Bu eser NSF kariyer Ödülü 1553023 ve NIH/NIAID Ödülü R01AI103369 tarafından desteklenmiştir.

1. Pseudomonas aeruginosa koloni biyofilmler büyüme
<ol><li>Orta-Bilayer plakaları hazırlanması<ol>
<li>Hazırlamak bir 10 g/L tryptone, 10 g/M agar (bakınız Tablo reçetesi) çözüm deiyonize su.</li>
		<li>Otoklav 20 dk. 50-60 ° c serin bir su banyosunda.</li>
		<li>45 mL agar-tryptone çözeltisi bir 100 x 100 mm kare tabak içine dökün ( Tablo malzemelerigörmek) 50 mL konik tüp kullanarak. Agar kuvvetlendirmek izin (~ 20-30 dk). İlk katman üzerinde bir ikinci, 15 mL katmanı dökün. Gecede kuvvetlendirmek izin, yoğunlaşma üzerinden kaldırılması gerekirse hav bırakmayan dokusu ile silerek kapakları.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Koloni biyofilmler lekelenme<ol>
<li>Dondurucu stokları LB Ağar kaplamalar13 üzerine gelen faiz suşları çizgi ve 12-16 h 37 ° C ve 80-%100 bağıl nem, karanlıkta kuluçkaya.</li>
		<li>Her zorlanma veya çoğaltma için bir koloni 2 mL lb aşılamak ve 12-16 250 devir / dakikada sallayarak ile h 37 ° C'de karanlıkta kuluçkaya için kullanın.</li>
		<li>Taze LB ve 250 devir / dakikada sallayarak ile 2,5-3 h 37 ° C'de karanlıkta kuluçka 1: 100 sulandrarak alt kültür.</li>
		<li>Ölçmek bir Spektrofotometre kullanarak optik yoğunluk ve aşırı doz ile bir hücre süspansiyon ulaşmak için steril LB ile ayarlamak500 nm ~ 0,5.</li>
		<li>Üzerinde istenen kolonisi bağlı olarak boyut, damlalıklı 2.5-10 µL hücre süspansiyon (1.1 adımda hazırlanan) bir orta-bilayer plaka üzerine ve ~ 20 dk. petri kapağı açık alev yakınındaki Aralık bırakarak kurutma kolaylaştırmak için kuru için bir yer sağlar.</li>
		<li>Spot colonies adlı 25 ° C ve 80-%100 bağıl nem, 4 gün için karanlıkta kuluçkaya.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. sabitleştirici çözüm hazırlanması
<ol><li>Sabitleştirici çözüm örnek hasat gününde hazırlamak. 1 x PBS son konsantrasyonu % %4 37 formaldehit (FA) seyreltik SK. Dikkat: SK geçici ve zehirli. Koruyucu ekipman giymek ve iyi havalandırılan bir duman-hood işe.</li>
	<li>Kullanımdan hemen önce L-lizin hidroklorür % 4 olarak dağıtılması (2.1 adımda hazırlanan) FA 50 mM L-lizin HCl son bir konsantrasyon için oda sıcaklığında.</li>
</ol>3. doğrudan sabitleştirici uygulamaya koloni biyofilm [isteğe bağlı]
Not: Biz agar bindirme fiksasyon önce eklendiğinde biyofilm Morfoloji en iyi korunmuş bulduk. Ancak, bu adımı da gen ifadesinin etkileyebilecek çevre koşullarında bir değişiklik kabul ettiğiniz anlamına gelir. Floresan muhabir ifade desenleri bu nedenle burada açıklandığı gibi fiksasyon adım agar yerleşimi, toplamadan önce içinde yapılan ayrı bir iletişim kuralı kullanılarak doğrulanması gerekir.
<ol><li>Fiksasyon ve iyi havalandırılan bir duman mahallede çalışma günü, koloni'nın kenar, koloni'nın çevre batış olmadan ulaşmak izin etrafında agar yüzeye doğrudan 2. adımda hazırlanan sabitleştirici pipette. Koloni için tam gerektiği kadar sabitleştirici surround olarak yaklaşık 500 µL. izin sadece koloni ve çevresindeki agar yaygın sabitleştirici uygulanır.</li>
	<li>Bir kez sabitleştirici koloni ve çevre medya, yaklaşık 20-30 dakika, tamamen absorbe olmuştur ve kalan SK artık plaka üzerinde görünür, 3.1 arasındaki adımları yineleyin. Bu sabitleştirici koloni ve çevresindeki agar yaygın izin.</li>
	<li>Sabitleştirici tamamen koloni içine emilir ve çevresindeki edildikten sonra medya 3.1, bu sefer sabitleştirici koloni yüzeyine doğrudan uygulama adımları yineleyin. Bu sabitleştirici koloni ve çevresindeki agar yaygın izin, adım 4'e sadece devam sonuçta sabitleştirici absorbe oldu ve artık plaka üzerinde görünür.</li>
</ol>4. overlaying kolonileri Agar ile
<ol><li>Fiksasyon günü, 10 g/M agar çözüm deiyonize su ve basınçlı kap çözülmeye 10-20 dakika içinde hazır olun. Bir su banyosu 50 ˚C için serin.</li>
	<li>Yavaşça agar çözüm 15 mL büyüme orta ve koloni üzerine dökün. Agar 5 min (şekil 1B) için oda sıcaklığında bir jel oluşturmak olanak sağlar.</li>
	<li>Keskin bir ustura arasında en iyi iki kat lamine koloni ile bir kare, 3 katmanlı chuck kesmek için kullanın. Birden çok örnekleri hazırlama, her chuck karşılaştırılabilir bir boyutuna kesme emin.</li>
	<li>Yavaşça aşırı agar koloni içeren Chuck'tan çıkarın.</li>
	<li>Agar (koloni içeren) iki üst kat chuck (şekil 1 c) alt tabaka uzakta kaldırmak için bir spatula 1 x PBS veya su düz kafa ıslak ve yavaşça arasında üst ve alt Katmanlar ekleyin. Lamine koloni alt katmandan ayrı olmalıdır. Deforme etmek ya da ne zaman onun tabanından kaldırarak lamine koloni viraj değil dikkatli olun.</li>
</ol>5. fiksasyon
<ol><li>Gömme bir kaset lamine kolonisi (yani, 2 katlı chuck) Aktarım hemen bir iyi havalandırılmış duman-başlık, çalışma (bakınız Tablo malzemeler), etiketli bir kimyasal dayanıklı işaretleme kalemiyle. Bir cam slayt mailler gömme kaset yerleştirin (bkz. tablo malzemelerin) 2.1-2.2 adımda hazırlanan sabitleştirici içeren. Gömme kaset içinde hapsolmuş hava hava kabarcığı yok olduğundan emin olun.</li>
	<li>Oda sıcaklığında karanlık gecede sabitleştirici örnekte kuluçkaya.</li>
</ol>6. örnek işleme: Arabellek yıkama, su kaybı, takas ve infiltrasyon
<ol><li>Gecede fiksasyon sonra örnek iki kez 1 x PBS için 1 h yıkayın. En iyi sonuçlar için reaktif homojenizasyon spin kullanarak otomatikleştirmek işlevi bir otomatik doku işlemcinin düşük bir ayara ayarla (malzemelerin tabloya bakın). Hiçbir işlemcisi varsa, işleme el ile çalıştırabilirsiniz.</li>
	<li>1s için her oda sıcaklığında dehidratasyon etanol (alkol) dilutions 1 x PBS (% 25, % 50, % 70, % 95) içinde kademeli bir dizi tarafından arabellek yıkama izleyin.</li>
	<li>% 100 üç yıkar kurutmak için 1 h her oda sıcaklığında alkol.</li>
	<li>% 100 portakal yağ bazlı temizleme aracının üç yıkama susuz örnekte temizleyin (malzemelerin tabloya bakın) oda sıcaklığında her 1 h için.</li>
	<li>Temizlenen örnek iki kez ile erimiş parafin balmumu (bkz. Tablo reçetesi) sızmak ısıtmalı 2 h için 55˚C için.</li>
</ol>7. örnek katıştırma
<ol><li>Bir mum kalıp için 55 ˚C ısıtılan erimiş parafin mum ile doldurun. Bir ısıtmalı, düz spatula gömme kaset infiltre chuck chuck kalıp tabanına paralel aittir sağlanması mum kalıp içine hızlı bir şekilde aktarmak için kullanın. Chuck üzerine aşırı basınç uygulamaktan kaçının. Mum kalıpları özel 3 boyutlu baskılı olabilir veya piyasada bulunan ( Tablo reçetesi' ya bak›n).</li>
	<li>Gecede 4 ˚C kuvvetlendirmek balmumu izin. Katı mum kalıp örnekleri 4 ˚C süresiz olarak depolanabilir.</li>
	<li>Bir kez balmumu katılaşmış, kalıp örnekten tüketim ve fazla balmumu bir tıraş bıçağı ile örnek etrafında döşeme. Microtome kelepçe için kullanılan örnek, kesit, uçağa paralel bir ucunu uzanan aşırı balmumu bırakın ( Tablo malzemelerigörmek). Ayrıca balmumu, yaklaşık 1 mm kalın, örnek etrafında kılıf bırakın ve onun yüzleri pürüzsüz.</li>
</ol>8. kesit
