Biz düzenleme yardım için Sabin Russell müteşekkiriz. Bu çalışma (http://www.jbei.org) ABD Enerji Bölümü, Bilim, Biyolojik ve Çevresel Araştırma Ofisi, Ofisi tarafından desteklenen DOE Ortak Biyoenerji Enstitüsü parçası oldu Lawrence Berkeley arasındaki sözleşme DE-AC02-05CH11231 yoluyla Ulusal Laboratuvarı ve ABD Enerji Bakanlığı.

1.. Gömmeyi Kök <ol><li> Su içinde bir% 7 agaroz çözeltisi (distile su, 100 ml dereceli agaroz elektroforezi 7 g) elde edin. 20 dakika için otoklav ile ya da düşük yoğunlukta (1250 watt bir mikrodalga, örneğin,% 10 yoğunluk) 20 dakika boyunca mikrodalga ile agaroz eritilir. </li><li> Plastik şişeleri kullanarak kaynaklanıyor gömmek için bir ev yapımı kalıp hazırlayın. <ol><li> Bir jilet kullanarak, bir 2 ml vidalı kapaklı mikrosantrifüj tüp (Bölüm A) konik alt kesti. , Bir şırınga iğnesi ile, gömülü olarak kök çapından biraz daha büyük boru kap içinde bir delik delinerek. Sonraki, bir 0.6 ml mikrosantrifüj tüp (Bölüm B) alt kısmına 0,5 cm kesti. </li><li> Önceden kesilmiş 2 ml mikrosantrifüj tüpü içine 0.6 ml mikrosantrifüj tüpü cut-off 0.5 cm kısmını ekleyin. Parafilm (Şekil 1) kullanılarak, iki parça kapatın. NOT: Tüpün alt Agaroz katılaşmış sonra gömülü numunenin çıkarılmasını kolaylaştırmak için kesilir. To kap içinde bir delik kök agaroz gömüldüğünde kök sabit tutulmasına yardımcı olur. Kalıp agaroz tutun ve gömerken kök düz tutmak için hizmet edecektir. Agaroz ayarlanır ve kök gömülü kadar Parafilm, iki parça, A ve B yapacak. </li><li> Bir jilet kullanarak, ilgi alanı, (ilk kök boğum örneğin orta) bir kök bölümü kesti. NOT: İdeal olarak, kök sadece dehidratasyon yıkımı önlemek için gömmeden önce kesilmelidir. Seçenek olarak ise, sap geçici olarak su ile ıslatılmış filtre kağıdı içeren bir plaka saklanabilir. Bu plaka, doku su kaybını ve deformasyonunu önlemek için gömülü olması için hazır olana kadar buz üzerine yerleştirilebilir. Yüksek nem olmadan 30 dakika daha uzun süreler için kök saklama kök kurumasına neden olur. </li></ol></li><li> Düşük yoğunlukta mikrodalgada agaroz eritin. DİKKAT: agaroz içeren şişe sıcak olabilir. Şişe almak için de eldiven kullanın. Erimiş agaroz diyelim(20 ° C ve 25 ° C arasında), oda sıcaklığında tand yaklaşık 50 ° C&#39;ye soğuyana kadar </li><li> Yavaş yavaş şişeyi doldurmak için önceden hazırlanmış plastik kalıp içine agaroz 5 ml pipetle. NOT: Emin kalıplar içinde hiçbir hava kabarcığı olmadığından emin olun. Hava kabarcıkları agaroz kalıp boşlukları neden olur ve tamamen sonunda numune bölümlerinin düzensiz kesme yol açacaktır kök örneği, kapsamaz. <ol><li> Agaroz yarı katı olmak için 30 ila 60 saniye boyunca soğumaya bırakın. Nüfuz ve agaroz, yüzer ayağa olamaz, ama emin, küçük bir kürdan ile test edin. NOT: agaroz o hücre morfolojisi yok, kök aksatmanın tarafından örnek zarar verecektir hala sıcak olduğu zaman kök yerleştirilir ise. </li><li> Bu agaroz dolu şişe içinde kök yerleştirin. Gövdesi düz kalır emin olun. Kök ucu, kapak tarafından düzenlenen bir şekilde delikli kapağı yerleştirin. Vidalı kapağı açmayın. Bazen (tek bir tür) bir kök daha embe olabilirTek bir şişede dded; ama bu özel durumda, kap kullanmayın. NOT: vidalı kapak açıksa, kök bükümlü alacak. </li></ol></li><li> Sertleşene kadar, 10-30 dakika süre ile, oda sıcaklığında ya da 4 ° C &#39;de şişeyi bırakın. </li><li> Yavaşça tüpün dışına kaydırarak kalıp çıkarın. Parafilm açın. Bir cam mikroskop lamı üzerine Kısım A katılaşmış agaroz serbest bırakmak için parmak ile hafifçe kalıbın Kısım B alt itin. </li><li> 1.2 cm uzunluğunda üç eşit parçaya agaroz gömülü kök kesilir. Agaroz değildi ve atın kök kısmını kesip. <ol><li> Gömülü olan agaroz bu parçaları Mağaza hava geçirmez bölüme hazır olana kadar 4 ° C&#39;de bir siyah kutu içinde 2 ml mikrosantrifüj tüpleri kaynaklanıyor. Seçenek olarak ise, bir haftalık bir süre için 4 ° C&#39;de tüpler saklayın. NOT: Depolama mümkündür, ama deneyci gömülü kaynaklanıyor hala hayatta ve deney olarak farkında olması gerekir, Eserler potansiyel tanıtıldı olabilir. </li></ol></li></ol> 2.. Kesit alma Kök <ol><li> DİKKAT: dikkatle vibratome kılavuzunu okuyun ve tüm emniyet talimatlarını izleyin. </li><li> Numune disk (herhangi bir katı veya sıvı ücretsiz) temiz ve tamamen kuru olduğundan emin olun. Önceki deneylerden herhangi bir kalıntı tutkal ve suyla yıkamak için bir traş makinesi bıçak ile numune diski temizleyin. Sonra bir kağıt havlu ile kurulayın. Not: Bu yapıştırıcı iyi çalışır ve agaroz numune bağlanan sağlayacaktır. Bu adımı düzgün yapılmazsa ise, numune diske uygun olmayabilir ve daha sonra numune kesit sırasında diske devrilmesine neden olasıdır. <ol><li> Kullanın yumuşak kağıt örnekler içeren agaroz blok herhangi bir nemi çıkarmak için mendil. </li><li> Örnek disk üzerinde doku yapıştırıcı bir damla yerleştirin. Çizgi yapışkan şişenin ucu kullanılarak plakanın ortasına bir alanı kapsayacak şekilde, yapışkan var. Çabuk yerAgaroz blok numuneler dik ya da sırasıyla, çapraz veya uzunlamasına kesitlerde, için plaka paralel olarak ya da olduğu kadar. Yapışkan 10-30 dakika için oda sıcaklığında ya da 4 ° C&#39;de numune diske örnek düzeltmek için izin verin. NOT: Bu bir zaman duyarlı bir adımdır. </li></ol></li><li> Tampon tepsiye veya çukur üzerinde yerinde numune diski düzeltmek. Bölümleri ile agaroz blok / s jilet paralel olmalıdır. Örnekler tamamen gömülü olduğu kadar oda sıcaklığında damıtılmış su ile tampon tepsi doldurun. </li><li> Yarısında jilet kesmek ve daha sonra bıçak tamamen düz kalır, böylece sağlam bir makasla uçlarını kesin. Bıçak tutucu üzerine önceden kesilmiş jilet yansım takın. <ol><li> 84 ° bıçak tutucuya açısını ayarlamak, 50 Hz (Vibratome pozisyon 5) 0.90 / sn mm (Vibratome pozisyon 8) ve frekans hızı. 100 um kalınlığında kesitler halinde kesilmiştir. Sürekli modunu kullanın. HAYIRTE: Bu kalınlık, doku boyama protokollerini kullanılan çeşitli asit ve baz tedavi dayanabilir emin olmak için seçildi. Kesit için pencere ayarlayın ve bölüm yaklaşık 1.2 cm&#39;lik bir agaroz blok için Vibratome için sürekli bir modda 15-20 dk bekleyin. </li></ol></li><li> Tampon tepsisine kesit boyunca bir tek kullanımlık plastik pipet kullanarak bölümleri toplayın. Alternatif olarak, kısımlar, bir cam kabın içine tampon tepsiden aktarılır ve daha sonra berrak bir Petri levhaya edilebilir. 