Mevcut işleri Sağlık (NIH) hibe HD043680, MH106392, DA013137 ve NS100624 Ulusal Enstitüleri tarafından desteklendi. Kısmi Fonu Biyomedikal davranış bilimleri NIH T32 eğitim grant tarafından sağlandı.

Deneysel protokol hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) University of South Carolina tarafından kabul edildi (federal güvence numarası: A3049-01).
1. taze donmuş beyin bölümleri hazırlanması
<ol><li>F344/N sıçan zorlanma kullanın: her seks üç fareler 13 ay-in yaş, vücut ağırlığı yaklaşık 320 g.</li>
	<li>Sevoflurane konsantrasyonu % 5 (sevoflurane dozda) için ayarlayın. Sevoflurane maruz kalma durur bir dakika için nefes sonra devam.</li>
	<li>Fareyi başını kesmek ve beyin kaldırın.</li>
	<li>Sıçan beyin 15 için sıvı azot daldırın doku hasat 5 dk içinde s.</li>
	<li>-20 ° C'de 1 h için cryostat beyne equilibrate.</li>
	<li>30 µm bölümleri kesilmiş ve ( Tablo malzemelerigörmek) slaytlar aktarın.</li>
	<li>Nucleus accumbens bölgesinden yaklaşık 2,76 mm Bregma14anterior 2.28 mm bölümleri tercih.</li>
	<li>Sürekli dilim olfaktör ampul nucleus accumbens bölgeye göre fare stereotaksik beyin yapısı ile fare beyninden.</li>
	<li>Örnek slaytlar üzerine monte. -20 ° c kuru için 10 dakika için bölümleri tutmak.</li>
	<li>Hemen bırakın önceden soğutulmuş %4 paraformaldehyde 4 ° C'de 1 h için slaytları</li>
	<li>Oda sıcaklığında (RT) artan bir etanol degrade slaytlar yer: % 50 alkol 5 dakika; % 70 alkol 5 dakika; ve %100 5 min için alkol.</li>
	<li>Taze %100 ile tekrar alkol.</li>
	<li>Slaytlar emici kağıt üzerine yerleştirin ve kuru hava.</li>
	<li>Bir bariyer her bölümün bariyer kalemle çizin ( Tablo malzemelerigörmek). 1 dk. tamamen kuru bariyer izin.</li>
</ol>2. ön beyin bölümleri
<ol><li>Fırını ve 40 ° c sıcaklık ayarla</li>
	<li>3 damla (90 µL) Önarıtma 4 reaktif ekleyin ( Tablo malzemelerigörmek) her beyin bölümünde (slayt başına bir bölüm).</li>
	<li>30 dk RT. az için bölümleri kuluçkaya</li>
	<li>1 x PBS RT. tekrar ediyorum, 1 dk. için taze 1 x PBS ile slaytları daldırın. Not: 1 x PBS 15dk daha uzun süre içinde slayt kalmamalıdır.</li>
</ol>3. RNA In Situ hibridizasyon floresan Multiplex tahlil
<ol><li>Hedef sonda bir su banyosunda 40 ° C'de 10 dakika sıcak ve sonra RT için cool</li>
	<li>RNA reaktif yerleştirin (örneğin, Amp 1-4 FL), RT.</li>
	<li>Aşırı sıvı slayt raf üzerinde geri emici kağıt ve yer ile slaytlardan kaldırmak ( Tablo malzemelerigörmek).</li>
	<li>3 damla (90 µL) örnek dilim üzerinde Drd1α inceleyebilirsek (C1) ekleyin. 40 ° C'de 2 h için kuluçkaya</li>
	<li>Taze 1 yıkama arabellek x ile RT. tekrar az 2 dakika boyunca 1 yıkama arabellek x slaytları daldırın.</li>
	<li>Aşırı sıvı slayt raf üzerinde geri emici kağıt ve yer ile slaytlardan kaldırmak ( Tablo malzemelerigörmek).</li>
	<li>Amp 1-FL örnek dilim üzerinde 3 damla (90 µL) ekleyin. 40 ° C'de 30 dk için kuluçkaya</li>
	<li>Taze 1wash arabellek ile RT. tekrar 2 min için 1 yıkama tampon içindeki slaytları daldırın.</li>
	<li>Aşırı sıvı slayt raf üzerinde geri emici kağıt ve yer ile slaytlardan kaldırmak ( Tablo malzemelerigörmek).</li>
	<li>Amp 2-FL örnek dilim üzerinde 3 damla (90 µL) ekleyin. 40 ° C'de 15 dakika kuluçkaya</li>
	<li>Taze 1 yıkama arabellek x ile RT. tekrar az 2 dakika boyunca 1 yıkama arabellek x slaytları daldırın.</li>
	<li>Aşırı sıvı slayt raf üzerinde geri emici kağıt ve yer ile slaytlardan kaldırmak ( Tablo malzemelerigörmek).</li>
	<li>Amp 3-FL örnek dilim üzerinde 3 damla (90 µL) ekleyin. 40 ° C'de 30 dk için kuluçkaya</li>
	<li>Taze 1 yıkama arabellek x ile yıkama arabellek RT. tekrar 2 min için x 1 içindeki slaytları daldırın.</li>
	<li>Aşırı sıvı slayt raf üzerinde geri emici kağıt ve yer ile slaytlardan kaldırmak ( Tablo malzemelerigörmek).</li>
	<li>Amp 4-FL-Alt A örnek dilim üzerinde 3 damla (90 µL) ekleyin. 40 ° C'de 15 dakika kuluçkaya</li>
	<li>Taze 1 yıkama arabellek x ile RT. tekrar az 2 dakika boyunca 1 yıkama arabellek x slaytları daldırın.</li>
	<li>Aşırı sıvı slaytlardan kaldırmak ve hemen montaj reaktif 2 damla yerleştirin (bkz. Tablo reçetesi) her bölüme.</li>
	<li>22 mm 22 mm coverslip yerleştirin (bkz. Tablo reçetesi) her beyin bölümü üzerinde.</li>
	<li>Slaytları 2-8 ° C'de karanlık kadar kuru depolama.</li>
	<li>Confocal mikroskobunun açmak ve bir 60 X amaç için geçiş.</li>
	<li>Z-yığın görüntü confocal mikroskopla elde. Tamamlayıcı video confocal görüntüleme ayrıntılı yordam için bkz.</li>
	<li>Nucleus accumbens bölgedeki hücreler etiketli Drd1α görüntüleri (uyarma: 488 nm; Emisyon: 515/30 nm). Not: beyin bölümleri arasında kuluçka adımları kurumasına izin vermeyin.</li>
</ol>4. veri analizi
<ol><li>Boyama desen yarı kantitatif analiz: "ayrık noktalar".<ol>
<li>Görüntü tek hücre tanımlamak için DAPI nükleer bir işareti olarak boyama gerçekleştirmek. Ancak, birden çok türde hücre çekirdeği ve/veya hücreler düzensiz şekli ile olduğundan beyin doku bazı kısımlarını çözümlemek hala zordur. Burada, iki deneyimli araştırmacılar hücre bölgesi tanımlamak için görüntülerden her hücre ayrı olarak atayın.</li>
		<li>Görsel olarak her hücre içinde belirli bir ölçüte uyan (şekil 1B) kullanarak hücre başına nokta sayısını temel alan temsilcisi confocal görüntüleri puan.</li>
		<li>Her kategoride toplam cep numarasını belirlemek ve tüm doku bölümlerin (şekil 2A) hem kadın ve erkek için her kategori içindeki hücreleri yüzde frekans görüntüleyen göreli sıklığı grafikler oluşturmak için toplam hücresini sayı x100 bölmek ayrı ayrı (şekil 2E).</li>
		<li>Tüm önceden kategoriler içinde hücrelerin toplamı ayrı ayrı hücreleri tüm doku bölümlerin (şekil 2B) ve kadın ve erkek için toplu sıklığını belirlemek için toplam hücresini sayıya x100 bölme (şekil 2F).</li>
	</ol>
</li>
	<li>"Ayrık noktalar desen (isteğe bağlı) boyama" istatistiksel analiz.<ol>
<li>Sıralı (Yani, her rütbe en düşük hücre ifade (1) yüksek hücre ifadesi (9) kategoriye dahil hücre sayısı) doğada kategorik bir değişken sağlamak için hücre başına nokta sayısını inceleyin daha da İstatistiksel analizler için.</li>
