현재 작품은 HD043680, MH106392, DA013137, 및 NS100624 건강 (NIH)의 국가 학회에 의해 지원 되었다. 부분 기금 NIH T32 훈련 그랜트 생물 행동 과학에 의해 제공 되었다.

실험 프로토콜 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 사우스 캐롤라이나 대학에 의해 승인 되었다 (연방 보증 번호: A3049-01).
1입니다. 신선한 냉동된 뇌 섹션의 준비
<ol><li>F344/N 쥐 긴장을 사용 하 여: 각 성의 3 쥐 13 개월, 몸 무게 약 320 g.</li>
	<li>5% (sevoflurane의 과다) sevoflurane 농도 조정 합니다. 추가 분에 대 한 중지를 호흡 후 sevoflurane 노출을 계속 합니다.</li>
	<li>목을 벨 쥐 하 고 두뇌를 제거 합니다.</li>
	<li>15 액체 질소에 쥐 뇌 잠수함 s 조직 수확의 5 분 이내.</li>
	<li>-20 ° c에서 1 h cryostat 뇌 equilibrate</li>
	<li>30 µ m 섹션을 잘라내어 슬라이드 ( 재료의 표참조)에 전송.</li>
	<li>핵 accumbens 지역 Bregma14앞쪽 2.28 m m 약 2.76 m m에서에서 섹션을 선택 하십시오.</li>
	<li>지속적으로 쥐의 stereotaxic 두뇌 구조에 따라 핵 accumbens 영역을 통해 후 각 전구에서 쥐 뇌를 슬라이스.</li>
	<li>샘플 슬라이드에 탑재 합니다. 건조 10 분 동안-20 ° C에서 섹션을 유지.</li>
	<li>즉시 미리 냉장된 4% paraformaldehyde 1 h 4 ° c.에 대 한 슬라이드를 담가</li>
	<li>실 온 (RT)에서 증가 에탄올 그라데이션에서 슬라이드 배치: 50% EtOH 5 분; 70% EtOH 5 분; 그리고 100% EtOH 5 분.</li>
	<li>신선한 100%와 반복 EtOH.</li>
	<li>흡수 성 종이에 슬라이드를 배치 하 고 건조 한 공기.</li>
	<li>장벽 펜으로 각 섹션 주위 방 벽을 그리기 ( 재료의 표참조). 1 분 동안 완전히 건조 하는 배리어를 하자.</li>
</ol>2입니다. 뇌 섹션의 전처리
<ol><li>오븐에 설정 하 고 설정 온도 40 ° c</li>
	<li>전처리 4 시 약 3 방울 (90 µ L)을 추가 ( 재료의 표참조) 각 뇌 섹션 (슬라이드 당 하나의 섹션)에.</li>
	<li>실시간에서 30 분에 대 한 섹션을 품 어</li>
	<li>신선한 1 x PBS와 실시간 반복에서 1 분 동안 1 x PBS에 슬라이드 잠수함 참고: 슬라이드 1 x PBS 15 분 이상에 체류 하지 해야 합니다.</li>
</ol>3. RNA 제자리에서 교 잡 형광 다중 분석 결과
<ol><li>따뜻한 물 욕조에 40 ° C에서 10 분 동안 대상 조사와 다음 실시간에 멋진</li>
	<li>RNA 시 장소 (예를 들어, 앰프 1-4 층)에서 실시간</li>
	<li>슬라이드 선반에 다시 흡수 성 종이와 장소 슬라이드에서 과잉 액체를 제거 ( 재료의 표참조).</li>
	<li>샘플 조각에 Drd1α 프로브 (C1)의 3 방울 (90 µ L)를 추가 합니다. 2 h 40 ° c.에 대 한 품 어</li>
	<li>워시 버퍼 x 신선한 1 실시간 반복에서 2 분 동안 세척 버퍼 x 1에 슬라이드를 잠수함.</li>
	<li>슬라이드 선반에 다시 흡수 성 종이와 장소 슬라이드에서 과잉 액체를 제거 ( 재료의 표참조).</li>
	<li>앰프 1-샘플 조각에 3 방울 (90 µ L)를 추가 합니다. 40 ° c.에 30 분 동안 품 어</li>
	<li>슬라이드 1 워시 버퍼 실시간 반복에서 2 분에 대 한 신선한 1wash 버퍼와 잠수함</li>
	<li>슬라이드 선반에 다시 흡수 성 종이와 장소 슬라이드에서 과잉 액체를 제거 ( 재료의 표참조).</li>
	<li>샘플 조각에 앰프 2 층의 3 방울 (90 µ L)를 추가 합니다. 40 ° c.에서 15 분 동안 품 어</li>
	<li>워시 버퍼 x 신선한 1 실시간 반복에서 2 분 동안 세척 버퍼 x 1에 슬라이드를 잠수함.</li>
	<li>슬라이드 선반에 다시 흡수 성 종이와 장소 슬라이드에서 과잉 액체를 제거 ( 재료의 표참조).</li>
	<li>앰프 3-샘플 조각에 3 방울 (90 µ L)를 추가 합니다. 40 ° c.에 30 분 동안 품 어</li>
	<li>워시 버퍼 x 신선한 1 실시간 반복에서 2 분 동안 세척 버퍼 x 1에 슬라이드 잠수함</li>
	<li>슬라이드 선반에 다시 흡수 성 종이와 장소 슬라이드에서 과잉 액체를 제거 ( 재료의 표참조).</li>
	<li>앰프 4-플로리다-Alt A 샘플 조각에의 3 방울 (90 µ L)를 추가 합니다. 40 ° c.에서 15 분 동안 품 어</li>
	<li>워시 버퍼 x 신선한 1 실시간 반복에서 2 분 동안 세척 버퍼 x 1에 슬라이드를 잠수함.</li>
	<li>슬라이드에서 과잉 액체를 제거 하 고 즉시 장착 시 약의 2 방울의 장소 ( 테이블의 자료를 참조) 각 섹션에.</li>
	<li>22 m m 22 m m coverslip 장소 ( 테이블의 자료를 참조) 각 뇌 섹션.</li>
	<li>건조까지 2-8 ° C에서 어둠 속에서 슬라이드를 저장 합니다.</li>
	<li>Confocal 현미경 켜고 60 X 목표 전환.</li>
	<li>Confocal 현미경으로 Z-스택 이미지를 얻을. 공초점 이미지의 세부 절차에 대 한 보충 비디오를 참조 하십시오.</li>
	<li>핵 accumbens 영역에서 셀을 표시 하는 Drd1α의 이미지 (여기: 488 nm; 방출: 515/30 nm). 참고: 섹션 인큐베이션 단계 사이 밖으로 건조 하는 두뇌를 게 하지 마십시오.</li>
</ol>4. 데이터 분석
<ol><li>반 정량적 얼룩 패턴 분석: "개별 점".<ol>
<li>이미지에서 개별 셀을 지정 하려면 DAPI 얼룩 핵 표식으로 수행 합니다. 그러나, 그것은 여전히 핵 세포의 불규칙 한 모양으로 여러 종류의 세포는 뇌 조직의 특정 부분을 분석 어렵다. 여기, 두 경험이 풍부한 연구자 별도로 각 셀 셀 영역을 정의 하는 이미지에서 할당 합니다.</li>
		<li>시각적으로 특정 조건 (그림 1B)를 사용 하 여 셀 당 도트 수에 따라 대표 confocal 이미지 내의 각 셀 점수.</li>
		<li>각 카테고리에 총 셀 수를 결정 하 고 모든 조직 단면도 (그림 2A)와 남성 및 여성에 대 한 각 범주 내에서 세포의 백분율 주파수를 표시 하는 상대 주파수 그래프를 만들 총 셀 수 x100로 나누면 별도로 (그림 2E).</li>
		<li>모든 이전 범주 내에서 셀의 합계를 별도로 셀과 남성과 여성에 대 한 모든 조직 단면도 (그림 2B)에 대 한 누적 횟수를 확인 하려면 총 셀 수 x100 나누어 (그림 2F).</li>
	</ol>
</li>
	<li>통계적으로 분석 하는 "개별 점" 얼룩 패턴 (선택 사항).<ol>
<li>여 지 없이 변수 (즉, 낮은 셀 식 (1)에서 가장 높은 셀 식 (9) 각 순위 범주에가 셀 수) 자연에 서 수를 제공 하는 셀 당 도트 수 검사 추가 통계 분석에 대 한.</li>
		<li>검사 후 기술 통계의, 세 가지 주요 방법을 사용 하 여: 벽난로-Haenszel 통계, 맨-휘트니 U 테스트 및 Kruskal-월리스 테스트. 비록 정확한 통계 접근에 의존 될 것입니다 관심, 통계 의사 결정 트리 (그림 4)의 실험 설계 및 연구 질문의 분석 방법에 관한 결정에 도움이 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>얼룩 패턴에 대 한 관심 (ROI)의 신호 강도 계량: "클러스터".<ol>
<li>다음 수식을 사용 하 여 각 이미지의 신호 강도 계산. 신호 강도 = 투자 수익 이미지-(평균 배경 강도 × 총 이미지 영역)의 총 강도</li>
		<li>셀 당 대략적인 신호 식 계산 ROI 이미지 내의 셀의 총 수를 계산 합니다. 신호 강도/이미지 셀/이미지의 수에 있는 그룹 차이 신호 식/셀에서 본 그룹 차이에 기여할 수 있는 메커니즘을 고려 하는 관심 있을 수 있습니다 (그림 3B-3D).</li>
	</ol>
</li>
	<li>"클러스터" (선택 사항) 패턴을 얼룩이 지는 통계적으로 분석 합니다.<ol>
