Name: fractionation for resolution of soluble and insoluble huntingtin species
Uploaded: 2018-02-27T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 8 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Fractionation for Resolution of Soluble and Insoluble Huntingtin Species at JoVE.com

Bu eser NIH (RO1-NS090390) tarafından desteklenmiştir. Ayrıca Dr. Joan Steffanfor teknik yardım ve tartışma bu tahlil geliştirilmesi sırasında teşekkür etmek istiyorum.

Hayvan etik beyanı - deneyler yürütülen Kılavuzu ile sıkı uygun bakım ve kullanım laboratuvar hayvanları Ulusal Sağlık enstitüleri ve kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi () tarafından onaylanmış hayvan araştırma protokolü IACUC) University of California, Irvine, bir AAALAC akredite kurum. Tüm çabaları hayvan acı en aza indirmek için yapılmıştır.
1. lizis arabellekleri hazırlanması
<ol><li>"Çözünür" lizis arabellek hazırlamak (10 mM Tris pH 7.4, % 1 Triton-X 100, 150 mM NaCl, % 10 gliserol) ve 0,22 µm filtresi ile steril filtre.<ol>
<li>Çalışma "Çözünür" lizis için bir tampon, N-Ethylmaleimide (NEM) ölçmek ve iyice 100 mM phenylmethysulfonyl flor (PMSF) % 100 çözünmüş olarak dağıtılması alkol. Not: Lizis arabellek inhibitörleri: (i) 20 mM N-ethylmaleimide (NEM); (ii) 0.2 mM PMSF; (iii) 1 mM sodyum orthovanadate (Na3VO4); (iv) 1 µg/mL leupeptin; (v) 1 µg/mL aprotinin; (vi) 20 mM sodyum florür (kaf). Dikkat: bir yüz maskesi NEM boyunca protokolünün çalışırken giyiyorum. Lizis arabellek çalışma aktif inhibitörleri sağlamak için taze yapılmalıdır.</li>
		<li>Proteaz inhibitörleri ile çözünür lizis tampon için inhibitörleri aşağıdaki sırayla ekleyin: sodyum florür (kaf), soğuk lizis arabellek, sodyum orthovanadate (Na3VO4), Aprotinin ve Leupeptin bir birim kadar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>"Çözünmez" lizis arabellek için % 4 SDS "Soluble" lizis arabellek için 2 mL % 20 SDS 500 µL ekleyerek ek. Oda sıcaklığında bırakın. Not: 4 ° C'de tutulur dışarı SDS çökelti; Bu oda sıcaklığında tutmak. Son lizis arabellek oluşturma: 10 mM Tris (pH 7,4); % 1 Triton X-100; 150 mM NaCl; % 10 gliserol; %4 SDS (sadece çözünmez).</li>
</ol>2. çözünür/çözünmez ayırma iletişim kuralı
Not: Bkz. şekil 1 bir şematik için.
<ol><li>Tüpler her örnek için iki farklı etiket: "Soluble" ve "Çözünmez."</li>
	<li>X-µL buz gibi çalışma çözünür lizis arabelleği proteaz inhibitörleri (bkz: 1.1.1) doku ile takıma ekleyin. Not: X = birim değişir doku miktarı bağlı olarak; Bkz. Tablo 1.</li>
	<li>(Yani, striatum) fare beyin doku için dounce cam 1 mL douncer ve damlalıklı "Çözünmez" içine yavaş yavaş 30 kere tüp (buz üzerinde tutun) etiketli. Not: bubbles formu olacak ve eksik homojenizasyon verim gibi douncing, başlattıktan sonra sıvı yüzeyinin kırmamaya dikkat et.</li>
	<li>(Yani, HeLa, HEK293T) hücreler için hücreleri bir kez soğuk, 1 x PBS ile yıkayın. PBS kaldırmak ve asgari miktar lizis arabelleği hücrelere uygulayın ve hücre sıyırıcı kaldırın. Not: İçin yukarıdaki hücre satır, hücre 6 iyi plaka başına 5 x 105 hücre, kaplama ve confluency yakın büyüdü. Bir tane de fare striatum için kullanılan birimleri karşılaştırılabilir.</li>
	<li>Homogenate veya hücre içine lysate etiketli, "Çözünmez" tüpler aktarmak ve buz 1 h (son tüp işlendikten sonra başlangıç saat) koşullar. Not: cep lysates için kuluçka başlamadan önce hücre kümeleri bölmek için birkaç kez triturate. Kabarcıklar oluşumunu önlemek. Kısaca girdap darbe her örnek için 1 s lysing aracılığıyla yarı yolda.</li>
	<li>15.000 x g 20 dk için de 4 ° C'de örnekler santrifüj kapasitesi.</li>
	<li>Süpernatant "Soluble" kesir olarak kurtarmak.<ol>
<li>Damlalıklı ile kaldırmak için bu kesir kontamine gibi Pelet/bulutlu katman bozmamaya dikkat. Damlalıklı çözünür kesir "Soluble" içine tüp etiketli. Buz üstünde tutun.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Her yıkadıktan sonra Pelet 500 µL lizis arabellek (x2) ve santrifüj ile 15.000 x g 5 min için de 4 ° C'de yıkama; Bulutlu katman bazıları kapalı pipetted sorun değil.</li>
	<li>Son yıkama sonra kalan tüm yıkama arabellek yalnızca doku Pelet bırakarak kaldırın. Not: Bu noktadan sonra çözünmez örnekleri şimdi oda sıcaklığında tutulmalıdır.</li>
	<li>Resuspend Pelet X-µL lizis arabellek % 4 SDS ile takviye ile (birim Pelet boyutuna bağlı olarak ayarlanabilir; bkz. Tablo 1).</li>
	<li>Her örnek için 30 solüsyon içeren temizleyicide s bir sonda sonicator ile oda sıcaklığında (125 Watt, 20 kHz, nabız, genlik % 40, bkz: Malzemeler tablo).</li>
	<li>(Haddeleme kaynatın) örnekleri için 30 dk kaynatın; Kısaca santrifüj kapasitesi (15 s) 6.000 x g herhangi bir örnek kaybetmemek için de.</li>
	<li>DC (deterjan uyumlu) protein tahlil gerçekleştirmek ( Tablo malzemelerigörmek) veya Lowry protein tahlil protein konsantrasyonu (1/5 ilgili lizis arabelleği hücre kültürü için örnek ve 1/10 için doku lysates başlamış dilutions önerilen) ölçmek için. Not: Protein konsantrasyonları yüksek deterjan konsantrasyon nedeniyle DC veya Lowry tahlil kullanarak okunması gerekir.</li>
	<li>Donma-çözülme sorunları önlemek için 50 µL toplu işleme aliquot örnekleri. Not: İletişim kuralı burada daha fazla biyokimyasal analiz önce her iki kesirler-20 ° C'de depolayarak duraklatılmış</li>
</ol>3. Western Blot ve miktar
<ol><li>Batı açıkları olarak bildirilen başka bir yerde1,13 30 µg sulandrarak Örnek 1:1 arabellek (boya, 1 azaltmak x yükleme x 1.6) yük içinde yerine getirilir. Not: protein fraksiyonu başına 30 µg yeterlidir, ancak en iyi çözünürlük için ayarlanabilir. 3 - %8 Tris-asetat Poli-Akrilamid jelleri çözünmez kesir için kullanılmalıdır. 4 - %12 bis-Tris jelleri çözünür kesir için tavsiye edilir.</li>
	<li>Kısaca 5 dk. santrifüj örnekleri (haddeleme kaynatın) kaynatın (15 s) örnek toplamak için 6.000 x g de.</li>
	<li>Kesirler SDS-sayfa ve western blot, azaltılmış örnekleri için üreticinin protokolüne göre analiz. Not: Çözünmez kesir en iyi 0,45 µM nitroselüloz membran Transfer edildiğinde giderir. 0,45 veya 0.2 µM nitroselüloz faiz protein büyüklüğüne bağlı olarak çözünür kesir için kullanılabilir. Bazı optimizasyon HMW malzemeleri en iyi transferi için gerekli olabilir.</li>
	<li>Membran protein verimlilik yükleme görselleştirmek için tüm protein leke ile (örneğin, MEMcode, bkz: Malzemeler tablo) leke. Not: Batı lekesi ortalama piksel yoğunluğu tarafından çözümlenebilir. Çözünür kesirler en iyi deneysel sistemi için uygun bir ev tutma protein için normalleştirilmiş. Çözünmez kesir olarak göreli protein bereket tersinir protein boyama veya ayrı leke üzerinde Histon 3 normalleştirme tarafından doğrulandı.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ochaba, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PIAS1+Regulates+Mutant+Huntingtin+Accumulation+and+Huntington's+Disease-Associated+Phenotypes+In+Vivo.">PIAS1 Regulates Mutant Huntingtin Accumulation and Huntington's Disease-Associated Phenotypes In Vivo.</a> Neuron. 90 (3), 507-520 (2016).</li><li>La Spada, A. R., Taylor, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repeat+expansion+disease:+progress+and+puzzles+in+disease+pathogenesis.">Repeat expansion disease: progress and puzzles in disease pathogenesis.</a> Nat Rev Genet. 11 (4), 247-258 (2010).</li><li>Reiner, A., Dragatsis, I., Dietrich, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+and+neuropathology+of+Huntington's+disease.">Genetics and neuropathology of Huntington's disease.</a> Int Rev Neurobiol. 98, 325-372 (2011).</li><li>The Huntington's Disease Collaborative Research Group. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+gene+containing+a+trinucleotide+repeat+that+is+expanded+and+unstable+on+Huntington's+disease+chromosomes.">A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington's disease chromosomes.</a> Cell. 72 (6), 971-983 (1993).</li><li>Sassone, J., Colciago, C., Cislaghi, G., Silani, V., Ciammola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huntington's+disease:+the+current+state+of+research+with+peripheral+tissues.">Huntington's disease: the current state of research with peripheral tissues.</a> Exp Neurol. 219 (2), 385-397 (2009).</li><li>Weydt, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermoregulatory+and+metabolic+defects+in+Huntington's+disease+transgenic+mice+implicate+PGC-1alpha+in+Huntington's+disease+neurodegeneration.">Thermoregulatory and metabolic defects in Huntington's disease transgenic mice implicate PGC-1alpha in Huntington's disease neurodegeneration.</a> Cell Metab. 4 (5), 349-362 (2006).</li><li>Schulte, J., Littleton, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biological+function+of+the+Huntingtin+protein+and+its+relevance+to+Huntington's+Disease+pathology.">The biological function of the Huntingtin protein and its relevance to Huntington's Disease pathology.</a> Curr Trends Neurol. 5, 65-78 (2011).</li><li>Gipson, T. A., Neueder, A., Wexler, N. S., Bates, G. P., Housman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aberrantly+spliced+HTT,+a+new+player+in+Huntington's+disease+pathogenesis.">Aberrantly spliced HTT, a new player in Huntington's disease pathogenesis.</a> RNA Biol. 10 (11), 1647-1652 (2013).</li><li>Neueder, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenic+exon+1+HTT+protein+is+produced+by+incomplete+splicing+in+Huntington's+disease+patients.">The pathogenic exon 1 HTT protein is produced by incomplete splicing in Huntington's disease patients.</a> Sci Rep. 7 (1), 1307 (2017).</li><li>Arndt, J. R., Chaibva, M., Legleiter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+role+of+the+first+17+amino+acids+of+huntingtin+in+Huntington's+disease.">The emerging role of the first 17 amino acids of huntingtin in Huntington's disease.