2.0 ml mikrosantrifüj tüplerine birkaç bölümleri aktarın. Not: numuneler saydam bir zemin üzerine bölümlerine bakınız daha kolay olduğu için, bir Petri plakasından toplanan ve tampon, tepsi bir sonraki numune için hazır olarak kabul edilebilir. </li><li> Kesitler, 30-60 dakika boyunca 4 ° C de, 50 ml bir tüp içinde saklanan ya da toplandı ve 1,5-2 ml mikrosantrifüj tüpleri içinde saklanabilir. NOT: Daha uzun süreler için bölümleri saklanması kötü görüntü kalitesine yol açacaktır. </li&gt; </ol> Görüntüleme için 3. Mikroskop ve Kamera Ayarı <ol><li> Mikroskop Koehler aydınlatma ayarlayın. Bir hedef seçin. İlk numune odaklanın. Bir buçuk veya daha düşük bir ışık yoğunluğunu getirin. Alanında diyafram (FD) ve diyafram (AP) kapatın veya belirli bir hedef üzerinde mümkün olan en düşük ayara getirin. <ol><li> Büyütme kadar yüksek olursa, o kadar büyük halkası olacaktır. Gibi keskin mümkün olduğunca alan iris odaklanmak için kondansatör odaklanarak düğmeyi kullanın. </li><li> Yavaşça kondansatör-merkezleme topuzlarını (Kondansörü çevreleyen iğne şeklindeki vida) kullanılarak merkeze alan iris (altıgen şekilli, küçük halka) resim getirecektir. Yavaşça alan iris kenarına ulaşır diyafram (FD) bu tür artış. Alan iris kenarını geçtikten hemen sonra FD artan durdurun. </li><li> Yavaşça kontrastını ayarlamak için açıklığı (AP) artar. Gerektiği gibi ışık yoğunluğunu ayarlayın. NOT: Koehler aydınlatma her o için ayarlanması gerekiyorbjective, her deney gün. Gün için düzeltme yapıldıktan sonra elde edilen numaralarını not edin. Bu rakamlar hedefler o gün için ileri ve geri açıldığında her defasında yeniden edilecektir. </li></ol></li><li> Diyafram, şiddeti, maruz kalma süresi, kazanç, ve Tablo 1&#39;de açıklandığı gibi filtreleri ayarlayın. Bu bilgiler sadece bir rehber olarak kullanılmalıdır. </li><li> Floresan görüntü yakalamak için hiçbir mekanik obtüratör ile bir geniş format CCD çipi ile yüksek çözünürlüklü dijital fotoğraf makinesi kullanın; ve aydınlık alan görüntüler için yüksek çözünürlüklü, yüksek hızlı kamera. </li><li> Standart yazılımı kullanarak slaytlar işleyin. Yazılımı yükleyin. &quot;Al&#39;ı&quot; ve tıklayın &quot;Set kamera / ütü masası,&quot; daha sonra kullanılacak kamera seçin. &quot;Tamam&quot; düğmesine tıklayın. Ardından &quot;Al&quot; Click &quot;Renk sekmesinde.&quot; Altında &quot;Renk sekmesinde,&quot; seçim &quot;Bayer metodu&quot; ve ardından &quot;ortalama dört.&quot; Önerdi kazancı (kırmızı, yeşil, mavi) sağa sola eklem Tablo 1. &quot;Set kaydetmek&quot; sekmesini seçin ve görüntülerin saklanacağı dizinde tıklayın. Tablo 1&#39;de önerileri &quot;Pozlama süresi&quot; olarak ayarlayın. &quot;1&quot; &quot;binning&quot; olarak ayarlayın ve &quot;Canlı binning&quot; ilgi bölgeye &quot;1&quot;., Odak ve sonra tıklayın &quot;canlı kaydedin.&quot; </li><li> Kamera yazılımı çıkış görüntüleri &quot;TIF&quot; formatında bulunmaktadır. Hücre tipleri için histokimyasal görüntüleri analiz edin. Sunum ve yayın aşağı kullanımlar için standart bilgisayar yazılımı kullanın. </li></ol> 4.. Ultraviyole ve Parlak alan Görüntüleme <ol><li> Bölümler kolayca pipetle böylece pipet ucu kesilmiş bir 1 ml pipet kullanın. Yavaşça pipet bölümler ucu içine ve bir mikroskop lamı üzerine. Bir kapak kayma bölümleri kapsayacak. UV ışığı veya parlak ışık altında alan bölümleri gözlemlemek. </li></ol> 5. Phloroglucinol-HCl (Wiesner) Boyama 12 <ol><li> % 3 phloroglucinol çözeltisi hazırlamak için, 10 ml mutlak etanol içinde 0.3 g floroglukinol çözülür. Etanol% 3 floroglukinol iki hacim için konsantre HCI (37 N), bir hacim karıştırın; Bu çözeltiye, phloroglucinol-HCl (Ph-HCI) veya Wiesner leke. NOT: Bu çözüm çözüm zamanla düşer ve boyama etkisiz hale gelecektir çünkü, boyamanın gününde taze yapılacak ve saklanabilir olamaz. DİKKAT: HCl oldukça yıpratıcıdır, Ph-HCl leke tutarken çok dikkatli kullanın. </li><li> Bir 2.0 ml mikrosantrifüj tüpüne kök bölümleri aktarın. Bölümleri ihtiva eden tüpe Ph-HCl çözeltisi 1 ml ilave edilir ve Ph-HCl leke olarak HCl oldukça aşındırıcı, çünkü hemen kap. Yavaşça tüm bölümleri boyanır sağlamak için tüp hareket ettirin. Bu aşama için bir alternatif, Ph-HCl çözeltisi yukarı ve aşağı pipetle böylece tercihen saniye bozmadan, açık boru kap tutmaktırTIONS. NOT: Bu, bu bölümleri zarar verebileceğinden, pipet içine bölümleri pipetle için dikkatli olun. <ol><li> Bölümler zarar vermeden kolayca pipetle edilebilir bir şekilde pipet ucu kesilmiş bir 1 ml pipet kullanın. Yavaşça ucu içine ve bir mikroskop lamı üzerine bölümleri pipetle. Kapak kayma bölümleri kapsayacak. Aydınlık alan ışık altında bölümleri gözlemlemek. NOT: Ph-HCl çözüm örneklerinin bir bozulmaya neden, 5-10 dakika içinde kurur. Bu nedenle, görüntüleme bu süre içinde tamamlanması gerekmektedir. </li></ol></li></ol> 6.. Maule Boyama 13,14 <ol><li> % 0.5 &#39;lik bir potasyum permanganat solüsyonu hazırlamak için, 40 ml damıtılmış su içerisinde potasyum permanganat, 0.2 g çözülür. 7 günlük bir süre boyunca oda sıcaklığında karanlık şişe içinde depolayın. <ol><li> 9 ml saf su (1:10) ile, 1 ml konsantre HCI (37 N) ilavesiyle, bir% 3.7 HCI solüsyonu hazırlayın. Taze bir% 3.7 HCl çözeltisi hazırlayınDeney günü. Kullanılan 37 N HCI stok çözümü çok eski olmadığından emin olun. Konsantre amonyum hidroksit çözeltisi (14.8 M) azalan gelen doymuş çözeltisi molaritesini önlemek için 4 ° C&#39;de depolanmalıdır. </li></ol></li><li> Bir 2.0 ml mikrosantrifüj tüpüne kök bölümleri aktarın. Bölümleri ihtiva eden tüpe% 0.5 potasyum permanganat çözeltisi 1 ml ilave edilir. <ol><li> Tercihen bölümleri bozmadan, yavaşça yukarı ve aşağı% 0.5 potasyum permanganat çözüm pipetle. 