<li>신호 식/추가 통계 분석에 대 한 연속 변수를 제공 하기 위해 셀을 검사 합니다. 독립 샘플 t-테스트 및 분산 분석 (ANOVA), 과목 사이의 요인의 수에 따라 두 가지 방법, 디자인에 포함 된 사용 합니다. 통계적 의사 결정 트리 (그림 4)는 가장 적절 한 통계적 접근에 관한 결정에 도움이 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Goldman-Rakic, P. S., Castner, S. A., Svensson, T. H., Siever, L. J., Williams, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+dopamine+D1+receptor+in+schizophrenia:+insights+for+cognitive+dysfunction.">Targeting the dopamine D1 receptor in schizophrenia: insights for cognitive dysfunction.</a> Psychopharmacology (Berl). 174 (1), 3-16 (2004).</li><li>Beaulieu, J. M., Gainetdinov, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physiology,+signaling,+and+pharmacology+of+dopamine+receptors.">The physiology, signaling, and pharmacology of dopamine receptors.</a> Pharmacol Rev. 63, 182-217 (2011).</li><li>Zahrt, J., Taylor, J. R., Mathew, R. G., Arnsten, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supranormal+stimulation+of+D1+dopamine+receptors+in+the+rodent+prefrontal+cortex+impairs+spatial+working+memory+performance.">Supranormal stimulation of D1 dopamine receptors in the rodent prefrontal cortex impairs spatial working memory performance.</a> J Neurosci. 17, 8528-8535 (1997).</li><li>Floresco, S. B., Magyar, O., Ghods-Sharifi, S., Vexelman, C., Tse, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiple+dopamine+receptor+subtypes+in+the+medial+prefrontal+cortex+of+the+rat+regulate+set-shifting.">Multiple dopamine receptor subtypes in the medial prefrontal cortex of the rat regulate set-shifting.</a> Neuropsychopharmacology. 31, 297-309 (2006).</li><li>Arnsten, A. F., Girgis, R. R., Gray, D. L., Mailman, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+dopamine+therapeutics+for+cognitive+deficits+in+schizophrenia.">Novel dopamine therapeutics for cognitive deficits in schizophrenia.</a> Biol Psychiatry. 81, 67-77 (2017).</li><li>Ellenbroek, B. A., Budde, S., Cools, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prepulse+inhibition+and+latent+inhibition:+the+role+of+dopamine+in+the+medial+prefrontal+cortex.">Prepulse inhibition and latent inhibition: the role of dopamine in the medial prefrontal cortex.</a> Neuroscience. 75 (2), 535-542 (1996).</li><li>Parker, K. L., Alberico, S. L., Miller, A. D., Narayanan, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prefrontal+D1+dopamine+signaling+is+necessary+for+temporal+expectation+during+reaction+time+performance.">Prefrontal D1 dopamine signaling is necessary for temporal expectation during reaction time performance.</a> Neuroscience. 255, 246-254 (2013).</li><li>Manduca, A., Servadio, M., Damsteegt, R., Campolongo, P., Vanderschuren, L. J., Trezza, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopaminergic+Neurotransmission+in+the+Nucleus+Accumbens+Modulates+Social+Play+Behavior+in+Rats.">Dopaminergic Neurotransmission in the Nucleus Accumbens Modulates Social Play Behavior in Rats.</a> Neuropsychopharmacology. 41 (9), 2215-2223 (2016).</li><li>Okubo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+prefrontal+dopamine+D1+receptors+in+schizophrenia+revealed+by+PET.">Decreased prefrontal dopamine D1 receptors in schizophrenia revealed by PET.</a> Nature. 385 (6617), 634-636 (1997).</li><li>Abi-Dargham, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prefrontal+dopamine+D1+receptors+and+working+memory+in+schizophrenia.">Prefrontal dopamine D1 receptors and working memory in schizophrenia.</a> J Neurosci. 22 (9), 3708-3719 (2002).</li><li>Shinohara, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dopamine+D1+receptor+subtype+mediates+acute+stress-induced+dendritic+growth+in+excitatory+neurons+of+the+medial+prefrontal+cortex+and+contributes+to+suppression+of+stress+susceptibility+in+mice.">Dopamine D1 receptor subtype mediates acute stress-induced dendritic growth in excitatory neurons of the medial prefrontal cortex and contributes to suppression of stress susceptibility in mice.</a> Mol Psychiatry. 19, (2017).</li><li>Okubo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decreased+prefrontal+dopamine+D1+receptors+in+schizophrenia+revealed+by+PET.">Decreased prefrontal dopamine D1 receptors in schizophrenia revealed by PET.</a> Nature. 385, 634-636 (1997).</li><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAscope:+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed,+paraffin-embedded+tissues.">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> J Mol Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).</li><li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The rat brain in stereotaxic coordinates. , (2014).</li></ol>

