Bu eser Aix-Marseille Üniversitesi ve CNRS tarafından desteklenen ve Pfizer laboratuvarlar bir hibe tarafından finanse.

Tüm yordamları Avrupa Ekonomik Topluluğu ile sıkı uygun bakım ve laboratuvar hayvanlarının (86/609/EEC ve 2010/63/UE) ve bir lisans altında kullanımı için verilen ö. Becquet (Préfecture des Bouches-du-Rhône, yetkilendirme No 13-002) yapıldı.
1. sonda tasarım
<ol><li>
Faiz lncRNA birincil dizisini kullanarak, "RNAstructure Web sunucusu"5ikincil yapısı oluşturmak. Not: Bu sitede farklı algoritmaları kullanılabilir. Sonda tasarımlar için en iyi sonuçları vermek üç tahmin araçları: "Kat" (en düşük fiyat serbest enerji yapısı), "MaxExpect" (son derece olası baz çifti) ve "Probnot" (muhtemel baz çifti pseudoknots de dahil olmak üzere). Bu üç analizleri gerçekleştirilen ve karşılaştırıldığında. Viyana RNA websuite7gibi diğer web sunucuları da kullanılabilir.<ol>
<li>İç baz eşleşmesi düşük bir olasılık görüntüleyen ve anti-anlamda Oligonükleotid probları bu bölgeler için güçlü bir ilgi ile 25 üslerinin tasarım bölgeleri seçin. Not: Bu sondalar GC içeriğini 40 ile % 60 arasında oluşan. Bir hizalama arama aracı (patlama) kullanarak, seçili Anti-anlamda Oligonükleotid probları seçilen hücre sisteminde ifade diğer RNA nükleotit dizilerinde tanıyor musunuz emin olun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ayrıca ben de benzeşme faiz lncRNA için ne de diğer RNA serileri için faiz genom görüntüleyen bir non-spesifik DNA Oligonükleotid sonda 25 üslerinin tasarımı.</li>
	<li>Probları biotin ile 3'-sonunda sipariş. Not: steric engel azaltmak için Oligonükleotid ve Biotin arasındaki mesafe triethyleneglycerol rondela ile arttırılması gerekir. Bir en iyi sonuç için ve açılan sonuçlarını özgüllük değerlendirmek için bu tasarım için 3 farklı Anti-anlamda Oligonükleotid probları tavsiye edilir ve daha sonra onların verimliliği deneysel olarak karşılaştırmak için.</li>
</ol>2. cross-linking
<ol><li>
Kültürlü hücre cross-linking
	<ol>
<li>Kültür GH4C1 sommatolactotroph hipofiz hücreleri Ham'ın F10 orta % 15 at serum ve % 2 fetal buzağı serum ile desteklenmiştir. İzdiham 78.5 cm2 kültür tabak içinde kadar hücreleri büyümek. Bu yaklaşık 1 x 107 hücrelere karşılık gelir.</li>
		<li>Hücre kültür orta Konfluent GH4C1 78.5 cm2 kültür tabağı kaldırmak, durulama 1 fosfat orta hacmi x ile serum fizyolojik (PBS) arabelleğe alınmış</li>
		<li>PBS (10 mL) 78.5 cm2 yemekler için; %1 paraformaldehyde çözeltilerine ile hücreleri tamir Bu çözüm %4 paraformaldehyde hisse senedi eriyik--dan taze hazırlanmalıdır. Ajitasyon (RT) oda sıcaklığında 10 dakika altında çapraz. Dikkat: Paraformaldehyde (PFA) toksik ve dikkatli bir şekilde ele alınması gerekir.</li>
		<li>Glisin 1.25 M (10 mL paraformaldehyde çözeltisi başına 1 mL); 1/10 hacmi ekleyerek paraformaldehyde eylem gidermek 5 dk RT. az tahrik</li>
		<li>Medya tarafından aspirasyon ve durulama iki (5 dk) 1 X PBS orta hacmi ile atmak.</li>
		<li>PBS 1'e karşılık gelen bir birim eklemek/medya, toplamak hücreleri hücre kazıyıcı ve sonra aktarmak için bir santrifüj tüpü hacmi 10.</li>
		<li>5 min için 4 ° C'de 510 g de spin.</li>
		<li>Mümkün olduğu kadar süpernatant kaldırın.</li>
		<li>Süresiz olarak-80 ° C'de gerektiği gibi granül depolamak</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Doku Cross-linking
	<ol>
<li>5 mg taze elde edilen fare hipofiz dokusunun PBS (yaklaşık 10 x cilt dokusunun) içinde seyreltilmiş %1 paraformaldehyde bir çözüm koymak, RT, 10 min için kışkırtmak</li>
		<li>Paraformaldehyde eylemi bir 1,25 M glisin çözüm (10 mL paraformaldehyde çözeltisi başına 1 mL) ekleyerek gidermek ve 5 dk RT. az tahrik</li>
		<li>Medya tarafından aspirasyon atın ve PBS (yaklaşık 10 doku hacmi x) ile iki kez durulayın. Mümkün olduğu kadar süpernatant kaldırın.</li>
		<li>Çapraz bağlı doku-80 ° C'de süresiz olarak depolamak</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. hücre veya doku lizis
<ol><li>Lizis arabellek (50 mM Tris-HCl pH 7,0, 10 mM EDTA, 200 U/mL RNAse inhibitörü çözeltisi ve proteaz inhibitörü 5 µL/mL bir kokteyl ile tamamlanan % 1 SDS) hazırlayın.</li>
	<li>Önceki çözdürme olmadan lysed örneklerini almak için hücre topakları veya bu arabelleği (yaklaşık 1 mL başına hücre Pelet veya doku 100 mg) ile çapraz bağlı doku yeniden askıya. 1 x 107 hücrelerinden elde edilen bir hücre Pelet artış yaklaşık 20 mg protein içeren bir lysed örnek ver. Not: kullanılan doku bağlı olarak, bir adım mekanik bozulma eklenmesi gerekir. Bu durumda, bu ek adımı sırasında örneklerin Isıtma önlemek önemlidir.</li>
</ol>4. sonication
<ol><li>
Sonication koşullardan en iyi duruma getirme
	<ol>
<li>Program 30 s ON 2-5 serisi ile sonicator ve 30 s OFF.</li>
		<li>Seyreltilmiş lysed örnekleri (seyreltme faktörü ½ veya protein yaklaşık 10 veya 5 mg için karşılık gelen ¼) sonication koşullara en iyi duruma getirmek için sınamaları gerçekleştirin. Yer lysed 4 ° C su banyosu örneklerinde seyreltilmiş ve sonication seri başlatmak.</li>
		<li>RNA'ların bir RNA arıtma kiti ile veya bir RNA izolasyon reaktif (örneğin, Trizol) ile arındırmak.</li>
		<li>% 1'özel Jel Elektroforez TBE tampon üzerinde saf RNA bütünlük yük, RNA parçaları uzunluğunu denetleyin. Bu uzunluk 200 ve 800 bp mesafe. Not: Anti-anlamda Oligonükleotid probları verimliliği RNA parça boyutuna bağlı olarak değişebilir. O zaman sonication farklı koşullar altında probları verimliliğini kontrol etmek için tavsiye edilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Lysed örnekleri sonication
	<ol>
<li>4 ° c (-den sonra adım 3.2 elde edilen) proteinlerin 20 mg karşılık gelen yer lysed örnekleri banyo su ve 4.1 adımda en iyi duruma getirilmiş gibi sonication seri başlatmak.</li>
		<li>Hemen sonication, santrifüj, 12.000 g 4 ° C'de 5 dakika sonra Supernatants yeni santrifüj tüpler aktarın. Not: homojenliği emin olmak için çoğaltma supernatants getirilebilir havuza alınmış ve bu adımda yeniden dağıtılabilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. RNA aşağı açılır
<ol><li>
Gün 1 – hibridizasyon adım
	<ol>
<li>Hibridizasyon arabelleği (50 mM Tris-HCl pH 7,0, 750 mM NaCl, 1 mM EDTA, % 1 SDS, Formamide eklendi altercations % 15) 2 cilt eklemek sonication adımdan sonra toplanan supernatants için. Girdap.</li>
		<li>Bir santrifüj tüpü (giriş örnekleri) her örneğinin 20 µL aktarın ve -20 ° C'de depolayın</li>
		<li>100 pmol biotinylated Oligonükleotid problar (özel ya da non-spesifik; bkz. Tablo 1), her örnek için ekleyin. 4-6 h altında orta ajitasyon RT. tüp rotator üzerinde kuluçkaya</li>
		<li>Manyetik streptavidin boncuk 50 µL 200 U/mL RNAse inhibitörü çözeltisi ve proteaz inhibitörü 5 µL/mL bir kokteyl ile desteklenmiş ekleyin.</li>
		<li>Gecede altında orta ajitasyon RT. tüp rotator üzerinde kuluçkaya</li>
	</ol>
</li>
	<li>
2. gün-RNA izolasyon adım
	<ol>
<li>Hücre lysate boncuk ayrı süpernatant atmak ve boncuk 900 µL yıkama arabelleği ile yıkamak için manyetik desteğini kullanın (SDS % 0.5, SSC 2 x). Tekrar 5 kere 5 dk ajitasyon RT. rotator üzerinde serpiştirilmiş</li>
		<li>Son yıkama sonra son bir kez dikkatle boşaltmak ve Proteinease K arabelleği (10 mM Tris-HCl pH 7,0, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, % 0.5 SDS) 95 µL ekleyin ve 5 µL İndinavir-k (20 mg/mL) örnekleri.</li>