</a> Biomol Concepts. 6 (1), 33-46 (2015).</li><li>Saudou, F., Finkbeiner, S., Devys, D., Greenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huntingtin+acts+in+the+nucleus+to+induce+apoptosis+but+death+does+not+correlate+with+the+formation+of+intranuclear+inclusions.">Huntingtin acts in the nucleus to induce apoptosis but death does not correlate with the formation of intranuclear inclusions.</a> Cell. 95 (1), 55-66 (1998).</li><li>Kim, S., Kim, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+Approaches+for+Inhibition+of+Protein+Aggregation+in+Huntington's+Disease.">Therapeutic Approaches for Inhibition of Protein Aggregation in Huntington's Disease.</a> Exp Neurobiol. 23 (1), 36-44 (2014).</li><li>O'Rourke, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUMO-2+and+PIAS1+modulate+insoluble+mutant+huntingtin+protein+accumulation.">SUMO-2 and PIAS1 modulate insoluble mutant huntingtin protein accumulation.</a> Cell Rep. 4 (2), 362-375 (2013).</li><li>Shibata, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+intracellular+accumulation+of+mutant+Huntingtin+by+Beclin+1.">Regulation of intracellular accumulation of mutant Huntingtin by Beclin 1.</a> J Biol Chem. 281 (20), 14474-14485 (2006).</li><li>Apostol, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell-based+assay+for+aggregation+inhibitors+as+therapeutics+of+polyglutamine-repeat+disease+and+validation+in+Drosophila.">A cell-based assay for aggregation inhibitors as therapeutics of polyglutamine-repeat disease and validation in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (10), 5950-5955 (2003).</li><li>Wanker, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+filter+assay+for+detection+of+amyloid-like+polyglutamine-containing+protein+aggregates.">Membrane filter assay for detection of amyloid-like polyglutamine-containing protein aggregates.</a> Methods Enzymol. 309, 375-386 (1999).</li><li>Sontag, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Mutant+Huntingtin+Aggregation+Conformers+and+Modulation+of+SDS-Soluble+Fibrillar+Oligomers+by+Small+Molecules.">Detection of Mutant Huntingtin Aggregation Conformers and Modulation of SDS-Soluble Fibrillar Oligomers by Small Molecules.</a> J Huntingtons Dis. 1 (1), 119-132 (2012).</li><li>Grima, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutant+Huntingtin+Disrupts+the+Nuclear+Pore+Complex.">Mutant Huntingtin Disrupts the Nuclear Pore Complex.</a> Neuron. 94 (1), 93-107 (2017).</li><li>Sontag, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methylene+blue+modulates+huntingtin+aggregation+intermediates+and+is+protective+in+Huntington's+disease+models.">Methylene blue modulates huntingtin aggregation intermediates and is protective in Huntington's disease models.</a> J Neurosci. 32 (32), 11109-11119 (2012).</li><li>Trushina, E., Rana, S., McMurray, C. T., Hua, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tricyclic+pyrone+compounds+prevent+aggregation+and+reverse+cellular+phenotypes+caused+by+expression+of+mutant+huntingtin+protein+in+striatal+neurons.">Tricyclic pyrone compounds prevent aggregation and reverse cellular phenotypes caused by expression of mutant huntingtin protein in striatal neurons.</a> BMC Neurosci. 10, 73 (2009).</li><li>Shahmoradian, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRiC's+tricks+inhibit+huntingtin+aggregation.">TRiC's tricks inhibit huntingtin aggregation.</a> Elife. 2, e00710 (2013).</li><li>Kim, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteasome+inhibition+induces+alpha-synuclein+SUMOylation+and+aggregate+formation.">Proteasome inhibition induces alpha-synuclein SUMOylation and aggregate formation.</a> J Neurol Sci. 307 (1-2), 157-161 (2011).</li><li>Goldberg, N. R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Neural+Progenitor+Transplantation+Rescues+Behavior+and+Reduces+alpha-Synuclein+in+a+Transgenic+Model+of+Dementia+with+Lewy+Bodies.">Human Neural Progenitor Transplantation Rescues Behavior and Reduces alpha-Synuclein in a Transgenic Model of Dementia with Lewy Bodies.</a> Stem Cells Transl Med. 6 (6), 1477-1490 (2017).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bazı önlemler tutarlı ve kantitatif sonuç sağlamak yukarıdaki iletişim kuralları için ihtiyaç vardır. İlk olarak, mHTT her iki kesirler kendiliğinden toplamları üzerine birden çok donma çözülme çevrimleri, zamanla oluşturacak özellikle ne zaman yüksek bir konsantrasyon içinde. Böylece protein preps aliquots dondurma ve yalnızca gerekli birim Protokolü yukarıda açıklandığı gibi tahlil çalıştırmadan önce çözülme çok önemlidir. Ayrıca, çözünmez kesir çözdürme üzerine beyaz precipitant belirtiyorsa, sulandırma bir ek 5 s sonication darbe, 5 dk kaynatın ve biyokimyasal deneyleri ile analiz önce yeniden Nefelometri tarafından gerekli olabilir.
Bu tahlil için nicel çözümleme çözünür kesir bir yükleme denetim veya ev tutma gen her örnek içinde olan için ortalama piksel yoğunluğu normalleştirme tarafından ulaşılabilir. Ağırlıklı olarak sitozol (şekil 1) yerelleştirir gibi burada gösterildiği gibi GAPDH için çözünür kesir bir ev tutma gen kullanıldı. Yaygın olarak kullanılan diğer ev tutma proteinlerin aktin, α-tübülin ve Erk 1/2 vardır. Ancak, uygun normalleştirme proteinler kararlı duruma ifade doğru ve etkilenmemiş normalleştirme için emin olmak için eğitim sistemi için optimize edilmelidir. Çözünmez kesir GAPDH1eksikliği ve Histon 3 varlığı tarafından görüldüğü gibi ham nükleer kesir olarak hizmet vermektedir, % 3-8 sayfa sınırları tespit için yaygın olarak jelleri çözünürlüğüne nükleer işaretleri kullanmışlardır. Bu nedenle, çözünmez kesir protein bereket göreli bir temsili ham sinyal yoğunluk değeri kullanarak miktar için uygundur. Ancak, tersinir protein lekeleri gibi tüm protein işaretleri denetimine yükleme protein değişimler için kullanılır ve çözünmez kesir normalleştirme faktörü olarak adapte.
Ayrıca, ayırma çözünür ve çözünmez mHTT türler çözme yolu sağlarken, mHTT hastalık patogenezinde, bazıları çözünmez kesir ayırt olmayacaktır boyunca çok sayıda konformasyon değişiklikleri uğrar. Ayrıca, bazı biçimler beneficially hastalık sonucu doğru katkıda bulunmak ve istikrarlı Gümrükleme ara ürün hareket. Bu nedenle Escherichia türleri için sonuçları ile ilişkili diğer mHTT conformers belirlemek önemlidir. Bazı optimizasyon diğer mHTT ara ürün görselleştirmek gerekli olabilir. Toplam konsantrasyonları düşürmek için dayanıklıdır bu sorunu çözmek için SDS yüzdesi % 20'si artırılabilir.
Bu iletişim kuralı protein ayırma koşulları ve çeşitli biçimler ve mHTT birikimi ve toplama parçaları hücre kültürü ve HD bir transgenik fare modeli tespit ortaya çıkan deneyleri gösterir. Bu tür bir biyokimyasal protein yalıtım diğer HD modellerinde hastalık progresyon değerlendirmesi için öngörülen ve mHTT dynamics hücre ve hastalık patoloji üzerindeki etkileri içinde büyüyen anlayış için katkıda bulunabilir.
Ayırma sonra sayısız şekillerde örnekleri işlenebilir. SDS-sayfa western blot analizi tarafından takip göreli bir değerlendirme mHTT türler1düzeyde sağlamak için çözünür ve çözünmez mHTT tür çözümler. Kesirler daha da mHTT türler değerlendirmek için ek biyokimyasal deneyleri içinde değerlendirmek mümkündür. Örneğin, özel Jel Elektroforez (yaş) gidermek ve filtre geriliği (FR) tahlil çözünmez, fibrillary mHTT tür16,17algılamak için güçlü bir araç iken çözünür, oligomeric mHTT, algılamak.
Ek bir avantaj bu tahlil sunar protein mislocalization patogenezi ile ilgili bir değerlendirme olduğunu. 18içinde gösterildiği bu Ayırma Protokolü görselleştirme ve göre büyük çözünmez toplamları münzevi gibi görünüyor ve bir standart sayfa jel çözmeyebilir proteinler gibi Rangap1, izlenmesini sağlar. Bu tahlil, aynı zamanda bir ham nükleer/sitoplazmik ayrılık hizmet gibi Ayrıca, bir de mislocalization proteinler, örneğin, p65, HD fare modelleri1ölçebiliyor.
Analiz için önemli bir motivasyon mHTT toplama ve birikimi roman HD teşhis ve tedavi gelişmedir. İnhibe veya mHTT toplama ters bileşikler yüksek üretilen iş ekranlar ve hedeflenen testleri1,12,19,20,21tespit edilmiştir. Ancak, birçok mHTT biçimlerinin çözümlenmesinde zorluk göz önüne alındığında, toplama modülasyon değerlendirilmesi her zaman mümkün olmamıştır. Geleneksel lizis yöntemleri potansiyel çözünmez toplam protein içeren pelleted hücresel enkaz kurtulmak veya lizis arabellekleri solubilization için yeterli deterjan içermeyebilir. Burada açıklanan yöntemi yalıtma ve hücre tabanlı veya önceden klinik in vivo Değerlendirmeler biyokimyasal bir işaretleyici olarak kullanılan mHTT toplanan bir şeklinde tespit için bir platform sağlar.
Burada açıklanan deneyleri için misfolded diğer proteinler uygulanabilir. Misfolded protein dinamik özelliği nedeniyle, bu deneyleri etkili protein homeostazı ve toplama derinlemesine mekanizmaları ortaya çıkarmak için diğer analizler ile birleştiğinde olabilir. Bu analizler ve kararlı duruma düzeyde toplamları ve onların bölümleri farklı hücre kesirler (şekil 1) ya da protein katlama/saflaştırılmış rekombinant proteinler kullanarak toplama analizini ölçme içerir. Bu deneyleri genetik veya farmakolojik modülasyon doğrudan veya dolaylı etkileri protein yıkımı veya toplama ayırmak için yardımcı olur. Önceki vitro synuclein bir şeker toplama Değerlendirmeler22üzerinde bina, biz beri bu iş için Parkinson hastalığı fare modelleri çeşitli biçimler synuclein bir23gidermek için başvurdum. Bu nedenle, bu çalışmada açıklanan protokoller protein misfolding ve toplama diğer modelleri için uygulanabilir ve bulma ve yeni tedavi toplanan proteinler hedefleme gelişimine katkıda bulunabilir.