<ol><li>Bir su banyosu için 42 ˚C ısı. Örnek microtome yüzeye dik bıçak kenarına odaklı koloninin içine kelepçe ( Tablo malzemelerigörmek).</li>
	<li>Kadar koloni istenen boyutunda ulaştı, hangi bölümlerde toplanacak örnek 50 µm aralıklarla kırpın.</li>
	<li>İstenen sayıda 10 µm kalınlığında bölümü 75-80 rpm bir parça hız ve bir boşluk açısı 6-10˚ olarak ayarlanmış bir microtome kullanarak bir şerit kesin. Şerit'ten bıçak ayırmak için ince uçlu bir fırça kullanın.</li>
	<li>Pasteur pipet (tercih edilen) veya forseps ucunda bir damla su kullanarak, yavaşça su banyosu için transfer folyosunu. Bindirme hava kabarcıkları altında belgili tanımlık parça önlemek için dikkatli olun.</li>
	<li>Hemen su banyosu bir slayt ekleyin ve bir 45˚ açıyla şerit altında konumlandırın.</li>
	<li>Sadece buzlu etiketinin altında slayt Şerite dar kenarı dokun. Şerit i uygun olmalıdır.</li>
	<li>Slayt su yüzeyine dik olmak için açı ayarlayarak ve slayt uzunluğu boyunca karşı yat için şerit i sağlayan su banyosu dışarı çekin. Şerit altında aşırı su bindirme kaçının.</li>
	<li>Yavaşça slayt bölümünde aşırı su esneklik emici bir hav bırakmayan dokusu üzerine standı.</li>
	<li>Slaydı bir kağıt havlu üzerinde yatıyordu ve gece karanlıkta oda sıcaklığında kurumasını bekleyin. Slaytlar, karanlıkta 4 ˚C süresiz olarak saklanır.</li>
</ol>9. ısı sabitleme, rehidrasyon ve montaj
<ol><li>Düzeltilmiş elektrikli Ocak 45 ˚C için ısı. Slayt için 30-60 dk ısı. Balmumu yarı erimiş olmak ve slayt karşı düzleştirin.</li>
	<li>Yavaşça sıcak plaka slayttan kaldırın ve yatıyordu kullanarak bir düz, düzeltilmiş, oda sıcaklığında yüzeye düz kulak balmumu (~ 1 dk) katılaşır kadar erimiş mum slayt, her iki tarafına çekin değil olduğunu emin olmak.</li>
	<li>Bir cam slayt mailler kullanarak, dört yıkar yıkar arasında çözüm kaldırmak için bir Büchner aspiratör kullanarak Aracısı 5 dk her, açıklığın slaytları de-balmumu.</li>
	<li>Slaytları üç kere % 100 yıkama alkol 1 dk için.</li>
	<li>Etanol (% 95, % 70, % 50 ve % 25) her iki 1-dak yıkar 1 x PBS ardından 1dk için işleme tersten kademeli bir dizi slayt rehydrate.</li>
	<li>Hemen Tris tamponlanmış montaj orta bölümlerinde mount ( Tablo malzemelerigörmek) ve hava kabarcıkları getirilmesi kaçınarak bir coverslip uygulayın. Gecede oda sıcaklığında polimerize için montaj orta izin.</li>
	<li>Sonra polimerli, coverslip açık oje kullanarak slayt için mühür. Kapalı slaytlar süresiz olarak 4 ˚C kararınca depolanabilir.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ray, V. A., Morris, A. R., Visick, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+semi-quantitative+approach+to+assess+biofilm+formation+using+wrinkled+colony+development.">A semi-quantitative approach to assess biofilm formation using wrinkled colony development.</a> J. Vis. Exp. (64), e4035 (2012).</li><li>Friedman, L., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+involved+in+matrix+formation+in+Pseudomonas+aeruginosa+PA14+biofilms.">Genes involved in matrix formation in Pseudomonas aeruginosa PA14 biofilms.</a> Mol. Microbiol. 51 (3), 675-690 (2004).</li><li>Okegbe, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron-shuttling+antibiotics+structure+bacterial+communities+by+modulating+cellular+levels+of+c-di-GMP.">Electron-shuttling antibiotics structure bacterial communities by modulating cellular levels of c-di-GMP.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 114 (26), E5236-E5245 (2017).</li><li>Vlamakis, H., Aguilar, C., Losick, R., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+cell+fate+by+the+formation+of+an+architecturally+complex+bacterial+community.">Control of cell fate by the formation of an architecturally complex bacterial community.</a> Genes Dev. 22 (7), 945-953 (2008).</li><li>Serra, D. O., Richter, A. M., Klauck, G., Mika, F., Hengge, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microanatomy+at+cellular+resolution+and+spatial+order+of+physiological+differentiation+in+a+bacterial+biofilm.">Microanatomy at cellular resolution and spatial order of physiological differentiation in a bacterial biofilm.</a> MBio. 4 (2), e00103-e00113 (2013).</li><li>Serra, D. O., Richter, A. M., Hengge, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulose+as+an+architectural+element+in+spatially+structured+Escherichia+coli+biofilms.">Cellulose as an architectural element in spatially structured Escherichia coli biofilms.</a> J. Bacteriol. 195 (24), 5540-5554 (2013).</li><li>McGlinn, E., Mansfield, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+gene+expression+in+mouse+embryos+and+tissue+sections.">Detection of gene expression in mouse embryos and tissue sections.</a> Methods Mol. Biol. 770, 259-292 (2011).</li><li>Choi, Y. S., Kim, Y. C., Baek, K. J., Choi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Situ+Detection+of+Bacteria+within+Paraffin-embedded+Tissues+Using+a+Digoxin-labeled+DNA+Probe+Targeting+16S+rRNA.">In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA.</a> J. Vis. Exp. (99), e52836 (2015).</li><li>James, G., Hunt, A. M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Biofilms+in+Tissue+Specimens.">Imaging Biofilms in Tissue Specimens.</a> Antibiofilm Agents. , 31-44 (2014).</li><li>Madsen, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facultative+control+of+matrix+production+optimizes+competitive+fitness+in+Pseudomonas+aeruginosa+PA14+biofilm+models.">Facultative control of matrix production optimizes competitive fitness in Pseudomonas aeruginosa PA14 biofilm models.</a> Appl. Environ. Microbiol. 81 (24), 8414-8426 (2015).</li><li>Jo, J., Cortez, K. L., Cornell, W. -. C., Price-Whelan, A., Dietrich, L. E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+orphan+cbb3-type+cytochrome+oxidase+subunit+supports+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+growth+and+virulence.">An orphan cbb3-type cytochrome oxidase subunit supports Pseudomonas aeruginosa biofilm growth and virulence.</a> bioRxiv. , 171538 (2017).</li><li>Fong, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+dynamics+of+RbmA+governs+plasticity+of+Vibrio+cholerae+biofilms.">Structural dynamics of RbmA governs plasticity of Vibrio cholerae biofilms.</a> Elife. 6, (2017).</li><li>Bertani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysogeny+at+mid-twentieth+century:+P1,+P2,+and+other+experimental+systems.">Lysogeny at mid-twentieth century: P1, P2, and other experimental systems.</a> J. Bacteriol. 186 (3), 595-600 (2004).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat. Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Dietrich, L. E. P., Teal, T. K., Price-Whelan, A., Newman, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Redox-active+antibiotics+control+gene+expression+and+community+behavior+in+divergent+bacteria.">Redox-active antibiotics control gene expression and community behavior in divergent bacteria.