		<li>Buz üzerinde giriş örnekleri (20 μL) çözülme ve Proteinease K arabelleği 75 µL ve 5 µL İndinavir-k (20 mg/mL) ekleyin.</li>
		<li>Tüm örnekleri ile İndinavir K 50 ° c sonra 10 min 95 ° C'de 45 dk için kuluçkaya</li>
		<li>Örnek 3 dakika buzda boncuk RNA'ların manyetik desteğiyle ayıran önce sakin ol. Süpernatant tutmak ve boncuk atın.</li>
		<li>RNA'ların DNA sindirim adımı içermelidir bir RNA arıtma kiti ile arındırmak. RNA'ların-80 ° C'de depolayın</li>
		<li>Ters transkripsiyon qPCR (RT-qPCR) belirli primerler (Tablo 1) kullanılarak qPCR tarafından izlenen bir RT kit kullanarak gerçekleştirin.</li>
		<li>Her belirli Neat1 sondalar (Tablo 1) ile elde edilen iki RNA havuzlarına karşılık gelen iki DNA kitaplığı oluşturun. Sıralama yeni nesil sıralama sistem üzerinde gerçekleştir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Chu, C., Qu, K., Zhong, F. L., Artandi, S. E., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+maps+of+long+noncoding+RNA+occupancy+reveal+principles+of+RNA-chromatin+interactions.">Genomic maps of long noncoding RNA occupancy reveal principles of RNA-chromatin interactions.</a> Mol Cell. , 667-678 (2011).</li><li>Chu, C., Quinn, J., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+isolation+by+RNA+purification+(ChIRP).">Chromatin isolation by RNA purification (ChIRP).</a> J Vis Exp. , e3912 (2012).</li><li>Simon, M. D., Wang, C. I., Kharchenko, P. V., West, J. A., Chapman, B. A., Alekseyenko, A. A., Borowsky, M. L., Kuroda, M. I., Kingston, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genomic+binding+sites+of+a+noncoding+RNA.">The genomic binding sites of a noncoding RNA.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , 20497-20502 (2011).</li><li>Simon, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capture+hybridization+analysis+of+RNA+targets+(CHART).">Capture hybridization analysis of RNA targets (CHART).</a> Curr Protoc Mol Biol. , (2013).</li><li>Reuter, J. S., Mathews, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAstructure:+software+for+RNA+secondary+structure+prediction+and+analysis.">RNAstructure: software for RNA secondary structure prediction and analysis.</a> BMC Bioinformatics. 11, 129 (2010).</li><li>Sun, X., Haider Ali, M. S. S., Moran, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+interactions+of+long+non-coding+RNAs+and+heterogeneous+nuclear+ribonucleoproteins+in+regulating+cellular+functions.">The role of interactions of long non-coding RNAs and heterogeneous nuclear ribonucleoproteins in regulating cellular functions.</a> Biochem J. , 2925-2935 (2017).</li><li>Gruber, A. R., Lorenz, R., Bernhart, S. H., Neub&#246;ck, R., Hofacker, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Vienna+RNA+websuite.">The Vienna RNA websuite.</a> Nucleic Acids Res. , W70-W74 (2008).</li><li>Tollervey, J. R., Curk, T., Rogelj, B., Briese, M., Cereda, M., Kayikci, M., K&#246;nig, J., Hortob&#225;gyi, T., Nishimura, A. L., Zupunski, V., Patani, R., Chandran, S., Rot, G., Zupan, B., Shaw, C. E., Ule, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+RNA+targets+and+position-dependent+splicing+regulation+by+TDP-43.">Characterizing the RNA targets and position-dependent splicing regulation by TDP-43.</a> Nat Neurosci. , 452-458 (2011).</li><li>Riva, P., Ratti, A., Venturin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+long+non-coding+RNAs+in+neurodegenerative+diseases:+novel+mechanisms+of+pathogenesis.">The long non-coding RNAs in neurodegenerative diseases: novel mechanisms of pathogenesis.</a> Curr Alzheimer Res. (27338628), (2016).</li><li>Barry, G., Briggs, J. A., Hwang, D. W., Nayler, S. P., Fortuna, P. R., Jonkhout, N., Dachet, F., Maag, J. L., Mestdagh, P., Singh, E. M., Avesson, L., Kaczorowski, D. C., Ozturk, E., Jones, N. C., Vetter, I., Arriola-Martinez, L., Hu, J., Franco, G. R., Warn, V. M., Gong, A., Dinger, M. E., Rigo, F., Lipovich, L., Morris, M. J., O'Brien, T. J., Lee, D. S., Loeb, J. A., Blackshaw, S., Mattick, J. S., Wolvetang, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+long+non-coding+RNA+NEAT1+is+responsive+to+neuronal+activity+and+is+associated+with+hyperexcitability+states.">The long non-coding RNA NEAT1 is responsive to neuronal activity and is associated with hyperexcitability states.</a> Sci Rep. , 40127 (2017).</li><li>Adriaens, C., Standaert, L., Barra, J., Latil, M., Verfaillie, A., Kalev, P., Boeckx, B., Wijnhoven, P. W., Radaelli, E., Vermi, W., Leucci, E., Lapouge, G., Beck, B., van den Oord, J., Nakagawa, S., Hirose, T., Sablina, A. A., Lambrechts, D., Aerts, S., Blanpain, C., Marine, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+induces+formation+of+NEAT1+lncRNA-containing+paraspeckles+that+modulate+replication+stress+response+and+chemosensitivity.">p53 induces formation of NEAT1 lncRNA-containing paraspeckles that modulate replication stress response and chemosensitivity.</a> Nat Med. , (2016).</li><li>Fang, J., Qiao, F., Tu, J., Xu, J., Ding, F., Liu, Y., Akuo, B. A., Hu, J., Shao, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+expression+of+long+non-coding+RNA+NEAT1+indicates+poor+prognosis+of+human+cancer.">High expression of long non-coding RNA NEAT1 indicates poor prognosis of human cancer.</a> Oncotarget. , (2017).</li><li>Torres, M., Becquet, D., Blanchard, M. P., Guillen, S., Boyer, B., Moreno, M., Franc, J. L., Fran&#231;ois-Bellan, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circadian+RNA+expression+elicited+by+3'-UTR+IRAlu-paraspeckle+associated+elements.">Circadian RNA expression elicited by 3'-UTR IRAlu-paraspeckle associated elements.</a> Elife. , (2016).</li><li>Chen, L. L., DeCerbo, J. N., Carmichael, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alu+element-mediated+gene+silencing.">Alu element-mediated gene silencing.</a> EMBO J. , 1694-1705 (2008).</li><li>Tripathi, V., Ellis, J. D., Shen, Z., Song, D. Y., Pan, Q., Watt, A. T., Freier, S. M., Bennett, C. F., Sharma, A., Bubulya, P. A., Blencowe, B. J., Prasanth, S. G., Prasanth, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+nuclear-retained+noncoding+RNA+MALAT1+regulates+alternative+splicing+by+modulating+SR+splicing+factor+phosphorylation.">The nuclear-retained noncoding RNA MALAT1 regulates alternative splicing by modulating SR splicing factor phosphorylation.</a> Mol Cell. , 925-938 (2010).</li><li>Engreitz, J. M., Sirokman, K., McDonel, P., Shishkin, A. A., Surka, C., Russell, P., Grossman, S. R., Chow, A. Y., Guttman, M., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-RNA+Interactions+Enable+Specific+Targeting+of+Noncoding+RNAs+to+Nascent+Pre-mRNAs+and+Chromatin+Sites.">RNA-RNA Interactions Enable Specific Targeting of Noncoding RNAs to Nascent Pre-mRNAs and Chromatin Sites.</a> Cell. , 188-199 (2014).</li><li>Nakagawa, S., Ip, J. Y., Shioi, G., Tripathi, V., Zong, X., Hirose, T., Prasanth, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malat1+is+not+an+essential+component+of+nuclear+speckles+in+mice.">Malat1 is not an essential component of nuclear speckles in mice.</a> RNA. , (2012).