Uygun katlama sağlamak protein kalite kontrol ağları bozulma ve yıkımı proteinlerin patoloji Alzheimer hastalığı (Ah), Parkinson hastalığı (PD), Huntington hastalığı (HD) için büyük olasılıkla orta ve protein diğer "misfolding" olduğunu 2,3bozuklukları. Proteostasis ağ bileşenleri ve onların katkıları patoloji için detaylı bir anlayış bu nedenle geliştirilmiş tedavi müdahaleler geliştirmek için çok önemli. HD bir CAG tekrar polyglutamines (polyQ) huntingtin (HTT) protein4genişletilmiş bir streç sonuçlanan HD gen içinde anormal genişlemesi nedeniyle oluşur. Bir tutarlı patolojik HD Patogenez elde edilen misfolding, birikimi ve çeşitli şekillerde normal hücre homeostazı ve işlev girişimine gösterilen HTT beyin bölgelerinde ve periferik dokularda agregasyon özelliğidir 5 , 6. iken HTT ubiquitously ifade, striatum orta dikenli nöronların Ayrıca HD patogenezi ile ilgili dikkate değer kortikal Atrofi ile seçmeli olarak savunmasız ve en açıktan etkilenen vardır.
HTT HD hasta ve hayvan modelleri beyinde agrega oluşumu genellikle hastalık ilerleme ve baskın negatif kazanç mHTT7için işlevinin bir proxy marker olarak hizmet vermiştir. Hangi protein tarafından misfolding ve toplama mHTT kaynaklı toksisite için katkıda bulunabilir kesin mekanizmaları belirsiz kalır rağmen beyindeki bu kapanımlar HD hasta ve çeşitli hayvan modelleri oluşumu bir sabit ve kaçınılmaz özelliğidir. N-terminal içeren büyük ölçüde birikmiş HTT parçaları oluşan için o proteolizis belirten polyQ, genişletilmiş ve tam uzunlukta HTT yanı sıra alternatif Uçbirleştirme8,işleme9 oynayabilir kapanımlar görünür bir HD. N-terminal HTT parçaları patogenezinde önemli rol hızla toplamak, nucleate ve hızlandırmak veya toplama işlemi10yaymak HTT patolojik bir tür teşkil edebilir.
Ancak, bu eklemeler varlığı mutlaka HTT kaynaklı toksisite ya da hücre ölüm11ile ilişkilendirmek değil. HTT çözünür bir monomer çözünür oligomeric türler ve β-yapraklık liflerinde bir toplama işleminden çözünmez toplamları ve kapanımlar12geçmesi teklif edildi. Bu protein türleri standart biyokimyasal deneyleri ile çözme onların istikrar içinde düşük-deterjan lizis tampon ve standart biyokimyasal testleri kullanarak görselleştirme zorluk nedeniyle alandaki bir mücadele vardı. Böylece, metodolojik konusu derecesi ve birikmiş ve toplanan mHTT desen saptamada kritik önem taşır.
Burada sunulan Protokolü HTT, özellikle HD Patogenez ve hastalık ilerleme1,13 ile yakından izlemek için görünür bir çözünmez HMW HTT türlerin oluşumu, birkaç ara ürün görselleştirmek için bir yöntem sağlar ,14. Gidermek ve mHTT birden çok tür takip edememek araştırmacılar hastalığın patogenezinde çalışma ve modülasyon ve hastalık patogenezinde üzerindeki etkisi ile potansiyel terapötik müdahaleler değerlendirmek biyokimyasal bir araçtır.