선언 하는 관심의 없습니다 충돌을 확인 하 고 있습니다.

이 프로토콜에 우리가 현장에서 교 잡 신선한 냉동 두뇌 분할 영역 핵 accumbens (NAc)에 Drd1α 수용 체 식과 티로신 hydroxylase (TH) 식 substantia nigra (SNR) 지역에서 평가 하의 소설 기법을 설명 합니다. 우리는 또한 다른 얼룩 패턴에 대 한 데이터 분석의 방법 제공: "개별 점" 또는 "클러스터".
교 잡 시험 현장에서 성공적인 멀티플렉스 형광 RNA에 대 한 중요 한 단계가 포함 되어 있습니다. 일단 목이 쥐 그리고 두뇌 제거 액체 질소 5 분 이내에 뇌 동결 4 %paraformaldehyde 고정까지-20 ° C에서 뇌 섹션을 유지. 전처리 4의 외피의 30 분 후 슬라이드 15 분 이상 1 x PBS에 체류 하지 해야 합니다. 뇌를 섹션 증폭 단계 사이 밖으로 건조 하지 마십시오. Confocal 영상 보여주는 명확한 얼룩 신호 조직 샘플에서 높은 품질의 이미지를 제공 하는 매우 도움이 됩니다. 교 잡 오븐을 사용 하 여 신속 하 고 효율적으로 나타납니다 샘플을 40 ° c
NAc에 Drd1α 수용 체 식의 개별 형광 신호는 단일 "점," 각각 나타내는 셀 내의 단일 RNA 사본으로 확인 되었다. 중요 한 것은, "점" 크기 차이 분석 결과 조건에서 샘플 준비, 및 다른 요인 보다는 Drd1α RNA 식 수준을 반영합니다. 마찬가지로, 개별 "점"의 신호 강도 Drd1α RNA 식 수준에 무관 하다. 우리 반 정량 분석 "0-9로" 범위 Drd1α 식에 대 한 가변성을 평가할 수 있는 셀 당 도트 수에 따라 득점으로이 식의 동적 범위를 평가 합니다. 게다가, 셀 당 도트 수의 검사 추가 통계 분석을 위한 범주 변수를 제공 한다.
기술 통계의 시험에 따라 우리의 프로토콜 통계적으로 제시 "개별 점" 추가 분석에 대 한 서 수 변수를 제공 하는 패턴을 얼룩이 지는 신호를 분석 하 세 가지 주요 방법을 권장 합니다. 특히, 비패라메트릭 맨-휘트니 U 테스트, 비패라메트릭 Kruskal-월리스 테스트 및 협회의 벽로 선반-Haenszel 테스트는 것이 좋습니다. 맨-휘트니 U 테스트 및 Kruskal-월리스 테스트 때 단 하나 검사 사이-주제 요소 (예: 성) 가장 적합 하다. 또한, 협회의 벽로 선반-Haenszel 테스트 분포의 변화를 조사 하기 위한 적절 한 수 있습니다. 더 복잡 한 통계 분석, 일반화 추정 방정식 또는 일반 선형 혼합된 모델을 포함 하 여 수 있습니다 적절 한 추가 요소가 포함 되어 있습니다. 권고는 철저 한, 그리고 정확한 통계 접근 실험 설계 및 관심의 연구 질문에 종속 됩니다.
그러나, 성적 증명서의 복사본 수 매우 높은 경우에는 신호 클러스터로 나타날 수 있습니다. 여기, SNR 지역에서 일 식을 "클러스터" 얼룩 패턴을 보여주었다. 높은 표현 일 마커를 계량, 우리는 이미지 강도 평균 배경 강도 위에 최소 강도 임계값 설정에 따라 고로 목의 셀 마다 신호 분석 조정 독립을 사용 하 여 snr, TH를 통계적으로 분석할 수 같은 얼룩 패턴, "클러스터"를 제공 하는 신호 샘플 t-테스트 또는 그룹을 비교 하려면 ANOVA.
이 소설 RNA 제자리에서 교 잡의 분석 결과의 한계가 있다. "이산 점" 얼룩 패턴, 이러한 개별 셀을 더 정확 하 게 정의 하는 방법을 포함 합니다. 우리의 연구에서 이미지에서 개별 셀을 식별 하기 위해 우리가 수행 DAPI 핵 표식으로 얼룩. 그러나, 그것은 여전히 핵 세포의 불규칙 한 형태와 여러 종류의 세포는 뇌 조직의 특정 부분을 분석 어렵다. 여기, 두 경험이 풍부한 연구자 별도로 각 셀 셀 영역을 정의 하는 이미지에서 할당 합니다. "클러스터" 얼룩 패턴, 특정 소프트웨어 설정 임계값 또는 자동 셀 recognization 선택 되어야 한다.
따라서, 혁신적인 RNA 제자리에서 교 잡 분석 결과 우리 모두 다 통풍 관 및 다 출시 동시에 영향을 미치는, striatal 다 시스템의 복잡성의 이해를 개선 하는 메커니즘을 조사를 활성화. 전반적으로, 출현 및 뇌 질환의 진행 하는 동안 dopaminergic 표식에 역 기능 변화를 조사할 때 연구원은 교 잡 기술을 현장에서 새로운 RNA에서 혜택 것 이다.