</li><li>Zhang, B., Arun, G., Mao, Y. S., Lazar, Z., Hung, G., Bhattacharjee, G., Xiao, X., Booth, C. J., Wu, J., Zhang, C., Spector, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lncRNA+Malat1+is+dispensable+for+mouse+development+but+its+transcription+plays+a+cis-regulatory+role+in+the+adult.">The lncRNA Malat1 is dispensable for mouse development but its transcription plays a cis-regulatory role in the adult.</a> Cell Rep. , 111-123 (2012).</li><li>Trapnell, C., Roberts, A., Goff, L., Pertea, G., Kim, D., Kelley, D. R., Pimentel, H., Salzberg, S. L., Rinn, J. L., Pachter, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+gene+and+transcript+expression+analysis+of+RNA-seq+experiments+with+TopHat+and+Cufflinks.">Differential gene and transcript expression analysis of RNA-seq experiments with TopHat and Cufflinks.</a> Nat Protoc. , 562-578 (2012).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Büyük bir alan araştırma uzun kodlamayan RNA'ların (lncRNAs) sayısı ve çeşitliliği temsil ve rolleri hala keşfedilmeyi çoğu. Çoğu bu lncRNAs nükleer bir Yerelleştirme ve bunlar arasında bazı transkripsiyon veya posttranscriptional mekanizmalar yoluyla gen ifadesinin yasal yollar karıştığı. Bu alanda geçerli sorunlardan biri bu lncRNAs RNA'ların çoğu işlemedeki alaka anlamaktır. Bu amaçla, lncRNAs tarafından hedef RNA'ların tespit edilmesi gerekiyor. Önceki çalışmalarda lncRNAs Derneği Kromatin ile üzerinde duruldu esinlenerek, RNA'ların bir lncRNA ile ilişkili kimliği sağlar bir yordam geliştirdik. Esas olarak iki önemli adım üzerinde bağımlı RNA aşağı açılır adlı bu protokol başarıdır, yani Anti-anlamda DNA Oligonükleotid probları tasarımını var özellikle ve sadece ilgi lncRNA ve doku koşullarına melezlemek veya Tüm moleküler ortakları arasında ağ bütünlüğünü korumak zorunda hücre fiksasyon.
Daha önce bir lncRNA ile birlikte, ilişkili Kromatin dizileri (cıvıltı1,2, grafik3,4) yalıtmak için yordamları sağlanan protokoller yayınlandı. Bu protokoller farklı stratejiler Anti-anlamda DNA biotinylated Oligonükleotid probları tasarım istihdam edildi. Cıvıltı yordamda yazarlar DNA biotinylated Oligonükleotid probları lncRNA ilgi tüm uzunluğu tüm gereksiz ve non-spesifik problar1,2dışlanması sonra kapsayan bir havuz kullanılır. GRAFİK protokolündeki yazarlar hibridizasyon için daha erişilebilir lncRNA bölgelerinde tespit ve bu bölgelerde hedef yakalama oligonucleotides tasarlanmış. Bu bölgeler temelinde kendi RNase H duyarlılık seçildi. Gerçekten de, RNA'ların RNA-DNA bağlama sitelerdeki hidrolize için RNAse H özelliğini kullanarak, lncRNA erişilebilir sitelere melezlemek oligonucleotides RNA-DNA melez üretmek ve lncRNA enzimatik bölünme için yol. Yazarlar bu aday yakalama oligonucleotides üçü seçili ve onları bir kokteyl3,4' te kullanılan.
Yordamı grafik protokolünde kullanılan anti-anlamda DNA biotinylated Oligonükleotid probları yapıldı yakın tasarım yapardık ama istenen lncRNA hibridizasyon kullanılabilir bölgelerinde onların RNAse H duyarlılık temelinde, seçili değil ama Biyoinformatik modelleme lncRNA ikincil yapılara sahip tarafından belirlenen iç baz eşleşmesi onların düşük olasılık göre. Farklı ikincil yapılar farklı algoritmaları kullanarak tahmin ve seçilecek sondalar o lncRNA en büyük sayısı tahmin ikincil yapılar olarak kullanılabilir sıralarını melezlemek olmalıdır fark gerekir. Aynı sonuçları üç tasarlanmış bir kokteyl, belirli probları veya tek bir sonda kullanarak tek tek elde edilmiştir. Bu iki ayrı, belirli problar kullanımı ve bu iki problar için ortak olan bu olumlu sonuçlar dikkate istenir. Son olarak, bu nedenle bir en iyi sonuç için yöntem geliştirilmesi başında önerilir ve 3 farklı Anti-anlamda Oligonükleotid tasarlamak için aşağı açılır, sonuçlarını özgüllük değerlendirmek muktedir probları ve sonra karşılaştırmak için özellikle sonda verimliliği hücre lysate hazırlık tarafından değişmiş olabilir beri deneysel olarak onların verimliliği. Yine de, lncRNA biz kullanılan yapısı daha ucuz fayans Oligonükleotid probları2takımlık üzerinde temel kaldı ve bu yöntemi göre daha az zaman alıcı ikincil modellenmesi Biyoinformatik dayalı soruşturma tasarım prosedürü RNAse H duyarlılık4üzerinde.
Bir negatif kontrol negatif yakalama Oligonükleotid anlamda DNA biotinylated Oligonükleotid probları gibi kullanarak aynı zamanda gerçekleştirilmesi gereken veya Oligonükleotid probları veya karşı ilgisiz bir RNA yönetmen oligonucleotides karıştırılmış. Doğal antianlamlı transkript lncRNAs varlığı nedeniyle anlamda Oligonükleotid sonda kullanımı bazen yetersiz olabilir. Negatif denetim için seçilmiş Oligonükleotid sonda ne olursa olsun, bilinen bir RNA ile melez değil patlamanın kontrol etmek ve bu Oligonükleotid hala un ek açıklama eklenen bir lncRNA melezlemek akılda tutmak için gereklidir.
Bu RNA açılan deneylerde kullanılan hücre lysates 10 elde edilmiştir6 -107 hücreler kültürlü hücrelerle ve 1-10 mg doku ile çalışırken çalışırken. Hücre lysates hazırlanması optimize edilmiş olması gereken iki ana adımları ile kullanılan doku veya hücre tipine göre adapte gerekiyor: Yani, cross-linking adım lncRNA ve moleküler ortakları arasında Kovalent bağlar oluşumunu sağlayan ve viskozite Kromatin parçalama tarafından azaltır sonication adım.
Cross-linking adım tüm moleküler ortakları arasında bir ağ oluşumu inducing tarafından tüm RNA hedefler için lncRNA kapalı kalmasını sağlamak için amaçtır. Yararlanılabilmesi için retiküle. lncRNA ve ortakları arasında Kovalent bağlar oluşturacak bir paraformaldehyde tedavi adım sağlar GRAFİK iletişim kuralında nükleer lncRNA ile paraformaldehyde ile ilk tedavi gerçekleştirmek için çalışan bütün lysate hücre ve bir saniye önerildi tedavi izole nükleik kesir3,4. Hücrelerdeki lncRNA erişilebilirlik azaltarak, bu ek adım sondalar, verimliliğini muhtemelen azalma gözlendi. Bu nedenle, hücre dikkate alarak adapte olmak paraformaldehyde tarafından Şebekeleşme derecesine sahiptir veya doku türü kullanıldığında, yerelleştirme tasarlanmış probları etkinlik ve faiz lncRNA.
Hücreleri lysing, süre Kromatin lysate içinde yayınlanır ve viskozite artırır; Kromatin örnekleri akışkanlık ve dolayısıyla Oligonükleotid erişilebilirliğini kolaylaştırmak için sonication tarafından parçalamak için gerekli faiz lncRNA için probları, sonra nedir. Ancak, sonication da faiz lncRNA ile çıkarılan RNA'ları parçalayıp. Böyle bir şekilde verimli bir şekilde lysate viskozite azaltır iken, bu da bir uzunluğu ile elde RNA'ın parçaları sağlayan sonication süresini en aza indirmek önemli 200-800 bp. sonication zaman-ecek var olmak yüksek not arasında oluşan, sonra nedir hem miktar hem de doku veya kullanılan kültürlü hücre türüne bağlıdır.
Sonuç olarak, burada açıklanan yordam 2-3 gün içinde istenen lncRNA RNA hedeflerini yakalama sağlar. RT-qPCR ile birleştiğinde, bu yöntemler tarafından istenen lncRNA bir aday yaklaşım olarak bir ilişki ve düzenleme, bir mRNA arıyor izin verir. Genom geniş yaklaşım için RNA açılan deneyler yüksek üretilen iş RNA-sıralama istenen lncRNA ile ilişkili tüm RNA'ların alınmasını sağlayan tarafından analiz edilebilir. Seçilen her türlü analitik strateji, RNA açılan yordam tarafından lncRNAs RNA regülasyonu yeni önemli bilgi sağlamalıdır.