		<li>Tanımlayıcı istatistik muayene sonrasında, üç ana yaklaşım kullanın: bir şömine-Haenszel istatistik, Mann-Whitney U testi ve Kruskal-Wallis testi. Kesin istatistiksel yaklaşım üzerine bağlı olacaktır, ancak faiz, istatistiksel karar ağacı (şekil 4) deneysel tasarım ve araştırma sorusu bir analitik yaklaşım ile ilgili kararların alınmasında yardımcı olabilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Desen boyama için sinyal şiddeti faiz (ROI) bölgesinde ölçmek: "kümeler".<ol>
<li>Aşağıdaki denklemi kullanarak her görüntü sinyali yoğunluğunu hesaplamak: Sinyal şiddeti toplam yatırım Getirisi görüntü - (ortalama arka plan yoğunluğu × Toplam görüntü alanını) yoğunluğu =</li>
		<li>Toplam hücre başına yaklaşık sinyal ifade hesaplamak için yatırım Getirisi görüntü içindeki hücreleri saymak. Sinyal şiddeti/resim hem de hücreleri/resim sayısı grup farklılıkları sinyal ifade/hücrede görülen grup farklılıklara katkıda bulunabilir mekanizmaları dikkate ilgi olabilir (şekil 3B-3D).</li>
	</ol>
</li>
	<li>"Desen (isteğe bağlı) Boyama kümeleri" istatistiksel analiz.<ol>
<li>Daha fazla istatistiksel analiz için bir sürekli değişken sağlamak için sinyal ifade/hücre inceleyin. Kullanım tasarımında bir bağımsız örnek t-Testi ve konular arasındaki faktörler sayısına göre Varyans analizi (ANOVA), dahil olmak üzere iki yaklaşım dahil. İstatistiksel karar ağacı (şekil 4) en uygun istatistiksel yaklaşım ile ilgili kararların alınmasında yardımcı olabilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Goldman-Rakic, P. S., Castner, S. A., Svensson, T. H., Siever, L. J., Williams, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+dopamine+D1+receptor+in+schizophrenia:+insights+for+cognitive+dysfunction.">Targeting the dopamine D1 receptor in schizophrenia: insights for cognitive dysfunction.</a> Psychopharmacology (Berl). 174 (1), 3-16 (2004).</li><li>Beaulieu, J. M., Gainetdinov, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physiology,+signaling,+and+pharmacology+of+dopamine+receptors.">The physiology, signaling, and pharmacology of dopamine receptors.</a> Pharmacol Rev. 63, 182-217 (2011).</li><li>Zahrt, J., Taylor, J. R., Mathew, R. G., Arnsten, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supranormal+stimulation+of+D1+dopamine+receptors+in+the+rodent+prefrontal+cortex+impairs+spatial+working+memory+performance.">Supranormal stimulation of D1 dopamine receptors in the rodent prefrontal cortex impairs spatial working memory performance.</a> J Neurosci. 17, 8528-8535 (1997).</li><li>Floresco, S. B., Magyar, O., Ghods-Sharifi, S., Vexelman, C., Tse, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+dopamine+receptor+subtypes+in+the+medial+prefrontal+cortex+of+the+rat+regulate+set-shifting.">Multiple dopamine receptor subtypes in the medial prefrontal cortex of the rat regulate set-shifting.</a> Neuropsychopharmacology. 31, 297-309 (2006).</li><li>Arnsten, A. F., Girgis, R. R., Gray, D. L., Mailman, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+dopamine+therapeutics+for+cognitive+deficits+in+schizophrenia.">Novel dopamine therapeutics for cognitive deficits in schizophrenia.</a> Biol Psychiatry. 81, 67-77 (2017).</li><li>Ellenbroek, B. A., Budde, S., Cools, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prepulse+inhibition+and+latent+inhibition:+the+role+of+dopamine+in+the+medial+prefrontal+cortex.">Prepulse inhibition and latent inhibition: the role of dopamine in the medial prefrontal cortex.</a> Neuroscience. 75 (2), 535-542 (1996).</li><li>Parker, K. L., Alberico, S. L., Miller, A. D., Narayanan, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prefrontal+D1+dopamine+signaling+is+necessary+for+temporal+expectation+during+reaction+time+performance.">Prefrontal D1 dopamine signaling is necessary for temporal expectation during reaction time performance.</a> Neuroscience. 255, 246-254 (2013).</li><li>Manduca, A., Servadio, M., Damsteegt, R., Campolongo, P., Vanderschuren, L. J., Trezza, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopaminergic+Neurotransmission+in+the+Nucleus+Accumbens+Modulates+Social+Play+Behavior+in+Rats.">Dopaminergic Neurotransmission in the Nucleus Accumbens Modulates Social Play Behavior in Rats.</a> Neuropsychopharmacology. 41 (9), 2215-2223 (2016).</li><li>Okubo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+prefrontal+dopamine+D1+receptors+in+schizophrenia+revealed+by+PET.">Decreased prefrontal dopamine D1 receptors in schizophrenia revealed by PET.</a> Nature. 385 (6617), 634-636 (1997).</li><li>Abi-Dargham, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prefrontal+dopamine+D1+receptors+and+working+memory+in+schizophrenia.">Prefrontal dopamine D1 receptors and working memory in schizophrenia.</a> J Neurosci. 22 (9), 3708-3719 (2002).</li><li>Shinohara, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+D1+receptor+subtype+mediates+acute+stress-induced+dendritic+growth+in+excitatory+neurons+of+the+medial+prefrontal+cortex+and+contributes+to+suppression+of+stress+susceptibility+in+mice.">Dopamine D1 receptor subtype mediates acute stress-induced dendritic growth in excitatory neurons of the medial prefrontal cortex and contributes to suppression of stress susceptibility in mice.</a> Mol Psychiatry. 19, (2017).</li><li>Okubo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+prefrontal+dopamine+D1+receptors+in+schizophrenia+revealed+by+PET.">Decreased prefrontal dopamine D1 receptors in schizophrenia revealed by PET.</a> Nature. 385, 634-636 (1997).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAscope:+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissues.">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).</li><li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The rat brain in stereotaxic coordinates. , (2014).</li></ol>

