Biz araştırma Federasyon FRABio ve TisBio görüntüleme platformu için borçlu bulunmaktadır (Univ. Lille, CNRS, FR 3688, FRABio, BiochimieStructurale et Fonctionnelle des buluntu Biomoléculaires) bu ulaşmak için elverişli teknik ortamı sağlamak için iş.

Not: Sıvı ve katı ½ MS medya ek tablo 1' de açıklandığı gibi önceden hazırlanmış olması gerekir.
1. bitki kültürü
<ol><li>
2 aylık Keten bitki kültürü
	<ol>
<li>Plastik tencere Çömlekçilik kompost kullanarak keten (Linum usitatissimum L.) tohumları ekmek.</li>
		<li>Büyümek büyüme odalarında bir photoperiod 16 h/8 h ile 22 ° C'de keten/gündüz.</li>
		<li>1 ay sonra dikey destek bitkilerle donatmak ve 2 aylık onlar kadar büyür.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Kültür 2 haftalık keten fidan
	<ol>
<li>12 keten tohumu bir parça peynir bez sarın ve bir paket yapmak için bir lastik bant ile düzeltmek. Not: sonraki adımlar laminar akış duman başlık altında steril koşullarda yerine getirir.</li>
		<li>Tohum paket bir daha önce autoclaved 250 mL cam şişe yerleştirin.</li>
		<li>% 70 70 mL ekleyin alkol şişe ve yavaşça 1 dakika karıştırın.</li>
		<li>Dikkatli bir şekilde şişeye paket bırakarak decantation tarafından alkol çıkarın.</li>
		<li>100 mL % 2 sodyum hipoklorit ekleyin ve 10 dakika hafifçe karıştırın.</li>
		<li>Sodyum hipoklorit çözüm şişede paket bırakarak decantation çıkarın.</li>
		<li>Adımları 1.2.5-1.2.6 tekrarlayın.</li>
		<li>100 mL steril ultrasaf su ekleyin ve 1 dakika karıştırın.</li>
		<li>1.2.8 3 kez, her durulama (5, 10 ve 15 dk) durulama süre artan adımları yineleyin.</li>
		<li>Katı ½ MS orta sıcak, bir steril bitki kültür kutuda 2 cm yüksekliğinde dök ve katılaşma kadar aşağı soğumaya bırakın.</li>
		<li>Kibar bir şekilde her tohum steril forseps kullanarak katı medyada yer.</li>
		<li>Steril kutusunu kapatın.</li>
		<li>Kutuyu bir büyüme odası ile bir photoperiod 16 h/8 h 22 ° C'de transfer gündüz/gece ve 2 hafta boyunca keten fidan büyümeye.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. metabolik kimyasal gazetecilere birleşmesiyle
Not: Üç modeller aşağıda sunulmuştur: i) metabolik etiketleme kök kesit, II) bütün kaynaklanıyor ve III) bitki fidesi. Her iletişim kuralı için bir biyolojik REPLICATE sunulur ve miktarları gerekli biyolojik çoğaltır sayıya adapte edilebilir. Monolignol çözümler deneme önce Tablo 2 ' de açıklandığı gibi yapılır stok çözümlerinden hazırlanır. Hisse senedi çözümleri-20 ° C'de birkaç ay saklanabilir HAZ: GALK veya H:G oranlarını tüm özel yapım deneysel tasarımlar uyacak şekilde ayarlanabilir.
<ol><li>2 aylık keten kök kesit içine kimyasal muhabir birleşme
	<ol>
<li>GALK 10 µM ve HAZ 10 µM sıvı steril ½ MS orta içeren bir 300 µL kimyasal muhabir çözüm hazırlamak.</li>
		<li>Girdap HAZ/GALK çözüm ve bir micropipette 48-şey plakalı bir kuyu aktarmak.</li>
		<li>10 µM g ve H 10 µM sıvı steril ½ MS orta içeren 300 µL negatif kontrol çözümü hazırlayın.</li>
		<li>Girdap H/G çözüm ve aynı 48-şey plaka ikinci bir kuyu için transfer.</li>
		<li>Yeni jilet kullanarak toprak seviyesinden 10 cm 2 aylık Keten bitki kök kesmek.</li>
		<li>İnce 50 serbest enine kesit jilet (yaklaşık 150-250 µm kalınlığında) kullanarak kök hazırlamak.</li>
		<li>Hemen izle cam sıvı steril ½ MS orta kesit yerleştirin.</li>
		<li>Kontrol edin ve bozulmamış tüm kesit seçin ve rasgele 10 tanesi de HAZile dolu, dağıtmak /GALK çözüm.</li>
		<li>Adımı yineleyin 2.1.8 de dolu için h/G çözüm (olarak negatif kontrol).</li>
		<li>Bir de (floresan temel confocal mikroskobu görüntülerin sonraki veri işleme sırasında ayarlamak için arka plan denetimi) olarak ½ MS orta 300 µL ile dolu üçüncü için 2.1.8 arasındaki adımları yineleyin.</li>
		<li>Sürekli bir büyüme odası 20 h için 20 ° C'de ışıkta plaka kuluçkaya.</li>
		<li>Her iyi bir micropipette ile monolignol çözüm kaldırın.</li>
		<li>Her şey için 500 µL ½ MS orta ekleyin, 10 dakikadır hafifçe karıştırın ve bu çözüm bir micropipette ile durulama kaldırın. 4 kez tekrarlayın ve hemen etiketleme BLISS (Bölüm 3) devam edin.</li>
	</ol></li>
	<li>2 aylık keten bütün kaynaklanıyor içine kimyasal muhabir birleşme
	<ol>
<li>GALK 10 µM ve HAZ 10 µM sıvı steril ½ MS orta içeren bir 5 mL kimyasal muhabir çözüm hazırlamak.</li>
		<li>Girdap HAZ/GALK çözüm ve transfer için bir 20 cm yüksek cam test tüp bir pipet ile.</li>
		<li>10 µM g ve H 10 µM sıvı steril ½ MS orta içeren 5 mL negatif kontrol çözümü hazırlayın.</li>
		<li>Girdap H/G çözüm ve transfer için bir 20 cm yüksek cam test tüp.</li>
		<li>(Floresan temel confocal mikroskobu görüntülerin sonraki veri işleme sırasında ayarlamak için arka plan denetimi) olarak ½ MS orta 5 mL içeren üçüncü bir cam test tüpü hazırlayın.</li>
		<li>Yeni jilet kullanarak toprak seviyesinden 10 cm 2 aylık Keten bitki kök kesmek. Kök sistemi ve kök alt kısmı atın ve bitki kök üst kısmındaki sonraki adıma geçin.</li>
		<li>HAZiçeren tüp içinde bütün kesilmiş kök Bankası sokmak /GALK çözüm. Kök kuluçka çözüm kurumasını önlemek için hemen kök sistemi kaldırıldıktan sonra yerleştirin. Not: küçük/büyük bitkiler ve/veya diğer türler için yöntem uygulanırsa, monolignol çözümleri hacmi büyüklüğüne göre ayarlanması gerekir / yaş bitki ve onun kök çapı.</li>
		<li>Kök düz tutmak için dikey bir destek ekleyin.</li>
		<li>Cam tüp çözüm buharlaşma önlemek için parafilm ile kapatın.</li>
		<li>Hile negatif kontrol örneği için adımları 2.2.6-2.2.9 tekrar /G çözüm.</li>
		<li>Adımları 2.2.6-2.2.9 ½ MS orta içeren floresan arka plan denetimi örneğini için yineleyin.</li>
		<li>Her kök sürekli ışık neon ışık kullanarak 20 h için kuluçkaya.</li>
		<li>Metabolik şirketleşme 20 h sonra HAZinkübe kök kaldırmak /GALK çözüm ve ½ MS orta ile durulayın.</li>
		<li>Kesip alt jilet kullanarak kök 1 cm atmak ve 1 cm yüksek silindir kalan kök tabanından hazır olun.</li>
		<li>Dikkatle 20 serbest enine kesit (yaklaşık 150-250 µm kalınlığında) üzerinden bu silindir hazırlamak ve hemen izle ½ MS orta ile dolu bir bardak koyun.</li>
		<li>½ MS orta 500 µL 48-şey plaka bir kuyuda koymak.</li>
		<li>Kontrol edin ve bozulmamış tüm kesit seçin ve rasgele 10 tanesi ½ MS çözümü ile dolu iyi dağıtmak.</li>
		<li>2.2.13-2.2.17 H/G çözüm ile inkübe negatif kontrol kök için adımları yineleyin.</li>
		<li>Adımları 2.2.13-2.2.17 floresan arka plan denetimi kök için ½ MS orta ile inkübe yineleyin.</li>
		<li>Dikkatli bir şekilde çözüm her iyi bir micropipette ile çıkarın.</li>
		<li>Her şey için 500 µL ½ MS orta ekleyin, 10 dakikadır hafifçe karıştırın ve bu çözüm bir micropipette ile durulama kaldırın. 4 kez tekrarlayın ve hemen etiketleme BLISS (Bölüm 3) devam edin.</li>
	</ol></li>
	<li>2 haftalık keten fidan içine kimyasal muhabir birleşme Not: Aşağıdaki adımları tüm steril koşullar altında yapılmaktadır.<ol>
<li>GALK 10 µM ve HAZ 10 µM sıvı steril ½ MS orta içeren bir 2 mL kimyasal muhabir çözüm hazırlamak.</li>
		<li>Girdap HAZ/GALK çözüm ve transfer için bir 20 cm yüksekliğindeki cam test tüp bir pipet ile.</li>
		<li>10 µM g ve H 10 µM sıvı steril ½ MS orta içeren 2 mL negatif kontrol çözümü hazırlayın.</li>
		<li>Girdap H/G çözüm ve transfer için bir 20 cm yüksekliğindeki cam test tüp.</li>
		<li>(Floresan temel confocal mikroskobu görüntülerin sonraki veri işleme sırasında ayarlamak için arka plan denetimi) olarak ½ MS orta 2 mL içeren üçüncü bir 20 cm yüksek cam test tüpü hazırlayın.</li>
		<li>İnce uzun bir çift cımbız kullanarak katı ½ MS ortamından bir 2 haftalık keten fide kaldırmak (Bölüm 1.2. yukarıda).</li>
		<li>Yavaşça fide HAZiçeren tüp transferi /GALK çözüm, kökleri çözümde daldırılır sağlanması.</li>
		<li>Cam tüp buharlaşma önlemek için plastik bir kap ile kapatın.</li>
		<li>H ile negatif kontrol tüp için adımları 2.3.6-2.3.8 tekrar / G çözüm.</li>
		<li>Adımları 2.3.6-2.3.8 ½ MS orta içeren floresan arka plan denetimi tüp için yineleyin.</li>
		<li>Sürekli ışık 20 ° C'de 20 h için büyüme odasında her fide kuluçkaya</li>
		<li>İnce HAZinkübe fide kaldırmak /GALK çözüm ve ½ MS orta ile durulayın.</li>
		<li>İnce 20 serbest kesit (kalın approximatively 150-250 µm) hypocotyl, hazır olun.</li>
		<li>½ MS orta 500 µL 48-şey plaka bir kuyuda koymak.</li>
		<li>Kontrol edin ve bozulmamış tüm kesit seçin ve rasgele 10 tanesi ½ MS çözümü ile dolu iyi dağıtmak.</li>
		<li>2.3.12-2.3.15 H/G çözüm ile inkübe negatif kontrol fide için adımları yineleyin.</li>
		<li>Adımları 2.3.12-2.3.15 floresan arka plan denetimi fide için ½ MS orta ile inkübe yineleyin.</li>
		<li>Dikkatli bir şekilde çözüm her iyi bir micropipette ile çıkarın.</li>
		<li>Her şey için 500 µL ½ MS orta ekleyin, 10 dakikadır hafifçe karıştırın ve bu çözüm bir micropipette ile durulama kaldırın. 4 kez tekrarlayın ve hemen etiketleme BLISS (Bölüm 3) devam edin.</li>
	</ol></li>
</ol>3. çift floresan bitki kesit örnekleri SPAAC ve CuAAC tarafından etiketlerine göre
Not: Protokolü etiketleme BLISS tüm 3 deneysel modeller (Bölüm 2) için aynıdır.
<ol><li>
Zorlanma terfi azid ALKİN Cycloaddition (SPAAC) etiketleme
	<ol>
<li>1 mL DBCO-PEG4-5 5 mikron içeren bir SPAAC çözeltisi hazırlamak/6-carboxyrhodamine 110 sıvı steril ½ MS orta. Girdap çözüm ve karanlıkta tut.</li>
		<li>Son yıkama sonrası adımları [2.1.13, 2.2.21 veya 2.3.19 bağlı olarak seçilen deneysel tasarım], metabolik kuruluş protokolünün ½ MS orta kaldırın ve SPAAC çözüm iyi bir micropipette ile başına 300 µL ekleyin.</li>
		<li>Işık 48-şey plaka kaplama alüminyum folyo ile veya bir kutuya yerleştirerek kalkan.</li>
		<li>Hafifçe plaka üzerinde karanlık ortam sıcaklığında 1 h için mekanik bir shaker karıştırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bakır katalize azid ALKİN Cycloaddition (CuAAC) etiketleme
	<ol>
<li>Her şey 4 kez adım 2.1.13 açıklandığı gibi karanlıkta plaka tutarken yıkayın.</li>
		<li>1 mL 2.5 mM sodyum askorbat, 0,5 mM CuSO4 ve 5-TAMRA-PEG35 mikron içeren bir CuAAC çözeltisi hazırlamak-azid sıvı steril ½ MS orta. Girdap çözüm ve karanlıkta tut. Not: Bu CuAAC çözüm kullanmadan önce taze hazırlanmalıdır ve birkaç gün 4 ° C'de depolanan</li>
		<li>½ MS orta her kuyuya kaldırın ve doğrudan 300 µL iyi bir micropipette kullanarak başına CuAAC çözüm ekleyin.</li>
		<li>Hafifçe plaka üzerinde karanlık ortam sıcaklığında 1 h için mekanik bir shaker karıştırın.</li>
		<li>Bir micropipette kullanarak CuAAC çözüm kaldırın.</li>
		<li>Bir micropipette kullanarak, ½ MS 500 µL ekleyin, 10 min için karanlık ilave edin sonra bu yıkama çözüm kaldırın. İki kez tekrarlayın.</li>
		<li>7:3 MeOH/su solüsyonu 500 µL ekleyin, 1 h için karanlık ilave edin sonra çözüm kaldırma Dikkat: Metanol ciltle temas veya inhalasyon tarafından toksik ve bir insan kanserojen atanır. Onun kullanımı kimyasal duman davlumbaz ve eldiven gerektirir.</li>
		<li>½ MS 500 µL ekleyin, 10 min için karanlık ilave edin sonra çözümü kaldırın. 4 kere tekrar edin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. mikroskop örnekleri montajı slaytlar
<ol><li>Montaj orta cam mikroskop Slayttaki yer 5 bırakır.</li>
	<li>Dikkatle her HAZdepozito /GALKtagged kesiti slayt üzerinde.</li>
	<li>Tırnak cilası slaydın iki karşı taraflarda uygulanır.</li>
	<li>Bir coverslip slaytla kapsar. Hava kabarcıklarını önlemek dikkatli olun.</li>
	<li>Aşırı montaj orta bir kağıt havlu kullanarak kaldırın.</li>
	<li>Tırnak cilası her 4 tarafında örnekle kapatın. Oda sıcaklığında (yaklaşık 30 dakika) kuru vernik çivi ver.</li>