Burada açıklanan yöntemi genel amacı uzun kodlamayan RNA (lncRNA) RNA moleküler ortakları belirlemektir. LncRNA tanımlanmış okuma çerçeve olmadan 200'den fazla nükleotit dizilerinin karşılık gelir. Bazıları gen ifade düzenlemesi, transkripsiyon düzeyinde, hem de RNA co - ve çoğu olgunlaşma farklı adımlar dahil olmak için göstermiştir. İkinci durumda, moleküler lncRNA, belirlenecek olan RNA'ların ortağız. RNA'ların doğrudan ilişkili olan ya da dolaylı olarak bir lncRNA ilgi ile kimlik etkinleştirme yöntemi daha sonra geliştirmek için gerekli olacaktır.
Kromatin yalıtım RNA arıtma (cıvıltı)1,2 ve yakalama hibridizasyon analizi, RNA hedefler (grafik)3,4, tarafından izin yüksek üretilen iş keşfi olarak daha önce yayınlanan yöntemleri, RNA bağlı proteinler ve genomik bağlama sitelerin belirli bir lncRNA. Bu iki yöntem, faiz lncRNA ilk biotinylated tamamlayıcı oligonucleotides melezleşmiştir ve karmaşık sonra streptavidin boncuklar kullanılarak izole. Bu iki teknik arasındaki temel fark lncRNAs hedef probları için tasarım ilgilidir. Cıvıltı, strateji RNA balık tarafından lncRNA tüm uzunluğu döşemek için kısa Tamamlayıcı DNA Oligonükleotid probları bir havuz tasarımı oluşuyordu, ilham. Buna karşılık, GRAFİKTE, site hibridizasyon için mevcut soruşturma için lncRNAs bir RNase H eşleme tahlil yazarlar uyarlanmış.
Burada önerilen tasarım Anti-anlamda DNA biotinylated Oligonükleotid iç düşük bir olasılık görüntülemek bölgeler için güçlü bir yakınlık ile seçmek için lncRNA ikincil yapı5 / Biyoinformatik modelleme probları probları kullanır yordamı baz çifti. Bu yordam döşeme Oligonükleotid probları2 takımlık üzerinde dayalı olanlar daha ucuz ve daha az zaman alıcı RNAse H duyarlılık4üzerinde dayalı olanlar daha olmanın avantajı vardır.
Kanıt lncRNAs6tarafından çoğu gen düzenlemesi için büyüyen bir vücut gibi bir lncRNA hedefler RNA'ların yakalama etkinleştirme bir yaklaşım geliştirmek çok yararlıdır. Ayrıca, çoğu uygulama için kullanılabilir olması için yaklaşım hem kültürlü hücre ve doku özleri optimize edildi.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bioruptor Plus</td>
			<td>Diagenode</td>
			<td>B01020001</td>
			<td>Sonicator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynabeads My One</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>65001</td>
			<td>Magnetic streptavidin beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formamide</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>15515-026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel electrophoresis apparatus</td>
			<td>Advance</td>
			<td>Mupid-One</td>
			<td>Gel electrophoresis apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2308</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA XS purification kit</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740902</td>
			<td>RNA purificationkit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAseOUT</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>10777-019</td>
			<td>RNAse inhibitor</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizol</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>15596018</td>
			<td>RNA purification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tube Rotator</td>
			<td>Stuart</td>
			<td>SB2</td>
			<td>Eppendorf tube rotator</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNA to DNA</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>4387405</td>
			<td>Reverse transcription kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>iTaq Universal SYBR Green Supermix</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>1725124</td>
			<td>qPCR reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Applied 7500 Fast</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>4351107</td>
			<td>qPCR apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina TruSeq Stranded mRNA Sample Preparation kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20020594</td>
			<td>DNA library construction kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina NextSeq 500</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-415-1002</td>
			<td>NGS system</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rna pull-down procedure to identify rna targets of a long non-coding rna