</a> Science. 321 (5893), 1203-1206 (2008).</li><li>Zupan&#269;i&#269;, D., Ter&#269;elj, M., &#352;trus, B., Verani&#269;, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+obtain+good+morphology+and+antigen+detection+in+the+same+tissue+section?.">How to obtain good morphology and antigen detection in the same tissue section?.</a> Protoplasma. , (2017).</li><li>Priester, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+visualization+of+microbial+biofilms+by+staining+and+environmental+scanning+electron+microscopy.">Enhanced visualization of microbial biofilms by staining and environmental scanning electron microscopy.</a> J. Microbiol. Methods. 68 (3), 577-587 (2007).</li><li>Boyles, J., Anderson, L., Hutcherson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+fixative+for+the+preservation+of+actin+filaments:+fixation+of+pure+actin+filament+pellets.">A new fixative for the preservation of actin filaments: fixation of pure actin filament pellets.</a> J. Histochem. Cytochem. 33 (11), 1116-1128 (1985).</li><li>Blackburn, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Examination+of+normal+and+abnormal+placentation+in+the+mouse.">Examination of normal and abnormal placentation in the mouse.</a> Methods Mol. Biol. 136, 185-193 (2000).</li><li>Hoffman, E. A., Frey, B. L., Smith, L. M., Auble, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formaldehyde+crosslinking:+a+tool+for+the+study+of+chromatin+complexes.">Formaldehyde crosslinking: a tool for the study of chromatin complexes.</a> J. Biol. Chem. 290 (44), 26404-26411 (2015).</li><li>Jennings, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pel+is+a+cationic+exopolysaccharide+that+cross-links+extracellular+DNA+in+the+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+matrix.">Pel is a cationic exopolysaccharide that cross-links extracellular DNA in the Pseudomonas aeruginosa biofilm matrix.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112 (36), 11353-11358 (2015).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Parafin gömme ve ince kesit doku örnekleri mikro morfolojik yapılarının görüntüleme sağlar ve ökaryotik dokular üzerinde yaygın olarak kullanılan ve bazı başarı ile mikrobiyal örnekleri8 için uygulanan bir tekniktir klasik histolojik ,9. Cryoembedding endojen ve immünfloresan sinyal güçlü saklamak için izin verirken, Morfoloji16daha iyi koruma sağladığından parafin katıştırma genellikle tercih edilir. Bu yöntem uygulama mikrobiyal biyofilmler için uyum içinde bizim sisteme özgü özellikleri üzerinde duruldu. Biyofilmler daha hassas olma eğilimi olsa hücre ve dokuların matris kez birlikte nispeten sağlam tutulur; Bu nedenle rutin fiksasyon ve örnek saklama en üst düzeye çıkarmak için protokolleri katıştırma balmumu optimize. Örnek üzerinde büyüme substrat Bakımı ve agar hemen önce fiksasyon ile koloni overlaying örnek üst veya temeli kayıp değil sağlar. Ancak, bu adımı sırasında ekstra dikkat edilmelidir böylece kolonileri çok sıcak agar ile overlaying koloniler, zarar verebilir.
Fiksasyon takas, sert dehidrasyon yoluyla yapısını koruyarak için kritik bir adımdır ve infiltrasyon adımlar parafin gömmek için gerekli. Bulduğumuz o lizin-formaldehit fiksasyon en iyi örnek bütünlüğünü korur. Çözünür lizin, bir diamin, aldehitler ile çapraz bağlı polimerler oluşturmak için tepki verebilir ve exopolymeric madde (EPS) mekanik bozulma17,18karşı güçlendirmek için önerilmiştir.
Arka plan Floresans örnek rehidrasyon (adım 9,3) sırasında ardışık yıkar turuncu yağ bazlı Temizleme Aracısı veya uzun süreli maruz kalma, aracılığıyla ile düşüş gözlemledik. Ancak, temizleme aracı ile aşırı tedavi bölüm19' a zor olan kırılgan örneklerinde sonuçlanabilir. Birim veya mum her rehidrasyon sırasında mevcut miktar yansıtacak şekilde yıkar sayısını ayarlamak gerekli olabilir. Artan arka plan Floresans aynı şekilde kontaminasyon reaktifler, biraz autofluorescent olan balmumu, tamamen veya kısmen takas solvent veya aşağıdaki adımları (adım kullanılan etanol karışan nerede işleme doku üzerinden ortaya çıkabilir 6.1 6.4). buna ek olarak, biz bulduk etanol muhabir sinyali azalır ve PBS iki yıkama fluorophore (adım 9.5-9,6) Montaj öncesinde yeniden oluşturmak için önemlidir.
Bu yöntem aynı zamanda kurucu ve organizatörü uygulamalı floresan hücreleri çözünürlükte yerelleştirmesini sağlar. Ancak, biz dikkat ne zaman gen ekspresyonu yorumlamak için bu yöntemi kullanarak öneriyoruz. Fiksasyon, 50 ˚C, önce uygulanan bu iletişim kuralı (Adım 4.2), ortaya çıkan bindirme adım gen ifade desenleri etkileyebilecek ilk büyüme koşullarına göre önemli bir çevresel değişimin sunar. Doğrudan kolonisi, hemen önce bindirmeyi dökme, ama bir maliyetle Morfoloji (isteğe bağlı adım 3.1-3.3) sabitleştirici uygulayarak ifade desenleri doğrulamak yararlı olabilir.
Floresans yorumu etkileyen başka bir bölümün kendisini topografya faktördür. Biyofilm farklı bölgelerinde yapısal bütünlük değişen derecelerde sergi ve az ya da yolu ile fiksasyon, bunun üzerine, bağlı olarak korunması için mükellef varsa, Fonksiyonel grupların bu bileşenlerin sabitleştirici cross-linking için katkıda edebiliyoruz 20. sonuç olarak, Bölüm biyokütle orantısız bölümü yüzeyden bir morfolojik veya metabolik bölgesinden koloni'nın z ekseni boyunca diğerine geçiş kaybedebilirsiniz. Bu bölümünün sağlam bir odak dilim confocal mikroskop düşsel tarafından ele.
Bu teknik ifade floresan protein Mühendisliği suşları için uygulamanın yanı sıra, biz micromorphological özellikleri transmisyon elektron mikroskobu (TEM) ve biyofilm örnekleri belirli floresan boyalar (şekil 3A ile lekeli inceledik ). Jennings ve ark. son zamanlarda Pel, P. aeruginosa PA14 biyofilmler 21tarafından üretilen büyük polisakkarit için boya belirli bir tarif. Yukarıdaki Protokolü ve temsilcisi sonuçları içinde açıklandığı gibi bu boya uygulama bölümlerine görselleştirme PA14 koloni biyofilmler yüksek çözünürlüklü (şekil 3 c) 3Pel dağıtım sağlar. Diğer taraftan, Kongo kırmızısı gibi floresan boyalar büyüme ortamına eklenebilir ve sonrası parça (şekil 3B) görüntüsü. Bir bindirme uygulama aynı zamanda işleme için TEM (3D şekil) boyunca koloni biyofilm morfoloji ve hücre yapısını korur.
Koloni biyofilmler hazırlanması parafin katıştırma üzerinden kesit için burada açıklanan en iyi duruma getirilmiş yöntem sağlar, neyin endojen sinyal ve özellikleri veya complexed boya olabilir vivo içinde üstün çözünürlüğü ile örnek en aza indirerek lokalize kaybı ve yerel koloni makro - ve mikro-türleri Morfoloji koruyarak. Önemli çaba, zaman ve reaktif kullanım bu yöntem için gerekli olduğunu kabul. Ancak, biz bu sakıncaları morfolojik korunması, situ Floresans çözümlenmesi ve amenability öncesi ve sonrası boyama yordamlara veya alternatif işleme stratejileri (örneğin için hazırlık derecesini tarafından karşılık hissediyorum TEM) tanınan bu tekniği ile.