부전 striatal 도파민 시스템의 여러 neurocognitive 질병에서 관찰 하는 임상 증상의 진행에 포함 된다. 도파민 D1 수용 체는 두뇌의 전 두 엽 피 질 (PFC) 지역과 striatal에 존재 하 고 무 겁 게 영향 인지 프로세스1, 작동 메모리, 시간 처리, 및 기관차 동작2,3 등 , 4 , 5 , 6 , 7. 이전 연구는 도파민 D1 수용 체의 변화 주의 적자 과다 장애 (ADHD)8, 정신 분열 증9, 에 neurocognitive 증상의 진행과 관련 된 했다 해명 10 , 스트레스 감수 성11. 특히, 정신 분열 증, 양전자 방출 단층 촬영 (PET) 연구 엽 외피가 있는 도파민 D1 수용 체의 바인딩을 능력 높은 인식 적자와 부정적인 증상11의 존재에 관련 된 표시. 전 두 엽 피 질 도파민 D1 수용 체에 의해 통제에서 흥분 성의 뉴런의 수지상 성장 스트레스 민감성을 완화 한다. 또한, 내측 전 두 엽 피 질 (mPFC) 신경 수용 체 D1의 최저 사회 패배 스트레스로 사회적 회피12향상 시킬 수 있습니다.
여기, RNA 교 잡 제자리에서 신선한-냉동 조직 샘플 셀에 단일 RNA 분자를 시각화의 새로운 기술을 소개 합니다. 현재 기술은 현재 문학 내에서 존재 하는 방법에 비해 여러 장점이 있습니다. 첫째, 현재 프로시저는 조직의 공간 및 형태학 컨텍스트를 유지 하 고 신선한 요구 하는 다른 절차, 조직에 포함 되지 않은 현재 방법으로 결합 될 수 있습니다 있도록 신선한 냉동 조직 샘플에서 수행 되었다. 포 르 말린 고정 및 파라핀 끼워 넣어진 조직에 유사한 절차는 단일 전송 해상도는 RNA 제자리에서 교 잡 기술은13를 사용 하 여 달성 될 수 있다 설명 했다. 우수한 감도 낮은 복사 번호 식으로 다른 핵 산 탐지 방법으로 얻을 수 없는 개별 셀 수준에서 유전자 발현을 비교 하는 기회를 제공 하는 단일 전사 수준에서 RNA의 검출 같은 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 기술. 현재 메서드의 단일 대상 RNA 사본에 때 교배 하 고 순차적으로 신호 증폭 분자 검출에의 묶인 매우 구체적인 RNA 프로브를 통해 높은 신호 대 잡음 비율을 사용 하 여 이미지를 유지 하는 또한, 시스템입니다. 마지막으로, 현재 기술 우리의 조사 시스템 관련 마커 단백질에 의해 감지와 같은 단 하나의 클래스를 제한 하는 것 보다는 그것의 특정 대상 독점 프로브, 여러 생물 학적 시스템을 평가 하는 기회 제공 immunohistochemistry 방법입니다.
우리의 연구에서 우리 둘 다 남성과 여성 F344/N 쥐의 핵 accumbens (NAc)에 Drd1α 수용 체 식과 티로신 hydroxylase (TH) 식 substantia nigra (SNR)에서 평가를이 소설 RNA 제자리에서 교 잡 사용. 교 잡 제자리에서 혁신적인 RNA 우리 모두 다 통풍 관 및 다 출시 동시에 영향을 미치는, striatal 다 시스템의 복잡성에 대 한 우리의 이해를 향상 시키는 메커니즘을 조사를 활성화. 신선한 냉동 뇌 조각 및 다른 얼룩 패턴에 대 한 데이터 분석의 방법 제공 절차, 설명: "개별 점" 또는 "클러스터".

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="857">
	<tbody>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:329px;">HybEZ Oven system</td>
			<td style="width:205px;">Advanced Cell Diagnostics&#160;</td>
			<td style="width:135px;">310010</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">RNAscope Probe - Rn-Drd1a</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics&#160;</td>
			<td>317031</td>
			<td>Color channel 1, Green</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">RNAscope Probe - Rn-Th-C2</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics&#160;</td>
			<td>314651-C2</td>
			<td>Color channel 2, Orange</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">RNAscope Fluorescent Multiplex Reagent Kit</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics&#160;</td>
			<td>320850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen</td>
			<td>Vector Laboratory</td>
			<td>H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">SuperFrost Plus Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-154%&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">4% paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Sevoflurane</td>
			<td>Merritt Veterinary Supply</td>
			<td>347075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Tissue-Tek vertical 24 slide rack</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9837976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Tissue-Tek staining dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC0731403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;">Precision General Purpose Baths</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>TSGP28</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:329px;">Pretreatment 4</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics&#160;</td>
			<td>320850</td>
			<td>parts of kits</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:329px;">ProLong Gold anti-fade reagent</td>
			<td style="width:205px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:135px;">P36930</td>
			<td style="width:188px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:329px;">Amp 1-FL</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics&#160;</td>
			<td>320850</td>
			<td>parts of kits</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:329px;">Amp 2-FL</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics&#160;</td>
			<td>320850</td>
			<td>parts of kits</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:329px;">Amp 3-FL</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics&#160;</td>
			<td>320850</td>
			<td>parts of kits</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:329px;">Amp 4-FL-Alt A</td>
			<td>Advanced Cell Diagnostics&#160;</td>
			<td>320850</td>
			<td>parts of kits</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:329px;">EZ-C1 software package</td>
			<td style="width:205px;">Nikon Instruments</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td>version 3.81b</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:329px;">SAS/STAT Software</td>
			<td style="width:205px;">SAS Institute, Inc.,</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td>version 9.4</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

identification of dopamine d1-alpha receptor within rodent nucleus accumbens by an innovative rna in situ detection technology

중앙 신경 조직에서 D1-알파 하위 수용 체 (Drd1α)은 가장 풍부한 도파민 (DA) 수용 체, 조절 신경 성장 및 개발에 중요 한 역할을. 그러나, Drd1α 수용 체 이상 행동 응답을 중재 하 고 변조 작업 메모리 기능을 기본 메커니즘을 아직 명확 하지 않다. 새로운 RNA 제자리에서 교 잡 분석 결과 사용 하 여, 현재 연구 식별 도파민 Drd1α 수용 체와 티로신 hydroxylase (TH) RNA 식 핵 accumbens (NAc) 지역과 substantia nigra 지역 (SNR)에 다 관련 회로에서 각각. Drd1α 식은 NAc에 얼룩 패턴 "개별 점"을 보여줍니다. 분명 성 다름 Drd1α 식에서 관찰 되었다. 반면, 일 "클러스터 된" 얼룩 패턴을 보여 줍니다. 일 식에 관한 여성 쥐 남성 동물을 기준으로 셀 당 더 높은 신호 식 표시. 여기에 제시 된 방법을 중앙 신 경계 질환의 진행 하는 동안 변경 내용을 도파민 시스템 장애에서를 조사 소설 현장에서 교 잡 기술을 제공 합니다.