Uzun bir tanımlanmış okuma çerçeve olmadan 200'den fazla nükleotit dizilerinin olan RNA (lncRNA), kodlamayan düzenleyici kodlamayan RNA'ın ailesine ait. Her ne kadar biyolojik işlevleri büyük ölçüde bilinmeyen kalır, bu lncRNAs sayısı giderek artmıştır ve bu şimdi insanlar 10.000'den fazla tür transkript olabilir tahmin edilmektedir. Bunlardan bazıları transkripsiyon düzeyi, fakat aynı zamanda RNA co - ve çoğu olgunlaşma farklı adımları gerçekleşecek önemli yasal yollar gen ifadesinin yer olduğu bilinmektedir. İkinci durumda, tespit edilmesi lncRNA tarafından hedef RNA'ların var. Bu neden kimlik RNA'ların doğrudan ilişkili olan ya da dolaylı olarak bir lncRNA ilgi ile sağlayan bir yöntem geliştirmek yararlıdır nedenidir.
Bir lncRNA ile birlikte, ilişkili Kromatin dizileri izolasyon sağlar daha önce yayımlanmış iletişim kuralları tarafından ilham kaynağı oldu, bu iletişim kuralını ilişkili RNA'ların yalıtım izin vermek için uyarlanmıştır. Biz iki adım bu protokolünün etkinliği için kritik belirlenir. İlk belirli DNA Anti-anlamda Oligonükleotid probları faiz lncRNA için melezlemek mümkün tasarımıdır. Bu amaçla, lncRNA ikincil yapı Biyoinformatik tarafından tahmin edilmiştir ve anti-anlamda Oligonükleotid probları iç baz eşleşmesi düşük bir olasılık görüntülemek bölgeler için güçlü bir yakınlık ile tasarlanmıştır. İkinci önemli adım yordam doku veya tüm moleküler ortakları arasında ağ korumak için olan kültürlü hücreleri sabitleştirici koşulları kullanır. Yüksek işlem hacmi RNA sıralama ile birleştiğinde, bu RNA açılan iletişim kuralı bir lncRNA ilgi tüm RNA interactome sağlayabilir.