Çoğu mikroplar için formu biyofilmler kapasitesine sahip, hücre toplulukları birlikte kendi ürettiği matrisler tarafından düzenlenen. Biyofilmler fiziksel kurulumları, birçok türde besin ve substrat hükmün çeşitli rejimleri ile yetiştirilen olabilir. Biyofilm oluşumu için belirli deneyleri tekrarlanabilir çok hücreli yapıları verim eğilimi ve ortak mimariler topluluk veya makroskopik düzeyinde filogenetik çeşitli türler için gözlenir. Mikroplar bir atmosfer altında katı ortamdaki koloniler yetiştirilmektedir, makroskopik Morfoloji için matris üretim kapasitesi hakkında bilgi veriyor ve sık sık diğer özellikleri 1,2,3ile karşılıklı olarak ilişkilendirir. Mikrobiyal kolonileri iç mimarisini de biyofilm özel kimya ve fizyolojisi ile ilgili ipuçları sağlayabilir ama karakterize için zor olmuştur. Cryoembedding ve cryosectioning teknikleri son uygulamaları bakteri kolonileri için görüntüleme ve görselleştirme benzeri görülmemiş çözünürlük 4,5,6' daki belirli özelliklerin etkinleştirdiniz. Ancak, çalışmalar ile hayvan doku parafin gömme cryoembedding 7 ' ye göre Morfoloji üstün koruma sağlar ve bakteri doku 8,9görselleştirmek için kullanılan göstermiştir. Bu nedenle bir protokol fiksasyon, parafin katıştırma ve mikrobiyal koloni biyofilmler ince kesit için geliştirdik. Burada, Pseudomonas aeruginosa PA14 koloni-biyofilm ince kesitler 10,11hazırlanması anlatacağız ama biz de başarıyla bu teknik bakteriler tarafından kurulan biyofilmler başvuran Pseudomonas synxantha, Bacillus subtilis, ve Vibrio cholerae12.
İşlemi parafin gömme ve ince kesit biyofilmler için basit bir mantık uygulanabilir. İlk olarak, biyofilmler Morfoloji işleme sırasında korumak için agar tabakası kaplı. İkinci olarak, kaplı biyofilmler bir sabitleştirici crosslink oluştururlar sular altında ve micromorphology korumak. Bunlar, bir daha kutup solvent ile temizlenir, alkol ile sıvı kaybı ve Sıvı parafin balmumu ile sızmış. Sızmış bir kez örnekleri kesit için balmumu bloklara yerleştirilmiştir. Bölümler kesmek, slaytların üzerine monte edilmiş ve sonra onları daha yerel bir duruma döndürmek için rehydrated. Bu noktadan sonra onlar lekeli veya montaj orta mikroskobik analizlerin yapıldığı için kapalı.
Bu iletişim kuralı ince mikrobiyal biyofilmler histolojik analiz için uygun bölümlerini üretir. Bu yöntem kullanılarak hazırlanan ince bölümleri tarafından ışık mikroskobu görüntüsü zaman koloni biyofilm kümelendirilebilir görülebilir. Biyofilmler Ayrıca medya içeren floresan lekesi için bireysel özellikleri belirli yetiştirilen veya hemen önce (adım 9.5-9,6) Montaj rehidrasyon aşamada lekeli. Son olarak, mikroplar floresan proteinler hücre dağıtım veya gen ifade bu topluluklar içinde in situ raporlama sağlayan bir kurucu veya düzenlenmiş moda üretmek için tasarlanmış. Koloni biyofilm derinlik, hücre dağıtım, matris dağılım, büyüme kalıpları ve kronolojik zamanmekansal gen ekspresyonu belirlemek için bu yöntemler kullandık.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1205">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">5 3/4&#34; Pasteur pipette</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">13-678-6A</td>
			<td style="width:577px;">Purchased from univeristy biostores&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Agar&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Teknova&#160;</td>
			<td style="width:161px;">A7777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Buchner Aspirator (Vacuum) Flask&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Pyrex</td>
			<td style="width:161px;">5340</td>
			<td>Purchased from univeristy biostores&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Chemically-resistant Marking Pen</td>
			<td style="width:191px;">VWR</td>
			<td style="width:161px;">103051-182</td>
			<td>Manufacturer: Leica</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Clear Fingernail Polish&#160;</td>
			<td style="width:191px;">********</td>
			<td style="width:161px;">********</td>
			<td>Store bought</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Congo Red Indicator Grade</td>
			<td style="width:191px;">VWR</td>
			<td style="width:161px;">AAAB24310-14</td>
			<td>Manufacturer: Alfa Aesar</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Coomassie Blue&#160;</td>
			<td style="width:191px;">VWR</td>
			<td style="width:161px;">EM-3340</td>
			<td>Manufacturer: EMD Millipore</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:276px;">TRIS-buffered Mounting Medium (w/ DAPI)&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">50 247 04</td>
			<td>Manufacturer: Electron Microscopy Sciences</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Embedding Mold&#160;</td>
			<td style="width:191px;">********</td>
			<td style="width:161px;">********</td>
			<td>3D printed in-house</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:276px;">Embedding Mold (commercial)&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:161px;">70182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Ethanol 200P</td>
			<td style="width:191px;">Decon Labs, Inc.&#160;</td>
			<td style="width:161px;">2701</td>
			<td>Purchased from univeristy biostores&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Fine-tipped Brush</td>
			<td style="width:191px;">********</td>
			<td style="width:161px;">********</td>
			<td>Store bought, paint brush</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Glass Coverslips 60x22mm</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">12-519-21C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Glass Rehydration Mailer&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:161px;">21043</td>
			<td>20 slide mailer&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:276px;">Histoclear-II, orange oil-based clearing agent&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">50 899 90150</td>
			<td>Manufacturer: National Diagnostics&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Histosette, Embedding Casette</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">15 182 701A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">L-lysine hydrochloride&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">BP386 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Low Profile Microtome Blades</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">22 210 048</td>
			<td>Manufacturer: Sturkey&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Micropipette&#160;</td>
			<td style="width:191px;">VWR</td>
			<td style="width:161px;">89080-004</td>
			<td>Promo-pack</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Micropipette Tips&#160;</td>
			<td style="width:191px;">See comments section</td>
			<td style="width:161px;">See comments section</td>
			<td>p10 (Fisher Scientific, 02 707 469), p200 (VWR, 89079-474), p1250 (VWR, 89079-486)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Microtome&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">905200U/00016050</td>
			<td>Model: HM355S, Manufacturer: Microm, NON-CATALOG, Vendor Catalog # 905200U/00016050</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Formaldehyde, 37% Aqueous (Formalin)</td>
			<td style="width:191px;">Ricca Chemical</td>
			<td style="width:161px;">RSOF0010-500A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Paraplast Xtra (paraffin wax)</td>
			<td style="width:191px;">VWR</td>
			<td style="width:161px;">15159-486</td>
			<td>Manufacturer: McCormick Scientific&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:276px;">Petri Dishes Square 100x100x15mm</td>
			<td style="width:191px;">Laboratory Disposable Products&#160;</td>
			<td style="width:161px;">D210-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Potassium chloride&#160;</td>
			<td style="width:191px;">EMD Chemicals&#160;</td>
			<td style="width:161px;">PX1405-1</td>
			<td>Component of phosphate buffered saline, prepared in-house&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Potassium phosphate&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">P380-500</td>
			<td>Component of phosphate buffered saline, prepared in-house&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Razor Blades&#160;</td>
			<td style="width:191px;">VWR</td>
			<td style="width:161px;">55411-050</td>
			<td>Purchased from univeristy biostores&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Slide Warmer&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">NC0865259</td>
			<td>NON-CATALOG, Vendor Catalog # 12857D</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Sodium chloride&#160;</td>
			<td style="width:191px;">VWR</td>
			<td style="width:161px;">0241-1KG</td>
			<td>Component of phosphate buffered saline, prepared in-house&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Sodium phosphate&#160;</td>
			<td style="width:191px;">VWR</td>
			<td style="width:161px;">BDH9296.500</td>
			<td>,Component of phosphate buffered saline, prepared in-house&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Suprafrost Histology Slides&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">12-544-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Tissue Flotation Water Bath&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">NC0815797</td>
			<td>Manufacturer: Ted Pella, Vendor Catalog # 28156-B</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Automatic Tissue Processor&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">813160U/Q#00009061</td>
			<td>Model: STP120 Tissue Processor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Tryptone&#160;</td>
			<td style="width:191px;">Teknova&#160;</td>
			<td style="width:161px;">T9012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:276px;">Yeast extract</td>
			<td style="width:191px;">Teknova&#160;</td>
			<td style="width:161px;">Y9010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