Hiçbir bildirmek için çıkar çatışması vardır.

Bu protokol için in situ hibridizasyon nucleus accumbens (NAc) Drd1α reseptör ifade ve tirozin hidroksilaz (TH) ifade gözlemliyorum nigra (SNR) bölgesinde değerlendirmek için taze donmuş beyin dilimler için roman tekniği tarif. Ayrıca farklı boyama desenleri için veri analizi yöntemleri sağlar: "ayrı nokta" veya "kümeler".
Başarılı multiplex Floresans RNA in situ hibridizasyon tahlil için kritik adımlar dahil edilir. Don sıçan decapitating ve beyin, kaldırma sonra beyin 5 dk. içinde sıvı azot beyin bölümleri-20 ° C'de % 4 paraformaldehyde fiksasyon kadar tutun. Ön 4 kuluçka 30 dk sonra slaytlar 1 x PBS 15dk daha uzun süre kalmamalıdır. Beyin bölümleri arasında amplifikasyon adımları kurumasına izin vermeyin. Confocal görüntüleme için-mek şartıyla yüksek kaliteli görüntüler gösteren açık boyama sinyaller doku örneği de çok yardımcı oldu. Hibridizasyon fırın kullanarak hızla ve verimli bir şekilde örnekleri 40 ° C'ye getirecek
Kak Drd1α reseptör ifade bireysel floresan sinyallerini "tek nokta, her biri tek bir RNA transkript hücre içinde temsil" olarak tespit edilmiştir. Önemlisi, "nokta" boyutu tahlil koşulları farklılıklar, numune hazırlama ve diğer faktörler yerine Drd1α-RNA ifade düzeylerini yansıtır. Benzer şekilde, tek tek "nokta" sinyal yoğunluğu Drd1α-RNA ifade seviyelere konuyla ilgisi yok. Bu ifade "0-9 ölçüde ve değişkenlik Drd1α ifade değerlendirir hücre başına nokta sayısını temel alan" ile attı bir yarı kantitatif analiz olarak dinamik aralığını değerlendirildi. Ayrıca, hücre başına nokta sayısı incelenmesi kategorik bir değişken daha da İstatistiksel analizler için sağlar.
Tanımlayıcı istatistik muayene, bizim Protokolü "ayrı nokta deseni, daha fazla çözümleme için sıralı bir değişkeni sağlayan boyama" mevcut sinyalleri istatistiksel analiz için üç ana yaklaşım önerir. Özellikle, parametrik olmayan Mann-Whitney U testi, nonparametrik Kruskal-Wallis testi ve dernek bir şömine-Haenszel test tavsiye edilir. Tek inceleyerek arasında-faktörü (Örneğin, seks) konular Mann-Whitney U testi ve Kruskal-Wallis testi en uygun olduğunda. Ayrıca, bir şömine-Haenszel test Derneği dağıtım nöbetleşe incelenmesi için uygun olabilir. Ek etkenler dahil olduğunda daha karmaşık istatistiksel analizler, genelleştirilmiş tahmin denklemi veya genel doğrusal karma modeli de dahil olmak üzere uygun olabilir. Önerileri ayrıntılı değildir ve hassas istatistiksel yaklaşım deneysel tasarım ve araştırma soru ilgi bağlı olacaktır.
Ancak, transkript kopya sayısı çok yüksek olduğu durumlarda, sinyalleri kümeleri görünebilir. Burada, TH ifade SNR bölgesinde "desen boyama kümeleri" gösterdi. Yüksek ifade TH işaretçiyi ölçmek için biz ortalama arka plan yoğunluğu en düşük yoğunluk eşiğin ayarlama konusunda temel ve sinyal TH. Hücre başına olarak analiz görüntü yoğunluğu ayarlanabilir Bağımsız bir kullanarak gibi SNR TH istatistiksel analiz "desen, boyama küme" mevcut sinyalleri örnekler t-testleri veya ANOVA grupları karşılaştırmak için.
Bu roman RNA in situ hibridizasyon testin sınırlamalar vardır. "Desen boyama ayrı nokta için", bu daha doğru bir şekilde tek bir hücrenin tanımlama içerir. Bizim çalışmada, görüntüden, tek hücre tanımlamak için DAPI nükleer bir işareti olarak boyama yapılır. Ancak, birden çok türde hücre çekirdeği ve/veya hücreler düzensiz şekillerle olduğundan beyin doku bazı kısımlarını çözümlemek hala zordur. Burada, iki deneyimli araştırmacılar hücre bölgesi tanımlamak için görüntülerden her hücre ayrı olarak atayın. "Desen boyama kümeleri için" özel bir yazılım eşik veya otomatik hücre recognization kurulum için seçilmelidir.
Böylece, yenilikçi RNA in situ hibridizasyon tahlil DA alımı ve DA yayın aynı anda etkileyen, striatal DA sistem karmaşıklığı anlayış iyileştirilmesi mekanizmaları incelemek için bize etkin. Genel olarak, araştırmacılar araştırma dopaminerjik işaretleri işlevsel olmayan değişiklikler ortaya çıkması ve beyin bozukluklarının ilerlemesini sırasında zaman roman RNA in situ hibridizasyon tekniği yararlanırlar.