Birkaç son çalışmalar göstermiştir lncRNAs hemen hemen her önemli biyolojik süreç içinde önemli bir rol oynamak ve bu rolün hem transkripsiyon ve çoğu düzeylerinde meydana gelen gen ifadesinin denetimi yoluyla elde edilir Bu ikinci durumda RNA'ların lncRNAs6hedefi olabilir gösterilen.
LncRNA nükleer zenginleştirilmiş bol transkript 1 (Neat1) içinde farklı neuropathologies da demans, amyotrofik lateral skleroz veya epilepsi8,9,10karıştığı ve aynı zamanda misregulated farklı kanser11,12'.
Bu lncRNA da bilinir yapısal bileşeni belirli nükleer organları, paraspeckles olarak ve çoğu sirkadiyen gen ifade13yönetmelikte dahil olmak. Her hücre çekirdeğinde bulunan ve sadece birkaç RNA bağlayıcı protein (RBP)14, ama aynı zamanda etrafında onların oluşumu için gerekli olan Neat1, etrafında oluşan Paraspeckles gerçekten de15 çekirdeği içinde RNA hedefler korumak mümkün olduğu bilinmektedir . Paraspeckles oluşumu farklı bileşenleri Derneği elde edilir. Bu oluşumun sirkadiyen bir ritmik desen RNA hedef13ritmik bir nükleer tutma sürüş görüntülemek için gösterildi. RNA hedeflerini paraspeckles göre nükleer tutma RBP için bağlama aracılığıyla veya doğrudan RNA/RNA Derneği aracılığıyla ortaya çıkabilir, ama belirlenecek RNA'ların paraspeckles tarafından hedeflenen ölçüde vardı. Hedef RNA tanımlamak için doğrudan veya dolaylı olarak Neat1 tarafından yalıtım ve kültürlü hücreler de ( şekil 1 bir grafik için bkz: doku örnekleri olduğu gibi bütün Neat1 RNA hedefleri tanımlaması sağlayan bir RNA açılan protokol tasarlanmıştır sunum tekniği).
Protokol bir başka bir lncRNA metastaz ilişkili akciğer adenokarsinom transkript 1 (Malat1) RNA hedefleri tanımlaması da başarıyla uygulandı. Malat1 ile birlikte birkaç RNA faktörler Uçbirleştirme nükleer speckles bulunan son derece korunmuş ve ifade lncRNA var. Malat1 birkaç yeni doğmakta olan pre-mRNA16,17ve yapıştırma yönetmelikte yer olduğu bilinmektedir.
Özel (SO) ve non-spesifik Oligonükleotid (NSO) sondalar burada açıklanan soruşturma tasarım stratejisini kullanarak oluşturulan. Bu strateji iç Bankası eşleştirme düşük bir olasılık olarak tahmin lncRNA ikincil yapı tarafından görüntülemek bölgeleri seçimi ve bu bölgeler için güçlü bir ilgi ile belirli probları tasarım dayanmaktadır. Bu Biyoinformatik tahminler, tahmin edilen ikincil yapı, Neat1 bir dizi resmi temsilcisi bir sonucu olarak (nukleotid 1.480-2000) ile birlikte iki probları Şekil 2' de verilen bu yüzden tasarlanmış konumunu.
Tasarlanmış probları kültürlü GH4C1 hücreleri ve hipofiz doku özleri (Tablo 1) için fare Neat1 için Neat1 veya Malat1 sıçan için yönetildi. Neat1 veya Malat1 göreli zenginleştirme için belirsiz ve belirli probları giriş örnekleri göre hesaplanır. Şekil 3 için açılan Neat1 sıçan GH4C1 hipofiz hücre kültürünü (şekil 3A) içinde belirli probları verimliliğini gösterir ve fare hipofiz doku (şekil 3B) ayıklar. Sonda tasarım Protokolü (böylece Malat1 için probları yönetmen) belirli Oligonükleotid oluşturmak için kullanırken, bir süre başka yeterince verimli değildi ve verimli sonda elde edildi (şekil 4A) atılır.
Sonra bir RNA RT-qPCR deneyleri, bazı RNA'ların belirli astar (Tablo 1) ile değerlendirildi ve ardından açılan yordamı GH4C1 özler Neat1 veya Malat1 ile ilişkili olduğu gösterildi. GH4C1 hücre özler Neat1 ile ilişkili RNA'ların da hipofiz doku özler Neat1 ile ilişkilendirilmesi gösterilmiştir. Gerçekten de, Neat1 RNA aşağı açılır sonra Malat1 Neat1 tarafından GH4C1 hücre kültürünü ve hipofiz fare doku özleri (şekil 5A) hedef tespit edildi. Malat1 RNA aşağı açılır (şekil 4B) GH4C1 hücrelerdeki belirli bir sonda ile yapılır sonra karşılıklı, Neat1 önemli ölçüde zenginleştirilmiş. İki lncRNAs arasında yakın bir ilişki vurgulayarak, bu sonuçlar Neat1 ve varyasyonları Neat1 RNA ifade18', görüntülemek Malat1 nakavt fareler tarafından önerilen Malat1 potansiyel co-regulatory rolü ile tutarlı 19. iki ana hipofiz hormonları, büyüme hormonu (Gh) (şekil 5B) ve prolaktin (Prl) (şekil 5C) Tutanaklar önemli ölçüde Neat1 RNA aşağı açılır GH4C1 hücreleri ve hipofiz belirli probları ile zenginleştirilmiş özler, olası bir düzenleme Neat1 tarafından iki hormon, düşündüren. Kullanılan iki belirli problar karşılaştırırken, onların verimliliği kabul RNA hedef bağlı olarak (ve şekil 5C5B anlamaya) değişebilir ortaya çıktı. Bu sonuçlar bu sadece açılan lncRNA zenginlik içinde en iyi verimlilik, aynı zamanda en iyi verimlilik RNA hedeflerini zenginleştirme görüntüleme seçmek için birkaç belirli probları tasarlama gerekliliği vurgulayın.
RNA açılan yöntemi Ayrıca faiz13lncRNA RNA hedefleri kapsamlı listesini elde etmek için RNA yüksek üretilen iş sıralama tarafından izlenebilir. RNA-seq analizi yukarıda açıklanan iki belirli problar kullanarak Neat1 RNA açılan gerçekleştirmesinden sonra GH4C1 hipofiz hücreleri üzerinde. RNA açılan NSO ile inşaat kütüphanelerin izin için yeterli olduğu sonra RNA düzeyini yeniden elde etmek, bir negatif kontrol bir NSO kullanarak da RNA-seq analize tabi unutulmamalıdır. Bu durum önceki deneyim13' te böyle değildi. Belirli sonda kullanımı analiz sonra zanaat/kol düğmeleri kullanarak oluşturulan kitaplıkları boru hattı20 ve yalnızca transkript kilobaz başına parçasının değerlerle milyon eşlenen okur (FPKM) 1 dikkate alınmıştır daha yüksek. Listeleri elde Neat1 için yönettiği iki belirli problar ile (Tablo 1) sonuçları özgüllük değerlendirmek için çaprazdı. 4,268 gen GH4C1 hücreleri13' te ifade tutanakları % 28 temsil paraspeckles ile ilişkili bulunmuştur. QPCR analizi (Şekil 5A-C) kullanılarak elde edilen sonuçlar ile tutarlı, Gh, Prl ve Malat1 transkript Neat1 ile ilişkili bulunmuştur. RNA açılan yöntemi bu nedenle lncRNAs ve RNA hedeflerine arasındaki etkileşimi keşfetmek için verimli bir araç olarak kanıtlanmıştır.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57379/57379fig1v2.jpg"> Şekil 1: RNA grafik gösterimini çekin prosedürü. İlk gününde, hücreleri veya doku paraformaldehyde ile çapraz bağlı, lysed ve biotinylated belirli probları ekleyerek gerçekleştirilen hibridizasyon adım önce sonicated. Manyetik streptavidin boncuk sonra belirli malzeme hücre lysate geri kalanından ayırmak için eklenmiştir. İkinci gün, boncuk bir mıknatıs tarafından izole ve birkaç kez yıkanmış. Bir de-çapraz adım saflaştırılmış ve RT-qPCR veya RNA-seq analiz için kullanılan RNA'lar kurtarılması izin. <a href="/files/ftp_upload/57379/57379fig1v2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57379/57379fig2.jpg"> Şekil 2: ikincil yapı olarak tahmin Biyoinformatik kaynak (RNAstructure webserver; en düşük serbest enerji yapısı) tarafından Neat1 dizisinin (nükleotit 1.480-2000). Yapısı baz eşleşmesi olasılık derecesine göre renklidir. İki oligonucleotides problar (SO1 ve SO2) kırmızı Neat1 RNA yapısı konumlandırılır. <a href="/files/ftp_upload/57379/57379fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57379/57379fig3.jpg"> Şekil 3: Neat1 zenginleştirme giriş karşı doğrulanmasını qPCR. Neat1 RNA sonra giriş karşı Neat1 zenginleştirme qPCR doğrulama iki farklı belirli problar (SO1-rn ve SO2-rn GH4C1 hücreleri ve SO1-mm ve SO2-mm hipofiz doku için) bir belirsiz karşılaştırıldığında tarafından aşağı çekin bir (GH4C1 hücreler için NSO-rn ve NSO-mm için Hipofiz bez) GH4C1 fare hücreleri(a)ve fare hipofiz doku (B) ayıklar. 3-10 deneylerde elde edilen ortalama ± SEM sonuçlarıdır. <a href="/files/ftp_upload/57379/57379fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57379/57379fig5.jpg">
Şekil 4: aşağı çekin Malat1 RNA sonra giriş karşı Malat1 ve Neat1 zenginleştirme doğrulanmasını qPCR. Malat1 qPCR doğrulama(a)ve Neat1 (B) zenginleştirme giriş karşı Malat1 RNA sonra iki farklı belirli problar (SO3-rn ve SO4-rn) spesifik olmayan karşılaştırıldığında tarafından aşağı çekin bir (NSO-rn) GH4C1 fare hücrelerinde. 3 deneylerde elde edilen ortalama ± SEM sonuçlarıdır. <a href="/files/ftp_upload/57379/57379fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57379/57379fig4.jpg"> Şekil 5: Malat1, Gh, Prl zenginleştirme Neat1 RNA aşağı çekin sonra giriş karşı doğrulanmasını qPCR. Malat1 qPCR doğrulama(a)aşağı çekin non-spesifik bir GH4C1 fare hücrelerinde karşılaştırıldığında farklı belirli probları kullanarak Gh (B), Neat1 RNA sonra giriş karşı Prl (C) zenginleştirme ve fare hipofiz doku ayıklar. 3-8 deneylerde elde edilen ortalama ± SEM sonuçlarıdır. <a href="/files/ftp_upload/57379/57379fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>SONDA ADLARI</td>
			<td colspan="2">Dizileri</td>
		</tr>
<tr>
<td>NSO-Rn</td>
			<td colspan="2">TAAAATACCATTTGATGTTTGAAATTAT</td>
		</tr>
<tr>
<td>SO1-Rn</td>
			<td colspan="2">CTCCACCATCATCAATCCTCTGGAC</td>
		</tr>
<tr>
<td>SO2-Rn</td>
			<td colspan="2">GCCTTCCCACATTTAAAAACACAAC</td>
		</tr>
<tr>
<td>SO3-Rn</td>
			<td colspan="2">AACTCGTGGCTCAAGTGAGGTGACA</td>
		</tr>
<tr>
<td>SO4-Rn</td>
			<td colspan="2">AAGACTCTCAGGCTCCTGCTCATTC</td>
		</tr>
<tr>
<td>NSO-mm</td>
			<td colspan="2">GTTTGTGGTTTAACAGTGGGAAGGC</td>
		</tr>
<tr>
<td>SO1-mm</td>
			<td colspan="2">GCCTTCCCACTGTTAAACCACAAAC</td>
		</tr>
<tr>
<td>SO2-mm</td>
			<td colspan="2">CTCACCCGCACCCCGACTCCTTCAA</td>
		</tr>
<tr>
<td>qPCR ASTAR:</td>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td>Rattus norvegicus</td>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Neat1</td>
			<td colspan="2">AAGGCACGAGTTAGCCGCAAAT</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">TGTGCACAGTCAGACCTGTCATTC</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Malat1</td>
			<td colspan="2">GAAGGCGTGTACTGCTATGCTGTT</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">TCTCCTGAGGTGACTGTGAACCAA</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">GH1</td>
			<td colspan="2">CCGCGTCTATGAGAAACTGAAGGA</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">GGTTTGCTTGAGGATCTGCCCAAT</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">PRL</td>
			<td colspan="2">TGAACCTGATCCTCAGTTTGGT</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">AGCTGCTTGTTTTGTTCCTCAA</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mus musculus</td>
			<td colspan="2"></td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">Neat1</td>
			<td colspan="2">TGGGCCCTGGGTCATCTTACTAGATA</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">CACAGCTGTTCCAATGAGCGATCT</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">GH1</td>
			<td colspan="2">CTCGGACCGTGTCTATGAGAAACTGA</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">TTTGCTTGAGGATCTGCCCAACAC</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="2">PRL</td>
			<td colspan="2">TGAACCTGATCCTCAGTTTGGT</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">AGCTGCTTGTTTTGTTCCTCAA</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: DNA Oligonükleotid probları ve qPCR astar dizileri