	<li>4.1-4,6 negatif kontrol H/G kesit için yineleyin.</li>
	<li>4.1-4,6 floresan arka plan denetimi kesit için yineleyin.</li>
	<li>4 ° C'de slaytları gözlem confocal mikroskop altında kadar karanlıkta depolama. Not: Hazırlanan slaytlar hazırlık kalitesine bağlı olarak birkaç ay birkaç hafta saklanır. Yeni bir gözlem depolama sonra yapılacak ise, örnekleri kurumuş olduğunu değil emin olun.</li>
</ol>5. resim alma tarafından Confocal Floresans mikroskobu
<ol><li>Üreticinin yönergelerine göre doğru düzende confocal mikroskobu sisteminin tüm gerekli birimler açın.</li>
	<li>Maksimal sayısal diyafram ile istediğiniz hedefi seçin ve uyarma ve emisyon dalga boylarında uyarlanmış (örneğin, obj 60 x, N.A. 1.2. Autofluorescence kanal: λex 405 nm, λem 450 nm /25; SPAAC HAZ kanal: λex 488 nm, λem 525 nm /25; CuAAC GALK kanal: λex 561 nm, λem 595 nm /25; Sıralı modu).</li>
	<li>Yazılım (12 veya 16 gerekli, bit piksel boyutunu Nyquist kriteri için uyarlanmış) Albümdeki nesil için istenen parametrelerini seçin.</li>
	<li>HAZ/GALK slayt mikroskop sahnesinde yerini ve objektif mercek altında örnek konumlandırın.</li>
	<li>Gözlemlemek ve bitki dokusunun istediğiniz bölgesini bulun.</li>
	<li>
Yüksek kaliteli iki kat etiketli HAZ/G confocal görüntülerini eldeALK örnek.
	<ol>
<li>En floresan uçağa z ekseni seçin.</li>
		<li>Kazanç, ayarlamak en iyi sinyal dağıtım her kanal (autofluorescence, HAZ ve GALK) için tüm gri düzeyi aralığı boyunca elde etmek için uzaklık ve lazer güç. Aynı parametreleri aşağıdaki satın almalar için uygulanması gerekir.</li>
		<li>Seçili resmin edinimi başlatın ve dosyayı kaydedin. Örnek ilgili her alanı için yineleyin. Not: 3D Z-yığın rekonstrüksiyonlar Ayrıca gerekirse elde edilebilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aynı ayarları kullanarak, yalnızca autofluorescence düzeyi (2 bölümde açıklandığı gibi floresan arka plan denetimi) belirlemek için ½ MS inkübe etiketsiz örnek görüntüleri elde etmek.</li>
	<li>Aynı ayarları kullanarak, yerel monolignols belirsiz fluorophore yapışma örnek belirlemek için H/G ile inkübe negatif kontrol örnekleri için görüntüleri elde etmek.</li>
	<li>Veri tedavi çıkarma arka plan autofluorescence sinyalleri H/G negatif kontrol görüntüleri ve HAZ/GALK görüntüleri elde edilen görüntülere uygulanır.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Grammel, M., Hang, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+reporters+for+biological+discovery.">Chemical reporters for biological discovery.</a> Nat Chem Biol. 9 (8), 475-484 (2013).</li><li>Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry+in+living+systems.">Chemistry in living systems.</a> Nat Chem Biol. 1 (1), 13-21 (2005).</li><li>Sletten, E. M., Bertozzi, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioorthogonal+chemistry:+fishing+for+selectivity+in+a+sea+of+functionality.">Bioorthogonal chemistry: fishing for selectivity in a sea of functionality.</a> Ange Chemie (Int Ed. Engl). 48 (38), 6974-6998 (2009).</li><li>Chang, P. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+labeling+of+sialic+acids+in+living+animals+with+alkynyl+sugars.">Metabolic labeling of sialic acids in living animals with alkynyl sugars.</a> Ange Chemie (Int Ed. Engl). 48 (22), 4030-4033 (2009).</li><li>Gilormini, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sequential+bioorthogonal+dual+strategy:+ManNAl+and+SiaNAl+as+distinct+tools+to+unravel+sialic+acid+metabolic+pathways.">A sequential bioorthogonal dual strategy: ManNAl and SiaNAl as distinct tools to unravel sialic acid metabolic pathways.</a> Chem. Commun. 52 (11), 2318-2321 (2016).</li><li>Mbua, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+accumulation+and+recycling+of+glycoproteins+visualized+in+Niemann-Pick+type+C+cells+using+the+chemical+reporter+strategy.">Abnormal accumulation and recycling of glycoproteins visualized in Niemann-Pick type C cells using the chemical reporter strategy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (25), 10207-10212 (2013).</li><li>Anderson, C. T., Wallace, I. S., Somerville, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+click-labeling+with+a+fucose+analog+reveals+pectin+delivery,+architecture,+and+dynamics+in+Arabidopsis+cell+walls.">Metabolic click-labeling with a fucose analog reveals pectin delivery, architecture, and dynamics in Arabidopsis cell walls.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (4), 1329-1334 (2012).</li><li>Tobimatsu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+click+chemistry+strategy+for+visualization+of+plant+cell+wall+lignification.">A click chemistry strategy for visualization of plant cell wall lignification.</a> Chem. Commun. 50 (82), 12262-12265 (2014).</li><li>Bukowski, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+clickable+designer+monolignol+for+interrogation+of+lignification+in+plant+cell+walls.">Development of a clickable designer monolignol for interrogation of lignification in plant cell walls.</a> Bioconjugate Chem. 25 (12), 2189-2196 (2014).</li><li>Pandey, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+click-compatible+monolignol+probe+to+study+lignin+deposition+in+plant+cell+walls.">A versatile click-compatible monolignol probe to study lignin deposition in plant cell walls.</a> PLOS ONE. 10 (4), e0121334 (2015).</li><li>Pandey, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+biochemical+and+developmental+dependencies+of+lignification+with+a+click-compatible+monolignol+analog+in+Arabidopsis+thaliana+stems.">Investigating biochemical and developmental dependencies of lignification with a click-compatible monolignol analog in Arabidopsis thaliana stems.</a> Front Plant Sci. 7, (2016).</li><li>Zhu, Y., Wu, J., Chen, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+labeling+and+imaging+of+N-linked+glycans+in+Arabidopsis+thaliana.">Metabolic labeling and imaging of N-linked glycans in Arabidopsis thaliana.</a> Ange Chemie (Int Ed. Engl). 55 (32), 9301-9305 (2016).</li><li>Boerjan, W., Ralph, J., Baucher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lignin+biosynthesis.">Lignin biosynthesis.</a> Annu Rev Plant Biol. 54, 519-546 (2003).</li><li>Weng, J. -. K., Chapple, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+and+evolution+of+lignin+biosynthesis.">The origin and evolution of lignin biosynthesis.</a> New Phytol. 187 (2), 273-285 (2010).</li><li>Mottiar, Y., Vanholme, R., Boerjan, W., Ralph, J., Mansfield, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designer+lignins:+harnessing+the+plasticity+of+lignification.">Designer lignins: harnessing the plasticity of lignification.</a> Curr Opin Biotechnol. 37, 190-200 (2016).</li><li>Rinaldi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paving+the+way+for+lignin+valorisation:+recent+advances+in+bioengineering,+biorefining+and+catalysis.">Paving the way for lignin valorisation: recent advances in bioengineering, biorefining and catalysis.</a> Ange Chemie (Int Ed). 55 (29), 8164-8215 (2016).</li><li>Wratil, P. R., Horstkorte, R., Reutter, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+glycoengineering+with+N-acyl+side+chain+modified+mannosamines.">Metabolic glycoengineering with N-acyl side chain modified mannosamines.</a> Ange Chemie (Int Ed. Engl). 55 (33), 9482-9512 (2016).</li><li>Feng, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bifunctional+unnatural+sialic+acids+for+dual+metabolic+labeling+of+cell-surface+sialylated+glycans.">Bifunctional unnatural sialic acids for dual metabolic labeling of cell-surface sialylated glycans.</a> J Am Chem Soc. 135 (25), 9244-9247 (2013).</li><li>Dumont, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+cell+wall+imaging+by+metabolic+click-mediated+labelling+of+rhamnogalacturonan+II+using+azido+3-deoxy-+d+-+manno+-oct-2-ulosonic+acid.">Plant cell wall imaging by metabolic click-mediated labelling of rhamnogalacturonan II using azido 3-deoxy- d - manno -oct-2-ulosonic acid.</a> Plant J. 85 (3), 437-447 (2016).</li><li>Niederwieser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-color+glycan+labeling+of+live+cells+by+a+combination+of+Diels-Alder+and+click+chemistry.">Two-color glycan labeling of live cells by a combination of Diels-Alder and click chemistry.</a> Ange Chemie Int Ed. 52 (15), 4265-4268 (2013).</li><li>Sp&#228;te, A. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+potential+of+norbornene-modified+mannosamine+derivatives+for+metabolic+glycoengineering.">Exploring the potential of norbornene-modified mannosamine derivatives for metabolic glycoengineering.</a> Chem Bio Chem. 17 (14), 1374-1383 (2016).</li><li>Sp&#228;te, A. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Labeling+of+metabolically+engineered+cell-surface+glycoconjugates+with+a+carbamate-linked+cyclopropene+reporter.">Rapid Labeling of metabolically engineered cell-surface glycoconjugates with a carbamate-linked cyclopropene reporter.</a> Bioconjugate Chem. 25 (1), 147-154 (2014).</li><li>Lion, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BLISS:+a+bioorthogonal+dual-labeling+strategy+to+unravel+lignification+dynamics+in+plants.">BLISS: a bioorthogonal dual-labeling strategy to unravel lignification dynamics in plants.</a> Cell Chem Biol. 24 (3), 326-338 (2017).</li><li>del R&#237;o, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+characterization+of+guaiacyl-rich+lignins+in+flax+(Linum+usitatissimum)+fibers+and+shives.">Structural characterization of guaiacyl-rich lignins in flax (Linum usitatissimum) fibers and shives.</a> J Agric Food Chemist. 59 (20), 11088-11099 (2011).</li><li>Huis, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+hypolignification+is+associated+with+extensive+oligolignol+accumulation+in+flax+stems.">Natural hypolignification is associated with extensive oligolignol accumulation in flax stems.</a> Plant Physiol. 158 (4), 1893-1915 (2012).</li><li>Chantreau, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectopic+lignification+in+the+flax+lignified+bast+fiber1+mutant+stem+is+associated+with+tissue-specific+modifications+in+gene+expression+and+cell+wall+composition.">Ectopic lignification in the flax lignified bast fiber1 mutant stem is associated with tissue-specific modifications in gene expression and cell wall composition.</a> The Plant Cell. 26 (11), 4462-4482 (2014).</li><li>Terashima, N., Ko, C., Matsushita, Y., Westermark, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monolignol+glucosides+as+intermediate+compounds+in+lignin+biosynthesis.+Revisiting+the+cell+wall+lignification+and+new+13C-tracer+experiments+with+Ginkgo+biloba+and+Magnolia+liliiflora.">Monolignol glucosides as intermediate compounds in lignin biosynthesis. Revisiting the cell wall lignification and new 13C-tracer experiments with Ginkgo biloba and Magnolia liliiflora.</a> Holzforschung. 70 (9), 801-810 (2016).</li><li>Noel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+CMP-sialic+acid+donor+specificity+of+two+human+&#946;-d-galactoside+sialyltransferases+(ST3Gal+I+and+ST6Gal+I)+selectively+acting+on+O-+and+N-glycosylproteins.">Probing the CMP-sialic acid donor specificity of two human &#946;-d-galactoside sialyltransferases (ST3Gal I and ST6Gal I) selectively acting on O- and N-glycosylproteins.</a> Chembiochem: Eur J Chem Biol. , (2017).</li></ol>

