölümü (T30 1) ve bir (T30 3) karşılık gelen denetim taraf (ctrl 1 ve ctrl 3) karşılaştırıldığında arka belirgin bir azalma önemli bir artış gösterir. Ara dilim (ctrl 2, T30 2) iki koşul arasında herhangi bir değişiklik görüntülemez. Diğer iki dilim iki grubu (dilim 2 ve 3 dilim) herhangi bir farklılık ortaya çıkarmak değil ise (C) p-Tau ifade denetim eşleşen muadili (ctrl 1), tedavi rostral bölümünde (T30 1) önemli ölçüde daha yüksektir. (D) Aβ önemli bir artış karşılık gelen tedavi edilmezse yan yana için (ctrl 1 ve ctrl 2) göre ön ve orta düzey tedavi alt bölümleri (T30 1 ve T30 2) görüntüler. Kaudal bölümlerde, iki grup arasında hiçbir varyasyon vardır. SEM hata Çubuklarõn * p < 0.05.n = (hemislices, grup başına fareler) olduğunu (27, 9). Ölçek çubuğu 1 mm'dir. Bu rakam22değiştirildi. <a href="/files/ftp_upload/57507/57507fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices at JoVE.com

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

Biz daha fazla ateş altında yatan erken etkinlik kazandırabileceğini kurulan eski-vivo beyin tekniğine dayalı bir yöntemini in vivo ve in vitro deneyler avantajlarını birleştiren mevcut. Ayrıca, tedavi ve tedavi edilmezse grubun aynı anatomik düzlemde doğrudan karşılaştırma için eşsiz bir fırsat temsil eder.

Ateş Ex Vivo sıçan beyin dilimleri kullanarak birincil olayları incelemek için alternatif bir yaklaşım

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, ...

an-alternative-approach-to-study-primary-events-neurodegeneration

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

6.8K Görüntüleme.  Culham Science Centre. Biz daha fazla ateş altında yatan erken etkinlik kazandırabileceğini kurulan eski-vivo beyin tekniğine dayalı bir yöntemini in vivo ve in vitro deneyler avantajlarını birleştiren mevcut. Ayrıca, tedavi ve tedavi edilmezse grubun aynı anatomik düzlemde doğrudan karşılaştırma için eşsiz bir fırsat temsil eder.

Video: An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron is damaged by injury or disease, it may regenerate. Cell-intrinsic and extrinsic factors influence the ability of a neuron to regenerate and restore function. Recently, the nematode C. elegans has emerged as an excellent model organism to identify genes and signaling pathways that influence the regeneration of neurons1-6. The main way to initiate neuronal regeneration in C. elegans is laser-mediated cutting, or axotomy. During axotomy, a fluorescently-labeled neuronal process is severed using high-energy pulses. Initially, neuronal regeneration in C. elegans was examined using an amplified femtosecond laser5. However, subsequent regeneration studies have shown that a conventional pulsed laser can be used to accurately sever neurons in vivo and elicit a similar regenerative response1,3,7.
We present a protocol for performing in vivo laser axotomy in the worm using a MicroPoint pulsed laser, a turnkey system that is readily available and that has been widely used for targeted cell ablation. We describe aligning the laser, mounting the worms, cutting specific neurons, and assessing subsequent regeneration. The system provides the ability to cut large numbers of neurons in multiple worms during one experiment. Thus, laser axotomy as described herein is an efficient system for initiating and analyzing the process of regeneration.

In vivo Laser Axotomy in C. elegans

A protocol to cut neurons in C. elegans with a MicroPoint pulsed laser is presented. We describe setting up the system, immobilizing worms, and severing labeled neurons. Advantages include a relatively low-cost system and the ability to sever neuronal processes or ablate cells in vivo.

C in vivo Lazer Axotomy elegans

Neurons communicate with other cells via axons and dendrites, slender membrane extensions that contain pre- or post-synaptic specializations. If a neuron ...