<table><tbody><tr><td>Sterile Filter</td><td>Millipore</td><td>SCGP505RE</td><td>Screw cap, sterile vaccum filter</td></tr><tr><td>1 mL Tissue Grinder, Dounce</td><td>Wheaton</td><td>357538</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Qsonica</td><td>Model Q125</td><td></td></tr><tr><td>DC Protein Assay</td><td>Biorad</td><td>5000111</td><td>Comparable to Lowry assay</td></tr><tr><td>Tris 1M buffer solution</td><td>Alfa Aesar</td><td>J60636</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher</td><td>BP151-100</td><td></td></tr><tr><td>NaCl 5M solution</td><td>Teknova</td><td>S0251</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher</td><td>BP229-1</td><td></td></tr><tr><td>20% SDS solution</td><td>Teknova</td><td>S0295</td><td></td></tr><tr><td>N-ethylmaleimide</td><td>Sigma</td><td>E1271</td><td></td></tr><tr><td>Phenylmethylsulfony flouride</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td>create 100mM stock solution in 100%EtOH, store at 4&amp;deg;C</td></tr><tr><td>Sodium orthovanadate</td><td>Sigma</td><td>S6508</td><td>Create 0.5M stock solution in water</td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Sigma</td><td>L2884</td><td>Create 10mg/ml stock solution in water</td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Sigma</td><td>A1153</td><td>Create 10mg/ml stock solution in water</td></tr><tr><td>Sodium Fluoride</td><td>Sigma</td><td>S4504</td><td>Create 500mM stock solution in water</td></tr><tr><td>Anti-HTT</td><td>Millipore</td><td>MAB5492</td><td>Use 1:1000 for western blot, 1:500 for filter retardation assay</td></tr><tr><td>Anti-GAPDH</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-56875</td><td>Use 1:1000 for soluble western blot</td></tr></tbody></table>