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Daha önce belirtildiği gibi bu raporda sunulan çift etiketleme BLISS bir SPAAC/CuAAC kombinasyon vivo içinde12,23ilk örneklerinden biri protokoldür. Her adım iyice optimize edilmiş ve onaylanmış ve içinde iki etiketleme reaksiyonlar sırayla gerçekleştirilen kimya tıklatın sipariş saygı çok önemlidir (yani, SPAAC ilk, takip CuAAC tarafından). Tüm çapraz denetimleri BLISS Protokolü uygulanan23 olduğunda etiketleme her adım belirli olduğunu gösterdi: SPAAC adım taşıyan ilk yüksek chemoselective yol HAZ azid işlevleri tarafından etiketlerine göre cyclooctyne functionalized fluorophore hızlı kinetiği ile [3 + 2] cycloaddition reaksiyonu yoluyla. HAZ birimleri etiketlendikten sonra triazole bağlantılar tarafından tepki ile azid fluor 545 probe oluşturmak için GALK terminal alkynes aktivasyonu katalize copper(I) gerektiren CuAAC adım yapılabilir. Buna karşılık, ters sırada (yani, CuAAC ilk, takip SPAAC tarafından) GALK ve HAZ birimine yol açar gibi kullanılmamalıdır fluorophore ligasyonu ile birlikte buz dansında yarışmaktadır ve dramatik bir sinyal kaybı indükler çapraz-bağlantı . Non-spesifik boyama önlemek için ara çamaşır adımlar gerekliliğini vurgulamak önemlidir.
Biz bizim yöntem çeşitli biyolojik deney tasarımları için uygulanabilir olduğunu göstermiştir. İletişim kuralı etiketleme BLISS ilk serbest kesit önceden kesilmiş ve tıklayın hazır monolignols ile inkübe keten kaynaklanıyor (yaklaşık 150-250 µm kalınlığında) uygulandı. Bu tasarım gibi (kuluçka birimleri azaltılır) kimyasal muhabir gerekli miktarda en aza indirilmesi ve istatistiksel çoğaltır üretimini kolaylaştırmak avantajı olmasına rağmen bu kesinlikle bahsetmişken, bir vivo içinde sistem değil ve bazı durumlarda, değil gerçek spatio-temporal lignification dynamics tüm yönleriyle yansıtabilir. Bir ikinci deneysel tasarım, bu nedenle daha önce çam ve gingko27' deki radiolabeled monolignols birleşmesiyle çalışmak için kullanılan bir yöntem BLISS protokole uyarlanmış. Bu yaklaşımda, kökler ve kök bitki fiziksel olarak ayrılır ve tüm kök tabanı ne 'çiçek vazo' yaklaşım lakaplı içinde monolignol çözümünde inkübe. Sapları istediğiniz (kuluçka) zaman ayrıldıktan sonra kesit kesim ve gerçekleştirilen BLISS Protokolü vardır. Bu değiştirilmiş monolignols yaşayan kök taşınır ve lignin polimerler hücre duvarları içinde büyüyen dahil edilmiştir (i) olduğunu ve yerelleştirme modeli esas kesit için özdeş (II) olduğunu göstermek bize izin yaklaşım. Bu tür bir deney bir gerçek yaşam tesisinde gerçekleştirilen hak vardır / canlı hücre uzun deneyler ve daha ayrıntılı çalışmalar izin yaklaşım, ama kimyasal muhabir büyük miktarda gerektirir. Son olarak, BLISS protokolü de Keten bitki Fidan, bir gerçek yaşam içinde kimyasal gazetecilere kadar kök nakli önce kökleri absorbe olması gerekir bitki modeli temsil eden ile kullanıldı. Bu model uygulamada, yaşam tesislerinde gerçekleştirilen açık avantajı ise genç fidan sınırlıdır ve lignification dynamics büyük tesislerinde pratik nedenlerle (uzun bir kuluçka süresi, yükseltilmiş soruşturma için gerçekten uygun değildir ««kimyasal gazetecilere miktarı). Yine de, bu üç deney tasarımları tamamlayıcı niteliktedir ve tüm kendi artıları ve eksileri ile ilgili pratik yönleri ve biyolojik soru cevap türüne bağlı olarak biyolojik önemi var.
Keten lignification dinamiklerini incelemek için geliştirilen, bizim protokol son derece uyarlanabilir, sadece biyolojik deney tasarımı açısından aynı zamanda diğer uygulama açısından bitki tür ve organ/doku. Örneğin, BLISS kolayca Arabidopsis ya da daha fazla çalışmalar çeşitli genler için knock-out veya knock-down mutantlar ile mükellef bulunmaktadır Populus cins için transfer edilebilir. Prensip olarak, bizim yaklaşım ile çift etiketleme çalışmaları da diğer biomolecules için bitki hücre duvarı polimerler - tüm üç ana monolignols veya metabolik onların öncüleri olarak çeşitli de dahil olmak üzere iki ayrı değiştirilmiş öncüleri kullanarak uzatılabilir polisakkarit matris oluşturan bol. Kuruluşundan bu yana, bioorthogonal kimya gerçekten de esas olarak glukanlardir/polisakkaritler metabolik oligosakkarit mühendislik (MOE)4,5,17,28üzerinden araştırmak için geliştirilmiştir, Ama şaşırtıcı olmuştur sadece biyoloji bitki için çok az uygulamaları defa7,8,9,10,11,12. Tepkiler uyumluluk açısından, lignin ve çalışma gerçekten her iki kimyasal gazetecilere aynı retiküle polimer dahil edilmiştir gibi çözmek için karışık bir vaka oldu. Etiketlenmemiş HAZ- olasılığıGALK kullandığında oluşumu GALK ve HAZ birimleri 3D içinde kayma yakınlığı nedeniyle üstesinden gelmek için büyük bir sorun oldu. lignin23, iki kimyasal gazetecilere değil dahil edilmiştir Eğer biyopolimer aynı tür veya verilen herhangi bir hücreyi aynı kayma bölgesi olmayabilir bir sınırlama yapısını.
Daha geniş bir kapsamda BLISS metodoloji aslında iki farklı kimyasal gazetecilere taşıyan bir azid ve terminal ALKİN etiketi, sırasıyla kullanarak bakteriyel veya hayvan modellerinde herhangi bir iki renkli floresan görüntüleme çalışma için uygulanabilir.