2 dakika boyunca inkübe edin ve pipetleme tekrarlayın. Tüm bölümler sakinleşene kadar mikrosantrifüj tüp bekletin. NOT: bölümleri zarar verebilir gibi pipet içine bölümleri pipetle için dikkatli olun. Bu çözüm karanlık olduğu gibi kök bölümlere bakın, bu yüzden tüp rafa bölümleri ile tüp tutmak ve onları 2 dakika boyunca yerleşmek için izin zor olabilir. </li><li> 1 ml pipet kullanarak,% 0.5 potasyum permanganat çözeltisi 700 ul çekmek.Potasyum permanganat solüsyonu çalkalamak için damıtılmış su içinde 700 ul ekleyin. Su çözeltisi berrak kalana kadar 3-4x tekrarlayın ya. </li><li> Su atın. Derin bir kahverengi renk bölümlerde taburcu kadar hızlı% 3 HCl 1 ml ekleyin. Bu, 3-5 dakika içinde ortaya çıkabilir veya 5 dakika her 2 yıkar gerektirebilir. Tüm% 3 HCl çözümü Pipet ve hemen bir sonraki adıma geçin. </li><li> Konsantre amonyum hidroksit çözeltisi 1 ml ilave edilir. Bölümler zarar vermeden kolayca pipetle edilebilir bir şekilde uç kesim ile 1 ml pipet kullanın. Yavaşça ucu içine ve bir mikroskop lamı üzerine bölümleri pipetle. Bir lamel ile bölümleri kapsayacak. Aydınlık alan ışık altında bölümleri gözlemlemek. DİKKAT: amonyum hidroksit derece aşındırıcı olduğundan, mikroskop veya mercek aşamasına korozyona neden önlemek için ekstra bakım ve dikkat gerektirir. NOT: amonyum hidroksit dumanlar zor örneği gözlemlemek için yapım, lamel sis olabilir. Bu nedenle lamel eklemeden önce ekstra dikkatli olun. Çözelti 5-10 dakika içinde kurur, bu yüzden görüntüleme o süre içinde tamamlanması gerekmektedir. </li></ol></li></ol> 7. Kongo Kırmızı Boyama 11,15 <ol><li> % 0.5 &#39;lik Kongo kırmızı bir çözelti hazırlamak için damıtılmış su, 100 ml kırmızı Kongo 0.5 g çözülür. </li><li> Bir 2.0 ml mikrosantrifüj tüpüne kök bölümleri aktarın. Tüpe% 0.5 Kongo kırmızısı çözeltisi 1 ml ilave edilir. Yavaşça% 0.5 kongo kırmızı çözümü pipet ve aşağı bölümleri bozmadan. NOT: Bu bölümleri zarar verebilir pipet içine bölümleri pipetle için dikkatli olun. <ol><li> 10 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir ve tekrar pipetleme. Oda sıcaklığında kuluçkalama bir diğer 3 dakika ile izleyin. </li><li> % 0.5 kongo kırmızı solüsyon 700 ul çekmek için 1 ml pipet kullanın. Kongo kırmızı bir çözelti çalkalamak için damıtılmış su içinde 700 ul ekleyin. Yıkama çözeltisi kadar yıkama 3-4x Tekraraçıktır. </li><li> Bölümler zarar vermeden kolayca pipetle edilebilir bir şekilde kendi ucu kesilmiş bir 1 ml pipet kullanın. Yavaşça ucu içine ve bir mikroskop lamı üzerine bölümleri pipet, ve kapak örtün. 560/40 bir bant geçiren bir filtre kullanılarak mavi ışık uyarma altında mikroskop lamı üzerine örnekleri gözlemlemek. NOT: Su 10-30 dakika içinde kongo kırmızı yıkayın gibi, önce mikroskopik analiz için uzun süre suda bölümleri tutmayın. </li></ol></li></ol> 8. Kalkofluor Beyazı Boyama 9 <ol><li> % 0,2 &#39;lik bir stok çözelti hazırlamak için damıtılmış su, 10 ml (beyaz Kalkofluor M2R&#39;den) fluoresan parlatıcı 28 0.02 g çözülür. % 0.2 &#39;lik çözelti, 4 ° C de karanlık bir şişe içinde, altı ay boyunca saklanabilir Damıtılmış su ile% 0.2 &#39;lik stok çözeltisi 10x seyreltilerek% 0.02&#39; lik bir çalışma çözeltisi hazırlayın. </li><li> Bir 2.0 ml mikrosantrifüj tüpüne kök bölümleri aktarın. % 0.02 calcof en boru 1 ml ekleluor beyaz çözelti. Yavaşça yukarı ve aşağı 0.02% calcofluor beyaz çözüm pipetle. NOT: Bu bölümleri zarar verebilir pipet içine bölümleri pipetle için dikkatli olun. <ol><li> 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir ve tekrar pipetleme. Oda sıcaklığında bir diğer 3 dakika için bölümü inkübe edin. NOT: bölümleri daha kolay bölümlere zarar vermeden çözüm pipetle yapmak için tüpün dibine çökmesine izin verilmektedir. </li><li> % 0.02 calcofluor beyaz solüsyon 700 ul çekmek ve distile su 700 ul eklemek için 1 ml pipet kullanın; 5 dk calcofluor beyaz çözümü çalkalamak için bekleyin. Yıkandıkları 3-4x tekrarlayın. Bölümler zarar vermeden kolayca pipetle olabilir Bu şekilde olarak pipet ucu kesilmiş bir 1 ml pipet kullanın. </li><li> Yavaşça ucu içine ve bir mikroskop lamı üzerine bölümleri pipet ve bir lamel ile onları karşılamak. UV ışık altında bölümleri gözlemlemek. </li></ol></li></ol> 9. Toluidine Blue O Boyama 16,17 <ol><li> A% 0.02 çözeltisi hazırlamak için 100 ml damıtılmış su içinde 0.02 g toluidin mavi O çözülür. NOT: toluidin mavi O çözelti, oda sıcaklığında karanlık şişe iki hafta içinde saklanabilir. </li><li> Bir 2.0 ml mikrosantrifüj tüpüne kök bölümleri aktarın. Tüpe% 0,02 toluidin mavi O solüsyonun 1 ml ilave edilir. Yavaşça yukarı ve aşağı 0.02% toluidin mavisi O çözüm pipetle. Daha sonra 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin ve bir kez tekrar pipetleme. NOT: Bu bölümleri zarar verebilir pipet içine bölümleri pipetle için dikkatli olun. Bölümler sakinleşene kadar mikrosantrifüj tüp hala bekletin. Bu çözüm karanlık olduğu gibi, görmek, bu yüzden tüp rafa bölümleri içeren tüp tutmak ve onları oda sıcaklığında 2 dakika boyunca yerleşmek için izin zor olabilir. <ol><li> % 0.02 toluidin mavisi O çözeltisi 700 ul çekmek için 1 ml pipet kullanın. Toluidin mavi O sol dışarı durulama için distile su 700 ul ekleyinution. 3-4x tekrarlayın veya yıkama solüsyonu kadar açıktır. Bölümler onlara zarar vermeden kolayca pipetle edilebilir bir şekilde pipet ucu kesilmiş bir 1 ml pipet kullanın. </li><li> Yavaşça ucu içine ve bir mikroskop lamı üzerine bölümleri pipet ve bir lamel ile onları karşılamak. Aydınlık alan ışık altında bölümleri gözlemlemek. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Boerjan, W., Ralph, J., Baucher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lignin+biosynthesis.">Lignin biosynthesis.</a> Annual review of plant biology. 54, 519-546 (2003).</li><li>Vanholme, R., Demedts, B., Morreel, K., Ralph, J., Boerjan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lignin+biosynthesis+and+structure.">Lignin biosynthesis and structure.</a> Plant physiology. 