Nörobilim

A Rapid Approach to High-Resolution Fluorescence Imaging in Semi-Thick Brain Slices

A fundamental goal to both basic and clinical neuroscience is to better understand the identities, molecular makeup, and patterns of connectivity that are characteristic to neurons in both normal and diseased brain. Towards this, a great deal of effort has been placed on building high-resolution neuroanatomical maps1-3. With the expansion of molecular genetics and advances in light microscopy has come the ability to query not only neuronal morphologies, but also the molecular and cellular makeup of individual neurons and their associated networks4. Major advances in the ability to mark and manipulate neurons through transgenic and gene targeting technologies in the rodent now allow investigators to 'program' neuronal subsets at will5-6. Arguably, one of the most influential contributions to contemporary neuroscience has been the discovery and cloning of genes encoding fluorescent proteins (FPs) in marine invertebrates7-8, alongside their subsequent engineering to yield an ever-expanding toolbox of vital reporters9. Exploiting cell type-specific promoter activity to drive targeted FP expression in discrete neuronal populations now affords neuroanatomical investigation with genetic precision.
Engineering FP expression in neurons has vastly improved our understanding of brain structure and function. However, imaging individual neurons and their associated networks in deep brain tissues, or in three dimensions, has remained a challenge. Due to high lipid content, nervous tissue is rather opaque and exhibits auto fluorescence. These inherent biophysical properties make it difficult to visualize and image fluorescently labelled neurons at high resolution using standard epifluorescent or confocal microscopy beyond depths of tens of microns. To circumvent this challenge investigators often employ serial thin-section imaging and reconstruction methods10, or 2-photon laser scanning microscopy11. Current drawbacks to these approaches are the associated labor-intensive tissue preparation, or cost-prohibitive instrumentation respectively.
Here, we present a relatively rapid and simple method to visualize fluorescently labelled cells in fixed semi-thick mouse brain slices by optical clearing and imaging. In the attached protocol we describe the methods of: 1) fixing brain tissue in situ via intracardial perfusion, 2) dissection and removal of whole brain, 3) stationary brain embedding in agarose, 4) precision semi-thick slice preparation using new vibratome instrumentation, 5) clearing brain tissue through a glycerol gradient, and 6) mounting on glass slides for light microscopy and z-stack reconstruction (Figure 1).
For preparing brain slices we implemented a relatively new piece of instrumentation called the 'Compresstome' VF-200 (http://www.precisionary.com/products_vf200.html). This instrument is a semi-automated microtome equipped with a motorized advance and blade vibration system with features similar in function to other vibratomes. Unlike other vibratomes, the tissue to be sliced is mounted in an agarose plug within a stainless steel cylinder. The tissue is extruded at desired thicknesses from the cylinder, and cut by the forward advancing vibrating blade. The agarose plug/cylinder system allows for reproducible tissue mounting, alignment, and precision cutting. In our hands, the 'Compresstome' yields high quality tissue slices for electrophysiology, immunohistochemistry, and direct fixed-tissue mounting and imaging. Combined with optical clearing, here we demonstrate the preparation of semi-thick fixed brain slices for high-resolution fluorescent imaging.

Here we describe a rapid and simple method to image fluorescently labeled cells in semi-thick brain slices. By fixing, slicing, and optically clearing brain tissue we describe how standard epifluorescent or confocal imaging can be used to visualize individual cells and neuronal networks within intact nervous tissue.

Yarı Kalın Beyin Slices Yüksek Çözünürlük Floresans Görüntüleme Hızlı Bir Yaklaşım

A fundamental goal to both basic and clinical neuroscience is to better understand the identities, molecular makeup, and patterns of connectivity that are ...