Son iki yılda, kimyasal muhabir strateji dynamics ve sigara-genetik olarak kodlanmış biomolecules fonksiyonlarını araştırmak için güçlü iki aşamalı metodoloji ortaya çıkmıştır. 1 , 2 , 3 bu strateji küçük modülasyon- kimyasal muhabir -ilgiyle biomolecule sentetik bir analog ilk canlı organizma ve sonra kimyasal bir sonda metabolize (örn., bir fluorophore floresan için confocal mikroskobu görüntüleme) kovalent anonim muhabiri bioorthogonal tıklayın kimya yoluyla bağlanır. Sonda hızla ve özellikle tepki gerekir herhangi bir biomolecules yaşam sistemde, inert olurken tanıtılan kimyasal değişiklik ile. Birçok yönden, bu yöntem çok özel tıklayın kimya d böylece metabolitleri veya önceden ulaşılmaz biomacromolecules izlemek için fırsat sağlayan kullanımı ile ortak bioconjugation teknikleri ile ilgili sınırlamalar üstesinden gelir yaşayan sistemler4,5,6.
Bakteri ve hayvan hücrelerinde güçlü Bu yöntem hızlı büyüyen popülerlik rağmen şaşırtıcı derecede az ve çok7arasında,8,9,10kullanımı bitki Biyoloji açıklayan raporlar, 11,12. Bu strateji lignin, gezegendeki en yaygın biyopolimer biri ve lignocellulosic biyokütle önemli bir bileşeni oluşumu eğitim tesislerinde uygulama özellikle ilgilenmişlerdir. 13 , 14 lignin geliştirme ve hayat daha yüksek bitkilerin önemli bir yapısal ve koruyucu rol oynar Bakalit bir polimerdir.
Genellikle üç 4-hydroxyphenylpropanoid moieties oluşmaktadır: H (p- hydroxyphenyl), G (guaiacyl) ve S (syringyl) birimler sırasıyla üç türetilmiş olan 'monolignols' (p- coumaryl, coniferyl ve sinapyl alkoller) (şekil 1) hücrenin sitoplazmada phenylpropanoid yolu üzerinden sentezledim. Hücre duvarı ihraç edilmekte, monolignols okside peroxidases veya laccases sonra onlar kimyasal radikal kaplin tepkiler lignin polimerler için polimerize geçmesi radikaller için bir işlemi olarak lignification. 15 , 16 lignins güçlü birçok bitki kaynaklı sanayi valorization etkisi rağmen ürünler, bilimsel topluluk hala vardır lignification düzenleyen karmaşık mekanizmaları deşifre etmek için gitmek için uzun bir yol.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56947/56947fig1.jpg"> Şekil 1: bitki hücreleri lignification işleminde. Monolignols uzarlar fenilalanin sitozol içinde gelen vardır. Hücre duvarı ihraç edilmekte, monolignols okside peroxidases veya laccases sonra onlar kimyasal radikal kaplin tepkiler lignin polimerler için polimerize geçmesi radikaller için bir işlemi olarak lignification. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56947/56947fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
Bioorthogonal reaksiyonlar kullanım için glycan analiz raporları çeşitli olmakla birlikte,2,3,17 biomolecules diğer türleri için kendi uygulama örnekleri daha az. Bioorthogonal kimya lignin bioimaging amaçlar için kullanımı ancak son zamanlarda Tobimatsu ve ark. tarafından öncülük 8 ' Arabidopsis thaliana nereye G birimleri, böylece kavram kanıtı gösteren8,9 formları lignin polimer alkol vekilleri coniferyl birleşme hakkında bilgi sağlamak için bu kimyasal muhabir stratejileri bu bağlamda geçerlidir. CuAAC kullanımı da farklı coniferyl alkol türev kullanarak bir kaç ay sonra Bukowski ve arktarafından betimlenir. 9 lignin ancak, ayrıca H ve S birimleri içerir ve lignification işlemi daha derin bir anlayış nasıl tüm monolignols polimer dahil edilmiştir hakkında daha fazla bilgi gerektirir ve ne faktörler kompozisyonunu kontrol edebilirsiniz. Bu alandaki yeni gelişmeler şu anda birden fazla kimyasal gazetecilere aynı anda yaşayan sistemler içinde izlemek için etkili yöntemler geliştirilmesi bağlıdır. Glukanlardir üzerinde bir kaç makale son yıllarda18,19',zemin koydu olsa bile20,21,22, yaklaşımlar etiketleme çift kalır içinde büyük bir meydan okuma bioorthogonal Kimya. Bir tekrarlanabilir tek etiketleme tıklayın Protokolü geliştirmek zor, o zaman çift karşılıklı iki tandem optimizasyonu gerektirir yaklaşımlar etiketleme ise iki ayrı kimyasal gazetecilere uyumlu bioorthogonal reaksiyonlar daha da zor. Bu yönü öncülük birkaç örnekler zorlanma terfi azid-ALKİN cycloaddition (SPAAC) ve alkene-tetrazine ters elektronik talep Diels-Alder (DAInv) reaksiyonları glukanlardir hayvan hücrelerinde çalışırdım. Ancak, biz DAinv tepki bioorthogonality (oluşan elektron-fakirlerle tepki verebilir yerine konan cinnamyl türü-elektron zengini monomerleri lignin ve yapısal özellikleri sayesinde bu uygulamada garanti değil olduğunu düşündüm Hava Dienes DAinv tepkileri kullanılan tetrazine sondalar gibi) ve bu belirsiz etiketleme oluşturabilir. Ayrıca, erişim, hem de için hantal ve böylece olasılığını yükseltmek lipofilik sentetik zor olan kimyasal kolları DAInv tepki gerektirir bu birleşme, taşıma ve/veya kimyasal yerelleştirilmesini oranı muhabir vivo içinde etkilenip etkilenmedikleri sınanmamıştır. Biz ikinci yönü özellikle lignification çalışmak için bir tıklama kimya yaklaşım söz konusu olduğunda ilgili olarak kabul olarak, farklı yönde seçti ve bir Bioorthogonal tüp ligasyonu Imaging sıralı strateji (mutluluk) kullanılarak geliştirilmiş bir Strain-Promoted azid ALKİN Cycloaddition (SPAAC) ve bakır katalizörlük azid ALKİN Cycloaddition (CuAAC) içinde vivo. 23
Bu iki tepkiler gerçekten iki ana bioorthogonal'ı tıklatın bugüne kadar kullanılan reaksiyonlar ve lignin ve birkaç örnek daha özellikle bu Imaging Yayınlandı son zamanlarda vardır. 8 , 9 çift etiketleme stratejimiz sağlar bir azid yan bir monolignol muhabiri ve terminal ALKİN diğer i) biyolojik ilgili yapıların doğru tepkisizdir ve II) çok küçük boyutlu (Şekil 2 iki kimyasal işleme ). Sonuç olarak, sentetik modifikasyonlardan altında eğitim biomolecule fizikokimyasal özellikleri üzerinde etkisi böylece taşıma açısından doğal olmayan ve doğal monolignol yüzeyler arasındaki olası tutarsızlıkları azaltmak küçültülür ve metabolization gore metabolik birleşme adım sırasında. SPAAC ve CuAAC ile birlikte ilk bakışta çok sezgisel görünüyor, bizim bilgi yapıları glukanlardir dışında bu strateji ve ilk uygulamasını kullanarak ikili işaretleme sadece ikinci örneği olsa da. 12 , 23
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56947/56947fig2.jpg"> Şekil 2: BLISS strateji etiketleme ikili. Kimyasal gazetecilere HAZ ve GALK yerel H ve G monolignols tagged analogları vardır. Onlar ilk eksojen (Adım 1) besleme tarafından hücre duvarları büyüyen lignin polimerler dahil edilmiştir. Cyclooctyne - ve azid-floresan problar o zaman sırayla bakmaksızın anonim gazetecilere bioorthogonal tarafından functionalized kimya tıklatın: SPAAC reaksiyon (Adım 2) HAZ birimlerinin çok özel ve bir CuAAC reaksiyon (tarafından takip edilir 3. adım) GALK birimleri (Adım 3), belirli böylece her iki gazeteci belirli yerelleştirme izin bağımsız olarak aynı örnek. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56947/56947fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
Biz öncelikle tasarlanmış ve azid öğesini monolignol muhabir HAZ (vekil p- coumaryl alkol) ve lignin H birimleri habercisi doğrulanmış ve BLISS çift etiketleme stratejisi içinde kullanılan ile tandem tasarladı daha önce ALKİN öğesini GALK,9 (vekil coniferyl alkol) ve lignin G birimleri habercisi bildirdi. Geliştirilen ve keten içinde test tekrarlanabilir bu protokol için bir ekonomik açıdan önemli bitki türleri, HAZ ve GALK çift metabolik birleşme lignin içine ilk sıralı SPAAC/CuAAC önce elde edilir etiketleme. Burada, tagged HAZ birimleri ilk özellikle yolu ile etiketlenmiş GALK CuAAC-aracılı ligasyonu ikinci bir floresan inceleyebilirsek tarafından takip bir cyclooctyne functionalized fluorophore SPAAC ligasyonu etiketlenir birimleri. Bu yöntem lignification süreçleri bitki hücre duvarları içinde dinamikleri araştırmak için kullanılan ve kesitler, fidan farklı bitki türlerinin yanı sıra kaynaklanıyor yaşayan durdurması için uygulanan vivo içinde olabilir.