153, 895-905 (2010).</li><li>Humphreys, J. M., Chapple, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rewriting+the+lignin+roadmap.">Rewriting the lignin roadmap.</a> Current opinion in plant biology. 5, 224-229 (2002).</li><li>Adler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lignin+chemistry&#8212;past,+present+and+future.">Lignin chemistry&#8212;past, present and future.</a> Wood Sci. Technol. 11, 169-218 (1977).</li><li>Brien, T. P., Feder, N., McCully, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polychromatic+Staining+of+Plant+Cell+Walls+by+Toluidine+Blue.">Polychromatic Staining of Plant Cell Walls by Toluidine Blue.</a> 59, 368-373 (1964).</li><li>Mori, B., Bellani, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+staining+for+cellulosic+and+modified+plant+cell+walls.">Differential staining for cellulosic and modified plant cell walls.</a> Biotechnic &amp; histochemistry: official publication of the Biological Stain Commission. 71, 71-72 (1996).</li><li>Maeda, H., Ishida, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+of+binding+of+hexopyranosyl+polysaccharides+with+fluorescent+brightener.">Specificity of binding of hexopyranosyl polysaccharides with fluorescent brightener.</a> Journal of biochemistry. 62, 276-278 (1967).</li><li>Wood, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificity+in+the+interaction+of+direct+dyes+with+polysaccharides.">Specificity in the interaction of direct dyes with polysaccharides.</a> Carbohydrate Research. 85, 271-287 (1980).</li><li>Hughes, J., McCully, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+an+optical+brightener+in+the+study+of+plant+structure.">The use of an optical brightener in the study of plant structure.</a> Stain technology. 50, 319-329 (1975).</li><li>Verbelen, J. P., Kerstens, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarization+confocal+microscopy+and+congo+red+fluorescence:+a+simple+and+rapid+method+to+determine+the+mean+cellulose+fibril+orientation+in+plants.">Polarization confocal microscopy and congo red fluorescence: a simple and rapid method to determine the mean cellulose fibril orientation in plants.</a> Journal of microscopy. 198, 101-107 (2000).</li><li>Anderson, C. T., Carroll, A., Akhmetova, L., Somerville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+cellulose+reorientation+during+cell+wall+expansion+in+Arabidopsis+roots.">Real-time imaging of cellulose reorientation during cell wall expansion in Arabidopsis roots.</a> Plant physiology. 152, 787-796 (2010).</li><li>Liljegren, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phloroglucinol+Stain+for+Lignin.">Phloroglucinol Stain for Lignin.</a> Cold Spring Harbor Protocols. , (2010).</li><li>Nakano, J., Meshitsuka, G., lin, S., Dence, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Detection of Lignin Methods in Lignin Chemistry. , (1992).</li><li>Sibout, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CINNAMYL+ALCOHOL+DEHYDROGENASE-C+and+-D+are+the+primary+genes+involved+in+lignin+biosynthesis+in+the+floral+stem+of+Arabidopsis.">CINNAMYL ALCOHOL DEHYDROGENASE-C and -D are the primary genes involved in lignin biosynthesis in the floral stem of Arabidopsis.</a> The Plant cell. 17, 2059-2076 (2005).</li><li>Teather, R. M., Wood, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+Congo+red-polysaccharide+interactions+in+enumeration+and+characterization+of+cellulolytic+bacteria+from+the+bovine+rumen.">Use of Congo red-polysaccharide interactions in enumeration and characterization of cellulolytic bacteria from the bovine rumen.</a> Applied and environmental microbiology. 43, 777-780 (1982).</li><li>Yeung, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+beginner's+guide+to+the+study+of+plant+structure.">A beginner's guide to the study of plant structure.</a> Proceedings of the 19th Workshop/Conference of the Association for Biology Laboratory Education (ABLE. 19, 365-36 (1998).</li><li>Turner, S. R., Somerville, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collapsed+xylem+phenotype+of+Arabidopsis+identifies+mutants+deficient+in+cellulose+deposition+in+the+secondary+cell+wall).">Collapsed xylem phenotype of Arabidopsis identifies mutants deficient in cellulose deposition in the secondary cell wall).</a> The Plant Cell Online. 9, 689-701 (1997).</li><li>Iiyama, K., Pant, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mechanism+of+the+M&#228;ule+colour+reaction.+Introduction+of+methylated+syringyl+nuclei+into+softwood+lignin.">The mechanism of the M&#228;ule colour reaction. Introduction of methylated syringyl nuclei into softwood lignin.</a> Wood Sci. Technol. 22, 167-175 (1988).</li><li>Yang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+secondary+cell+wall+deposition+in+plants.">Engineering secondary cell wall deposition in plants.</a> Plant biotechnology journal. 11, 325-335 (2013).</li><li>Zhong, R., Ripperger, A., Ye, Z. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ectopic+deposition+of+lignin+in+the+pith+of+stems+of+two+Arabidopsis+mutants.">Ectopic deposition of lignin in the pith of stems of two Arabidopsis mutants.</a> Plant physiology. 123, 59-70 (2000).</li><li>Chapple, C. C., Vogt, T., Ellis, B. E., Somerville, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Arabidopsis+mutant+defective+in+the+general+phenylpropanoid+pathway.">An Arabidopsis mutant defective in the general phenylpropanoid pathway.</a> The Plant cell. 4, 1413-1424 (1992).</li><li>Fagard, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PROCUSTE1+Encodes+a+Cellulose+Synthase+Required+for+Normal+Cell+Elongation+Specifically+in+Roots+and+Dark-Grown+Hypocotyls+of+Arabidopsis.">PROCUSTE1 Encodes a Cellulose Synthase Required for Normal Cell Elongation Specifically in Roots and Dark-Grown Hypocotyls of Arabidopsis.</a> The Plant Cell Online. 12, 2409-2423 (2000).</li></ol>

The authors have no financial conflicts to disclose.