GABA-activated Single-channel and Tonic Currents in Rat Brain Slices

The GABAA channels are present in all neurons and are located both at synapses and outside of synapses where they generate phasic and tonic currents, respectively 4,5,6,7 The GABAA channel is a pentameric GABA-gated chloride channel. The channel subunits are grouped into 8 families (&alpha;1-6, &beta;1-3, &gamma;1-3, &delta;, &#949;, &theta;, &pi; and &rho;). Two alphas, two betas and one 3rd subunit form the functional channel 8. By combining studies of sub-type specific GABA-activated single-channel molecules with studies including all populations of GABAA channels in the neuron it becomes possible to understand the basic mechanism of neuronal inhibition and how it is modulated by pharmacological agents.
We use the patch-clamp technique 9,10 to study the functional properties of the GABAA channels in alive neurons in hippocampal brain slices and record the single-channel and whole-cell currents. We further examine how the channels are affected by different GABA concentrations, other drugs and intra and extracellular factors. For detailed theoretical and practical description of the patch-clamp method please see The Single-Channel Recordings edited by B Sakman and E Neher 10.

We use the patch-clamp technique to measure GABA-activated single-channel currents (GABAA channels, GABAA receptors) and the synaptic and tonic currents they generate in neurons. Activation of the channels decreases neuronal excitability in health and disease 1,2,3,4.

Rat Beyin Dilimleri GABA-aktive Tek kanallı ve Tonik Akımlar

The GABAA channels are present in all neurons and are located both at synapses and outside of synapses where they generate phasic and tonic currents, ...

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the first born neurons remain closer to the ventricle while the last born neurons migrate past the first born neurons towards the surface of the brain1. In addition to neuronal migration2, a key process for normal cortical function is the regulation of neuronal morphogenesis3. While neuronal morphogenesis can be studied in vitro in primary cultures, there is much to be learned from how these processes are regulated in tissue environments.
We describe techniques to analyze neuronal migration and/or morphogenesis in organotypic slices of the cerebral cortex4,6. A pSilencer modified vector is used which contains both a U6 promoter that drives the double stranded hairpin RNA and a separate expression cassette that encodes GFP protein driven by a CMV promoter7-9. Our approach allows for the rapid assessment of defects in neurite outgrowth upon specific knockdown of candidate genes and has been successfully used in a screen for regulators of neurite outgrowth8. Because only a subset of cells will express the RNAi constructs, the organotypic slices allow for a mosaic analysis of the potential phenotypes. Moreover, because this analysis is done in a near approximation of the in vivo environment, it provides a low cost and rapid alternative to the generation of transgenic or knockout animals for genes of unknown cortical function. Finally, in comparison with in vivo electroporation technology, the success of ex vivo electroporation experiments is not dependant upon proficient surgery skill development and can be performed with a shorter training time and skill.

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

To conduct a rapid assessment of the function of genes in the development of cerebral cortex, we describe methods involving the ex vivo electroporation of plasmids co-expressing inhibitory RNA (RNAi) and GFP in murine embryonic cortex. This protocol is amenable to the study of various aspects of neurodevelopment such as neurogenesis, neuronal migration and neuronal morphogenesis including dendrite and axon outgrowth.

Nöronal Morphogenesis Çalışması Yöntemleri:<em&gt; Ex vivo</emEmbriyonik Mürin Serebral Korteks olarak&gt; RNAi Elektroporasyon

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the ...

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

Ultrasonik Kan-beyin bariyeri bozulması ve Manganez kontrastlı MRG kullanma İşlevsel beyin görüntüleme

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion channel, and transporter cell surface presentation on a minutes time scale.&#160;There is a broad diversity of mechanisms that control endocytic trafficking of individual proteins. Studies investigating the molecular underpinnings of trafficking have primarily relied upon surface biotinylation to quantitatively measure changes in membrane protein surface expression in response to exogenous stimuli and gene manipulation.&#160;However, this approach has been mainly limited to cultured cells, which may not faithfully reflect the physiologically relevant mechanisms at play in adult neurons.&#160;Moreover, cultured cell approaches may underestimate region-specific differences in trafficking mechanisms.&#160;Here, we describe an approach that extends cell surface biotinylation to the acute brain slice preparation.&#160;We demonstrate that this method provides a high-fidelity approach to measure rapid changes in membrane protein surface levels in adult neurons.&#160;This approach is likely to have broad utility in the field of neuronal endocytic trafficking.