<table><tbody><tr><td>(E)-4-(3-(2-(2-(2-azidoethoxy)ethoxy)ethoxy)prop-1-en-1-yl)phenol (&lt;strong&gt;H&lt;sub&gt;AZ&lt;/sub&gt;&lt;/strong&gt;)</td><td></td><td></td><td>Synthesized as in Lion &lt;em&gt;et al. Cell Chem. Biol. 2017, 24, 3, 326-338&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>(&lt;em&gt;E&lt;/em&gt;)-4-hydroxy-3-propargyloxycinnamyl alcohol (&lt;strong&gt;G&lt;sub&gt;ALK&lt;/sub&gt;&lt;/strong&gt;)</td><td></td><td></td><td>Synthesized as in Lion &lt;em&gt;et al. Cell Chem. Biol. 2017, 24, 3, 326-338&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>2% sodium hypochlorite</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>20 cm high glass tube</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>250 mL Schott glass bottle</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>48-well Plate</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5/6-TAMRA-PEG&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;-Azide</td><td>Jena Bioscience</td><td>CLK-AZ109-1</td><td></td></tr><tr><td>Aluminium foil</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cheese cloth</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Compost containing clay</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coniferyl alcohol (&lt;strong&gt;G&lt;/strong&gt;)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>MFCD00002922</td><td></td></tr><tr><td>Copper (II) sulfate pentahydrate</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DBCO-PEG&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;-5/6-Carboxyrhodamine 110</td><td>Jena Bioscience</td><td>CLK-A127-1</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q Ultrapure water</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf 1,5 mL</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EtOH</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flax seeds (&lt;em&gt;L. usitatissimum&lt;/em&gt; L.)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G&amp;trade; Slide Mounting Medium</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>17984-25</td><td></td></tr><tr><td>Glass coverslip</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass microscope slide</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Growth chamber</td><td>CLF-Plant Climatics</td><td></td><td>For 2-week-old plants culture</td></tr><tr><td>Growth chamber</td><td>Angelantoni Life Sciences</td><td></td><td>For 2-month-old plants culture</td></tr><tr><td>Magenta plant culture box</td><td></td><td></td><td>For 2-week-old seedling culture</td></tr><tr><td>Methanol</td><td></td><td></td><td>Toxic (SGH02, SGH06, SGH08), work with gloves under a hood</td></tr><tr><td>Micropipette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nail polish</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon A1R confocal microscope</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Orbital shaker</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;p&lt;/em&gt;-Coumaryl alcohol (&lt;strong&gt;H&lt;/strong&gt;)</td><td>Carbosynth</td><td>FC145653</td><td></td></tr><tr><td>Plastic cap</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plastic pipette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plastic pot</td><td></td><td></td><td>For 2-month-old plants culture</td></tr><tr><td>Razor blade</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rubber band</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodium Ascorbate</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterile clamp</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vertical support</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents for liquid and solid &amp;frac12; MS medium&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KNO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;NO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;.2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MnSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZnSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>H&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;BO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>KI</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;MoO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CuSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.5H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CoCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;.6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;EDTA.2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FeSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thiamine.HCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pyridoxine.HCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nicotinic acid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Myo-inositol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MES hydrate</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

visualizing lignification dynamics in plants with click chemistry: dual labeling is bliss!

Lignin gezegendeki en yaygın biyopolimer ve lignocellulosic biyokütle önemli bir bileşeni biridir. Bu fenolik polimer geliştirme ve hayat daha yüksek bitkilerin önemli bir yapısal ve koruyucu rol oynar. Her ne kadar kuvvetle lignification süreçleri içinde vivo düzenleyen karmaşık mekanizmalar endüstriyel valorization birçok bitki elde edilen ürünlerin etkisi, bilimsel topluluk hala onları deşifre etmek için gitmek için uzun bir yol var. Basit bir üç adım akışında aktif bölgeleri bitki dokuların lignifying bioimaging çalışmaları burada sunulan çift etiketleme iletişim kuralı sağlar. İlk adım iki bağımsız kimyasal gazetecilere, lignin H ve G birimleri ortaya çıkmasına iki yerli monolignols vekilleri metabolik birleşmesiyle oluşur. Lignin polimerler büyüyen içine birleşme sonra her muhabir sonra özellikle kendi floresan sonda bioorthogonal SPAAC/CuAAC tıklayın reaksiyonlar sıralı kombinasyonu ile taşır. Lignin autofluorescence ile birlikte, bu yaklaşım ve lignin bitki hücre duvarları içinde üç renkli yerelleştirme haritaların üretimi confocal floresan mikroskopi tarafından yol açar ve etkin durumunda kesin mekansal bilgi sağlar lignification makine bitki doku, hücre ve farklı hücre duvarı katmanları ölçekte.