현재의 연구는 관찰 F344/N 쥐 (그림 1A)에서 NAc의 도파민 D1-알파 수용 체 (Drd1α)에서 RNA 식에 대 한 패턴을 얼룩이 지기 "개별 점". 개별 형광 신호 쉽게 확인 하 고 각 셀 내에 단일 RNA 사본을 나타내는 단일 "점"으로 볼 수 있습니다. "이산 점 들" 얼룩 패턴을 표시 하는 NAc에서 이미지에 대 한 우리 반 정량 분석 (그림 1A, 그림 2A및 2B)를 사용 하 여 식의 동적 범위를 평가 합니다. 각 셀은 "0-9에서" 셀 당 도트 수에 따라 득점 했다. 이 "교배 신호"-점수 (H 점수) 방법 따라서 평가할 수 범위와 변화 Drd1α 식에 대 한 개별 셀에 걸쳐.
"이산 점" 얼룩 패턴에 대 한 반 양적 접근 범주 변수를 추가 통계 분석에 대 한 (즉, 셀에서 가장 낮은 순위 (1) 최고 (9) 당 도트 수)를 자연 속에서 서 수를 제공 합니다. 현재 연구에서 우리는 NAc에 Drd1α 식에 한 과목 사이의 요소 (즉, 섹스)의 효과 검사에 관심이 있었다. 중첩 된 데이터 구조 (즉, NAc에 셀을 표시 하는 Drd1α의 2 개의 Z 스택 이미지 각 동물에 대 한 가져온)에 대 한 계정, 평균 개수 값 각 범주에 대 한 계산 되었고 통계 분석을 위해 사용 (남성: n= 3, 여성: n = 3). 맨-휘트니 U 2 개 그룹 (즉, 남성, 여성)와 한 사이 주제 요소 (즉, 섹스)에 차이 검사에 우리의 관심을 감안할 때 테스트 중간 셀 수 (그림 2D)에 차이 평가 하기 위해 실시 됐다. 맨-휘트니 U 테스트 남성 동물 상대적인 감소 중간 셀 점수를 표시 하는 여성 동물과 섹스 [z= 5.8 p≤0.001]의 중요 한 주 효과를 밝혔다. 두 가지 방법을 사용 하 여 각 카테고리에 셀의 주파수를 설명 하는 그림 2E 와 2F : 상대적인 주파수 및 누적 주파수. 여성 동물 남성 동물에 상대적으로 낮은 순서 카테고리에 셀의 큰 주파수 분포에 상당한 변화를 표시. 협회의 벽로 선반-Haenszel 테스트 통계적으로 섹스의 중요 한 효과 공개 배포 검사 실시 [χ2수소(1) 67.3, p≤0.001 =]. 따라서, 전반적으로, 결과 NAc에 Drd1α 식에서 분명 섹스 차이 건의 한다.
성적 증명서의 복사본 수 매우 높은 경우에는 신호 클러스터로 나타날 수 있습니다. 여기, 티로신 hydroxylase 식 (TH) SNR 지역에서 "클러스터" 얼룩 패턴 (그림 3A) 보여주었다. 이 높은 표현 마커를 계량, 우리는 먼저 배경 강도 8 개의 다른 배경 분야에서 평균. 평균 배경 강도 위에 최소 강도 임계값을 설정한 후 조정된 이미지 강도으로 목의 셀 마다 신호 분석
검사 한 주제 사이 요소 (즉, 섹스)에 우리의 관심을 감안할 때, 독립 샘플 t-테스트는 적절 한 통계적 접근 이다. 분석을 위해 데이터 로그 변환 했다. 중첩 된 데이터 구조 (즉, SNR에 세포 분류의 2 개의 Z 스택 이미지 각 동물에 대 한 가져온)에 대 한 계정, 평균값 계산 되었고 통계 분석을 위해 사용 (남성: n= 2, 여성: n= 3). 여성 동물 평균 신호 강도 (그림 3B), 남성 동물 기준으로 총 목 식의 높은 수준의 암시에 상당한 증가 표시 (t(3) = 3.3, p0.05). 그러나, 중요 한 섹스 차이가 관찰 되었다에 이미지 당 셀 수 (t(3) = 2.0, p> 0.05; 그림 3C) 또는 셀 당 식 신호 평균 (t(3) = 2.0, p> 0.05; 그림 3D)입니다. 혼합 디자인 ANOVA, 주제 내 요인으로 세 가지 조치를 고려 하 고 또한 섹스의 중요 한 주요 효과 밝혀 [F (1, 3) 10.6, p0.05 =].
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57444/57444fig1.jpg"> 그림 1: 얼룩 패턴에 대 한 셀 당 점의 평균 수에 반 정량 분석의 기준: "개별 점". A. 대표적인 confocal 이미지 (60 X) 다른 점수에 Drd1α 식의 (원래 사진 크기를 기준으로 250% 규모 증폭) 2. 특정 "점수" 범주 각 기준에 대 한. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57444/57444fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57444/57444fig2.jpg"> 그림 2: F344/N 쥐의 핵 Accumbens 지역에서 도파민 D1-알파 수용 체 (Drd1α) RNA 수준. A. 각 "점수" 카테고리의 상대 주파수 %. B. 자형 복용량 응답 곡선 제공 설명된 잘 맞는 (r2= 0.99) 95% 신뢰 간격 (CI; 점선으로 표시)의 각 "점수" 카테고리의 누적 빈도 %를 맞게 되었다. C. 대표 confocal (60 X)의 이미지는 "이산 점 들" 얼룩 패턴 남성 및 여성 쥐에 Drd1α 식. 남성 및 여성 쥐에 있는 평균 셀 점수 D. 대표 그래프. 오차 막대 (SEM)의 표준 오차를 뜻한다. E. 비교 컷과 여성 쥐에서 조직에 식 각 "점수" 카테고리의 상대 주파수 %. F. 자형 복용량 응답 곡선이 제공 설명된 잘 맞는 (r2s = 0.99) 남성과 여성 쥐 사이 각 "점수" 카테고리의 누적 빈도 %를 95% 신뢰 간격. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57444/57444fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57444/57444fig3.jpg"> 그림 3: F344/N 쥐에 Substantia Nigra (SNR) 지역에서 티로신 hydroxylase RNA 수준 (TH). A. 대표적인 confocal 이미지 (60 X; 여기: 543 nm; 방출: 590/50 nm) 표현의 일 남성 및 여성 쥐에 있는 "클러스터" 얼룩 패턴. B-디. 셀 마다 신호 강렬의 대표적인 분석입니다. 신호 식 / 셀 (배경 위의 강도 임계값 설정)와 이미지의 신호 강도 측정 하 고 이미지 내의 셀의 숫자로 그것을 나누어에서 파생 될 수 있다. 오차 막대는 평균 (SEM)의 표준 오차를 나타냅니다. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57444/57444fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57444/57444fig4.jpg"> 그림 4: 권장된 통계 분석에 대 한 진단트리. 의사 결정 트리는 통계 분석의 연구 질문에 대 한 가장 적절 한 결정에 대 한 지침을 제공 합니다. 의사 결정 트리는 철저 하 고 경우에 따라 다른 분석 적절 한 수 있습니다. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57444/57444fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology

탐지 기술 현장에서 혁신적인 RNA에 의해 설치류 핵 Accumbens에서 도파민 D1-알파 수용 체의 식별

핵 accumbens에 있는 도파민 D1-알파 수용 체의 식별은 중앙 신 경계 질환 중 D1 수용 체 역 기능을 명확히 중요 합니다. 우리는 새로운 RNA 제자리에서 교 잡 분석 결과 시각화 특정 뇌 영역에 하나의 RNA 분자를 수행.

In the central nervous system, the D1-alpha subtype receptor (Drd1&#945;) is the most abundant dopamine (DA) receptor, which plays a vital role in ...

identification-dopamine-d1-alpha-receptor-within-rodent-nucleus

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Identification of Dopamine D1-Alpha Receptor Within Rodent Nucleus Accumbens by an Innovative RNA In Situ Detection Technology

8.5K 조회수.  University of South Carolina. 핵 accumbens에 있는 도파민 D1-알파 수용 체의 식별은 중앙 신 경계 질환 중 D1 수용 체 역 기능을 명확히 중요 합니다. 우리는 새로운 RNA 제자리에서 교 잡 분석 결과 시각화 특정 뇌 영역에 하나의 RNA 분자를 수행.

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Simultaneous fMRI and Electrophysiology in the Rodent Brain

To examine the neural basis of the blood oxygenation level dependent (BOLD) magnetic resonance imaging (MRI) signal, we have developed a rodent model in which functional MRI data and in vivo intracortical recording can be performed simultaneously. The combination of MRI and electrical recording is technically challenging because the electrodes used for recording distort the MRI images and the MRI acquisition induces noise in the electrical recording. To minimize the mutual interference of the two modalities, glass microelectrodes were used rather than metal and a noise removal algorithm was implemented for the electrophysiology data. In our studies, two microelectrodes were separately implanted in bilateral primary somatosensory cortices (SI) of the rat and fixed in place. One coronal slice covering the electrode tips was selected for functional MRI. Electrode shafts and fixation positions were not included in the image slice to avoid imaging artifacts. The removed scalp was replaced with toothpaste to reduce susceptibility mismatch and prevent Gibbs ringing artifacts in the images. The artifact structure induced in the electrical recordings by the rapidly-switching magnetic fields during image acquisition was characterized by averaging all cycles of scans for each run. The noise structure during imaging was then subtracted from original recordings. The denoised time courses were then used for further analysis in combination with the fMRI data. As an example, the simultaneous acquisition was used to determine the relationship between spontaneous fMRI BOLD signals and band-limited intracortical electrical activity. Simultaneous fMRI and electrophysiological recording in the rodent will provide a platform for many exciting applications in neuroscience in addition to elucidating the relationship between the fMRI BOLD signal and neuronal activity.

We have developed a method for simultaneous functional magnetic resonance imaging and electrophysiological recording in the rodent brain, providing a platform for the investigation of the relationship between neural activity and the blood oxygenation level dependent (BOLD) MRI signal.

쥐 두뇌에 동시 fMRI와 전기 생리학

To examine the neural basis of the blood oxygenation level dependent (BOLD) magnetic resonance imaging (MRI) signal, we have developed a rodent model in ...

연구

신경과학

VisioTracker, an Innovative Automated Approach to Oculomotor Analysis

Investigations into the visual system development and function necessitate quantifiable behavioral models of visual performance that are easy to elicit, robust, and simple to manipulate. A suitable model has been found in the optokinetic response (OKR), a reflexive behavior present in all vertebrates due to its high selection value. The OKR involves slow stimulus-following movements of eyes alternated with rapid resetting saccades. The measurement of this behavior is easily carried out in zebrafish larvae, due to its early and stable onset (fully developed after 96 hours post fertilization (hpf)), and benefitting from the thorough knowledge about zebrafish genetics, for decades one of the favored model organisms in this field. Meanwhile the analysis of similar mechanisms in adult fish has gained importance, particularly for pharmacological and toxicological applications.
Here we describe VisioTracker, a fully automated, high-throughput system for quantitative analysis of visual performance. The system is based on research carried out in the group of Prof. Stephan Neuhauss and was re-designed by TSE Systems. It consists of an immobilizing device for small fish monitored by a high-quality video camera equipped with a high-resolution zoom lens. The fish container is surrounded by a drum screen, upon which computer-generated stimulus patterns can be projected. Eye movements are recorded and automatically analyzed by the VisioTracker software package in real time.
Data analysis enables immediate recognition of parameters such as slow and fast phase duration, movement cycle frequency, slow-phase gain, visual acuity, and contrast sensitivity.
Typical results allow for example the rapid identification of visual system mutants that show no apparent alteration in wild type morphology, or the determination of quantitative effects of pharmacological or toxic and mutagenic agents on visual system performance.

The VisioTracker is an automated system for the quantitative analysis of visual performance of larval and small adult fish based on the recording of eye movements. It features full control over visual stimulus properties and real-time analysis, enabling high-throughput research in fields such as visual system development and function, pharmacology, neural circuit studies and sensorimotor integration.

VisioTracker, 눈 돌림 분석에 대한 혁신적인 자동화 된 접근

Investigations into the visual system development and function necessitate quantifiable behavioral models of visual performance that are easy to elicit, ...