Disfonksiyon striatal dopamin sisteminin birden çok nörobilişsel hastalıklarda gözlenen klinik belirtiler ilerlemesini ilgilenmektedir. Dopamin D1 reseptörleri prefrontal korteks (PFC) ve beynin striatal bölgeler varsa ve Bilişsel süreçler1bellek, zamansal işleme ve lokomotif davranış2,3 çalışmak dahil olmak üzere, ağır etkisi , 4 , 5 , 6 , 7. önceki çalışmalar aydınlatılmamıştır değişiklikleri reseptörlerinin dopamin D1 ilerlemesini dikkat eksikliği-hiperaktivite bozukluğu (DEHB)8, şizofreni9, nörobilişsel belirtiler ile ilişkili bulunmuştur 10 ve stres duyarlılık11. Özellikle, şizofreni, Pozitron emisyon tomografisi (PET) çalışmalar dopamin D1 reseptörleri prefrontal cortices bağlama yeteneği son derece bilişsel açıkları ve negatif belirtiler11varlığı ile ilgili belirtti. D1 dopamin reseptör tarafından düzenlenir prefrontal korteks eksitatör nöronlar dendritik büyüme stres duyarlılık azaltır. Ayrıca, D1 reseptör medial prefrontal kortikal (mPFC) nöronlar içinde nakavt sosyal yenilgi sosyal kaçınma stres kaynaklı12geliştirmek.
Burada, tek RNA molekülleri ile taze donmuş doku örneklerini bir hücre görselleştirmek için RNA in situ hibridizasyon roman tekniği tanıtmak. Mevcut teknik içinde geçerli edebiyat mevcut yöntemleri üzerinde birden çok avantajları vardır. İlk olarak, geçerli yordam doku kayma ve morfolojik bağlamında korur ve böylece taze gerektiren diğer yordamlar, gömülü olmayan doku geçerli yöntemleri ile kombine taze donmuş doku örnekleri üzerinde gerçekleştirildi. Formalin sabit ve parafin gömülü dokularda benzer yordamlar tek transkripsiyon çözünürlük bir RNA in situ hibridizasyon tekniği13kullanılarak elde edilebilir gösterildiği. RNA tek transkripsiyon düzeyinde algılanması üstün hassasiyet düşük kopya numara ifadesi hem de diğer nükleik asit algılama yöntemlerle elde tek tek hücre düzeyinde gen ekspresyonu karşılaştırmak için fırsat sağlar, Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) teknikleri gibi. Ayrıca, geçerli yöntem için tek hedef RNA transkript melezleşmiştir ve sıralı olarak algılama sinyali amplifikasyon molekülleri bir çağlayan ile bağlı çok özel RNA probları ile imge ile yüksek sinyal gürültü oranı korur sistem. Son olarak, günümüz teknolojisi soruşturmamız için yalnızca bir sınıf sistemi ile ilgili işaretleri tarafından protein algılaması gibi sınırlama yerine onun hedef özgü özel probları ile birden çok biyolojik sistemleri değerlendirmek için fırsat sağlar immünhistokimya yöntemleri.
Bizim çalışmada, biz bu roman RNA in situ hibridizasyon nucleus accumbens (NAc) Drd1α reseptör ifade ve gözlemliyorum nigra (SNR) tirozin hidroksilaz (TH) ifadesinde değerlendirmek için her ikisi erkek ve dişi F344/N fareler kullandık. Yenilikçi RNA in situ hibridizasyon DA alımı ve DA yayın aynı anda etkileyen, striatal DA sistemin karmaşıklığı anlayışımızı geliştirmek mekanizmaları incelemek için bize etkin. Taze donmuş beyin dilimler ve veri analiz yöntemleri farklı boyama desenleri için sağlamak için burada, biz açıklayınız: "ayrı nokta" veya "kümeler".

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="857">
	<tbody>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:329px;">HybEZ Oven system</td>
			<td style="width:205px;">Advanced Cell Diagnostics&#160;</td>
			<td style="width:135px;">310010</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">RNAscope Probe - Rn-Drd1a</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics&#160;</td>
			<td>317031</td>
			<td>Color channel 1, Green</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">RNAscope Probe - Rn-Th-C2</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics&#160;</td>
			<td>314651-C2</td>
			<td>Color channel 2, Orange</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">RNAscope Fluorescent Multiplex Reagent Kit</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics&#160;</td>
			<td>320850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen</td>
			<td>Vector Laboratory</td>
			<td>H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">SuperFrost Plus Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-154%&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">4% paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Sevoflurane</td>
			<td>Merritt Veterinary Supply</td>
			<td>347075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Tissue-Tek vertical 24 slide rack</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9837976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Tissue-Tek staining dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0731403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Precision General Purpose Baths</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>TSGP28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:329px;">Pretreatment 4</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics&#160;</td>
			<td>320850</td>
			<td>parts of kits</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:329px;">ProLong Gold anti-fade reagent</td>
			<td style="width:205px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">P36930</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:329px;">Amp 1-FL</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics&#160;</td>
			<td>320850</td>
			<td>parts of kits</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:329px;">Amp 2-FL</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics&#160;</td>
			<td>320850</td>
			<td>parts of kits</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:329px;">Amp 3-FL</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics&#160;</td>
			<td>320850</td>
			<td>parts of kits</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:329px;">Amp 4-FL-Alt A</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics&#160;</td>
			<td>320850</td>
			<td>parts of kits</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:329px;">EZ-C1 software package</td>
			<td style="width:205px;">Nikon Instruments</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td>version 3.81b</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:329px;">SAS/STAT Software</td>
			<td style="width:205px;">SAS Institute, Inc.,</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td>version 9.4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of dopamine d1-alpha receptor within rodent nucleus accumbens by an innovative rna in situ detection technology

Merkezi sinir sistemi nöronal büyüme ve gelişme düzenlenmesinde önemli bir rol oynar en bol (DA) dopamin reseptör D1-Alfa alt türü reseptör (Drd1α) olduğunu. Ancak, davranışsal yanıt arabuluculuk ve çalışma bellek işlevi modülasyonlu Drd1α reseptör anormallikler temel mekanizmaları hala pek açık değildir. Bir roman RNA in situ hibridizasyon tahlil kullanarak, geçerli çalışma Drd1α dopamin reseptör ve tirozin hidroksilaz (TH) RNA ifadeden DA ilgili devre nucleus accumbens (NAc) alan ve gözlemliyorum nigra bölgesinde (SNR), tespit anılan sıraya göre. Kak Drd1α ifadede "ayrı nokta deseni boyama" gösterir. Drd1α ifade açık cinsiyet farklılıkları tespit edildi. Buna ek olarak, TH "kümelenmiş" boyama desen gösterir. TH ifade ile ilgili dişi rats erkek hayvanlar göreli hücre başına daha yüksek bir sinyal ifadesi görüntülenir. Burada sunulan yöntemleri bir roman situ hibridizasyon Teknik Merkezi sinir sistemi hastalıkları ilerleme sırasında dopamin sistem disfonksiyon değişimler soruşturma için sağlar.