Sentetik monolignol analogları ve bioorthogonal ilgili sunulan BLISS protokolünü kullanarak kimya tıklatın, yaşayan bitkiler lignification sürecinde dinamikleri görselleştirmek mümkündür. (Histochemical boyama, immunolocalization veya autofluorescence gibi), bu 'çift tıklayın' protokolü sadece görselleştirme lignin için kurulan teknikleri aksine metabolik birleşme sırasında üretilen lignin de novo hedefler adım ve confocal Floresans mikroskobu (şekil 3) üç kanallı hücresel görüntüleme ile örnek önceden varolan lignin dan ayırır. H AZ-birimleri DBCO-PEG4-5 uyarma ve emisyon dalga boylarında kullanarak algılanır/6-özellikle azid fonksiyonları tıklandığında carboxyrhodamine 110 dahil HAZ molekülleri SPAAC adım (λex sırasında 501 nm /λem 526 nm, yeşil kanal), oysa GALK-birimleri aynı şekilde özel olarak G anonim terminal ALKİN Etiketler tıklandığında azidefluor 545 inceleyebilirsek karakteristik dalga boylarında, tespit ALK CuAAC adımı (λex 546 nm /λem 565 nm, kırmızı kanal); Üçüncü kanal 405 kendi içsel autofluorescence kullanarak algılanır önceden varolan lignin karşılık gelen nm (mavi kanal). Bu yaklaşım üç renkli yerelleştirme haritalar ve lignin varlığı kesin mekansal bilgi sağlar bitki hücre duvarları içinde ya da aktif lignification makine yokluğu nesil bir organ (şekil 3A farklı dokular arasında açar. ), farklı hücre tipleri aynı doku (şekil 3B-C) ve (şekil 3D) aynı hücrenin farklı duvar katmanları arasında. Başka bir deyişle, bu metodoloji bize vurgulayın ve özellikle 'etkin' lignification siteleri (HAZ ve GALK kanalları) yerelleştirmek onları nerede lignin bir önceki kuruldu bölgelerdeki ayırt sağlar bitki gelişiminin (autofluorescence kanal) aşamasında. Buna ek olarak, teknik duyarlılığını autofluorescence için karşılaştırıldığında önemli ölçüde geliştirilmiş ve çok daha küçük miktarda taze sentezlenmiş lignin olabilir (şekil 3B) algıladı.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56947/56947fig3.jpg"> Şekil 3: keten kaynaklanıyor anonim monolignol kimyasal gazetecilere Imaging. (A)bir el yapımı enine bölümünü keten bir kök yeniden oluşturulan resmi yarısı. (B) xylem ayırt ilk katmanları Close-up. Paneli yaptı: lignin autofluorescence (mavi, 405 nm), Orta paneli: birleştirilmiş lignin autofluorescence (mavi) ve HAZ floresan (yeşil, 526 nm) kanallar, doğru kapı aynası: birleştirilmiş lignin autofluorescence (mavi) ve GALK floresan (kırmızı, 565 nm) kanalları. Ok autofluorescence ile karşılaştırıldığında BLISS artan duyarlılık gösteren cambium ilk etiketli hücre duvarından gösterir. (C) etiketleme farklı hücre farklı katmanları aynı hücre duvarı etiketleme değişimler gösteren ikincil xylem hücreleri üzerinde ikincil xylem ve (D) yakın çekim. Paneli yaptı: birleştirilmiş lignin autofluorescence (mavi) ve HAZ floresan (yeşil, 526 nm) kanallar, Orta paneli: birleştirilmiş lignin autofluorescence (mavi) ve GALK floresan (kırmızı, 565 nm) kanallar, sağ Panel: birleştirilmiş lignin autofluorescence (mavi), HAZ (yeşil) ve GALK (kırmızı) floresan kanalları. HAZ ve GALK co yerelleştirme sarı renk ile tasvir edilir. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56947/56947fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
Burada sunulan BLISS yöntemi veya daha önce Tobimatsu vd tarafından Yayınlanan tek etiketleme yordamlar gibi kimyasal muhabir stratejileri 8 bu nedenle IMMUNO - veya histochemical uygulanması çok kolay olurken boyama gibi daha önce erişilebilir yöntemlerine göre çok ince bir çalışma izin verebilirsiniz. Örneğin, şekil 4 göstermektedir HAZsinyal yoğunluğu /GALK birleşmesiyle keten ikincil xylem fiber tracheids/damarlarının (FT) cambium gelen ilk birkaç hücre duvarları içinde çok yüksek ama büyük hücrelerde giderek azalır. Bu profil bu autofluorescence karşısında ve en çok o lignification çok hızlı bir şekilde cambium gelen ilk 2-3 FT hücre katmanlarında ulaşıldığında gösterir. Buna ek olarak, daha sonraki aşamaları için lignification olarak HAZonların gelişimi devam etmek için ray (R) hücreleri görünür /GALK birleşme olduğunu çok daha sürekli cambium ilik için hücre duvarlarında. Bu hücre türleri farklı biyolojik rolleri ile ilişkili farklılıklar kendi gelişim programında beri FT ve R hücre türleri tezat lignification dinamikleri, görüntüler şaşırtıcı değil. FTs olgun ve hızlı bir şekilde ölmek gerçekten uzun tüpler, kalın lignified duvarlı R dar satırlarının hücreleri ise bu mekanik destek ve su ve mineraller, dikey taşıma önemli rol oynarlar bırakarak ölü boş hücreler xylem oluşturmak ışınları olgun ve fonksiyonel durumlarında kalın lignified duvarlar kalmadan hayattasın.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56947/56947fig4.jpg"> Şekil 4: hücre özgü monolignol muhabir birleşme keten xylem. Keten bir kök serbest bir kesitin parçası Bright-alan confocal mikroskobu görünümünü(a). Pembe (ray parankimi hücreleri, R) ve sarı (fiber tracheid hücreleri, FT) okları gösterir vektörler ilik doğru cambial bölgeden yayılan ve lignin autofluorescence 405, taranan nm (B), HAZ Floresans 526, nm (C) ve G ALK Floresan, 565 nm (D). İkincil xylem (E) görünümü. Paneli yaptı: birleştirilmiş lignin autofluorescence (mavi), HAZ (yeşil) ve GALK (kırmızı) floresan kanalları. HAZ ve GALK co yerelleştirme sarı renk ile tasvir edilir. Doğru kapı aynası: keten kök ikincil xylem yapısındaki şematik gösterimi. V, gemi; FT, fiber tracheid; R, ray parankimi hücre. Bu rakam aslan ve ark. değiştirildi 23 <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56947/56947fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
Buna ek olarak, iki farklı kimyasal gazeteciler için H - ve G-birimleri BLISS protokolündeki iki bioorthogonal reaksiyonlar ile karşılık gelen kullanımı daha fazla nicel sonuçları elde sağlar. BLISS ek anlayışlar birleşme oranları çeşitli koşullarda monolignol kontrolünü sağlayabilir ve zor lignification işleminin deşifre için katkıda bulunabileceğini gibi stratejileri etiketleme multiplexed. Lignins H, G ve S monolignols, göreli yüzdelerini gerçekten çok tür, doku, yaş veya bitki çevre koşullarına göre değişken ise, bu kompozisyon düzenleyen karmaşık mekanizmaları hala tamamen anlaşılır. Çift etiketleme teknolojisi lignin kompozisyon düzenleyen parametrelerden bazıları soruşturma güçlü bir şekilde temsil eder. Örneğin, HAZdeğişen: GBLISS ileALK oranı bize lignin kompozisyon ikincil xylem dokularda monolignol durumu hücre duvarları içinde yerine üzerine doğrudan bağlı olduğunu göstermek için izin peroksidaz/Lakkaz özgüllük (şekil 5).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56947/56947fig5.jpg"> Şekil 5: farklı yüzde oranları ile keten kök bölümlerini HAZ ve GALKkuluçka etkisi. HAZ: GALK% oranları rakamlar her sütun verilmiştir. Top: HAZ ve GALK kanalları birleştirilir. Alt: HAZ ve GALK farklı % oranları için ortalama Floresans yoğunluğunu gösteren çubuk grafikler. Değerleri gri düzeyleri ± SD ölçek ortalama Floresans şiddeti ortalaması olarak ifade edilen çubuk 100 µm. = bu rakam aslan ve ark. değiştirildi 23 <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56947/56947fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
Keten, tekstil, lüks evrak ya da çevre dostu kompozit malzemeler üretimi için kullanılan lif için (BF) büyüyor. Onların endüstriyel valorization önemli bir yönünü lignin bir son derece kalın S2/G ikincil katman19,24tarafından karakterize onların hücre duvarları içinde çok az düzeyde içermesidir. BLISS lignification dynamics farklılıklar aynı hücre duvarı farklı katmanları arasında vurgulayabilirsiniz. Şekil 6A HAZ ve GALK muhabir birleşme hücre köşe ve ancak tüm lif orta lamel/birincil hücre duvarı ile sınırlı olduğunu göstermektedir. Hypolignified durumlarına moleküler ortamı için uygun olmamasından ortaya çıkar ortaya lignification monolignol kimyasal gazetecilere exogenously olduğunda bile kalın bast fiber ikincil hücre duvar katmanını içinde toplam yokluğunda verilen enzimatik aracılı oksidasyon ve monolignols birleşmesiyle büyüyen polimer zinciri içine ve sadece monolignol biyosentezi genlerin transkripsiyon düzenlenmesi nedeniyle daha önce olmadığına25bildirdi. Bu gözlem de o keten peroksidaz gen up-lignified lif26sahip keten kimyasal lbf1 mutant dış kök dokularda düzenlenmiştir de gerçeği ile ilişkilendirir.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56947/56947fig6.jpg"> Şekil 6: BLISS hücre duvarı altyapı veya katman özel farklılıkları vurgulamaktadır. (A)sol kapı aynası: keten kök bölümüne alan parlak görüntü. Daire bir lif paket gösterir. Doğru kapı aynası: lif üzerinde yakın. Birleştirilmiş HAZ ve GALK kanalları (ve alan parlak olmayan) o lignification hücrenin köşeler için sınırlı olduğunu gösteren (<img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/56947/56947eq1.jpg">) ve orta lamel/birincil hücre duvarına bir lif. BF, bast fiber; Par, parankimi hücre; M, orta lamel; P, birincil hücre duvarı; S1, ikincil hücre duvarı ilk katman; İkincil hücre duvarı S2/G, ikincil katman/jelatinimsi tabakası. (B) 2D dilim ve 3D confocal z-yığın zum keten kök endodermis bölgesinin inşası. Casparian Şerit (<img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/56947/56947eq1.jpg">) sadece autofluorescence görüntüler ve HAZ veya GALKdahil değil. İlişkili fluorogram GALK/HAZ Anti-korelasyon gösterir: yüksek yeşil Floresans düşük kırmızı sinyal (korteks) ve tersi (endodermis) ilişkili. Pericycle (P), Endodermis (E), Cortex (C). <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56947/56947fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
Son olarak, bu iki renkli metodoloji da değerli bilgiler hücre duvarı ayarlamış 'lignification durumu' üzerinde çeşitli gelişim aşamalarında ve kök dışındaki bitki organlarında sağlayabilir. Örneğin, keten kökleri endodermis Radyal ve enine hücre duvarları Casparian grupta varlığını geliştirme erken aşamalarında karakterizedir. Hidrofobik biyopolimer, suberin ve/veya lignin, yapılan grup su ve solutes apoplast ile pasif girmesini kök tarafından alınan önler ve böylece katkıda bir symplastic yol ile plazma zarı geçmek güçleri Seçici alımını kapasiteleri bitki kökleri. Keten köklerine uygulanan, bizim strateji endodermal hücreleri de olduğu gibi Casparian band (6B rakamyok) nerede parçalar Radyal duvarların teğet duvarlar HAZ ve GALK dahil edilmiştir gösterdi. Ancak, Toplam Devamsızlık Casparian bandında monolignol muhabir şirketleşme hala sitenin daha fazla biyopolimer yükünün olmakla birlikte diğer duvarlar bu gelişme bu aşamada olgun olduğunu gösterir. Z-yığın yeniden oluşturulan 3B Görünümü açıkça Casparian band ışık getiriyor. İlginçtir, endodermis için bitişik bazı kortikal hücrelerinin duvarları da kanıtladı HAZ tercihen bütünleştiren (böylece lignin/suberin keten kök kortekste varlığını gösteren) değil GALKama. Co yerelleştirme analiz HAZ ve GALK, bu iki bitişik hücre türü hücre özel duvar yapısı/enzimatik makine varlığını önermek arasında anti-bir korelasyon gösterdi.
Ek tablo 1: hazırlık katı ½ MS orta <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56947/renamed_f17ea.xls">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>
Ek tablo 2: kimyasal muhabir hisse senedi çözümleri hazırlanması <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56947/Table_2_-_Preparation_of_chemical_reporter_stock_solutions.xls">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Lignification Dynamics in Plants with Click Chemistry: Dual Labeling is BLISS! at JoVE.com

Visualizing Lignification Dynamics in Plants with Click Chemistry: Dual Labeling is BLISS!

BLISS, lignification dinamikleri, eğitim için bir çift etiketleme iletişim kuralı geliştirilmiştir. Sentetik monolignol kullanarak gazetecilere ve SPAAC ve CuAAC bioorthogonal sıralı bir arada tepkiler, bu metodoloji açıyor lignins planta içindeBiyogenez düzenleyen faktörler derinlemesine analiz için yolu tıklatın.

Lignification Dynamics ile tıklatın kimya tesislerinde görselleştirme: Çift etiketleme BLISS olduğunu!

Lignin is one of the most prevalent biopolymers on the planet and a major component of lignocellulosic biomass. This phenolic polymer plays a vital ...

visualizing-lignification-dynamics-plants-with-click-chemistry-dual

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Chemistry

11.9K Görüntüleme.  Université de Lille. BLISS, lignification dinamikleri, eğitim için bir çift etiketleme iletişim kuralı geliştirilmiştir. Sentetik monolignol kullanarak gazetecilere ve SPAAC ve CuAAC bioorthogonal sıralı bir arada tepkiler, bu metodoloji açıyor lignins planta içindeBiyogenez düzenleyen faktörler derinlemesine analiz için yolu tıklatın.