A. thaliana sap bölümleri yaygın olarak sekonder hücre duvarındaki hücre organizasyonunu incelemek ve niteliksel olarak vahşi tip ve transjenik bitkiler arasındaki farklılıkları incelemek için kullanılır. Örneklerin kesit için yaygın olarak kullanılan teknikler doğrudan el kesme vardır; numuneleri agaroz veya sabitleyici gömülü olduğunda ya da kesit bir vibratome veya mikrotom ile yapılabilir. Helisli aksine, sadece son iki numune ve düzgün olmayan yüzeyler arasında kalınlık farklılıklarından kaynaklanan kötü bir numune hazırlama neden olur numuneleri arasındaki farklar eksik üretme riskini azaltır izin verir. Bütün bu yöntemler kendi artıları ve eksileri var. Bir vibratome kullanarak kesit ardından, agaroz içinde gömme seçtik ve aşağıdaki nedenlerle yaptı: taze doku ayrıntılı işleme ihtiyacını ortadan kaldırır gömme kolaylığı ve zaman agaroz kullanılarak geçirdi. Ayrıca, bizim ev yapımı kalıpları yapmak kolay ve ucuz, th tutabilire düz kök, uzun yıllar kullanılabilir, ve bir karmaşa yapmadan örneklerin kolay açıklamasında yardımcı olabilir. Yüksek yüzdeli agaroz çözülür ve homojen bir çözelti elde etmek için en iyi yolu (tıknaz granülleri oluşturan olmadan 100 ml agaroz 7 g tam çözülme) bunu otoklav veya düşük yoğunlukta mikrodalga için olduğunu. Taze kök doku kesmek için, ya da alternatif olarak, doku su kaybını ve deformasyonu önlemek için, su ile ıslatılmış filtre kağıdı içeren buz üzerine yerleştirilmiş bir plaka içinde depolamak için önemlidir. Yüksek nem olmadan 30 dakika daha uzun süreler için kök saklama kök kurumasına neden olur. Kök gömülü olduğu hemen önce agaroz sıcaklığı yaklaşık 50 ° C olmalıdır Hava kabarcıkları kalıp boşlukları neden olabilir ve bunun sonucu olarak düzgün olmayan kesit olacaktır, çünkü agaroz şişe içine döküldükten sonra hava kabarcıklarının varlığı kontrol etmek çok önemlidir. Hava kabarcıkları dökme önce vakum altında hızlı bir şekilde yerleştirerek çözeltisi temizlenebiliro. Hala yumuşak ve sıcak 50 ° C olduğu zaman kök agaroz yerleştirilmelidir Isı kök aksatmanın tarafından örnek zarar verir ve hücre morfolojisi yok edecektir. Agaroz çok soğuk ise kök agaroz nüfuz olmayacak ve gömme mümkün olmayacaktır. Agaroz gömülen, kök örnekleri, bir haftaya kadar 4 ° C &#39;de muhafaza edilebilir. Yerine el-kesit verimleri bir vibratom kullanılması tam örneklerini ve daha iyi görüntü kalitesi kesti. Tüm güvenlik talimatları dikkatlice okuyun ve bir Vibratome kullanırken takip edilmelidir. Bu örnek disk, kesit sırasında düşmek değil bu yüzden doku yapıştırıcı yerde güçlü örnek tutmasını sağlamak için temiz ve kuru olduğundan emin olmak için önemlidir. Örneğin kalınlığı, boyama işlemleri sırasında sert asit ve baz tedavi dayanacak şekilde belirtilir. Vibratome kullanılan traş makinesi bıçak bölümünde EV kesilir sağlamak için tamamen düz olmalıdırEnly. Kesit numune başına yaklaşık 20 dakika sürer; Zaman kazanmak için, benzer örnekler tek bir örnek plaka üzerinde gruplar halinde kesitli olabilir. Kesitlere ayırma esnasında bölümler açık bir arka plan üzerinde yer görmek için bölümleri daha kolay hale getirmek için ve bir sonraki numune için tampon kaseti serbest bırakmak için, küçük bir Petri kabı içine tampon tepsiye aktarılır. Bölümler hemen aşağı boyama işlemleri için kullanılan ya da daha sonra kullanmak için saklanabilir. 2.0 ml mikrosantrifüj tüplerine kök bölümleri aliquoting boyama işlemleri için prime yardımcı olur. Kamera ve mikroskop doğru ayarların yapılmasını yüksek kaliteli görüntüler elde etmek için çok önemlidir. Kohler aydınlatma ayarlanması mikroskop kullanımında en önemli adımlardan biridir. Yöntemler bölümünde tarif edildiği gibi diyafram ve ışık yoğunluğu için ayarlamalar, sadece bir kılavuz olarak içindir. Onlar kullanılan mikroskop ve kamera bağlı olarak modifiye edilmesi gerekebilir. Biz yüksek çözünürlük kullanılmışbir geniş format CCD çipi ve hiçbir mekanik obtüratör UV görüntüleme için, calcofluor beyaz ve kongo kırmızı boyanması ile dijital kamera; ve Maule, floroglukinol ve toluidin mavisi O boyama parlak alan görüntüler için yüksek çözünürlüklü ve yüksek hızlı renkli kamera. Görüntüler, analiz edilir, işlenir ve standart görüntüleme yazılımı kullanılarak monte edilmiştir. Phloroglucinol lignin tayini için en sık kullanılan leke olduğunu; sadece sinamaldehit uç gruplara lekeleri gibi gerçek bir lignin leke değildir. Ayrıca Weisner leke olarak bilinen floroglusinol leke, ksilem ve bu aldehit grupları 4 mevcut interfasiküler lifler karakteristik