fractionation for resolution of soluble and insoluble huntingtin species

Misfolded proteinleri birikimi patoloji Huntington hastalığı (HD) ve diğer birçok nörodejeneratif hastalıklar için merkezi bir noktada bulunuyor. Özellikle, bir ana patolojik HD yüksek molekül ağırlıklı kompleksleri içine mutant HTT (mHTT) protein birikimine anormal özelliğidir ve hücre içi dahil ceset parçaları ve diğer proteinler oluşur. Ölçmek ve mHTT içeren toplamları çeşitli formları katkılarıyla Floresans mikroskobu, western blot analizi ve filtre dahil anlamak için geleneksel yöntemler deneyleri tuzak.
Ancak, bu yöntemlerin çoğu belirli biçimi vardır ve bu nedenle mHTT protein akı toplama çözünürlük ve çözünürlük karmaşık yapısı nedeniyle tam durumunu çözmeyebilir.
Toplanan mHTT ve çeşitli değiştirilmiş form ve kompleksleri kimlik için ayırma ve solubilization hücresel toplamları ve parçaları zorunlu değildir. Burada biz yalıtmak ve görselleştirmek çözünür mHTT, monomerleri, reaksiyonlar, parçaları için bir yöntem tanımlamak ve çözünmez yüksek molekül ağırlıklı (HMW) mHTT türler birikmiş. HMW mHTT izler hastalık ilerlemesi ile fare davranışı çıktıları ile karşılık gelir ve beneficially belirli tedavi müdahaleler1tarafından modüle. Bu yaklaşım fare beyni, periferik doku ve hücre kültürü ile kullanılabilir ancak diğer sistemleri modellemek bağlamı olarak da bilinen hastalık için adapte edilebilir.

Kararlılık-in ayırma takip çözünür ve çözünmez hücre lysates Batı analizi ve filtre retardasyon deneyleri (Şekil 2) kullanarak tespit edilebilir. Örnek olarak, HEK293T hücre transfection reaktifi (örneğin, lipofectamine 2000) kullanarak transfected, ile HTT exon 1 kodlama cDNA 97 glutamin içeren Poli prolin zengin bölgeye göre takip15 tekrarlar ve bu hücreler için izin verildi 44 h. hücreleri tedavi edildi için hızlı ya 5 mikron ile proteasome engellemek için MG132 veya DMSO 18 s hasat öncesinde ve olarak lysed için bir denetim olarak yukarıda açıklanan. Ayırma Protokolü mutant HTT exon 1 civarında 45 kDa 4-%12 Bis-Tris sayfa jelleri ve 3-%8 Tris-asetat sayfa jelleri (şekil 2A) üzerinde HMW çözünmez birikmiş tür olarak çözünür bir monomer giderir. Sayısal ve bir ev tutma protein için normalleştirilmiş çözünür monomer (gösterilen burada GAPDH olarak). HMW, çözünmez mHTT ortalama piksel yoğunluğu tarafından göreli protein bereket sayılabilir. İnhibitörü MG132 ile tedavi, mHTT HMW, çözünmez mHTT buna karşılık gelen bir artış ile birlikte, çözünür monomer belirgin bir azalma olur.
Çözünmez kesirler çözünmez, fibriler mHTT16 (şekil 2B) gidermek için bir filtre retardasyon tahlil gibi ek teknikleri tarafından çözümlenebilir. HeLa hücreleri benzer şekilde yukarıdaki gibi 97Q-HTT exon 1 ve O'nun-SUMO-1 veya O'nun-SUMO-2 ile transfected. Hücreleri ayırma önce 18 h için DMSO ya da MG132 ile tedavi edildi ve western blot ve filtre retardasyon deneyleri kullanılarak analiz. Veri overexpressed SUMO izoformu varlığı HMW ve fibrillary çözünmez mHTT arttığını gösterir. MG132 ilavesi çözünmez mHTT türler artış exacerbates. HWM mHTT türler de overexpression veya azaltma HD hastalığı hedefinin PIAS1 her iki HeLa hücreleri13 ve fare striata1 (şekil 2C-D) modülasyonlu. PIAS1 nakavt, HD, R6/2, PIAS1 karşı bir siRNA viral teslim kullanarak hızla devam eden fare modeli HMW çözünmez mHTT birikimi azaltır. PIAS1 viral overexpression R6/2 farelerde HMW çözünmez mHTT (şekil 2B)1dikkate değer bir artış yol açar. Çözünürlük kesirler arasındaki değişikliği ölçülebilir ve bu iletişim kuralı modülasyonu bu hastalık müdahalenin önceden klinik Biyokimya değerlendirmeler için uygun tekniği yapım patojenik mutant protein türlerin izleyebilirsiniz gösterir. Çözünmez değişimler, fibriler mHTT türlerin akı MG132 ile tedavi veya düzenleme PIAS11gibi potansiyel tedavi hedefleri, modülasyonlu protein türler arasında da esir alma.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57082/57082fig1v2.jpg"> Şekil 1: çözünür/çözünmez Ayırma Protokolü ve protein çözüm. (A)görsel boru hattı için Ayırma Protokolü. Burada açıklanan protokol fare doku veya hücre kültür örnekleri için uygulanabilir ancak Ayarlamardan başka örnek türleri için uygundur. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57082/57082fig1v2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a> 
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57082/57082fig2.jpg"> Şekil 2: temsilcisi sonuçlar Soluble ve çözünmez fractionations ve analizler için. (A)Soluble ve çözünmez kesirler bir 4-%12 Bis-Tris ve 3-%8 Tris-asetat sayfa jelleri, saygıyla çözüldü HEK293T hücre lysates üzerinden. Denetim yükleniyor GAPDH için normalleştirilmiş çözünür kesir mHTT exon 1 çözünür monomer MG132 maruz göre dalgalanma gösterir. Çözünmez kesir HMW birikmiş mHTT tür MG132 tedavi ile aynı zamanda modülasyonlu gösterir. Batı leke ve filtre retardasyon analizleri kullanarak HeLa hücre lysates dan çözünür ve çözünmez kesirler (B) Analizi: HeLa hücreleri O'nun-SUMO-1 veya SUMO-2 ve/veya 97Q-HTT exon 1 ile transfected ve 5 mikron ile tedavi MG132 18 hr.* (C) için Çözünür ve çözünmez ayırma HeLa hücreleri 97Q-HTT exon 1 ve ya overexpressing overexpressed PIAS1 veya PIAS1 gösteri düzenleme potansiyel terapötik target.* (D) modülasyonlu sonra HMW mHTT birikimi, karşı bir siRNA ile tedavi Fare striata üzerinden çözünmez kesirler mikroRNA karşı PIAS1 ile tedavi ve 3-%8 Tris-asetat sayfa jelleri Haritayı modülasyon HWM çözünmez mHTT ** üzerinde çözüldü. Paneller (ABC) izni13ile değiştirildi. Paneli (D) izin1ile değiştirildi. * O'Rourke'ye gitti ve arkyayımlanmaktadır. 13 ile izni. ** Ochaba ve ark. yeniden basıldı 1 Elsevier izniyle. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/57082/57082fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Doku (başına yarıküre)</td>
			<td>Yaklaşık ağırlığı (mg)</td>
			<td>Birim çözünür (µL)</td>
			<td>Birim çözünmez (µL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>fare Striatum</td>
			<td>30</td>
			<td>250</td>
			<td>150</td>
		</tr>
<tr>
<td>fare korteks</td>
			<td>100</td>
			<td>500</td>
			<td>250</td>
		</tr>
<tr>
<td>farenin Hipokampus</td>
			<td>30</td>
			<td>250</td>
			<td>150</td>
		</tr>
<tr>
<td>fare beyincik</td>
			<td>40</td>
			<td>250</td>
			<td>150</td>
		</tr>
<tr>
<td>fare iskelet kas *</td>
			<td>100</td>
			<td>300</td>
			<td>150</td>
		</tr>
<tr>
<td>fare karaciğer (LOB)</td>
			<td>100</td>
			<td>400</td>
			<td>200</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">* bağ dokusu sütlü arabirimi oluşturur; kirlenmesini önlemek için Kaldır</td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: hem çözünür ve çözünmez lizis arabellekleri için doku özel ayırma birimleri (X) önerilir. Çözünmez lizis arabellek hacmi ayarlanabilir malzeme miktarını başlatılırken göre buna göre çözünmez Pelet boyutuna göre.