Video: Visualizing Lignification Dynamics in Plants with Click Chemistry: Dual Labeling is BLISS!

Analyzing Protein Dynamics Using Hydrogen Exchange Mass Spectrometry

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique amino acid sequence, it is only realized by the folding of the polypeptide chain into a single defined three-dimensional arrangement or more commonly into an ensemble of interconverting conformations. Investigating the connection between protein conformation and its function is therefore essential for a complete understanding of how proteins are able to fulfill their great variety of tasks. One possibility to study conformational changes a protein undergoes while progressing through its functional cycle is hydrogen-1H/2H-exchange in combination with high-resolution mass spectrometry (HX-MS). HX-MS is a versatile and robust method that adds a new dimension to structural information obtained by e.g. crystallography. It is used to study protein folding and unfolding, binding of small molecule ligands, protein-protein interactions, conformational changes linked to enzyme catalysis, and allostery. In addition, HX-MS is often used when the amount of protein is very limited or crystallization of the protein is not feasible. Here we provide a general protocol for studying protein dynamics with HX-MS and describe as an example how to reveal the interaction interface of two proteins in a complex. &#160;&#160;

Protein conformation and dynamics are key to understanding the relationship between protein structure and function. Hydrogen exchange coupled with high-resolution mass spectrometry is a versatile method to study the conformational dynamics of proteins as well as characterizing protein-ligand and protein-protein interactions, including contact interfaces and allosteric effects.

Hidrojen Değişim Kütle Spektrometre Kullanarak Protein Dinamiği Analizi

All cellular processes depend on the functionality of proteins. Although the functionality of a given protein is the direct consequence of its unique ...

Kimya

Combining Raman Imaging and Multivariate Analysis to Visualize Lignin, Cellulose, and Hemicellulose in the Plant Cell Wall

The application of Raman imaging to plant biomass is increasing because it can offer spatial and compositional information on aqueous solutions. The analysis does not usually require extensive sample preparation; structural and chemical information can be obtained without labeling. However, each Raman image contains thousands of spectra; this raises difficulties when extracting hidden information, especially for components with similar chemical structures. This work introduces a multivariate analysis to address this issue. The protocol establishes a general method to visualize the main components, including lignin, cellulose, and hemicellulose within the plant cell wall. In this protocol, procedures for sample preparation, spectral acquisition, and data processing are described. It is highly dependent upon operator skill at sample preparation and data analysis. By using this approach, a Raman investigation can be performed by a non-specialist user to acquire high-quality data and meaningful results for plant cell wall analysis.

This protocol aims to present a general method to visualize lignin, cellulose, and hemicellulose in plant cell walls using Raman imaging and multivariate analysis.

Bitki Hücresi Duvarında Lignin, Selüloz ve Hemiselülozu Görselleştirmek için Raman Görüntüleme ve Çok Değişkenli Analizin Birleştirilmesi

The application of Raman imaging to plant biomass is increasing because it can offer spatial and compositional information on aqueous solutions. The ...

Biyokimya

Measuring Interactions between Fluorescent Probes and Lignin in Plant Sections by sFLIM Based on Native Autofluorescence

In lignocellulosic biomass (LB), the activity of enzymes is limited by the appearance of non-specific interactions with lignin during the hydrolysis process, which maintains enzymes far from their substrate. Characterization of these complex interactions is thus a challenge in complex substrates such as LB. The method here measures molecular interactions between fluorophore-tagged molecules and native autofluorescent lignin, to be revealed by F&#246;rster resonance energy transfer (FRET). Contrary to FRET measurements in living cells using two exogenous fluorophores, FRET measurements in plants using lignin is not trivial due to its complex autofluorescence. We have developed an original acquisition and analysis pipeline with correlated observation of two complementary properties of fluorescence: fluorescence emission and lifetime. sFLIM (spectral and fluorescent lifetime imaging microscopy) provides the quantification of these interactions with high sensitivity, revealing different interaction levels between biomolecules and lignin.

This protocol describes an original setup combining spectral and fluorescence lifetime measurements to evaluate F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) between rhodamine-based fluorescent probes and lignin polymer directly in thick plant sections.

Floresan Problar ve Lignin Bitki Kesitlerinde Doğal Otofloresan Dayalı SFLIM Ile Etkileşimlerinin Ölçülmesi

In lignocellulosic biomass (LB), the activity of enzymes is limited by the appearance of non-specific interactions with lignin during the hydrolysis ...

Label-free in situ Imaging of Lignification in Plant Cell Walls

Meeting growing energy demands safely and efficiently is a pressing global challenge. Therefore, research into biofuels production that seeks to find cost-effective and sustainable solutions has become a topical and critical task. Lignocellulosic biomass is poised to become the primary source of biomass for the conversion to liquid biofuels1-6. However, the recalcitrance of these plant cell wall materials to cost-effective and efficient degradation presents a major impediment for their use in the production of biofuels and chemicals4. In particular, lignin, a complex and irregular poly-phenylpropanoid heteropolymer, becomes problematic to the postharvest deconstruction of lignocellulosic biomass. For example in biomass conversion for biofuels, it inhibits saccharification in processes aimed at producing simple sugars for fermentation7. The effective use of plant biomass for industrial purposes is in fact largely dependent on the extent to which the plant cell wall is lignified. The removal of lignin is a costly and limiting factor8 and lignin has therefore become a key plant breeding and genetic engineering target in order to improve cell wall conversion.
Analytical tools that permit the accurate rapid characterization of lignification of plant cell walls become increasingly important for evaluating a large number of breeding populations. Extractive procedures for the isolation of native components such as lignin are inevitably destructive, bringing about significant chemical and structural modifications9-11. Analytical chemical in situ methods are thus invaluable tools for the compositional and structural characterization of lignocellulosic materials. Raman microscopy is a technique that relies on inelastic or Raman scattering of monochromatic light, like that from a laser, where the shift in energy of the laser photons is related to molecular vibrations and presents an intrinsic label-free molecular "fingerprint" of the sample. Raman microscopy can afford non-destructive and comparatively inexpensive measurements with minimal sample preparation, giving insights into chemical composition and molecular structure in a close to native state. Chemical imaging by confocal Raman microscopy has been previously used for the visualization of the spatial distribution of cellulose and lignin in wood cell walls12-14. Based on these earlier results, we have recently adopted this method to compare lignification in wild type and lignin-deficient transgenic Populus trichocarpa (black cottonwood) stem wood15. Analyzing the lignin Raman bands16,17 in the spectral region between 1,600 and 1,700 cm-1, lignin signal intensity and localization were mapped in situ. Our approach visualized differences in lignin content, localization, and chemical composition. Most recently, we demonstrated Raman imaging of cell wall polymers in Arabidopsis thaliana with lateral resolution that is sub-&mu;m18. Here, this method is presented affording visualization of lignin in plant cell walls and comparison of lignification in different tissues, samples or species without staining or labeling of the tissues.

Label-free in situ Imaging of Lignification in Plant Cell Walls

A method based on confocal Raman microscopy is presented that affords label-free visualization of lignin in plant cell walls and comparison of lignification in different tissues, samples or species.

Etiket- In situ</emBitki Hücre Duvarlar Lignification> Görüntüleme

Meeting growing energy demands safely and efficiently is a pressing global challenge. Therefore, research into biofuels production that seeks to find ...

Biyoloji

3-D Time-Lapse Imaging of Cell Wall Dynamics Using Calcofluor in the Moss Physcomitrium patens

Time-lapse imaging with fluorescence microscopy allows observation of the dynamic changes of growth and development at cellular and subcellular levels. In general, for observations over a long period, the technique requires transformation of a fluorescent protein; however, for most systems, genetic transformation is either time-consuming or technically unavailable. This manuscript presents a protocol for 3-D time-lapse imaging of cell wall dynamics over a 3 day period using calcofluor dye (which stains cellulose in the plant cell wall), developed in the moss Physcomitrium patens. The calcofluor dye signal from the cell wall is stable and can last for 1 week without obvious decay. Using this method, it has been shown that the detachment of cells in ggb mutants (in which the protein geranylgeranyltransferase-I beta subunit is knocked out) is caused by unregulated cell expansion and cell wall integrity defects. Moreover, the patterns of calcofluor staining change over time; less intensely stained regions correlate with the future cell expansion/branching sites in the wild type. This method can be applied to many other systems that contain cell walls and that can be stained by calcofluor.

3-D Time-Lapse Imaging of Cell Wall Dynamics Using Calcofluor in the Moss Physcomitrium patens

This manuscript presents a detailed protocol to image the 3-D cell wall dynamics of living moss tissue, allowing the visualization of the detachment of cell walls in ggb mutants and thickening cell wall patterns in the wild type during development over a long period.

Moss Physcomitrium patens'te Calcofluor Kullanarak Hücre Duvarı Dinamiğinin 3-D Hızlandırılmış Görüntülenmesi

Time-lapse imaging with fluorescence microscopy allows observation of the dynamic changes of growth and development at cellular and subcellular levels. In ...

Gelişim Biyolojisi

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively in the study of secondary cell wall formation. Secondary cell wall deposition occurs after the primary cell wall is laid down, a process carried out exclusively by specialized cells such as those forming vessel and fiber tissues. Most secondary cell walls are composed of cellulose (40&#8211;50%), hemicellulose (25&#8211;30%), and lignin (20&#8211;30%). Several mutations affecting secondary cell wall biosynthesis have been isolated, and the corresponding mutants may or may not exhibit obvious biochemical composition changes or visual phenotypes since these mutations could be masked by compensatory responses. Staining procedures have historically been used to show differences on a cellular basis. These methods are exclusively visual means of analysis; nevertheless their role in rapid and critical analysis is of great importance. Congo red and calcofluor white are stains used to detect polysaccharides, whereas M&#228;ule and phloroglucinol are commonly used to determine differences in lignin, and toluidine blue O is used to differentially stain polysaccharides and lignin. The seemingly simple techniques of sectioning, staining, and imaging can be a challenge for beginners. Starting with sample preparation using the A. thaliana model, this study details the protocols of a variety of staining methodologies that can be easily implemented for observation of cell and tissue organization in secondary cell walls of plants.

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Plant cell wall composition varies between tissue types and can include lignin, cellulose, hemicelluloses, and pectin. Various staining techniques have been developed to visualize differences at the cell-type level. This paper is a compilation of commonly used cell wall staining techniques.