bir kiraz pembe ya da fuşya rengi verir. Pembe rengin yoğunluğu Lignifikasyon ölçüde değişir. Ince farklılıkları gözlemlemek için zor olsa da, bu vahşi tip ve lignin içeriği 19 varyasyonlara sahip mutant kök bölümleri arasındaki farkları kolaydır. Ayrıca, EASBu tür dokular arasında odunlaşma düzeyleri değişir çünkü, (kök apeks yönünde) daha genç ve daha yaşlı (baz kök) dokular arasındaki farklılıkları gözlemlemek için y. Genellikle vahşi tip sapı, epidermis korteks ve öz ektopik odunlaşma 20 olmadıkça (böylece renkli alamadım) sinamaldehitler&#39;in içermez. Maule leke, diğer taraftan, syringli linyin adet karşı spesifiktir ve S ya da G birimlerde farklı lignin zenginleşmeler (ksilem dokulara göre örneğin fiber) 14,18 ayırt etmek için kullanılabilir. Bir methoxycatechol oluşturmak için ve daha sonra amonyum hidroksit ile reaksiyonu takiben-o-kinon metoksi için lignin S biriminin syringly çekirdeği üzerinde, potasyum permanganat ve hidroklorik asit hareket ederler. Maule leke eksikliği ya da yoğun (A. thaliana F5H mutantlar ve genel gimnospermdir bitkilerde örneğin) lignin S birimlerinde tükenmiş olan mutantlar ayırt etmek için iyi bir gösterge olduğunu, Maule sarı-kahverengi renklenme Öğr verirksilem ve sertdokular 21 hem de kırmızı ead. Aynı nedenle, Maule esas boyama tipik olarak S birimi 18 eksikliği açıktohumlu ikinci S lignin ihtiva eden, kapalı-tohumlu ayırt etmek için kullanılabilir. Kuvvetli asit ve baz sırasıyla floroglukinol ve MAULE boyama işlemleri sırasında kullanılan olduğundan, bazı deneysel adımlar dikkatle yapılması gerekir. Konsantre HCl ve amonyum hidroksit hem de güçlü aşındırıcılar vardır; Ph-HCl ve MAULE lekeli örneklerini içeren slaytlar düzgün ele değilse onlar mikroskop sahne ve lens bozulabilir. Ayrıca numuneler bozulmaya neden 5-10 dakika içinde, çabuk kurur, böylece görüntüleme hızlı yapılmalıdır. Toluidin mavisi O bir çok renkli leke ve bir çok renkli numune üreten, farklı hücre duvarlarının farklı kimyasal bileşenler ile reaksiyona giren farklı renklerde hücre duvarının farklı bileşenlerinin boyar. Oluşturulan renkler provid olabilirhücrenin tabiatına e bilgiler. Toluidin mavisi O da negatif yüklü gruplar, 5,6 bağlanan katyonik bir boyadır. Bu boyanın sulu bir çözeltisi, mavi, ama boya hücreye farklı anyonik grup ile bağlar farklı renk oluşturulur. Boya pektin gibi karboksilatlı polisakkaritler ile reaksiyona Örneğin, pembemsi bir renk mor; yeşil, yeşilimsi mavi, ya da lignin ve tanen gibi aromatik maddeler ile parlak mavi; ve morumsu veya nükleik asitler ile yeşilimsi mavi. Boyama kolaydır ve iki gün boyunca sürebilir. Kalkofluor beyaz lekeler selüloz, kaloz ve diğer ikamesiz veya zayıf ikame β-glukanlar 6-9 ve Kongo kırmızı lekeler doğrudan doğruya (1 → 4)-β-glukan ve özellikle 8,10,11 selüloz. Beyaz lekeler Kalkofluor parlak epidermis, korteks ve öz ancak parlaklık önemli ölçüde ksilem ve interfasiküler liflerde azalır. İki p vardırağır Odunlaşmış dokularda calcofluor beyaz azaltılmış floresan için ossible açıklamalar; bir, sırayla polisakaritler üzerine düzgün bir şekilde yayılması için Kalkofluor beyaz kabiliyetini azaltacak, lignin varlığı için bağlıyor. UV altında heyecan beyaz Kalkoflorla tarafından yayılan flüoresans kısmi söndürülmesi için ikinci bir açıklama sayı. Bunun aksine, kırmızı boyama Kongo beyaz Kalkofluor daha az lignin varlığında etkilenir görünmektedir. Kırmızı calcofluor beyaz ve kongo arasındaki floresan özellikleri farkı ile ilgili olabilir; kongo daha iyi bir difüzyon kapasitesi calcofluor beyaz daha Odunlaşmış dokular aracılığıyla kırmızı; veya polisakarit bağlanma özelliklerine 22 çok az bir fark. Kongo kırmızı suyla yıkanıp almak eğilimindedir çünkü, Kongo kırmızısı ile boyanmış kesitler görüntüleme önce çok uzun saklanmamalıdır dikkat etmek önemlidir. Histokimyasal boyama kantitatif de olsane kesinlikle kesin, görsel ipuçları ile bu dokuların veya anormal hücre duvarı birikimi ve Lignifikasyon bütünlüğü gibi önemli özellikleri hakkında bilgi hazinesi ortaya çıkarabilir. Yukarıda anlatılan boyama teknikleri uygulaması kolay olan ve bu tür lignin ve selüloz gibi bir bitki hücresi duvarı kritik elemanları, için de geçerlidir. Buna, spesifik anti-serumlar ve monoklonal antikorlar kullanılarak imüno-hemiselülozlar ve pektin çeşitli bileşenlerin tespiti için gereklidir. Bu rapor, A kullanın ikincil hücre duvarı boyama alanında yeni başlayanlar için bir astar olarak hizmet etmek içindir onların modeli sistem olarak thaliana&#39;nın.