Brain Slice Biotinylation: An Ex Vivo Approach to Measure Region-specific Plasma Membrane Protein Trafficking in Adult Neurons

Neuronal membrane trafficking dynamically controls plasma membrane protein availability and significantly impacts neurotransmission.&#160;To date, it has been challenging to measure neuronal endocytic trafficking in adult neurons.&#160;Here, we describe a highly effective, quantitative method to measure rapid changes in surface protein expression ex vivo in acute brain slices.

Beyin Dilim Biyotinilasyonu: An<em&gt; Ex Vivo</emYetişkin Nöronlar Bölge özgü Plazma Membran Protein Ticaretiyle Tedbir&gt; Yaklaşım

Regulated endocytic trafficking is the central mechanism facilitating a variety of neuromodulatory events, by dynamically controlling receptor, ion ...

Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the brain, but subsequently migrate to new destinations to reach appropriate targets. Deciphering the molecular signals that cooperatively guide neuronal migration in the embryonic brain is therefore important to understand how the complex neural networks form which later support postnatal life. Facial branchiomotor (FBM) neurons in the mouse embryo hindbrain migrate from rhombomere (r) 4 caudally to form the paired facial nuclei in the r6-derived region of the hindbrain. Here we provide a detailed protocol for wholemount ex vivo culture of mouse embryo hindbrains suitable to investigate the signaling pathways that regulate FBM migration. In this method, hindbrains of E11.5 mouse embryos are dissected and cultured in an open book preparation on cell culture inserts for 24 hr. During this time, FBM neurons migrate caudally towards r6 and can be exposed to function-blocking antibodies and small molecules in the culture media or heparin beads loaded with recombinant proteins to examine roles for signaling pathways implicated in guiding neuronal migration.

Mouse Hindbrain Ex Vivo Culture to Study Facial Branchiomotor Neuron Migration

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the neural tube, but migrate to reach appropriate targets. Facial branchiomotor (FBM) neurons are a useful model to study neuronal migration. This protocol describes the wholemount ex vivo culture of mouse embryo hindbrains to investigate mechanisms that regulate FBM migration.

Fare Beyin<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Kültür Yüz Branchiomotor Nöron Göç Eğitim için

Embryonic neurons are born in the ventricular zone of the brain, but subsequently migrate to new destinations to reach appropriate targets. Deciphering ...

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal degeneration. Lack of growth cone formation, regeneration, and loss of additional myelinated axonal projections within the spinal cord greatly limits neurological recovery following injury. To assess how central myelinated axons of the spinal cord respond to injury, we developed an ex vivo living spinal cord model utilizing transgenic mice that express yellow fluorescent protein in axons and a focal and highly reproducible laser-induced spinal cord injury to document the fate of axons and myelin (lipophilic fluorescent dye Nile Red) over time using two-photon excitation time-lapse microscopy. Dynamic processes such as acute axonal injury, axonal retraction, and myelin degeneration are best studied in real-time. However, the non-focal nature of contusion-based injuries and movement artifacts encountered during in vivo spinal cord imaging make differentiating primary and secondary axonal injury responses using high resolution microscopy challenging. The ex vivo spinal cord model described here mimics several aspects of clinically relevant contusion/compression-induced axonal pathologies including axonal swelling, spheroid formation, axonal transection, and peri-axonal swelling providing a useful model to study these dynamic processes in real-time. Major advantages of this model are excellent spatiotemporal resolution that allows differentiation between the primary insult that directly injures axons and secondary injury mechanisms; controlled infusion of reagents directly to the perfusate bathing the cord; precise alterations of the environmental milieu (e.g., calcium, sodium ions, known contributors to axonal injury, but near impossible to manipulate in vivo); and murine models also offer an advantage as they provide an opportunity to visualize and manipulate genetically identified cell populations and subcellular structures. Here, we describe how to isolate and image the living spinal cord from mice to capture dynamics of acute axonal injury.