Çalışmada "(şekil 1A) F344/N Sıçanlarda NAC desen dopamin D1-Alfa reseptörleri (Drd1α) RNA ifade için boyama bir ayrık noktalar" görülmektedir. Bireysel Floresans sinyalleri kolayca tespit edilmiştir ve görülebilir tek "nokta," her biri tek bir RNA transkript hücre içinde temsil eder. "Ayrık noktalar desen boyama" ekran görüntüleri için Kak, ifade yarı kantitatif analiz (şekil 1A, şekil 2Ave 2B) kullanarak dinamik aralığını değerlendirildi. Her hücre "0-9 hücre başına nokta sayısını temel alan" atan oldu. Bu "melez sinyal"-puanı (H-score) yöntemi böylece değerlendirmek ölçüde ve değişkenlik Drd1α ifade için tek tek hücreler arasında.
"Ayrı nokta deseni boyama" için yarı kantitatif yaklaşım sıralı (Yani, en alt sırada hücreye (1) en yüksek (9) başına nokta sayısı) daha fazla istatistik analiz doğada kategorik bir değişken sağlar. Bu da çalışmanın, bir konular arasında faktör (Yani, seks) etkisi Kak Drd1α ifadede incelenmesiyle ilgileneceğini olduğumuzu. İç içe veri yapısı (NAc hücrelerde etiketli Drd1α iki Z-yığın resim her hayvan için eldeYani ) için hesap için ortalama sayısı değerleri her kategori için hesaplanan ve istatistiksel analiz için kullanılan (erkek: n= 3, erkek: n = 3). Verilen bir konular arasında faktör (Yani, seks) farklılıkları (Yani, erkek, kadın) iki grup ile Mann-Whitney U incelenmesi bizim ilgi test ortalama hücre sayısı (şekil 2B) farklılıkları değerlendirmek için yapılmıştır. Mann-Whitney U testi bir azalma medyan hücre Puan erkek hayvanlar göre görüntüleme dişi hayvanlarla seks [z=-5,8, p≤0.001], önemli bir temel etkisi ortaya koydu. Şekil 2E ve 2F göstermek hücreleri iki yöntem kullanarak her kategoride sıklığı: göreli sıklığı ve toplu frekans. Dişi hayvanlar dağılımıyla daha sık erkek hayvanlar göre daha düşük sıralı kategorilerdeki hücrelerinin önemli bir kayma görüntülenir. Bir şömine-Haenszel test Derneği istatistiksel olarak önemli bir etkisi seks açığa dağıtım, incelemek için yapılmıştır [χ2MH(1) 67.3, p≤0.001 =]. Böylece, genel olarak, sonuçları net seks farklılıklar Kak Drd1α ifadede öneririz.
Transkript kopya sayısı çok yüksek olduğu durumlarda, sinyalleri kümeleri görünebilir. Burada, tirozin hidroksilaz ifade (TH) SNR bölgesinde "desen (şekil 3A) Boyama kümeleri" gösterdi. Bu yüksek ifade işareti ölçmek için ilk sekiz farklı arka plan alanlardan arka plan yoğunluğu ortalama. Ortalama arka plan yoğunluğu en düşük yoğunluk eşiğin ayarladıktan sonra değiştirilmiş görüntü yoğunluğu TH. Hücre başına sinyal olarak analiz edildi
Bir konular arasında faktör (Yani, seks) incelenmesi bizim ilgi göz önüne alındığında, bir bağımsız örnekler t-Testi uygun istatistik yaklaşımıdır. Çözümleme için veri günlük dönüştürdü. İç içe veri yapısı (SNR hücrelerde etiketli TH iki Z-yığın resim her hayvan için eldeYani ) için hesap için ortalama değerleri hesaplanır ve istatistiksel analiz için kullanılan (erkek: n= 2, erkek: n= 3). Dişi hayvanlar ortalama sinyal yoğunluğu (şekil 3B), toplam TH ifade, erkek hayvanlar göre daha yüksek düzeyde düşündüren'önemli bir artış görüntülenir (t(3) 3.3, p≤0.05 =). Ancak, önemli cinsiyet farkı yok ya da görüntü başına hücre sayısı gözlendi (t(3) 2.0, p= > 0,05; Şekil 3 c) veya sinyal ifade hücre başına ortalama (t(3) 2.0, p= > 0,05; Şekil 3D). Üç ölçülerin bir konu içinde faktör olarak dikkate alınarak bir karışık-tasarım ANOVA, aynı zamanda seks önemli bir temel etkisi ortaya [F (1,3) 10.6, p≤0.05 =].
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57444/57444fig1.jpg"> Şekil 1: nokta deseni boyama için hücre başına ortalama sayısı yarı kantitatif analiz kriterleri: "ayrık noktalar". A. temsilcisi confocal görüntüleri (60 X) Drd1α ifade farklı puanları (% 250 ölçek orijinal resim boyutuyla güçlendirilmiş) B. "Puanı" belirli kategori her ölçütü için. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57444/57444fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57444/57444fig2.jpg"> Resim 2: F344/N sıçan Nucleus Accumbens bölgedeki dopamin D1-Alfa reseptör (Drd1α) RNA düzeyi. A. göreli sıklığı % her "puan" Kategorya. B. sigmoidal doz-yanıt eğrisi iyi tarif bir uyum sağladığı (r20,99 =) % 95 güven aralıkları ile (CI; noktalı çizgilerle gösterilir) her "puan" Kategorya toplu frekans % için uygun. C. temsilcisi confocal görüntülerini (60 X) Drd1α ifade içinde "ayrık noktalar desen boyama" var erkek ve dişi rats. ö Temsilcisi grafiği içinde erkek ve dişi rats ortalama hücre skor. Hata çubukları için standart hata değerlerin ortalamasının (SEM) dur. E. göreli sıklığı % erkek ve dişi fareler dokulardan ifadede karşılaştırma her "skor" kategori. F. Sigmoidal doz-yanıt eğrileri iyi tarif bir uyum sağladığı (r2s 0,99 =) % 95 güven aralıkları her "puan" Kategorya erkek ve dişi fareler arasında toplu frekans % ile. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57444/57444fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57444/57444fig3.jpg"> Şekil 3: tirozin hidroksilaz RNA düzeyi (TH) gözlemliyorum Nigra (SNR) bölgesi F344/N Sıçanlarda. A. temsilcisi confocal görüntüleri (60 X; Uyarma: 543 nm; Emisyon: 590/50 nm) TH ifadesi içinde erkek ve dişi rats, hangi-si olmak "desen boyama kümeleri". B-ö. Sinyal şiddeti hücre başına temsilcisi analizi. Sinyal ifade / hücre resimle (yoğunluk eşik küme arka plan üzerinde) sinyal yoğunluğu miktarının ve onun görüntü içindeki hücreleri tarafından bölücü den türemiş. Hata çubukları standart hata ortalamaya (SEM) temsil eder. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57444/57444fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57444/57444fig4.jpg"> Şekil 4: karar ağacı için önerilen istatistiksel analiz. Karar ağacı hangi istatistiksel analiz faiz araştırma soru için en uygun olduğunu belirlemek için yönergeler sağlar. Karar ağacı ayrıntılı değildir ve bazı durumlarda, diğer analizler uygun olabilir. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57444/57444fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology at JoVE.com

Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology

Dopamin D1-Alfa reseptör kemirgen Nucleus Accumbens bir yenilikçi RNA Situ içinde hafiye teknoloji tarafından içinde tanımlaması

Dopamin D1-Alfa reseptör nucleus accumbens tanımlaması D1 reseptör disfonksiyonu bir merkezi sinir sistemi hastalığı sırasında açıklığa kavuşturulması için önemlidir. Biz bir belirli beyin bölgesinde tek RNA molekülleri görselleştirmek için bir roman RNA in situ hibridizasyon tahlil yapılır.

In the central nervous system, the D1-alpha subtype receptor (Drd1&#945;) is the most abundant dopamine (DA) receptor, which plays a vital role in ...

identification-dopamine-d1-alpha-receptor-within-rodent-nucleus

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology

8.5K Görüntüleme.  University of South Carolina. Dopamin D1-Alfa reseptör nucleus accumbens tanımlaması D1 reseptör disfonksiyonu bir merkezi sinir sistemi hastalığı sırasında açıklığa kavuşturulması için önemlidir. Biz bir belirli beyin bölgesinde tek RNA molekülleri görselleştirmek için bir roman RNA in situ hibridizasyon tahlil yapılır.

Video: Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology

Simultaneous fMRI and Electrophysiology in the Rodent Brain

To examine the neural basis of the blood oxygenation level dependent (BOLD) magnetic resonance imaging (MRI) signal, we have developed a rodent model in which functional MRI data and in vivo intracortical recording can be performed simultaneously. The combination of MRI and electrical recording is technically challenging because the electrodes used for recording distort the MRI images and the MRI acquisition induces noise in the electrical recording. To minimize the mutual interference of the two modalities, glass microelectrodes were used rather than metal and a noise removal algorithm was implemented for the electrophysiology data. In our studies, two microelectrodes were separately implanted in bilateral primary somatosensory cortices (SI) of the rat and fixed in place. One coronal slice covering the electrode tips was selected for functional MRI. Electrode shafts and fixation positions were not included in the image slice to avoid imaging artifacts. The removed scalp was replaced with toothpaste to reduce susceptibility mismatch and prevent Gibbs ringing artifacts in the images. The artifact structure induced in the electrical recordings by the rapidly-switching magnetic fields during image acquisition was characterized by averaging all cycles of scans for each run. The noise structure during imaging was then subtracted from original recordings. The denoised time courses were then used for further analysis in combination with the fMRI data. As an example, the simultaneous acquisition was used to determine the relationship between spontaneous fMRI BOLD signals and band-limited intracortical electrical activity. Simultaneous fMRI and electrophysiological recording in the rodent will provide a platform for many exciting applications in neuroscience in addition to elucidating the relationship between the fMRI BOLD signal and neuronal activity.

We have developed a method for simultaneous functional magnetic resonance imaging and electrophysiological recording in the rodent brain, providing a platform for the investigation of the relationship between neural activity and the blood oxygenation level dependent (BOLD) MRI signal.

Kemirgen Beyin aynı anda fMRI ve Elektrofizyoloji

To examine the neural basis of the blood oxygenation level dependent (BOLD) magnetic resonance imaging (MRI) signal, we have developed a rodent model in ...

Nörobilim

VisioTracker, an Innovative Automated Approach to Oculomotor Analysis

Investigations into the visual system development and function necessitate quantifiable behavioral models of visual performance that are easy to elicit, robust, and simple to manipulate. A suitable model has been found in the optokinetic response (OKR), a reflexive behavior present in all vertebrates due to its high selection value. The OKR involves slow stimulus-following movements of eyes alternated with rapid resetting saccades. The measurement of this behavior is easily carried out in zebrafish larvae, due to its early and stable onset (fully developed after 96 hours post fertilization (hpf)), and benefitting from the thorough knowledge about zebrafish genetics, for decades one of the favored model organisms in this field. Meanwhile the analysis of similar mechanisms in adult fish has gained importance, particularly for pharmacological and toxicological applications.
Here we describe VisioTracker, a fully automated, high-throughput system for quantitative analysis of visual performance. The system is based on research carried out in the group of Prof. Stephan Neuhauss and was re-designed by TSE Systems. It consists of an immobilizing device for small fish monitored by a high-quality video camera equipped with a high-resolution zoom lens. The fish container is surrounded by a drum screen, upon which computer-generated stimulus patterns can be projected. Eye movements are recorded and automatically analyzed by the VisioTracker software package in real time.
Data analysis enables immediate recognition of parameters such as slow and fast phase duration, movement cycle frequency, slow-phase gain, visual acuity, and contrast sensitivity.
Typical results allow for example the rapid identification of visual system mutants that show no apparent alteration in wild type morphology, or the determination of quantitative effects of pharmacological or toxic and mutagenic agents on visual system performance.

The VisioTracker is an automated system for the quantitative analysis of visual performance of larval and small adult fish based on the recording of eye movements. It features full control over visual stimulus properties and real-time analysis, enabling high-throughput research in fields such as visual system development and function, pharmacology, neural circuit studies and sensorimotor integration.