Histokimyasal boyama<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Ortaöğretim Hücre Duvar Elemanları

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively ...

<meta charset="utf8"></head><body>MOE ile hücre içi sialillenmiş glikanları görselleştirmek için genleşme mikroskobu

Visualizing Intracellular Sialylation with Click Chemistry and Expansion Microscopy

Metabolic labeling techniques allow the incorporation of bioorthogonal reporters into glycans, enabling the targeted bioconjugation of molecular dyes within cells through click and bioorthogonal chemistry. Metabolic oligosaccharide engineering (MOE) has attracted considerable interest due to the essential role of glycosylation in numerous biological processes that involve molecular recognition and its impact on pathologies ranging from cancer to genetic disorders to viral and bacterial infections.
Although MOE is better known for the detection of cell surface glycoconjugates, it is also a very important methodology for the study of intracellular glycans in physiological and pathological contexts. Such studies greatly benefit from high spatial resolution. However, super-resolution microscopy is not readily available in most laboratories and poses challenges for daily implementation. Expansion microscopy is a recent alternative that enhances the resolution of microscopy by physically enlarging biological specimens labeled with fluorescent markers. By embedding the sample in a swellable gel and causing it to expand isotropically through chemical treatment, subcellular structures can be visualized with enhanced precision and resolution without the need for super-resolution techniques.
In this work, we illustrate the capacity of expansion microscopy to visualize intracellular sialylated glycans through the combined use of MOE and click chemistry. Specifically, we propose a procedure for bioorthogonal labeling and expansion microscopy that employs a reporter targeting sialylation, which may be associated with immunofluorescence for co-localization studies. This protocol enables localization studies of sialoconjugate biosynthesis, intracellular trafficking, and recycling.

<meta charset="utf8"></head><body>Click Kimyası ve Genleşme Mikroskobu ile Hücre İçi Sialilasyonun Görselleştirilmesi

Here, we propose a simple protocol combining metabolic oligosaccharide engineering, click chemistry, and expansion microscopy that allows bioimaging of intracellular sialylated N-glycoproteins with improved resolution using routine microscopy equipment.

Click Kimyası ve Genleşme Mikroskobu ile Hücre İçi Sialilasyonun Görselleştirilmesi

Metabolic labeling techniques allow the incorporation of bioorthogonal reporters into glycans, enabling the targeted bioconjugation of molecular dyes ...

Metabolic Labeling

Metabolic labeling is used to probe the biochemical transformations and modifications that occur in a cell. This is accomplished by using chemical analogs that mimic the structure of natural biomolecules. Cells utilize analogs in their endogenous biochemical processes, producing compounds that are labeled. The label allows for the incorporation of detection and affinity tags, which can then be used to elucidate metabolic pathways using other biochemical analytical techniques, such as SDS-PAGE and NMR.
This video introduces the concepts of metabolic labeling and show two general procedures.&#160; The first uses isotopic-labeling, to characterize the phosphorylation of a protein. The second covers a photoreactive labeling to characterize protein-protein interaction within a Also three applications of metabolic labeling are presented: labeling plant material, labeling RNA to measure kinetics and labeling glycans in developing embryos.

<div class="chapter_text" id="script_0">
Metabolic labeling is used to investigate the machinery of a cell. This is accomplished using chemical analogs to probe the biochemical transformations and modifications that occur. This video will show the principles of metabolic labeling, typical isotopic and photoreactive labeling procedures, and some applications.
</div>
<div class="chapter_text" id="script_1">
Metabolic labeling can be conducted using a number of strategies. Here we will describe isotopic, photoreactive, and bio-orthogonal labeling.
Isotopic labeling is performed using structural analogs that are chemically identical to their natural counterparts, but have uncommon isotopes incorporated into their structure. In this L-lysine analog the carbon and nitrogen atoms are replaced with carbon-13 and nitrogen-15. Cells cultured in the presence of isotopic analogs will incorporate them into their biochemical structures. Metabolites are collected from the cells and purified for analysis. Samples with stable isotopes are analyzed using techniques such as mass spectrometry or NMR spectroscopy. Samples with radioactive labels are analyzed using liquid scintillation counting and x-ray films, which will be demonstrated in the isotopic labeling protocol.
Photoreactive labels are functional groups incorporated into proteins, which are stable until exposed to ultraviolet light. The functional group forms a reactive radical, which binds to the nearest protein. A common example, L-photo-leucine, contains a diazirine ring, which is a photoreactive crosslinker. In contrast to isotopic labeling, there is some chemical dissimilarity between photo-reactive chemical analogs and their natural counterparts. Cells may preferentially incorporate natural compounds over analogs. Therefore, it is important to perform photo-reactive labeling in medium free of the compound being mimicked. Once exposed to ultraviolet radiation, the photo-reactive groups in a labeled protein become unstable and highly reactive, causing it to cross-link with interacting proteins, creating a protein complex. Cross-linked complexes, act as snapshots that can then be analyzed using SDS-PAGE and mass spectrometry methods. This provides insights into what reactions are occurring in the metabolic pathway by identifying reaction species and how they interact by determining binding sites.
Bioorthogonal labeling strategies utilize analogs with small functional groups that have little to no reactivity with natural biomolecules. For example, azides are small functional groups, whose reactivity is said to be orthogonal to biochemical reactions. In the Staudinger ligation, a phosphine group attacks the azido group. This yields a transition state that intramolecularly reacts with a nearby ester, resulting in an amine-bonded ligand. Bioorthogonal functional groups incorporated into biomolecules can be ligated with detection tags such as fluorescent functional groups, and affinity tags such as antigens.
Now that some concepts and strategies for metabolic labeling have been discussed, let&#39;s look at the process in the laboratory.
</div>
<div class="chapter_text" id="script_2">
The first step in a metabolic labeling experiment is to collect the protein of interest. To do this, cells are grown on a plate, and an expression method is used to promote synthesis of the desired protein. In this example, leucine-rich repeat kinases, or LRRK, are expressed. Disodium phosphate, containing radioactive phosphorus-32, is used as the analog. Proper measures must be taken to protect against ionizing radiation. This includes setting up a work area, wearing proper protective equipment, and checking for radioactive contamination. Once safety measures have been taken, the medium containing the isotopic analogs is prepared. The medium from the culture is removed and, replaced with one containing the isotopic chemical analogs and then incubated. Following incubation, the cells are lysed. The lysate is collected and purified.
After purification, proteins are resolved using SDS-PAGE and then transferred to a PVDF membrane. Autoradiography is performed by exposing the membrane to x-ray film and measured using a phosphor imager. Western blotting is used to measure relative protein levels in the PVDF membrane. In this example the phosphorylation levels of leucine-rich repeat kinases synthesized in 293T cells were measured. The autoradiogram shows how much phosphorous was incorporated into the protein. Western blotting elucidates the levels of the LRRK proteins. Image analysis software is used to obtain quantitative data of phosphorylation levels of the proteins.
</div>
<div class="chapter_text" id="script_3">
In this next procedure, photoreactive labeling is demonstrated. First, the cells are prepared and cultured. The photoreactive analog is added to the cells at the mid-log phase and incubated. In this procedure p-benzoylphenylalanine is used. Samples are collected over intervals and put on ice. The samples are then exposed to obtain snapshots of the biochemical pathways over time. The proteins of interest are then purified and resolved using SDS-PAGE.
A photoreactive labeling strategy was used to identify compounds that interact with the protein of interest. Immunodetection with Western blotting shows protein bands that indicate higher molecular weight proteins are present in the irradiated samples. These are from cross-linking due to protein-protein interaction occurring during the UV irradiation.
</div>
<div class="chapter_text" id="script_4">
Now that we&#39;ve reviewed metabolic labeling procedures, let&#39;s look at some of the ways the process is used.
Metabolic labeling concepts can be extended to multicellular organisms. Plants are grown in a sealed environment, rich in stable isotopes to produced labeled plant material. Carbon dioxide containing carbon-13 is added to the enclosure, while nitrogen-15 rich fertilizer is used. The resulting harvested plant material can help answer questions about carbon and nitrogen cycling from the ecosystem.
Labeling enables the separation of newly synthesized RNA from older RNA. By changing the initial concentration of analog, the kinetics of new RNA synthesis can be determined. The results show that the concentration of 4-thiouridine affects how much new RNA is transcribed. Additionally, incorporation rates of the label into RNA can be directly quantified with a spectrophotometer.
Using biorthogonal click chemistry, glycans in a zebra fish embryo can be labeled. The eggs are injected with a labeling compound that results in alkyne labels on the glycans. The glycans in the larvae are then ligated to a dye compound at the desired development stage. The glycans in the embryos are then imaged. Glycans produced at different time points can be identified by labeling using different colors at different stages of embryo development.
</div>
<div class="chapter_text" id="script_5">
You&#39;ve just watched JoVE&#39;s video on metabolic labeling. This video described the concepts behind metabolic labeling and their strategies, went over two general procedures, and covered some of the uses of the techniques.
Thanks for watching!
</div>

Isotopic, Photoreactive and Bioorthogonal Metabolic Labeling

Metabolic labeling is used to probe the biochemical transformations and modifications that occur in a cell. This is accomplished by using chemical analogs ...

Lignification Dynamics ile tıklatın kimya tesislerinde görselleştirme: Çift etiketleme BLISS olduğunu!

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Hidrojen Değişim Kütle Spektrometre Kullanarak Protein Dinamiği Analizi

Bitki Hücresi Duvarında Lignin, Selüloz ve Hemiselülozu Görselleştirmek için Raman Görüntüleme ve Çok Değişkenli Analizin Birleştirilmesi

Floresan Problar ve Lignin Bitki Kesitlerinde Doğal Otofloresan Dayalı SFLIM Ile Etkileşimlerinin Ölçülmesi

Etiket- In situ Görüntüleme

Moss Physcomitrium patens'te Calcofluor Kullanarak Hücre Duvarı Dinamiğinin 3-D Hızlandırılmış Görüntülenmesi

Histokimyasal boyama

Click Kimyası ve Genleşme Mikroskobu ile Hücre İçi Sialilasyonun Görselleştirilmesi

Click Kimyası ve Genleşme Mikroskobu ile Hücre İçi Sialilasyonun Görselleştirilmesi

Click Kimyası ve Genleşme Mikroskobu ile Hücre İçi Sialilasyonun Görselleştirilmesi

Metabolic Labeling