paraffin embedding and thin sectioning of microbial colony biofilms for microscopic analysis

Parafin katıştırma üzerinden kesit bir genel olarak kurulan ökaryotik sistemlerinde bir tekniktir. Burada biz gömme ve bozulmamış mikrobiyal koloni biyofilmler periosteum parafin balmumu kullanarak kesit fiksasyon için bir yöntem sağlayın. Bu yöntem koloni biyofilmler kullanmak için adapte, agar overlayer ile laminasyon ve her örnek, büyüme substrat olarak muhafaza geliştirilen ve lizin sabitleştirici çözümü eklendi. Bu en iyi duruma getirmeleri örnek saklama ve koruma micromorphological özellikleri geliştirmek. Bu şekilde hazırlanan numune kesit ve ışığı, floresan ve transmisyon elektron mikroskobu ile düşsel ince mükellef bulunmaktadır. Bu teknik, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas synxantha, Bacillus subtilisve Vibrio choleraekoloni biyofilmler için başvurdum. Ayrıntı bu yöntemle oluşturulan örneklerinde görünür yüksek düzeyde muhabir gerilme ile birlikte mühendislik veya belirli boya, kullanımı heyecan verici yorumlara fizyolojisi ve mikrobiyal topluluklar gelişimi sağlayabilir.

Bu yöntem biyofilm ince-neyin farklı Morfolojik özellikleri ve gen ekspresyonu bölgeleri DIC, Floresans mikroskobu ve TEM tarafından yansıması bölümleri oluşturur. DIC görüntüleme 40 X yağı daldırma amacı istimal bazı Morfolojik özellikleri (şekil 2E) göstermek yeterli olabilir, biz o floresan bulduk mikroskobu yapısal ifade floresan protein Mühendisliği suşları sağlar gelişmiş hücre dağıtım örnek (şekil 2B) içinde görselleştirme. Tek tek bölümler görüntülerini birlikte tüm koloni (2B şekil) bir kesit oluşturmak için ve genel morfolojisi (Karşılaştır makroskopik düzeyde içinde yapısal özellikleri yerelleştirme için bağlam sağlamak için dikişli Şekil 2A, B ve C). Morfolojik özellikleri ve floresan sinyallerini kullanarak görüntüleme yazılımı14ölçülebilir. Yapıları biyofilm veya gen ekspresyonu bölgeleri arasında geçişler içinde sonra metabolitleri veya kimyasal degradeler11 dağıtımları ile ilişkili olabilir.
Bu iletişim kuralı değiştirilmiş ve birkaç şekilde uyarlanmış. Belirli bir organizatörü kontrol altında ifade floresan protein için tasarlanmış bir yük görselleştirme gen ekspresyonu (şekil 3A) dağılımı sağlar. Koloniler boya, içeren ortamda yetiştirilen olabilir veya boya sonrası kesit eklenebilir, belirli polisakkaritler leke (3B ve C rakamlar). Son olarak, bu iletişim kuralı değiştirilmiş bir sürümü hazır örnekleri DIC tarafından etkin daha yüksek çözünürlükte görüntüleme için izin vermek için TEM (şekil 3D) veya floresan mikroskopi tarafından incelenebilir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57196/57196fig1.jpg"> Resim 1: Kurulum fiksasyon önce koloni büyüme için tasvir şematik. (A) koloniler agar katılaşmış büyüme orta (üst ve alt) iki kat üzerinde büyüdü ve o zaman koloni morfolojisi koruyan ek katmanı ile (bindirme), overlaid (B). (C) bindirme ve üst tabaka arasında gözükeceksin koloni sonra işlenmesi için alt katmana ayrılır. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57196/57196fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57196/57196fig2.jpg"> Resim 2: Micromorphological özellikleri ve YFP floresan kesit parafin gömülü kolonileri içinde. Yapısal YFP ifade bir Pseudomonas aeruginosa PA14 Δateran koloni için15 temsilcisi veri ve % 1 tryptone, %1 agar Kongo kırmızısı ve Coomassie içeren 3 gün boyunca mavi büyüdü. (A) üst-görünümü, bir koloni fiksasyon önce yarısı gösterilen floresan görüntü. (B) kesit parafin gömme sonra tüm koloninin. Kutulu alan bir 10 X objektif lens (C) görüntüsü. (C) kutulu alanda o zaman 40 X yağı daldırma objektif lens floresan (D) ve DIC (E) kullanarak yansıma. Ölçek çubukları 2 mm (A), 500 µm (B) ve 100 µm (C-E) temsil eder. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57196/57196fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57196/57196fig3.jpg"> Şekil 3: Gazeteci ifade, öncesi ve sonrası biyofilm özellikleri ve TEM görüntüleme parafin gömülü koloni biyofilm örnekleri boyama. (a) mexGPr-GFP muhabir floresan 3 gün boyunca üzerinde % 1 tryptone, %1 agar yetiştirilen bir P. aeruginosa PA14 koloni. (B) ilişkili Kongo kırmızısı 5 gün için boya içeren bir ortamda yetişen bir P. synxantha koloni floresan. (C) Pel polisakkarit kesit sonra uygulanan (2 gün için % 1 tryptone, %1 agar içeren Kongo kırmızısı ve Coomassie mavi yetiştirilen) bir P. aeruginosa PA14 Δateran Colony, Wisteria floribunda lektin leke floresan. (D) TEM görüntüsü (% 1 tryptone, %1 agar Kongo kırmızısı ve Coomassie içeren 3 gün boyunca mavi büyüdü), P. aeruginosa PA14 Δateran kolonisi ve parafin katıştırma üzerinden kesit için işlenen *. Ölçek çubuğu 40 µm (A-B), 20 µm (C) ve 5 mikron (D) temsil eder. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57196/57196fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
* Bu örnek ile adım adım 4.1-4.3, atlama 4 yukarıdaki iletişim kuralı, parafin katıştırma üzerinden kesit için işlenen ve ayrı olarak işlenen TEM analiz için.