Direct Intraventricular Delivery of Drugs to the Rodent Central Nervous System

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses specifically on antisense oligonucleotides (ASOs), though the techniques shown in the video here can also be used to deliver a plethora of other drugs to the CNS. Antisense oligonucleotides (ASOs) have the capability to knockdown sequence-specific targets 1 as well as shift isoform ratios of specific genes 2. To achieve widespread gene knockdown or splicing in the CNS of mice, the ASOs can be delivered into the brain using two separate routes of administration, both of which we demonstrate in the video.
The first uses Alzet osmotic pumps, connected to a catheter that is surgically implanted into the lateral ventricle. This allows the ASOs to be continuously infused into the CNS for a designated period of time. The second involves a single bolus injection of a high concentration of ASO into the right lateral ventricle. Both methods use the mouse cerebral ventricular system to deliver the ASO to the entire brain and spinal cord, though depending on the needs of the study, one method may be preferred over the other.

We describe a method to target drugs to the central nervous system by either implanting a catheter or performing a bolus injection into the right lateral ventricle in mice. We focus specifically on the delivery of antisense oligonucleotides. This technique is readily adaptable to other drugs and to rats.

Due to an inability to cross the blood brain barrier, certain drugs need to be directly delivered into the central nervous system (CNS). Our lab focuses ...

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

Single cell codetection of a gene, its RNA product and cellular regulatory proteins is critical to study gene expression regulation. This is a challenge in the field of virology; in particular for nuclear-replicating persistent DNA viruses that involve animal models for their study. Herpes simplex virus type 1 (HSV-1) establishes a life-long latent infection in peripheral neurons. Latent virus serves as reservoir, from which it reactivates and induces a new herpetic episode. The cell biology of HSV-1 latency remains poorly understood, in part due to the lack of methods to detect HSV-1 genomes in situ in animal models. We describe a DNA-fluorescent in situ hybridization (FISH) approach efficiently detecting low-copy viral genomes within sections of neuronal tissues from infected animal models. The method relies on heat-based antigen unmasking, and directly labeled home-made DNA probes, or commercially available probes. We developed a triple staining approach, combining DNA-FISH with RNA-FISH&#160;and immunofluorescence, using peroxidase based signal amplification to accommodate each staining requirement. A major improvement is the ability to obtain, within 10 &#181;m tissue sections, low-background signals that can be imaged at high resolution by confocal microscopy and wide-field conventional epifluorescence. Additionally, the triple staining worked with a wide range of antibodies directed against cellular and viral proteins. The complete protocol takes 2.5 days to accommodate antibody and probe penetration within the tissue.

Detection of the Genome and Transcripts of a Persistent DNA Virus in Neuronal Tissues by Fluorescent In situ Hybridization Combined with Immunostaining

We established a fluorescent in situ hybridization protocol for the detection of a persistent DNA virus genome within tissue sections of animal models. This protocol enables studying infection process by codetection of the viral genome, its RNA products, and viral or cellular proteins within single cells.

형광에 의한 신경 조직의 영구 DNA 바이러스의 게놈 및 성적 증명서의 검출 현장에서 하이브리드 면역 염색과 결합

Single cell codetection of a gene, its RNA product and cellular regulatory proteins is critical to study gene expression regulation. This is a challenge ...

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for maintenance, repair or neurodegeneration in postdevelopmental periods. High throughput analyses have recently revealed that axons have a more dynamic and complex transcriptome than previously expected. These analysis, however have been mostly done in cultured neurons where axons can be isolated from the somato-dendritic compartments. It is virtually impossible to achieve such isolation in whole tissues in vivo. Thus, in order to verify the recruitment of mRNAs and their functional relevance in a whole animal, transcriptome analyses should ideally be combined with techniques that allow the visualization of mRNAs in situ. Recently, novel ISH technologies that detect RNAs at a single-molecule level have been developed. This is especially important when analyzing the subcellular localization of mRNA, since localized RNAs are typically found at low levels. Here we describe two protocols for the detection of axonally-localized mRNAs using a novel ultrasensitive RNA ISH technology. We have combined RNAscope ISH with axonal counterstain using fluorescence immunohistochemistry or histological dyes to verify the recruitment of Atf4 mRNA to axons in vivo in the mature mouse and human brains.

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

RNA in situ hybridization (ISH) enables the visualization of RNAs in cells and tissues. Here we show how combination of RNAscope ISH with immunohistochemistry or histological dyes can be successfully used to detect mRNAs localized to axons in sections of mouse and human brains.

고해상도를 사용하여 뇌 섹션에서 Axonally 지역화 된 mRNA를 검출<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for ...

Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model

Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the gold-standard experimental model to study basic neurophysiological mechanisms involved in the formation and maintenance of neuronal cell assemblies. However, in vitro studies have been limited to the recording of the electrophysiological activity generated by bi-dimensional (2D) neural networks. Nonetheless, given the intricate relationship between structure and dynamics, a significant improvement is necessary to investigate the formation and the developing dynamics of three-dimensional (3D) networks. In this work, a novel experimental platform in which 3D hippocampal or cortical networks are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are realized by seeding neurons in a scaffold constituted of glass microbeads (30-40 &#181;m in diameter) on which neurons are able to grow and form complex interconnected 3D assemblies. In this way, it is possible to design engineered 3D networks made up of 5-8 layers with an expected final cell density. The increasing complexity in the morphological organization of the 3D assembly induces an enhancement of the electrophysiological patterns displayed by this type of networks. Compared with the standard 2D networks, where highly stereotyped bursting activity emerges, the 3D structure alters the bursting activity in terms of duration and frequency, as well as it allows observation of more random spiking activity. In this sense, the developed 3D model more closely resembles in vivo neural networks.

Interfacing 3D Engineered Neuronal Cultures to Micro-Electrode Arrays: An Innovative In Vitro Experimental Model

In this work, a novel experimental model in which 3D neuronal cultures are coupled to planar Micro-Electrode Arrays (MEAs) is presented. 3D networks are built by seeding neurons in a scaffold made up of glass microbeads on which neurons grow and form interconnected 3D structures.

마이크로 전극 배열에 3D 엔지니어링의 연결을 문화의 인터페이스 : 혁신을<em&gt; 체외</em&gt; 실험 모델

Currently, large-scale networks derived from dissociated neurons growing and developing in vitro on extracellular micro-transducer devices are the ...