VisioTracker, Okülomotor Analizi Yenilikçi Otomatik Yaklaşım

Investigations into the visual system development and function necessitate quantifiable behavioral models of visual performance that are easy to elicit, ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses specifically on antisense oligonucleotides (ASOs), though the techniques shown in the video here can also be used to deliver a plethora of other drugs to the CNS. Antisense oligonucleotides (ASOs) have the capability to knockdown sequence-specific targets 1 as well as shift isoform ratios of specific genes 2. To achieve widespread gene knockdown or splicing in the CNS of mice, the ASOs can be delivered into the brain using two separate routes of administration, both of which we demonstrate in the video.
The first uses Alzet osmotic pumps, connected to a catheter that is surgically implanted into the lateral ventricle. This allows the ASOs to be continuously infused into the CNS for a designated period of time. The second involves a single bolus injection of a high concentration of ASO into the right lateral ventricle. Both methods use the mouse cerebral ventricular system to deliver the ASO to the entire brain and spinal cord, though depending on the needs of the study, one method may be preferred over the other.

We describe a method to target drugs to the central nervous system by either implanting a catheter or performing a bolus injection into the right lateral ventricle in mice. We focus specifically on the delivery of antisense oligonucleotides. This technique is readily adaptable to other drugs and to rats.

Kemirgen Merkezi Sinir Sistemi İlaçların doğrudan Intraventriküler teslim

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

Single cell codetection of a gene, its RNA product and cellular regulatory proteins is critical to study gene expression regulation. This is a challenge in the field of virology; in particular for nuclear-replicating persistent DNA viruses that involve animal models for their study. Herpes simplex virus type 1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. Latent virus serves as reservoir, from which it reactivates and induces a new herpetic episode. The cell biology of HSV-1 latency remains poorly understood, in part due to the lack of methods to detect HSV-1 genomes in situ in animal models. We describe a DNA-fluorescent in situ hybridization (FISH) approach efficiently detecting low-copy viral genomes within sections of neuronal tissues from infected animal models. The method relies on heat-based antigen unmasking, and directly labeled home-made DNA probes, or commercially available probes. We developed a triple staining approach, combining DNA-FISH with RNA-FISH&#160;and immunofluorescence, using peroxidase based signal amplification to accommodate each staining requirement. A major improvement is the ability to obtain, within 10 &#181;m tissue sections, low-background signals that can be imaged at high resolution by confocal microscopy and wide-field conventional epifluorescence. Additionally, the triple staining worked with a wide range of antibodies directed against cellular and viral proteins. The complete protocol takes 2.5 days to accommodate antibody and probe penetration within the tissue.

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

We established a fluorescent in situ hybridization protocol for the detection of a persistent DNA virus genome within tissue sections of animal models. This protocol enables studying infection process by codetection of the viral genome, its RNA products, and viral or cellular proteins within single cells.

Floresan Nöronal Dokularda Kalıcı DNA Virüs Genomu ve Transkriptlerinin Algılama In situ Melezleme immün ile birlikte

Single cell codetection of a gene, its RNA product and cellular regulatory proteins is critical to study gene expression regulation. This is a challenge ...

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for maintenance, repair or neurodegeneration in postdevelopmental periods. High throughput analyses have recently revealed that axons have a more dynamic and complex transcriptome than previously expected. These analysis, however have been mostly done in cultured neurons where axons can be isolated from the somato-dendritic compartments. It is virtually impossible to achieve such isolation in whole tissues in vivo. Thus, in order to verify the recruitment of mRNAs and their functional relevance in a whole animal, transcriptome analyses should ideally be combined with techniques that allow the visualization of mRNAs in situ. Recently, novel ISH technologies that detect RNAs at a single-molecule level have been developed. This is especially important when analyzing the subcellular localization of mRNA, since localized RNAs are typically found at low levels. Here we describe two protocols for the detection of axonally-localized mRNAs using a novel ultrasensitive RNA ISH technology. We have combined RNAscope ISH with axonal counterstain using fluorescence immunohistochemistry or histological dyes to verify the recruitment of Atf4 mRNA to axons in vivo in the mature mouse and human brains.

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

RNA in situ hybridization (ISH) enables the visualization of RNAs in cells and tissues. Here we show how combination of RNAscope ISH with immunohistochemistry or histological dyes can be successfully used to detect mRNAs localized to axons in sections of mouse and human brains.

Yüksek Çözünürlük kullanma Beyin bölümlerde Axonally Lokalize mRNA&#39;larının Algılama<em&gt; In Situ</em&gt; Melezleme

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for ...

Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model

Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the gold-standard experimental model to study basic neurophysiological mechanisms involved in the formation and maintenance of neuronal cell assemblies. However, in vitro studies have been limited to the recording of the electrophysiological activity generated by bi-dimensional (2D) neural networks. Nonetheless, given the intricate relationship between structure and dynamics, a significant improvement is necessary to investigate the formation and the developing dynamics of three-dimensional (3D) networks. In this work, a novel experimental platform in which 3D hippocampal or cortical networks are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are realized by seeding neurons in a scaffold constituted of glass microbeads (30-40 &#181;m in diameter) on which neurons are able to grow and form complex interconnected 3D assemblies. In this way, it is possible to design engineered 3D networks made up of 5-8 layers with an expected final cell density. The increasing complexity in the morphological organization of the 3D assembly induces an enhancement of the electrophysiological patterns displayed by this type of networks. Compared with the standard 2D networks, where highly stereotyped bursting activity emerges, the 3D structure alters the bursting activity in terms of duration and frequency, as well as it allows observation of more random spiking activity. In this sense, the developed 3D model more closely resembles in vivo neural networks.

Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model

In this work, a novel experimental model in which 3D neuronal cultures are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are built by seeding neurons in a scaffold made up of glass microbeads on which neurons grow and form interconnected 3D structures.

Mikro Elektrot Diziler 3D Engineered Nöronal Kültürler Arayüz: Yenilikçi<em&gt; İn Vitro</em&gt; Deneysel Model

Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the ...