Watch this Scientific Journal Video about RNA Pull-down Procedure to Identify RNA Targets of a Long Non-coding RNA at JoVE.com

RNA Pull-down Procedure to Identify RNA Targets of a Long Non-coding RNA

Bu RNA açılan yöntem uzun kodlamayan RNA (lncRNA) RNA hedeflerini belirleme sağlar. Ev yapımı, tasarlanmış Anti-anlamda DNA Oligonükleotid probları bu lncRNA uygun bir şekilde sabit doku veya hücre için belirli hibridizasyon dayanarak, verimli bir şekilde lncRNA ait tüm RNA hedefleri yakalama sağlar.

Uzun kodlamayan RNA, RNA hedefleri tanımlamak için RNA Pull-down yordamı

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding ...

rna-pull-down-procedure-to-identify-rna-targets-long-non-coding

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

25.1K Görüntüleme.  Aix-Marseille Université. Bu RNA açılan yöntem uzun kodlamayan RNA (lncRNA) RNA hedeflerini belirleme sağlar. Ev yapımı, tasarlanmış Anti-anlamda DNA Oligonükleotid probları bu lncRNA uygun bir şekilde sabit doku veya hücre için belirli hibridizasyon dayanarak, verimli bir şekilde lncRNA ait tüm RNA hedefleri yakalama sağlar.

Video: RNA Pull-down Procedure to Identify RNA Targets of a Long Non-coding RNA

Novel RNA-Binding Proteins Isolation by the RaPID Methodology

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern biology. Only a few in vitro and in vivo methods enable the identification of RBPs associated with a particular target mRNA. However, their main limitations are the identification of RBPs in a non-cellular environment (in vitro) or the low efficiency isolation of RNA of interest (in vivo). An RNA-binding protein purification and identification (RaPID) methodology was designed to overcome these limitations in yeast and enable efficient isolation of proteins that are associated in vivo. To achieve this, the RNA of interest is tagged with MS2 loops, and co-expressed with a fusion protein of an MS2-binding protein and a streptavidin-binding protein (SBP). Cells are then subjected to crosslinking and lysed, and complexes are isolated through streptavidin beads. The proteins that co-purify with the tagged RNA can then be determined by mass spectrometry. We recently used this protocol to identify novel proteins associated with the ER-associated PMP1 mRNA. Here, we provide a detailed protocol of RaPID, and discuss some of its limitations and advantages.

RNA-protein interactions lie at the heart of many cellular processes. Here, we describe an in vivo method to isolate specific RNA and identify novel proteins that are associated with it. This could shed new light on how RNAs are regulated in the cell.

Rapid Metodoloji tarafından Roman RNA Bağlayıcı Proteinler İzolasyon

RNA-binding proteins (RBPs) play important roles in every aspect of RNA metabolism and regulation. Their identification is a major challenge in modern ...

Genetik

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA interactions such as microRNA-mRNA interactions have been shown to regulate gene expression, the full extent to which RNA interactions occur in the cell is still unknown. Previous methods to study RNA interactions have primarily focused on subsets of RNAs that are interacting with a particular protein or RNA species. Here, we detail a method named Sequencing of Psoralen crosslinked, Ligated, and Selected Hybrids (SPLASH) that allows genome-wide capture of RNA interactions in vivo in an unbiased manner. SPLASH utilizes in vivo crosslinking, proximity ligation, and high throughput sequencing to identify intramolecular and intermolecular RNA base-pairing partners globally. SPLASH can be applied to different organisms including bacteria, yeast and human cells, as well as diverse cellular conditions to facilitate the understanding of the dynamics of RNA organization under diverse cellular contexts. The entire experimental SPLASH protocol takes about 5 days to complete and the computational workflow takes about 7 days to complete.

Here, we detail the method of Sequencing of Psoralen crosslinked, Ligated, and Selected Hybrids (SPLASH), which enables genome-wide mapping of intramolecular and intermolecular RNA-RNA interactions in vivo. SPLASH can be applied to study RNA interactomes of organisms including yeast, bacteria and humans.

RNA-RNA Etkileşmelerini Biyotinlenmiş Psooren Kullanarak Küresel Olarak Haritalama

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Assessment of DNA Contamination in RNA Samples Based on Ribosomal DNA

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time PCR (RT-qPCR). It provides accurate, sensitive, reliable, and reproducible results. Several factors can affect the sensitivity and specificity of RT-qPCR. Residual genomic DNA (gDNA) contaminating RNA samples is one of them. In gene expression analysis, non-specific amplification due to gDNA contamination will overestimate the abundance of transcript levels and can affect the RT-qPCR results. Generally, gDNA is detected by qRT-PCR using primer pairs annealing to intergenic regions or an intron of the gene of interest. Unfortunately, intron/exon annotations are not yet known for all genes from vertebrate, bacteria, protist, fungi, plant, and invertebrate metazoan species.
Here we present a protocol for detection of gDNA contamination in RNA samples by using ribosomal DNA (rDNA)-based primers. The method is based on the unique features of rDNA: their multigene nature, highly conserved sequences, and high frequency in the genome. Also as a case study, a unique set of primers were designed based on the conserved region of ribosomal DNA (rDNA) in the Poaceae family. The universality of these primer pairs was tested by melt curve analysis and agarose gel electrophoresis. Although our method explains how rDNA-based primers can be applied for the gDNA contamination assay in the Poaceae family,&#160;it could be easily used to other prokaryote and eukaryote species

Here, we present a protocol for tracing genomic DNA (gDNA) contamination in RNA samples. The presented method utilizes primers specific for the internal transcribed spacer region (ITS) of ribosomal DNA (rDNA) genes. The method is suited for reliable and sensitive detection of DNA contamination in most eukaryotes and prokaryotes.

DNA kirlenme ribozomal DNA tabanlı RNA örneklerinde değerlendirilmesi

One method extensively used for the quantification of gene expression changes and transcript abundances is reverse-transcription quantitative real-time ...

Semi-quantitative Detection of RNA-dependent RNA Polymerase Activity of Human Telomerase Reverse Transcriptase Protein

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase activity. Although TERT is named as a reverse transcriptase, structural and phylogenetic analyses of TERT demonstrate that TERT is a member of right-handed polymerases, and relates to viral RNA-dependent RNA polymerases (RdRPs) as well as viral reverse transcriptase. We firstly identified RdRP activity of human TERT that generates complementary RNA stand to a template non-coding RNA and contributes to RNA silencing in cancer cells. To analyze this non-canonical enzymatic activity, we developed RdRP assay with recombinant TERT in 2009, thereafter established in vitro RdRP assay for endogenous TERT. In this manuscript, we describe the latter method. Briefly, TERT immune complexes are isolated from cells, and incubated with template RNA and rNTPs including radioactive rNTP for RdRP reaction. To eliminate single-stranded RNA, reaction products are treated with RNase I, and the final products are analyzed with polyacrylamide gel electrophoresis. Radiolabeled RdRP products can be detected by autoradiography after overnight exposure.

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) synthesizes not only telomeric DNA but also double-stranded RNA through RNA-dependent RNA polymerase activity. Here, we describe a newly established assay to detect RNA-dependent RNA polymerase activity of endogenous TERT.

İnsan revers transkriptaz protein RNA'ya bağımlı RNA polimeraz aktivitesinin yarı kantitatif algılama

Human telomerase reverse transcriptase (TERT) is the catalytic subunit of telomerase, and it elongates telomere through RNA-dependent DNA polymerase ...

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell type-specific fashion. AS expression patterns are typically analyzed by RT-PCR and RNA-seq using RNA samples isolated from a population of cells. In situ examination of AS expression patterns for a particular biological structure can be carried out by RNA in situ hybridization (ISH) using exon-specific probes. However, this particular use of ISH has been limited because alternative exons are generally too short to design exon-specific probes. In this report, the use of BaseScope, a recently developed technology that employs short antisense oligonucleotides in RNA ISH, is described to analyze AS expression patterns in mouse brain sections. Exon 23a of neurofibromatosis type 1 (Nf1) is used as an example to illustrate that short exon-exon junction probes exhibit robust hybridization signals with high specificity in RNA ISH analysis on mouse brain sections. More importantly, signals detected with exon inclusion- and skipping-specific probes can be used to reliably calculate the percent spliced in values of Nf1 exon 23a expression in different anatomical areas of a mouse brain. The experimental protocol and calculation method for AS analysis are presented. The results indicate that BaseScope provides a powerful new tool to assess AS expression patterns in situ.