Watch this Scientific Journal Video about Paraffin Embedding and Thin Sectioning of Microbial Colony Biofilms for Microscopic Analysis at JoVE.com

Paraffin Embedding and Thin Sectioning of Microbial Colony Biofilms for Microscopic Analysis

Parafin gömme ve ince mikrobiyal koloni biyofilmler mikroskobik analizlerin yapıldığı için kesit

Fiksasyon, parafin katıştırma ve mikrobiyal koloni biyofilmler için ince parça teknikler açıklanmaktadır. Hazır örnekleri, mikroskobu tarafından biyofilm altyapı ve muhabir ifade desenleri görüntülenmeyecektir.

Sectioning via paraffin embedding is a broadly established technique in eukaryotic systems. Here we provide a method for the fixation, embedding, and ...

paraffin-embedding-thin-sectioning-microbial-colony-biofilms-for

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

14.2K Görüntüleme.  Columbia University. Fiksasyon, parafin katıştırma ve mikrobiyal koloni biyofilmler için ince parça teknikler açıklanmaktadır. Hazır örnekleri, mikroskobu tarafından biyofilm altyapı ve muhabir ifade desenleri görüntülenmeyecektir.

Video: Paraffin Embedding and Thin Sectioning of Microbial Colony Biofilms for Microscopic Analysis

Colony Forming Cell (CFC) Assay for Human Hematopoietic Cells

Human hematopoietic stem/progenitor cells are usually obtained from bone marrow, cord blood, or peripheral blood and are used to study hematopoiesis and leukemogenesis. They have the capacity to differentiate into lymphoid and myeloid lineages. The colony forming cell (CFC) assay is used to study the proliferation and differentiation pattern of hematopoietic progenitors by their ability to form colonies in a semisolid medium. The number and the morphology of the colonies formed by a fixed number of input cells provide preliminary information about the ability of progenitors to differentiate and proliferate. Cells can be harvested from individual colonies or from the whole plate to further assess their numbers and differentiation states using flow cytometry and morphologic evaluation of Giemsa-stained slides. This assay is useful for assessing myeloid but not lymphoid differentiation. The term myeloid in this context is used in its wider sense to encompass granulocytic, monocytic, erythroid, and megakaryocytic lineages.

We have used this assay to assess the effects of oncogenes on the differentiation of primary human CD34+ cells derived from peripheral blood. For this purpose cells are transduced with either control retroviral construct or a construct expressing the oncogene of interest, in this case NUP98-HOXA9. We employ a commonly used retroviral vector, MSCV-IRES-GFP, that expresses a bicistronic mRNA that produces the gene of interest and a GFP marker. Cells are pre-activated by growing in the presence of cytokines for two days prior to retroviral transduction. After another two days, GFP+ cells are isolated by fluorescence-activated cell sorting (FACS) and mixed with a methylcellulose-containing semisolid medium supplemented with cytokines and incubated till colonies appear on the surface, typically 14 days. The number and morphology of the colonies are documented. Cells are then removed from the plates, washed, counted, and subjected to flow cytometry and morphologic examination. Flow cytometry with antibodies specific to the cell surface markers expressed during hematopoiesis provides information about lineage and maturation stage. Morphological studies of individual cells under a microscope after Wright- Giemsa staining provide further information with regard to lineage and maturation. Comparison of cells transduced with control empty vector to those transduced with an oncogene reveals the effects of the oncogene on hematopoietic differentiation.

Colony Forming Cell CFC Assay for Human Hematopoietic Cells

The colony forming cell (CFC) assay is an in vitro assay in which hematopoietic progenitors form colonies in a semi-solid medium. A combination of colony morphology, cell morphology, and flow cytometry are used to assess the ability of the progenitors to proliferate and differentiate along the different hematopoietic lineages.

Koloni Oluşturan İnsan Hematopoetik Hücreler Hücre (CFC) Testi

Human hematopoietic stem/progenitor cells are usually obtained from bone marrow, cord blood, or peripheral blood and are used to study hematopoiesis and ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly constituted by proteins and exopolysaccharides, among other factors 7-10. The microbial community encased within the biofilm often shows the differentiation of distinct subpopulation of specialized cells 11-17. These subpopulations coexist and often show spatial and temporal organization within the biofilm 18-21.
Biofilm formation in the model organism Bacillus subtilis requires the differentiation of distinct subpopulations of specialized cells. Among them, the subpopulation of matrix producers, responsible to produce and secrete the extracellular matrix of the biofilm is essential for biofilm formation 11,19. Hence, differentiation of matrix producers is a hallmark of biofilm formation in B. subtilis.
We have used fluorescent reporters to visualize and quantify the subpopulation of matrix producers in biofilms of B. subtilis 15,19,22-24. Concretely, we have observed that the subpopulation of matrix producers differentiates in response to the presence of self-produced extracellular signal surfactin 25. Interestingly, surfactin is produced by a subpopulation of specialized cells different from the subpopulation of matrix producers 15.
We have detailed in this report the technical approach necessary to visualize and quantify the subpopulation of matrix producers and surfactin producers within the biofilms of B. subtilis. To do this, fluorescent reporters of genes required for matrix production and surfactin production are inserted into the chromosome of B. subtilis. Reporters are expressed only in a subpopulation of specialized cells. Then, the subpopulations can be monitored using fluorescence microscopy and flow cytometry (See Fig 1).
The fact that different subpopulations of specialized cells coexist within multicellular communities of bacteria gives us a different perspective about the regulation of gene expression in prokaryotes. This protocol addresses this phenomenon experimentally and it can be easily adapted to any other working model, to elucidate the molecular mechanisms underlying phenotypic heterogeneity within a microbial community.