Bitki hücre duvarı çeşitli bileşenlerine içinde bilgi bir bolluk tutar: lignin, selüloz, hemiselülozlar (ksilan, glucuronoxylan, ksiloglukan, arabinoksilan, karışık bağlantı glukan veya glukomannanı), ve pektin. Histolojik teknikler örgütsel ve hücresel düzeyde ikincil hücre duvarları içinde farklılıklarını inceleyerek önemli görsel ipuçları sağlar. Çeşitli histolojik teknikler geliştirilmiş ve literatürde bulunabilir, ama basit görsel talimatları ile çok detaylı protokoller nadiren hiç varsa, çünkü bu teknikler zor ve zaman alıcı yeni başlayanlar için olabilir. Bu çalışmanın amacı, yüksek kaliteli görüntüler elde etmek histolojik boyama teknikleri için basit kurallar sağlamaktır. Kök doku Kesit hücre duvarları ve hücre şekillerde görselleştirilmesi ilk adımdır. El-cut bölümler ucuz ve hazırlamak için daha az zaman alacak olsa da, bir vibratom kullanımı tutarlılığı sunar veyüksek kaliteli görüntü verir. Bir vibratome kullanarak keskin görüntüler üretmek için yardımcı olur ve önemli ölçüde sadece kötü bir örnek hazırlama neden olacağını numuneler arasındaki yanlış farklılıkları üretme riskini azaltır, aynı kalınlıkta, hatta bölümleri üreterek daha iyi veri kalitesini üreten sağlar. Taze örnekleri düzeltmek için reçineler kullanılarak yeni başlayanlar için zor olabilir ve bir şekilde analiz yapılması gerektiğinde hala bile uzmanlar için zaman alıcı olabilir. Buna ek olarak, bir reçine içine gömülü olduğu zaman numunenin herhangi bir biyolojik aktivitesini ölçmek mümkün olur. Agaroz ve ev yapımı bir kalıp kullanır Basit bir tekniktir kök dokuları gömmek için yararlı olduğunu ve aynı zamanda yumuşak dokuların diseksiyonu gerektiren uygulamalarda kullanılabilir. Reçine içinde gömme örnekleri ile karşılaştırıldığında, bu yöntem, canlı dokuları tutmak ve örnek manipülasyon azaltma avantajına sahiptir. Bir vibratom yoluyla dokulara Kesit derece hassas ve homojen üretirÇalışmanın amacına bağlı olarak, daha sonra çeşitli boyama teknikleri ile kullanılabilir, lı bölümleri. Lignin ve diğer aromatik maddelerin görselleştirmek için en basit yöntem, ultraviyole (UV) ışık kullanır. UV ışığı ile aromat bazlı moleküllerin uyarma eski bir tekniktir, ancak yine de lignin görüntülenmesi için hızlı yaklaşımlardan biridir. UV ışık diğer aromatikleri heyecanlandıracak Ancak, UV görselleştirme aslında lignin tespiti için ideal değildir. 1-3: Lignin esas olarak üç yapı, monolinyollere (koniferil alkol, sinapil alkol ve p-kumaril alkol hydroxycinnamyl alkolleri) oluşur. Phloroglucinol leke ksilem, lif, ve trakea dokularda 4 mevcut sinamaldehitler&#39;in ölçüde ipuçları sağlayabilir. Phloroglucinol genel sinamaldehitler&#39;in iyi bir göstergesi olduğunu ve sinamaldehitler&#39;in ve diğer aromatik ayırt edebilirsiniz. Sinapil alkol monomerler algılanabilirve Maule leke kullanılmasıyla ayrılır. Toluidin mavisi O çok renkli bir boya ve bu nedenle farklı renklerde 5,6 hücre duvarının farklı unsurları leke yeteneğine sahiptir. Toluidin mavi O birincil kullanımı pektin ve lignin 5,6 tespit etmektir. Toluidin mavi O kullanmanın avantajı, hücre duvarının birçok unsuru tek bir aşamada görselleştirilebilir olmasıdır. Beyaz Kalkofluor ve Kongo Kırmızı hem de çalışmak için kolay ve selüloz görselleştirmek için kullanılabilmektedir. Kalkofluor beyaz lekeler selüloz, kaloz, ve diğer non-değiştirmiş veya zayıf ikame β-Glukan 6-9, kongo kırmızı lekeler, doğrudan özellikle 10,11-β (1 → 4)-Glukan ve selüloz oysa. Bu çalışmanın amacı A. yüksek kaliteli görüntüler elde etmek için yukarıda belirtilen boyama tekniklerinin kullanımı için basit kuralları sağlamaktır thaliana kaynaklanıyor.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#160;Agarose</td>
			<td>EMD</td>
			<td>MERC2125</td>
			<td>CAS Number: 9012-36-6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phloroglucinol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P 3502</td>
			<td>1,3,5-trihydroxybenzene [CAS Number: 108-73-6]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>EMD</td>
			<td>HX0603-75</td>
			<td>CAS Number: 7647-01-0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium hydroxide</td>
			<td>EMD</td>
			<td>AX1303-6</td>
			<td>CAS Number: 1336-21-6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Toulidine Blue O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3260</td>
			<td>Blutene chloride, Tolonium Chloride [CAS Number 92-31-9]&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium permanganate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>223468</td>
			<td>CAS Number 7722-64-7&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 190 proof</td>
			<td>KOPTEC</td>
			<td>V1401</td>
			<td>CAS Number: 64-17-5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Congo Red</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>C6277</td>
			<td>Disodium 3,3&#39;-[[1,1&#39;-biphenyl]-4,4&#39;-diylbis(azo)]bis(4-aminonaphthalene 1-sulphonate) [CAS Number 573-58-0 ]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent Brightener 28/ Calcofluor White Stain</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F3543&#160;</td>
			<td>4,4&#39;-Bis[4-[bis(2-hydroxyethyl)amino]-6-anilino-1,3,5-triazin-2-yl]amino]stilbene-2,2&#39;-disulphonic acid [CAS Number 4404-43-7]&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Leica Vibrating blade microtome VT1000S</td>
			<td>http://www.leicabiosystems.com/products/sectioning/vibrating-blade-microtomes/details/product/leica-vt1000-s/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor</td>
			<td>American Safety razor company</td>
			<td>Item # 60-0139-0000&#160;</td>
			<td>Stainless Steel Double Edge Blade (Personna Super)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw Cap Microcentrifuge Tubes (2ml)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>16466-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge Tubes (0.6ml)</td>
			<td>Axygen Scientific</td>
			<td>MCT-060-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mitt</td>
			<td>Bel-Art</td>
			<td>380000000</td>
			<td>SCIENCEWARE&#160; Hot Hand Protector Mitt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue adhesive&#160;</td>
			<td>Ted Pella Inc</td>
			<td>10033</td>
			<td>Store at 4&#176;C or 20&#176;C for 3 months or longer&#160; storage&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microwave</td>
			<td>Panasonic</td>
			<td>NN-SD762S</td>
			<td>PELCO Pro CA 44 Instant tissue adhesive&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera with CCD chip with no mechanical shutter&#160;</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>C4742-95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High speed color camera&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>QImaging</td>
			<td>MicroPublisher 5.0 RTV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera software&#160;</td>
			<td>&#160;Molecular Devices</td>
			<td>MetaMorph version 7.7.0.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imagining anaylsis&#160;</td>
			<td>Adobe&#160;</td>
			<td>Photoshop CS4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Cover Glasses, Square, No.1</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48366-067</td>
			<td>22 x 22 mm (7/8 x 7/8&#34;)-Cover glasses are corrosion-resistant and uniformly thick and flat. No. 1 thickness is 0.13 to 0.17mm.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frosted Micro Slides, 1mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48312-003</td>
			<td>75 x 25 mm- 1mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TX2 Filter cube</td>
			<td>Leica</td>
			<td>11513851/11513885</td>
			<td>Filter used for Congo red analysis with a band-pass of 560/40.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm M</td>
			<td>Alcan packaging</td>
			<td>BRNDPM998</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

histochemical staining of arabidopsis thaliana secondary cell wall elements

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively in the study of secondary cell wall formation. Secondary cell wall deposition occurs after the primary cell wall is laid down, a process carried out exclusively by specialized cells such as those forming vessel and fiber tissues. Most secondary cell walls are composed of cellulose (40&#8211;50%), hemicellulose (25&#8211;30%), and lignin (20&#8211;30%). Several mutations affecting secondary cell wall biosynthesis have been isolated, and the corresponding mutants may or may not exhibit obvious biochemical composition changes or visual phenotypes since these mutations could be masked by compensatory responses. Staining procedures have historically been used to show differences on a cellular basis. These methods are exclusively visual means of analysis; nevertheless their role in rapid and critical analysis is of great importance. Congo red and calcofluor white are stains used to detect polysaccharides, whereas M&#228;ule and phloroglucinol are commonly used to determine differences in lignin, and toluidine blue O is used to differentially stain polysaccharides and lignin. The seemingly simple techniques of sectioning, staining, and imaging can be a challenge for beginners. Starting with sample preparation using the A. thaliana model, this study details the protocols of a variety of staining methodologies that can be easily implemented for observation of cell and tissue organization in secondary cell walls of plants.