Watch this Scientific Journal Video about Fractionation for Resolution of Soluble and Insoluble Huntingtin Species at JoVE.com

Fractionation for Resolution of Soluble and Insoluble Huntingtin Species

Fare beyin ve hücre kültür çözünür ve çözünmez mutant huntingtin türlerinin ayırma için bir yöntemi açıklanmıştır. Açıklanan yöntemi karakterizasyonu ve miktar huntingtin protein akı ve protein homeostazı hastalık patogenezinde ve tedirginlikler huzurunda analiz AIDS için yararlıdır

Çözünür ve çözünmez Huntingtin türler çözümlenmesi için ayırma

The accumulation of misfolded proteins is central to pathology in Huntington's disease (HD) and many other neurodegenerative disorders. Specifically, a ...

fractionation-for-resolution-soluble-insoluble-huntingtin

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

9.5K Görüntüleme.  University of California Irvine. Fare beyin ve hücre kültür çözünür ve çözünmez mutant huntingtin türlerinin ayırma için bir yöntemi açıklanmıştır. Açıklanan yöntemi karakterizasyonu ve miktar huntingtin protein akı ve protein homeostazı hastalık patogenezinde ve tedirginlikler huzurunda analiz AIDS için yararlıdır

Video: Fractionation for Resolution of Soluble and Insoluble Huntingtin Species

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Assessing the synaptic protein composition and function constitutes an important challenge in neuroscience. However, it is not easy to evaluate neurotransmission that occurs within synapses because it is highly regulated by dynamic protein-protein interactions and phosphorylation events. Accordingly, when any method is used to study synaptic transmission, a major goal is to preserve these transient physiological modifications. Here, we present a brain membrane fractionation protocol that represents a robust procedure to isolate proteins belonging to different synaptic compartments. In other words, the protocol describes a biochemical methodology to carry out protein enrichment from presynaptic, postsynaptic, and extrasynaptic compartments. First, synaptosomes, or synaptic terminals, are obtained from neurons that contain all synaptic compartments by means of a discontinuous sucrose gradient. Of note, the quality of this initial synaptic membrane preparation is critical. Subsequently, the isolation of the different subsynaptic compartments is achieved with light solubilization using mild detergents at differential pH conditions. This allows for separation by gradient and isopycnic centrifugations. Finally, protein enrichment at the different subsynaptic compartments (i.e., pre-, post- and extrasynaptic membrane fractions) is validated by means of immunoblot analysis using well-characterized synaptic protein markers (i.e., SNAP-25, PSD-95, and synaptophysin, respectively), thus enabling a direct assessment of the synaptic distribution of any particular neuronal protein.

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

Here, we present a brain membrane fractionation protocol that represents a robust procedure to isolate proteins belonging to different synaptic compartments.

Beyin Membranı Fraksiyonu: Bir<emEx Vivo</em&gt; Subsınaptik Protein Lokalizasyonunu Değerlendirmede Yaklaşım

Assessing the synaptic protein composition and function constitutes an important challenge in neuroscience. However, it is not easy to evaluate ...

Biyokimya

Enrichment of Detergent-insoluble Protein Aggregates from Human Postmortem Brain

In this study, we describe an abbreviated single-step fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human postmortem brain. The ionic detergent N-lauryl-sarcosine (sarkosyl) effectively solubilizes natively folded proteins in brain tissue allowing the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from a wide range of neurodegenerative proteinopathies, such as Alzheimer&#39;s disease (AD), Parkinson&#39;s disease and amyotrophic lateral sclerosis, and prion diseases. Human control and AD postmortem brain tissues were homogenized and sedimented by ultracentrifugation in the presence of sarkosyl to enrich detergent-insoluble protein aggregates including pathologic phosphorylated tau, the core component of neurofibrillary tangles in AD. Western blotting demonstrated the differential solubility of aggregated phosphorylated-tau and the detergent-soluble protein, Early Endosome Antigen 1 (EEA1) in control and AD brain. Proteomic analysis also revealed enrichment of &#946;-amyloid (A&#946;), tau, snRNP70 (U1-70K), and apolipoprotein E (APOE) in the sarkosyl-insoluble fractions of AD brain compared to those of control, consistent with previous tissue fractionation strategies. Thus, this simple enrichment protocol is ideal for a wide range of experimental applications ranging from Western blotting and functional protein co-aggregation assays to mass spectrometry-based proteomics.

An abbreviated fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human postmortem brain is described.

Deterjan çözünmez Protein toplamları--dan insan öldükten sonra beyin zenginleştirme

In this study, we describe an abbreviated single-step fractionation protocol for the enrichment of detergent-insoluble protein aggregates from human ...

Method for Efficient Refolding and Purification of Chemoreceptor Ligand Binding Domain

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be greatly facilitated by the production of milligram amounts of pure, folded ligand binding domains. Attempts to heterologously express periplasmic ligand binding domains of bacterial chemoreceptors in Escherichia coli (E. coli) often result in their targeting into inclusion bodies. Here, a method is presented for protein recovery from inclusion bodies, its refolding and purification, using the periplasmic dCACHE ligand binding domain of Campylobacter jejuni (C. jejuni) chemoreceptor Tlp3 as an example. The approach involves expression of the protein of interest with a cleavable His6-tag, isolation and urea-mediated solubilisation of inclusion bodies, protein refolding by urea depletion, and purification by means of affinity chromatography, followed by tag removal and size-exclusion chromatography. The circular dichroism spectroscopy is used to confirm the folded state of the pure protein. It has been demonstrated that this protocol is generally useful for production of milligram amounts of dCACHE periplasmic ligand binding domains of other bacterial chemoreceptors in a soluble and crystallisable form.

A procedure is presented for the refolding of the dCACHE periplasmic ligand binding domain of Campylobacter jejuni chemoreceptor Tlp3 from inclusion bodies and the purification to yield milligram quantities of protein.

Verimli Refolding ve arıtma Chemoreceptor Ligand bağlayıcı etki için yöntemi

Identification of natural ligands of chemoreceptors and structural studies aimed at elucidation of the molecular basis of the ligand specificity can be ...