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

An in situ hybridization (ISH) protocol that uses short antisense oligonucleotides to detect alternative pre-mRNA splicing patterns in mouse brain sections is described.

Kantitatif analiz alternatif Pre-mRNA RNA In Situ hibridizasyon tahlil kullanarak fare beyin bölümlerde Uçbirleştirme

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

CRISPR Guide RNA Cloning for Mammalian Systems

The outlined protocol describes streamlined methods for the efficient and cost-effective generation of Cas9-associated guide RNAs. Two alternative strategies for guide RNA (gRNA) cloning are outlined based on the usage of the Type IIS restriction enzyme BsmBI in combination with a set of compatible vectors. Outside of the access to Sanger sequencing services to validate the generated vectors, no special equipment or reagents are required aside from those that are standard to modern molecular biology laboratories. The outlined method is primarily intended for cloning one single gRNA or one paired gRNA-expressing vector at a time. This procedure does not scale well for the generation of libraries containing thousands of gRNAs. For those purposes, alternative sources of oligonucleotide synthesis such as oligo-chip synthesis are recommended. Finally, while this protocol focuses on a set of mammalian vectors, the general strategy is plastic and is applicable to any organism if the appropriate gRNA vector is available.

Here, a simple, efficient, and cost-effective method of sgRNA cloning is outlined.

CRISPR Kılavuzu RNA memeli sistemler için klonlama

The outlined protocol describes streamlined methods for the efficient and cost-effective generation of Cas9-associated guide RNAs. Two alternative ...

Artificial RNA Polymerase II Elongation Complexes for Dissecting Co-transcriptional RNA Processing Events

Eukaryotic mRNA synthesis is a complex biochemical process requiring transcription of a DNA template into a precursor RNA by the multi-subunit enzyme RNA polymerase II and co-transcriptional capping and splicing of the precursor RNA to form the mature mRNA. During mRNA synthesis, the RNA polymerase II elongation complex is a target for regulation by a large collection of transcription factors that control its catalytic activity, as well as the capping, splicing, and 3&#8217;-processing enzymes that create the mature mRNA. Because of the inherent complexity of mRNA synthesis, simpler experimental systems enabling isolation and investigation of its various co-transcriptional stages have great utility.
In this article, we describe one such simple experimental system suitable for investigating co-transcriptional RNA capping. This system relies on defined RNA polymerase II elongation complexes assembled from purified polymerase and artificial transcription bubbles. When immobilized via biotinylated DNA, these RNA polymerase II elongation complexes provide an easily manipulable tool for dissecting co-transcriptional RNA capping and mechanisms by which the elongation complex recruits and regulates capping enzyme during co-transcriptional RNA capping. We anticipate this system could be adapted for studying recruitment and/or assembly of proteins or protein complexes with roles in other stages of mRNA maturation coupled to the RNA polymerase II elongation complex.

Here, we describe the assembly of RNA polymerase II (Pol II) elongation complexes requiring only short synthetic DNA and RNA oligonucleotides and purified Pol II. These complexes are useful for studying mechanisms underlying co-transcriptional processing of transcripts associated with the Pol II elongation complex.

Diseksiyon eş transkripsiyon RNA Işleme etkinlikleri için suni RNA polimeraz II uzama kompleksler

Eukaryotic mRNA synthesis is a complex biochemical process requiring transcription of a DNA template into a precursor RNA by the multi-subunit enzyme RNA ...

Exploring Sequence Space to Identify Binding Sites for Regulatory RNA-Binding Proteins

Gene regulation plays an important role in all cells. Transcriptional, post-transcriptional (or RNA processing), translational, and post-translational steps are used to regulate specific genes. Sequence-specific nucleic acid-binding proteins target specific sequences to control spatial or temporal gene expression. The binding sites in nucleic acids are typically characterized by mutational analysis. However, numerous proteins of interest have no known binding site for such characterization. Here we describe an approach to identify previously unknown binding sites for RNA-binding proteins. It involves iterative selection and amplification of sequences starting with a randomized sequence pool. Following several rounds of these steps-transcription, binding, and amplification-the enriched sequences are sequenced to identify a preferred binding site(s). Success of this approach is monitored using in vitro binding assays. Subsequently, in vitro and in vivo functional assays can be used to assess the biological relevance of the selected sequences. This approach allows identification and characterization of a previously unknown binding site(s) for any RNA-binding protein for which an assay to separate protein-bound and unbound RNAs exists.

Sequence specificity is critical for gene regulation. Regulatory proteins that recognize specific sequences are important for gene regulation. Defining functional binding sites for such proteins is a challenging biological problem. An iterative approach for identification of a binding site for an RNA-binding protein is described here and is applicable to all RNA-binding proteins.

Düzenleyici RNA Bağlayıcı Proteinler için Bağlayıcı Siteleri Belirlemek için Sıra Alanını Keşfetmek

Gene regulation plays an important role in all cells. Transcriptional, post-transcriptional (or RNA processing), translational, and post-translational ...

RNA Next-Generation Sequencing and a Bioinformatics Pipeline to Identify Expressed LINE-1s at the Locus-Specific Level

Long INterspersed Elements-1 (LINEs/L1s) are repetitive elements that can copy and randomly insert in the genome resulting in genomic instability and mutagenesis. Understanding the expression patterns of L1 loci at the individual level will lend to the understanding of the biology of this mutagenic element. This autonomous element makes up a significant portion of the human genome with over 500,000 copies, though 99% are truncated and defective. However, their abundance and dominant number of defective copies make it challenging to identify authentically expressed L1s from L1-related sequences expressed as part of other genes. It is also challenging to identify which specific L1 locus is expressed due to the repetitive nature of the elements. Overcoming these challenges, we present an RNA-Seq bioinformatic approach to identify L1 expression at the locus specific level. In summary, we collect cytoplasmic RNA, select for polyadenylated transcripts, and utilize strand-specific RNA-Seq analyses to uniquely map reads to L1 loci in the human reference genome. We visually curate each L1 locus with uniquely mapped reads to confirm transcription from its own promoter and adjust mapped transcript reads to account for mappability of each individual L1 locus. This approach was applied to a prostate tumor cell line, DU145, to demonstrate the ability of this protocol to detect expression from a small number of the full-length L1 elements.

Here, we present a bioinformatic approach and analyses to identify LINE-1 expression at the locus specific level.

RNA yeni nesil sıralamayı ve Biyoinformatik boru hattını Locus 'a özgü düzeyde Ifade eden SATıRı-1s tanımlamak için

Long INterspersed Elements-1 (LINEs/L1s) are repetitive elements that can copy and randomly insert in the genome resulting in genomic instability and ...

Antibody-Free Assay for RNA Methyltransferase Activity Analysis

There are more than 100 chemically distinct modifications of RNA, two thirds of which consist of methylations. Interest in RNA modifications, and especially methylations, has re-emerged due to the important roles played by the enzymes that write and erase them in biological processes relevant to disease and cancer. Here, a sensitive in vitro assay for accurate analysis of RNA methylation writer activity on synthetic or in vitro transcribed RNAs is provided. This assay uses a tritiated form of S-adenosyl-methionine, resulting in direct labeling of methylated RNA with tritium. The low energy of tritium radiation makes the method safe, and pre-existing methods of tritium signal amplification, make it possible to quantify and to visualize the methylated RNA without the use of antibodies, which are commonly prone to artifacts. While this method is written for RNA methylation, few tweaks make it applicable to the study of other RNA modifications that can be radioactively labeled, such as RNA acetylation with 14C acetyl coenzyme A. Overall, this assay allows to quickly assess RNA methylation conditions, inhibition with small molecule inhibitors, or the effect of RNA or enzyme mutants, and provides a powerful tool to validate and expand results obtained in cells.

Here, an antibody-free in vitro assay for direct analysis of methyltransferase activity on synthetic or in vitro transcribed RNA is described.