Reliable Identification of Living Dopaminergic Neurons in Midbrain Cultures Using RNA Sequencing and TH-promoter-driven eGFP Expression

In Parkinson&#39;s Disease (PD) there is widespread neuronal loss throughout the brain with pronounced degeneration of dopaminergic neurons in the SNc, leading to bradykinesia, rigidity, and tremor. The identification of living dopaminergic neurons in primary Ventral Mesencephalic (VM) cultures using a fluorescent marker provides an alternative way to study the selective vulnerability of these neurons without relying on the immunostaining of fixed cells. Here, we isolate, dissociate, and culture mouse VM neurons for 3 weeks. We then identify dopaminergic neurons in the cultures using eGFP fluorescence (driven by a Tyrosine Hydroxylase (TH) promoter). Individual neurons are harvested into microcentrifuge tubes using glass micropipettes. Next, we lyse the harvested cells, and conduct cDNA synthesis and transposon-mediated &#34;tagmentation&#34; to produce single cell RNA-Seq libraries1,2,3,4,5. After passing a quality-control check, single-cell libraries are sequenced and subsequent analysis is carried out to measure gene expression. We report transcriptome results for individual dopaminergic and GABAergic neurons isolated from midbrain cultures. We report that 100% of the live TH-eGFP cells that were harvested and sequenced were dopaminergic neurons. These techniques will have widespread applications in neuroscience and molecular biology.

In Parkinson&#39;s Disease (PD), Substantia Nigra (SNc) dopaminergic neurons degenerate, leading to motor dysfunction. Here we report a protocol for culturing ventral midbrain neurons from a mouse expressing eGFP driven by a Tyrosine Hydroxylase (TH) promoter sequence, harvesting individual fluorescent neurons from the cultures, and measuring their transcriptome using RNA-seq.

RNA 시퀀싱 및 TH-프로모터 중심 eGFP는 표현을 사용하여 중간 뇌 문화에서 생활 도파민 뉴런의 신뢰성 확인

In Parkinson&#39;s Disease (PD) there is widespread neuronal loss throughout the brain with pronounced degeneration of dopaminergic neurons in the SNc, ...

Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

Insects have evolved sophisticated olfactory reception systems to sense exogenous chemical signals. These chemical signals are transduced by Olfactory Receptor Neurons (ORNs) housed in hair-like structures, called chemosensilla, of the antennae. On the ORNs&#39; membranes, Odorant Receptors (ORs) are believed to be involved in odor coding. Thus, being able to identify genes localized to the ORNs is necessary to recognize OR genes, and provides a fundamental basis for further functional in situ studies. The RNA expression levels of specific ORs in insect antennae are very low, and preserving insect tissue for histology is challenging. Thus, it is difficult to localize an OR to a specific type of sensilla using RNA in situ hybridization. In this paper, a detailed and highly effective RNA in situ hybridization protocol particularly for lowly expressed OR genes of insects, is introduced. In addition, a specific OR gene was identified by conducting double-color fluorescent in situ hybridization experiments using a co-expressing receptor gene, Orco, as a marker.

Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

This paper describes a detailed and highly effective RNA in situ hybridization protocol particularly for low-level expressed Odorant Receptor (OR) genes, as well as other genes, in insect antennae using digoxigenin (DIG)-labeled or biotin-labeled probes.

RNA에 의한 Locust Antenna 내의 악취 수용체 유전자의 국산화<em&gt; 현장에서</em&gt; 하이브리드 화

Insects have evolved sophisticated olfactory reception systems to sense exogenous chemical signals. These chemical signals are transduced by Olfactory ...

Assessment of Dopaminergic Homeostasis in Mice by Use of High-performance Liquid Chromatography Analysis and Synaptosomal Dopamine Uptake

Dopamine (DA) is a modulatory neurotransmitter controlling motor activity, reward processes and cognitive function. Impairment of dopaminergic (DAergic) neurotransmission is strongly associated with several central nervous system-associated diseases such as Parkinson&#39;s disease, attention-deficit-hyperactivity disorder and drug addiction1,2,3,4. Delineating disease mechanisms involving DA imbalance is critically dependent on animal models to mimic aspects of the diseases, and thus protocols that assess specific parts of the DA homeostasis are important to provide novel insights and possible therapeutic targets for these diseases.
Here, we present two useful experimental protocols that when combined provide a functional read-out of the DAergic system in mice. Biochemical and functional parameters on DA homeostasis are obtained through assessment of DA levels and dopamine transporter (DAT) functionality5. When investigating the DA system, the ability to reliably measure endogenous levels of DA from adult brain is essential. Therefore, we present how to perform high-performance liquid chromatography (HPLC) on brain tissue from mice to determine levels of DA. We perform the experiment on tissue from dorsal striatum (dStr) and nucleus accumbens (NAc), but the method is also suitable for other DA-innervated brain areas.
DAT is essential for reuptake of DA into the presynaptic terminal, thereby controlling the temporal and spatial activity of released DA. Knowing the levels and functionality of DAT in the striatum is of major importance when assessing DA homeostasis. Here, we provide a protocol that allows to simultaneously deduce information on surface levels and function using a synaptosomal6 DA uptake assay.
Current methods combined with standard immunoblotting protocols provide the researcher with relevant tools to characterize the DAergic system.

Synaptosomal dopamine uptake and high-performance liquid chromatography analysis represent experimental tools to investigate dopamine homeostasis in mice by assessing the function of the dopamine transporter and levels of dopamine in striatal tissue, respectively. Here we present protocols to measure dopamine tissue content and assess the functionality of the dopamine transporter.

고성능 액체 크로마토그래피 분석 및 Synaptosomal 도파민 통풍 관의 사용에 의해 쥐에서 Dopaminergic 항상성의 평가

Dopamine (DA) is a modulatory neurotransmitter controlling motor activity, reward processes and cognitive function. Impairment of dopaminergic (DAergic) ...

Isolation of Adult Spinal Cord Nuclei for Massively Parallel Single-nucleus RNA Sequencing

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a powerful tool for studying transcriptional profiles of cells, particularly in heterogeneous tissues such as the central nervous system. However, dissociation methods required for single cell sequencing can lead to experimental changes in the gene expression and cell death. Furthermore, these methods are generally restricted to fresh tissue, thus limiting studies on archival and bio-bank material. Single nucleus RNA sequencing (snRNA-Seq) is an appealing alternative for transcriptional studies, given that it accurately identifies cell types, permits the study of tissue that is frozen or difficult to dissociate, and reduces dissociation-induced transcription. Here, we present a high-throughput protocol for rapid isolation of nuclei for downstream snRNA-Seq. This method enables isolation of nuclei from fresh or frozen spinal cord samples and can be combined with two massively parallel droplet encapsulation platforms.

Here, we present a protocol to rapidly isolate high-quality nuclei from the fresh or frozen tissue for downstream massively parallel RNA sequencing. We include detergent-mechanical and hypotonic-mechanical tissue disruption and cell lysis options, both of which can be used for isolation of nuclei.

대규모 병렬 단일 핵 RNA 시퀀싱에 대 한 성인 척수 핵의 절연

Probing an individual cell&#39;s gene expression enables the identification of cell type and cell state. Single-cell RNA sequencing has emerged as a ...