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Microbial biofilms are generally constituted by distinct subpopulations of specialized cells. Single-cell analysis of these subpopulations requires the use of fluorescent reporters. Here we describe a protocol to visualize and monitor several subpopulationswithin B. subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry.

Tek hücreli Analizi Bacillus subtilis</emFloresan Mikroskobu ve Akım Sitometri Kullanma> Biyofilmler

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including antibiotics. Although stress tolerance of M. tuberculosis is one of the likely contributors to the 6-month long chemotherapy of tuberculosis 1, the molecular mechanisms underlying this characteristic phenotype of the pathogen remain unclear. Many microbial species have evolved to survive in stressful environments by self-assembling in highly organized, surface attached, and matrix encapsulated structures called biofilms 2-4. Growth in communities appears to be a preferred survival strategy of microbes, and is achieved through genetic components that regulate surface attachment, intercellular communications, and synthesis of extracellular polymeric substances (EPS) 5,6. The tolerance to environmental stress is likely facilitated by EPS, and perhaps by the physiological adaptation of individual bacilli to heterogeneous microenvironments within the complex architecture of biofilms 7.
In a series of recent papers we established that M. tuberculosis and Mycobacterium smegmatis have a strong propensity to grow in organized multicellular structures, called biofilms, which can tolerate more than 50 times the minimal inhibitory concentrations of the anti-tuberculosis drugs isoniazid and rifampicin 8-10. M. tuberculosis, however, intriguingly requires specific conditions to form mature biofilms, in particular 9:1 ratio of headspace: media as well as limited exchange of air with the atmosphere 9. Requirements of specialized environmental conditions could possibly be linked to the fact that M. tuberculosis is an obligate human pathogen and thus has adapted to tissue environments. In this publication we demonstrate methods for culturing M. tuberculosis biofilms in a bottle and a 12-well plate format, which is convenient for bacteriological as well as genetic studies. We have described the protocol for an attenuated strain of M. tuberculosis, mc27000, with deletion in the two loci, panCD and RD1, that are critical for in vivo growth of the pathogen 9. This strain can be safely used in a BSL-2 containment for understanding the basic biology of the tuberculosis pathogen thus avoiding the requirement of an expensive BSL-3 facility. The method can be extended, with appropriate modification in media, to grow biofilm of other culturable mycobacterial species.
Overall, a uniform protocol of culturing mycobacterial biofilms will help the investigators interested in studying the basic resilient characteristics of mycobacteria. In addition, a clear and concise method of growing mycobacterial biofilms will also help the clinical and pharmaceutical investigators to test the efficacy of a potential drug.

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis forms drug tolerant biofilms when cultured in certain conditions. Here we describe methods for culturing M. tuberculosis biofilms and determining the frequency of drug tolerant persisters. These protocols will be useful for further studies into the mechanisms of drug tolerance in M. tuberculosis.

Büyüme Mycobacterium tuberculosis Biyofilmler

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including ...

Isolation and Genome Analysis of Single Virions using 'Single Virus Genomics'

Whole genome amplification and sequencing of single microbial cells enables genomic characterization without the need of cultivation 1-3. Viruses, which are ubiquitous and the most numerous entities on our planet 4 and important in all environments 5, have yet to be revealed via similar approaches. Here we describe an approach for isolating and characterizing the genomes of single virions called 'Single Virus Genomics' (SVG). SVG utilizes flow cytometry to isolate individual viruses and whole genome amplification to obtain high molecular weight genomic DNA (gDNA) that can be used in subsequent sequencing reactions.

Single Virus Genomics (SVG) is a method to isolate and amplify the genomes of single virons. Viral suspensions of a mixed assemblage are sorted using flow cytometry onto a microscope slide with discrete wells containing agarose, thereby capturing the virion and reducing genome shearing during downstream processing. Whole genome amplification is achieved using multiple displacement amplification (MDA) resulting in genomic material that is suitable for sequencing.

&#39;Tek Virüs Genomik&#39; kullanarak Tek viryonlar İzolasyonu ve Genom Analizi

Whole genome amplification and sequencing of single microbial cells enables genomic characterization without the need of cultivation 1-3. Viruses, which ...

Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms

The pH in bacterial biofilms on teeth is of central importance for dental caries, a disease with a high worldwide prevalence. Nutrients and metabolites are not distributed evenly in dental biofilms. A complex interplay of sorption to and reaction with organic matter in the biofilm reduces the diffusion paths of solutes and creates steep gradients of reactive molecules, including organic acids, across the biofilm. Quantitative fluorescent microscopic methods, such as fluorescence life time imaging or pH ratiometry, can be employed to visualize pH in different microenvironments of dental biofilms. pH ratiometry exploits a pH-dependent shift in the fluorescent emission of pH-sensitive dyes. Calculation of the emission ratio at two different wavelengths allows determining local pH in microscopic images, irrespective of the concentration of the dye. Contrary to microelectrodes the technique allows monitoring both vertical and horizontal pH gradients in real-time without mechanically disturbing the biofilm. However, care must be taken to differentiate accurately between extra- and intracellular compartments of the biofilm. Here, the ratiometric dye, seminaphthorhodafluor-4F 5-(and-6) carboxylic acid (C-SNARF-4) is employed to monitor extracellular pH in in vivo grown dental biofilms of unknown species composition. Upon exposure to glucose the dye is up-concentrated inside all bacterial cells in the biofilms; it is thus used both as a universal bacterial stain and as a marker of extracellular pH. After confocal microscopic image acquisition, the bacterial biomass is removed from all pictures using digital image analysis software, which permits to exclusively calculate extracellular pH. pH ratiometry with the ratiometric dye is well-suited to study extracellular pH in thin biofilms of up to 75 &#181;m thickness, but is limited to the pH range between 4.5 and 7.0.

A pH-sensitive ratiometric dye is used in combination with confocal laser scanning microscopy and digital image analysis to monitor extracellular pH in dental biofilms in real-time.

Diş Biyofilmler ekstraselüler pH rasyometrik Görüntüleme

The pH in bacterial biofilms on teeth is of central importance for dental caries, a disease with a high worldwide prevalence. Nutrients and metabolites ...

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic cooperation, competition, or predation. The study of biofilms is important in many biological fields, including environmental science, food production, and medicine. However, few studies have focused on such bacterial biofilms, partially due to the difficulty of investigating them. Most of the methods for qualitative and quantitative biofilm analyses described in the literature are only suitable for biofilms forming on abiotic surfaces or on homogeneous and thin biotic surfaces, such as a monolayer of epithelial cells.
While laser scanning confocal microscopy (LSCM) is often used to analyze in situ and in vivo biofilms, this technology becomes very challenging when applied to bacterial biofilms on fungal hyphae, due to the thickness and the three dimensions of the hyphal networks. To overcome this shortcoming, we developed a protocol combining microscopy with a method to limit the accumulation of hyphal layers in fungal colonies. Using this method, we were able to investigate the development of bacterial biofilms on fungal hyphae at multiple scales using both LSCM and scanning electron microscopy (SEM). This report describes the protocol, including microorganism cultures, bacterial biofilm formation conditions, biofilm staining, and LSCM and SEM visualizations.