Reliable Identification of Living Dopaminergic Neurons in Midbrain Cultures Using RNA Sequencing and TH-promoter-driven eGFP Expression

In Parkinson&#39;s Disease (PD) there is widespread neuronal loss throughout the brain with pronounced degeneration of dopaminergic neurons in the SNc, leading to bradykinesia, rigidity, and tremor. The identification of living dopaminergic neurons in primary Ventral Mesencephalic (VM) cultures using a fluorescent marker provides an alternative way to study the selective vulnerability of these neurons without relying on the immunostaining of fixed cells. Here, we isolate, dissociate, and culture mouse VM neurons for 3 weeks. We then identify dopaminergic neurons in the cultures using eGFP fluorescence (driven by a Tyrosine Hydroxylase (TH) promoter). Individual neurons are harvested into microcentrifuge tubes using glass micropipettes. Next, we lyse the harvested cells, and conduct cDNA synthesis and transposon-mediated &#34;tagmentation&#34; to produce single cell RNA-Seq libraries1,2,3,4,5. After passing a quality-control check, single-cell libraries are sequenced and subsequent analysis is carried out to measure gene expression. We report transcriptome results for individual dopaminergic and GABAergic neurons isolated from midbrain cultures. We report that 100% of the live TH-eGFP cells that were harvested and sequenced were dopaminergic neurons. These techniques will have widespread applications in neuroscience and molecular biology.

In Parkinson&#39;s Disease (PD), Substantia Nigra (SNc) dopaminergic neurons degenerate, leading to motor dysfunction. Here we report a protocol for culturing ventral midbrain neurons from a mouse expressing eGFP driven by a Tyrosine Hydroxylase (TH) promoter sequence, harvesting individual fluorescent neurons from the cultures, and measuring their transcriptome using RNA-seq.

RNA sıralaması ve TH-organizatörü odaklı eGFP İfade Kullanımı orta beyin Kültürlerde Yaşayan dopaminerjik nöronlar güvenilir Kimlik

In Parkinson&#39;s Disease (PD) there is widespread neuronal loss throughout the brain with pronounced degeneration of dopaminergic neurons in the SNc, ...

Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

Insects have evolved sophisticated olfactory reception systems to sense exogenous chemical signals. These chemical signals are transduced by Olfactory Receptor Neurons (ORNs) housed in hair-like structures, called chemosensilla, of the antennae. On the ORNs&#39; membranes, Odorant Receptors (ORs) are believed to be involved in odor coding. Thus, being able to identify genes localized to the ORNs is necessary to recognize OR genes, and provides a fundamental basis for further functional in situ studies. The RNA expression levels of specific ORs in insect antennae are very low, and preserving insect tissue for histology is challenging. Thus, it is difficult to localize an OR to a specific type of sensilla using RNA in situ hybridization. In this paper, a detailed and highly effective RNA in situ hybridization protocol particularly for lowly expressed OR genes of insects, is introduced. In addition, a specific OR gene was identified by conducting double-color fluorescent in situ hybridization experiments using a co-expressing receptor gene, Orco, as a marker.

Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

This paper describes a detailed and highly effective RNA in situ hybridization protocol particularly for low-level expressed Odorant Receptor (OR) genes, as well as other genes, in insect antennae using digoxigenin (DIG)-labeled or biotin-labeled probes.

Locust Antenlerinde Odorant Reseptör Genlerinin RNA ile Lokalizasyonu<em&gt; Yerinde</em&gt; Hibridizasyon

Insects have evolved sophisticated olfactory reception systems to sense exogenous chemical signals. These chemical signals are transduced by Olfactory ...

Assessment of Dopaminergic Homeostasis in Mice by Use of High-performance Liquid Chromatography Analysis and Synaptosomal Dopamine Uptake

Dopamine (DA) is a modulatory neurotransmitter controlling motor activity, reward processes and cognitive function. Impairment of dopaminergic (DAergic) neurotransmission is strongly associated with several central nervous system-associated diseases such as Parkinson&#39;s disease, attention-deficit-hyperactivity disorder and drug addiction1,2,3,4. Delineating disease mechanisms involving DA imbalance is critically dependent on animal models to mimic aspects of the diseases, and thus protocols that assess specific parts of the DA homeostasis are important to provide novel insights and possible therapeutic targets for these diseases.
Here, we present two useful experimental protocols that when combined provide a functional read-out of the DAergic system in mice. Biochemical and functional parameters on DA homeostasis are obtained through assessment of DA levels and dopamine transporter (DAT) functionality5. When investigating the DA system, the ability to reliably measure endogenous levels of DA from adult brain is essential. Therefore, we present how to perform high-performance liquid chromatography (HPLC) on brain tissue from mice to determine levels of DA. We perform the experiment on tissue from dorsal striatum (dStr) and nucleus accumbens (NAc), but the method is also suitable for other DA-innervated brain areas.
DAT is essential for reuptake of DA into the presynaptic terminal, thereby controlling the temporal and spatial activity of released DA. Knowing the levels and functionality of DAT in the striatum is of major importance when assessing DA homeostasis. Here, we provide a protocol that allows to simultaneously deduce information on surface levels and function using a synaptosomal6 DA uptake assay.
Current methods combined with standard immunoblotting protocols provide the researcher with relevant tools to characterize the DAergic system.

Synaptosomal dopamine uptake and high-performance liquid chromatography analysis represent experimental tools to investigate dopamine homeostasis in mice by assessing the function of the dopamine transporter and levels of dopamine in striatal tissue, respectively. Here we present protocols to measure dopamine tissue content and assess the functionality of the dopamine transporter.

Dopaminerjik Homeostasis farelerde yüksek performanslı sıvı Kromatografi analizi ve Synaptosomal dopamin alımı kullanımı tarafından değerlendirilmesi

Dopamine (DA) is a modulatory neurotransmitter controlling motor activity, reward processes and cognitive function. Impairment of dopaminergic (DAergic) ...

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a powerful tool for studying transcriptional profiles of cells, particularly in heterogeneous tissues such as the central nervous system. However, dissociation methods required for single cell sequencing can lead to experimental changes in the gene expression and cell death. Furthermore, these methods are generally restricted to fresh tissue, thus limiting studies on archival and bio-bank material. Single nucleus RNA sequencing (snRNA-Seq) is an appealing alternative for transcriptional studies, given that it accurately identifies cell types, permits the study of tissue that is frozen or difficult to dissociate, and reduces dissociation-induced transcription. Here, we present a high-throughput protocol for rapid isolation of nuclei for downstream snRNA-Seq. This method enables isolation of nuclei from fresh or frozen spinal cord samples and can be combined with two massively parallel droplet encapsulation platforms.

Here, we present a protocol to rapidly isolate high-quality nuclei from the fresh or frozen tissue for downstream massively parallel RNA sequencing. We include detergent-mechanical and hypotonic-mechanical tissue disruption and cell lysis options, both of which can be used for isolation of nuclei.

Yetişkin omurilik çekirdeği yalıtım kitlesel paralel tek-çekirdek RNA sıralama için

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...