Generation of Native, Untagged Huntingtin Exon1 Monomer and Fibrils Using a SUMO Fusion Strategy

Huntington&#39;s Disease (HD) is an inherited fatal neurodegenerative disease caused by a CAG expansion (&#8805;36) in the first exon of the HD gene, resulting in the expression of the Huntingtin protein (Htt) or N-terminal fragments thereof with an expanded polyglutamine (polyQ) stretch.
The exon1 of the Huntingtin protein (Httex1) is the smallest Htt fragment that recapitulates many of the features of HD in cellular and animal models and is one of the most widely studied fragments of Htt. The small size of Httex1 makes it experimentally more amenable to biophysical characterization using standard and high-resolution techniques in comparison to longer fragments or full-length Htt. However, the high aggregation propensity of mutant Httex1 (mHttex1) with increased polyQ content (&#8805;42) has made it difficult to develop efficient expression and purification systems to produce these proteins in sufficient quantities and make them accessible to scientists from different disciplines without the use of fusion proteins or other strategies that alter the native sequence of the protein. We present here a robust and optimized method for the production of milligram quantities of native, tag-free Httex1 based on the transient fusion of small ubiquitin related modifier (SUMO). The simplicity and efficiency of the strategy will eliminate the need to use non-native sequences of Httex1, thus making this protein more accessible to researchers and improving the reproducibility of experiments across different laboratories. We believe that these advances will also facilitate future studies aimed at elucidating the structure-function relationship of Htt as well as developing novel diagnostic tools and therapies to treat or slow the progression of HD.

Here, we present a robust and optimized protocol for the production of milligram quantities of native, tag-free monomers and fibrils of the exon1 of the Huntingtin protein (Httex1) based on the transient fusion of small ubiquitin related modifier (SUMO).

Yerli, etiketsiz Huntingtin Exon1 Monomer ve SUMO Fusion strateji kullanarak liflerinde nesil

Huntington&#39;s Disease (HD) is an inherited fatal neurodegenerative disease caused by a CAG expansion (&#8805;36) in the first exon of the HD gene, ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium homeostasis, particularly store-operated calcium entry, which is critical to maintaining proper function of synaptic vesicle release and intracellular signaling pathways. Accordingly, TRPC channels have been implicated in a variety of human diseases including cardiovascular disorders such as cardiac hypertrophy, neurodegenerative disorders such as Parkinson&#39;s disease, and neurologic disorders such as spinocerebellar ataxia. Therefore, TRPC channels represent a potential pharmacologic target in human diseases. However, the molecular mechanisms of gating in these channels are still unclear. The difficulty in obtaining large quantities of stable, homogeneous, and purified protein has been a limiting factor in structure determination studies, particularly for mammalian membrane proteins such as the TRPC ion channels. Here, we present a protocol for the large-scale expression of mammalian ion channel membrane proteins using a modified baculovirus gene transfer system and the purification of these proteins by affinity and size-exclusion chromatography. We further present a protocol to collect single-particle cryo-electron microscopy images from purified protein and to use these images to determine the protein structure. Structure determination is a powerful method for understanding the mechanisms of gating and function in ion channels.

This protocol describes techniques used to determine ion channel structures by cryo-electron microscopy, including a baculovirus system used to efficiently express genes in mammalian cells with minimum effort and toxicity, protein extraction, purification, and quality checking, sample grid preparation and screening, as well as data collection and processing.

İfade ve insan Lipid duyarlı ba * kanal TRPC3 arınma için tek-parçacık Cryo-elektron mikroskobu ile yapısal kararlılık

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this superfamily generally display multi-functionality, involving mainly hydrolase and decarboxylase mechanisms. This article presents a series of consecutive methods for the expression and purification of FAHD proteins, mainly FAHD protein 1 (FAHD1) orthologues among species (human, mouse, nematodes, plants, etc.). Covered methods are protein expression in E. coli, affinity chromatography, ion exchange chromatography, preparative and analytical gel filtration, crystallization, X-ray diffraction, and photometric assays. Concentrated protein of high levels of purity (&#62;98%) may be employed for crystallization or antibody production. Proteins of similar or lower quality may be employed in enzyme assays or used as antigens in detection systems (Western-Blot, ELISA). In the discussion of this work, the identified enzymatic mechanisms of FAHD1 are outlined to describe its hydrolase and decarboxylase bi-functionality in more detail.

Expression and purification of fumarylacetoacetate hydrolase domain-containing proteins is described with examples (expression in E. coli, FPLC). Purified proteins are used for crystallization and antibody production and employed for enzyme assays. Selected photometric assays are presented to display the multi-functionality of FAHD1 as oxaloacetate decarboxylase and acylpyruvate hydrolase.

Fumarylacetoasetat Hydrolase etki alanı Içeren proteinleri ifade, arıtma, kristalizasyon ve enzim Asdimleri

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Efficient and Scalable Production of Full-length Human Huntingtin Variants in Mammalian Cells using a Transient Expression System

Full-length huntingtin (FL HTT) is a large (aa 1-3,144), ubiquitously expressed, polyglutamine (polyQ)-containing protein with a mass of approximately 350 kDa. While the cellular function of FL HTT is not entirely understood, a mutant expansion of the polyQ tract above ~36 repeats is associated with Huntington's disease (HD), with the polyQ length correlating roughly with the age of onset. To better understand the effect of structure on the function of mutant HTT (mHTT), large quantities of the protein are required. Submilligram production of FL HTT in mammalian cells was achieved using doxycycline-inducible stable cell line expression. However, protein production from stable cell lines has limitations that can be overcome with transient transfection methods. 
This paper presents a robust method for low-milligram quantity production of FL HTT and its variants from codon-optimized plasmids by transient transfection using polyethylenimine (PEI). The method is scalable (&gt;10 mg) and consistently yields 1-2 mg/L of cell culture of highly purified FL HTT. Consistent with previous reports, the purified solution state of FL HTT was found to be highly dynamic; the protein has a propensity to form dimers and high-order oligomers. A key to slowing oligomer formation is working quickly to isolate the monomeric fractions from the dimeric and high-order oligomeric fractions during size exclusion chromatography. 
Size exclusion chromatography with multiangle light scattering (SEC-MALS) was used to analyze the dimer and higher-order oligomeric content of purified HTT. No correlation was observed between FL HTT polyQ length (Q23, Q48, and Q73) and oligomer content. The exon1-deleted construct (aa 91-3,144) showed comparable oligomerization propensity to FL HTT (aa 1-3,144). Production, purification, and characterization methods by SEC/MALS-refractive index (RI), sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), western blot, Native PAGE, and Blue Native PAGE are described herein.

We provide scalable protocols covering construct design, transient transfection, and expression and purification of full-length human huntingtin protein variants in HEK293 cells.

Geçici İfade Sistemi Kullanarak Memeli Hücrelerinde Tam Boy İnsan Huntingtin Varyantlarının Verimli ve Ölçeklenebilir Üretimi

Full-length huntingtin (FL HTT) is a large (aa 1-3,144), ubiquitously expressed, polyglutamine (polyQ)-containing protein with a mass of approximately 350 ...