This protocol describes a new method to grow and qualitatively analyze bacterial biofilms on fungal hyphae by confocal and electron microscopy.

Yeni Bir Yöntem Filamentli Mantar kolonileri ile ilgili Bakteriyel Biyofilmler Niteliksel Çok ölçekli Analizi için kullanılması Eşodaklı ve Elektron Mikroskobu

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis

During the pathogenic infection of Drosophila melanogaster, hemocytes play an important role in the immune response throughout the infection. Thus, the goal of this protocol is to develop a method to visualize the pathogen invasion in a specific immune compartment of flies, namely hemocytes. Using the method presented here, up to 3 &#215; 106 live hemocytes can be obtained from 200 Drosophila 3rd instar larvae in 30 min for ex vivo infection. Alternatively, hemocytes can be infected in vivo through injection of 3rd instar larvae followed by hemocyte extraction up to 24 h post-infection. These infected primary cells were fixed, stained, and imaged using confocal microscopy. Then, 3D representations were generated from the images to definitively show pathogen invasion. Additionally, high-quality RNA for qRT-PCR can be obtained for the detection of pathogen mRNA following infection, and sufficient protein can be extracted from these cells for Western blot analysis. Taken together, we present a method for definite reconciliation of pathogen invasion and confirmation of infection using bacterial and viral pathogen types and an efficient method for hemocyte extraction to obtain enough live hemocytes from Drosophila larvae for ex vivo and in vivo infection experiments.

Extraction of Hemocytes from Drosophila melanogaster Larvae for Microbial Infection and Analysis

This method demonstrates how to visualize pathogen invasion into insect cells with three-dimensional (3D) models. Hemocytes from Drosophila larvae were infected with viral or bacterial pathogens, either ex vivo or in vivo. Infected hemocytes were then fixed and stained for imaging with a confocal microscope and subsequent 3D cellular reconstruction.

Hemocytes mikrobiyal enfeksiyon ve çözümleme çekme--dan Drosophila melanogaster larva

During the pathogenic infection of Drosophila melanogaster, hemocytes play an important role in the immune response throughout the infection. Thus, the ...

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for macrophages. This predatory organism, similar to macrophages, employs phagocytosis to kill internalized cells. With the aid of a confocal laser-scanning microscope, images depicting interactive moments between cryptococcal cells and amoeba are captured. The resolution power of the electron microscope also helps to reveal the ultrastructural detail of cryptococcal cells when trapped inside the amoeba food vacuole. Since phagocytosis is a continuous process, quantitative data is then integrated in the analysis to explain what happens at the timepoint when an image is captured. To be specific, relative fluorescence units are read in order to quantify the efficiency of amoeba in internalizing cryptococcal cells. For this purpose, cryptococcal cells are stained with a dye that makes them fluoresce once trapped inside the acidic environment of the food vacuole. When used together, information gathered through such techniques can provide critical information to help draw conclusions on the behavior and fate of cells when internalized by amoeba and, possibly, by other phagocytic cells.

Complementary Use of Microscopic Techniques and Fluorescence Reading in Studying Cryptococcus-Amoeba Interactions

This paper details a protocol for preparing a co-culture of cryptococcal cells and amoebae that is studied using still, fluorescent images and high-resolution transmission electron microscope images. Illustrated here is how quantitative data can complement such qualitative information.

Kripokus-Amoeba etkileşimlerinde mikroskobik teknikler ve floresans okuma tamamlayıcı kullanımı

To simulate Cryptococcus infection, amoeba, which is the natural predator of cryptococcal cells in the environment, can be used as a model for ...

Applying Live Cell Imaging and Cryo-Electron Tomography to Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System

The Dot/Icm secretion system of Legionella pneumophila is a complex type IV secretion system (T4SS) nanomachine that localizes at the bacterial pole and mediates the delivery of protein and DNA substrates to target cells, a process generally requiring direct cell-to-cell contact. We have recently solved the structure of the Dot/Icm apparatus by cryo-electron tomography (cryo-ET) and showed that it forms a cell envelope-spanning channel that connects to a cytoplasmic complex. Applying two complementary approaches that preserve the native structure of the specimen, fluorescent microscopy in living cells and cryo-ET, allows in situ visualization of proteins and assimilation of the stoichiometry and timing of production of each machine component relative to other Dot/Icm subunits. To investigate the requirements for polar positioning and to characterize dynamic features associated with T4SS machine biogenesis, we have fused a gene encoding superfolder green fluorescent protein to Dot/Icm ATPase genes at their native positions on the chromosome. The following method integrates quantitative fluorescence microscopy of living cells and cryo-ET to quantify polar localization, dynamics, and structure of these proteins in intact bacterial cells. Applying these approaches for studying the Legionella pneumophila T4SS is useful for characterizing the function of the Dot/Icm system and can be adapted to study a wide variety of bacterial pathogens that utilize the T4SS or other types of bacterial secretion complexes.

Applying Live Cell Imaging and Cryo-Electron Tomography to Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System

Imaging of bacterial cells is an emerging systems biology approach focused on defining static and dynamic processes that dictate the function of large macromolecular machines. Here, integration of quantitative live cell imaging and cryo-electron tomography is used to study Legionella pneumophila type IV secretion system architecture and functions.

Legionella pnömophila Dot/Icm Salgı Sisteminin Spatiotemporal Özelliklerini Çözmek İçin Canlı Hücre Görüntüleme ve Kriyo-Elektron Tomografisi Uygulama

The Dot/Icm secretion system of Legionella pneumophila is a complex type IV secretion system (T4SS) nanomachine that localizes at the bacterial pole and ...

Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms

The microbial fungus Candida albicans can undergo a change from commensal colonization to virulence that is strongly correlated with its ability to switch from yeast-form growth to hyphal growth. Cells initiating this process become adherent to surfaces as well as to each other, with the resulting development of a biofilm colony. This commonly occurs not only on mucosal tissue surfaces in yeast infections, but also on medical implants such as catheters. It is well known that biofilm cells are resistant to antifungal drugs, and that cells that shed from the biofilm can lead to dangerous systemic infections. Biofilms range from heavily translucent to opaque due to refractive heterogeneity. Therefore, fungal biofilms are difficult to study by optical microscopy. To visualize internal structural, cellular, and subcellular features, we clarify fixed intact biofilms by stepwise solvent exchange to a point of optimal refractive index matching. For C. albicans biofilms, sufficient clarification is attained with methyl salicylate (n = 1.537) to enable confocal microscopy from apex to base in 600 &#181;m biofilms with little attenuation. In this visualization protocol we outline phase contrast refractometry, the growth of laboratory biofilms, fixation, staining, solvent exchange, the setup for confocal fluorescence microscopy, and representative results.

Clarifying and Imaging Candida albicans Biofilms

To view and quantify the internal features of Candida albicans biofilms, we prepare fixed intact specimens that are clarified by refractive index matching. Then, optical sectioning microscopy can be used to obtain three-dimensional image data though the full thickness of the biofilm.

Aydınlatma ve Görüntüleme Candida albicans Biyofilmler

The microbial fungus Candida albicans can undergo a change from commensal colonization to virulence that is strongly correlated with its ability to switch ...