An Ex Vivo Laser-induced Spinal Cord Injury Model to Assess Mechanisms of Axonal Degeneration in Real-time

We present a protocol utilizing two-photon excitation time-lapse microscopy to simultaneously visualize the dynamics of axon and myelin injuries in real time. This proposed protocol permits studies of both intrinsic and extrinsic factors which can influence central myelinated axon fate after injury and contribute to permanent clinical disability.

Bir<em&gt; Ex vivo</em&gt; Lazer kaynaklı Omurilik Felçlileri Modeli Gerçek zamanlı aksonal Dejenerasyon mekanizmaları değerlendirmek için

Injured CNS axons fail to regenerate and often retract away from the injury site. Axons spared from the initial injury may later undergo secondary axonal ...

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated proteins and subsequent manipulation of neural activity by light. Channelrhodopsins (ChRs) are light-gated cation-channels and when fused to a fluorescent protein their expression allows for visualization and concurrent activation of specific cell types and their axonal projections in defined areas of the brain. Via stereotactic injection of viral vectors, ChR fusion proteins can be constitutively or conditionally expressed in specific cells of a defined brain region, and their axonal projections can subsequently be studied anatomically and functionally via ex vivo optogenetic activation in brain slices. This is of particular importance when aiming to understand synaptic properties of connections that could not be addressed with conventional electrical stimulation approaches, or in identifying novel afferent and efferent connectivity that was previously poorly understood. Here, a few examples illustrate how this technique can be applied to investigate these questions to elucidating fear-related circuits in the amygdala. The amygdala is a key region for acquisition and expression of fear, and storage of fear and emotional memories. Many lines of evidence suggest that the medial prefrontal cortex (mPFC) participates in different aspects of fear acquisition and extinction, but its precise connectivity with the amygdala is just starting to be understood. First, it is shown how ex vivo optogenetic activation can be used to study aspects of synaptic communication between mPFC afferents and target cells in the basolateral amygdala (BLA). Furthermore, it is illustrated how this ex vivo optogenetic approach can be applied to assess novel connectivity patterns using a group of GABAergic neurons in the amygdala, the paracapsular intercalated cell cluster (mpITC), as an example.

Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices

Optogenetic approaches are widely used to manipulate neural activity and assess the consequences for brain function. Here, a technique is outlined that&#160;upon in vivo expression of the optical activator Channelrhodopsin, allows for ex vivo analysis of synaptic properties of specific long range and local neural connections in fear-related circuits.

Beyin Dilimleri Korku Devre Ex Vivo optogenetic Diseksiyon

Optogenetic approaches are now widely used to study the function of neural populations and circuits by combining targeted expression of light-activated ...

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new method of Ca2+-imaging using the bioluminescent reporter GFP-aequorin (GA) has been developed. This new technique relies on the fusion of the GFP and aequorin genes, producing a molecule capable of binding calcium and&#160;&#8212; with the addition of its cofactor coelenterazine &#8212; emitting bright light that can be monitored through a photon collector. Transgenic lines carrying the GFP-aequorin gene have been generated for both mice and Drosophila. In Drosophila, the GFP-aequorin gene has been placed under the control of the GAL4/UAS binary expression system allowing for targeted expression and imaging within the brain. This method has subsequently been shown to be capable of detecting both inward Ca2+-transients and Ca2+-released from inner stores. Most importantly it allows for a greater duration in continuous recording, imaging at greater depths within the brain, and recording at high temporal resolutions (up to 8.3 msec). Here we present the basic method for using bioluminescent imaging to record and analyze Ca2+-activity within the mushroom bodies, a structure central to learning and memory in the fly brain.

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

Here we present a novel Ca2+-imaging approach using a bioluminescent reporter. This approach uses a fused construct GFP-aequorin which binds to Ca2+ and emits light, eliminating the need for light excitation. Significantly this method permits long continuous imaging, access to deep brain structures and high temporal resolution.

Bioluminescent Kalsiyum Göstergesi GFP-aequorin dayanarak Vivo Fonksiyonel Beyin Görüntüleme Yaklaşım

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...