Extraction and Purification of FAHD1 Protein from Swine Kidney and Mouse Liver

Fumarylacetoacetate hydrolase domain-containing protein 1 (FAHD1) is the first identified member of the FAH superfamily in eukaryotes, acting as oxaloacetate decarboxylase in mitochondria. This article presents a series of methods for the extraction and purification of FAHD1 from swine kidney and mouse liver. Covered methods are ionic exchange chromatography with fast protein liquid chromatography (FPLC), preparative and analytical gel filtration with FPLC, and proteomic approaches. After total protein extraction, ammonium sulfate precipitation and ionic exchange chromatography were explored, and FAHD1 was extracted via a sequential strategy using ionic exchange and size-exclusion chromatography. This representative approach may be adapted to other proteins of interest (expressed at significant levels) and modified for other tissues. Purified protein from tissue may support the development of high-quality antibodies, and/or potent and specific pharmacological inhibitors.

This protocol describes how to extract fumarylacetoacetate hydrolase domain-containing protein 1 (FAHD1) from swine kidney and mouse liver. The listed methods may be adapted to other proteins of interest and modified for other tissues.

FAHD1 Proteininin Domuz Böbreği ve Fare Karaciğerinden Ekstraksiyonu ve Saflaştırılması

Fumarylacetoacetate hydrolase domain-containing protein 1 (FAHD1) is the first identified member of the FAH superfamily in eukaryotes, acting as ...

Purification of Hsp104, a Protein Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key selective advantages. First, renaturation of disordered aggregates by Hsp104 empowers yeast survival after various protein-misfolding stresses, including heat shock3,5,11,12. Second, remodeling of cross-beta amyloid fibrils by Hsp104 enables yeast to exploit myriad prions (infectious amyloids) as a reservoir of beneficial and heritable phenotypic variation13-22. Remarkably, Hsp104 directly remodels preamyloid oligomers and amyloid fibrils, including those comprised of the yeast prion proteins Sup35 and Ure223-30. This amyloid-remodeling functionality is a specialized facet of yeast Hsp104. The E. coli orthologue, ClpB, fails to remodel preamyloid oligomers or amyloid fibrils26,31,32.
Hsp104 orthologues are found in all kingdoms of life except, perplexingly, animals. Indeed, whether animal cells possess any enzymatic system that couples protein disaggregation to renaturation (rather than degradation) remains unknown33-35. Thus, we and others have proposed that Hsp104 might be developed as a therapeutic agent for various neurodegenerative diseases connected with the misfolding of specific proteins into toxic preamyloid oligomers and amyloid fibrils4,7,23,36-38. There are no treatments that directly target the aggregated species associated with these diseases. Yet, Hsp104 dissolves toxic oligomers and amyloid fibrils composed of alpha-synuclein, which are connected with Parkinson's Disease23 as well as amyloid forms of PrP39. Importantly, Hsp104 reduces protein aggregation and ameliorates neurodegeneration in rodent models of Parkinson's Disease23 and Huntington's disease38. Ideally, to optimize therapy and minimize side effects, Hsp104 would be engineered and potentiated to selectively remodel specific aggregates central to the disease in question4,7. However, the limited structural and mechanistic understanding of how Hsp104 disaggregates such a diverse repertoire of aggregated structures and unrelated proteins frustrates these endeavors30,40-42.
To understand the structure and mechanism of Hsp104, it is essential to study the pure protein and reconstitute its disaggregase activity with minimal components. Hsp104 is a 102kDa protein with a pI of ~5.3, which hexamerizes in the presence of ADP or ATP, or at high protein concentrations in the absence of nucleotide43-46. Here, we describe an optimized protocol for the purification of highly active, stable Hsp104 from E. coli. The use of E. coli allows simplified large-scale production and our method can be performed quickly and reliably for numerous Hsp104 variants. Our protocol increases Hsp104 purity and simplifies His6-tag removal compared to a previous purification method from E. coli47. Moreover, our protocol is more facile and convenient than two more recent protocols26,48.

Here, we describe a protocol for the purification of highly active Hsp104, a hexameric AAA+ protein from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation. This scheme exploits a His6-tagged construct for affinity purification from E. coli followed by anion-exchange chromatography, His6-tag removal with TEV protease, and size-exclusion chromatography.

Hsp104 saflaştırılması, Protein Disaggregase

Hsp104 is a hexameric AAA+ protein1 from yeast, which couples ATP hydrolysis to protein disaggregation2-10 (Fig. 1). This activity imparts two key ...

Biyoloji

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

Rapid responses involving fast redistribution of messenger(m)RNA and alterations of mRNA translation are pertinent to ongoing homeostatic adjustments of the cells. These adjustments are critical to eukaryotic cell survivability and &#39;damage control&#39; during fluctuating nutrient and salinity levels, temperature, and various chemical and radiation stresses. Due to the highly dynamic nature of the RNA-level responses, and the instability of many of the RNA:RNA and RNA:protein intermediates, obtaining a meaningful snapshot of the cytoplasmic RNA state is only possible with a limited number of methods. Transcriptome-wide, RNA-seq-based ribosome profiling-type experiments are among the most informative sources of data for the control of translation. However, absence of a uniform RNA and RNA:protein intermediate stabilization can lead to different biases, particularly in the fast-paced cellular response pathways. In this article, we provide a detailed protocol of rapid fixation applicable to eukaryotic cells of different permeability, to aid in RNA and RNA:protein intermediate stabilization. We further provide examples of isolation of the stabilized RNA:protein complexes based on their co-sedimentation with ribosomal and poly(ribo)somal fractions. The separated stabilized material can be subsequently used as part of ribosome profiling-type experiments, such as in Translation Complex Profile sequencing (TCP-seq) approach and its derivatives. Versatility of the TCP-seq-style methods has now been demonstrated by the applications in a variety of organisms and cell types. The stabilized complexes can also be additionally affinity-purified and imaged using electron microscopy, separated into different poly(ribo)somal fractions and subjected to RNA sequencing, owing to the ease of the crosslink reversal. Therefore, methods based on snap-chilling and formaldehyde fixation, followed by the sedimentation-based or other type of RNA:protein complex enrichment, can be of particular interest in investigating finer details of rapid RNA:protein complex dynamics in live cells.

Rapid In Vivo Fixation and Isolation of Translational Complexes from Eukaryotic Cells

We present a technique to rapidly stabilize translational (protein biosynthesis) complexes with formaldehyde crosslinking in live yeast and mammalian cells. The approach enables dissecting transient intermediates and dynamic RNA:protein interactions. The crosslinked complexes can be used in multiple downstream applications such as in deep sequencing-based profiling methods, microscopy, and mass-spectrometry.

Ökaryotik Hücrelerden Çeviri Komplekslerinin Hızlı In Vivo Fiksasyonu ve İzolasyonu

Rapid responses involving fast redistribution of messenger(m)RNA and alterations of mRNA translation are pertinent to ongoing homeostatic adjustments of ...