Gömme ve kesit Kök: Gömmek için ev yapımı plastik kalıp kullanımı agaroz hızlı ve kolay (Şekil 1) kanıtladı% 7 kaynaklanıyor. İki parça (A ve B; Şekil 1) gömülü flakon sistemin basit kolayca temiz sistemini tutmak, agaroz atıl olan şişe parçaları sopa değil gibi agaroz gömülü kök serbest bırakmak için yapmak. Vialler yıl için birden çok kez tekrar edilebilir. Gömülü kök depolamak kolaylık da sonraki adımları kolaylaştırır. , Bazen gömülü benzer kurtarmak için kaynaklanıyor kesit için tek bir kesit tabakta (3&#39;e kadar) toplanabilir. UV altında Aromatlar Gözlem: Kök bölümler cam slaytlar üzerine damıtılmış su içinde monte edilmiş ve UV ışığı altında gözlemlenmiştir. Hücrelerdeki lignin içeren aromatik bileşiklerin, UV ışığı altında otofloresansı ile görselleştirilebilir. Ksilem (Xy) ve interfasiküler lifler (Fi)lignin, bir aromatik polimer, ikincil hücre çeperi biyosentezi sırasında biriken, çünkü özü (Pi) ve korteks veya epidermis (Ep) (Şekil 2) UV ışıması altında değil otoflüoresanı gösterdi. Bitkiler vaküol (örneğin, antosiyanin) aromatiklerin önemli miktarda birikirse Bazı durumlarda, floresan kortikal hücrelerinin (veriler gösterilmemiştir) de gözlenebilir. Kök kesitleri 5X, 10X, 20X altında analiz edildi ve 40X büyütme (Şekil 2 Panel A, B, C, ve D - sırasıyla E,), daha çok kök hücre duvarı üzerinde bir aromatik dağıtım görselleştirmek için. Phloroglucinol ve Maule boyalar ile boyanmıştır Kök bölümlerde Lignin Gözlem: Damar ve lifler ve liflerden oluşan interfasiküler ksilem lignin lekeler (phloroglucinol ve Maule ile boyandı sapının sadece unsurları olduğunu), Vahşi tip kök bölümünde örnek kullanılmıştır. Phloroglucinol leke bir pembe ya da Fuchsia renk 4 (Şekil 3) vermek üzere lignin sinamaldehit uç-grupları ile reaksiyona girer. UV ışıması altında görüldüğü gibi, bir fuşya renklenmesi ksilem ve interfasiküler elyaf gözlenmiştir fakat özü ve korteks veya epidermis (Şekil 3) mevcut olmasıdır. Kök kesitler 5X, 10X, 20X altında analiz edildi ve 40X büyütme (Şekil 3 Paneller A, B, C, ve D - E, sırasıyla) daha sap genelinde floroglusinol leke dağılımını görselleştirmek ve büyük dokuları ayırt etmek; ksilem ve interfasiküler elyaflar; öz ve korteks; ve epidermis. Genellikle Rengin yoğunluğu, bir niteliksel şekilde Lignifikasyon seviyesi ile ilişkilidir - analiz edilen mutant ya da transgenik anormal sinamaldehit türetilmiş birim (örneğin cad mutant) içinde zenginleştirilmiş olan dışında &lt;&gt; 14 sup. Maule leke ksilem ve interfasiküler liflerde syringli linyin &#39;birimleri tespit özeldir. Kırmızı renklenmesi lignin elemanları syringli linyin &#39;birimlerinin varlığı (Şekil 4) 18 göstermektedir. Ksilem G birimlerde daha zengin iken liflerin S lignin yüksek bir seviyede içerdiğini göstermektedir ksilem dokulara kıyasla Ancak, daha parlak bir kırmızı rengi elyaflar gözlenmektedir. Floroglusinol boyama sonrası görülen gibi, kırmızı renklenmesi ksilem ve interfasiküler elyaf görülen ama lif özü ve korteks veya epidermis (Şekil 4) mevcut olmasıdır. Ayrıca, UV altında gözlenen lignin dağılımı (Şekil 2) ile ilişkilidir ve syringly birimler, bu kök örneğin her Odunlaşmış dokusunda mevcut olduğunu göstermektedir. Kök kesitleri 5X, 10X, 20X altında incelenmiştir ve 40X büyütme (Şekil 2 Panel A, B, C, ve edilmiştirD - E, sırasıyla) daha sap genelinde MAULE leke dağılımını görselleştirmek ve büyük dokuları ayırt etmek için: ksilem ve interfasiküler lifler, öz ve korteks ve epidermis. Bu miktar ve Odunlaşmış dokular arasında syringly ünitelerinden dağılımı sapının yaşma ve genç sap (veri gösterilmemiştir) mevcut olabilir dikkat etmek önemlidir. Kalkofluor Beyaz ve Kongo Kırmızı lekeler ile Vitray Kök Kesitleri Gözlem: Kalkofluor beyaz lekeler selüloz, kaloz ve diğer ikamesiz veya zayıf ikame β-glukan; oysa Kongo kırmızı lekeler doğrudan β-(1 → 4)-glukanlar ve özellikle de selüloz. Kalkofluor Beyazı ile boyanmış kök bölümleri UV ışığı altında gözlemlenmiştir 6-9. Congo kırmızısı ile boyanmış kesitler 560/40 bir bant geçiren bir filtre kullanılarak mavi ışık uyarma altında gözlendi. Hem beyaz Kalkofluor ve kongo epidermis, korteks, ve ilik lekeli kırmızı; inciBu dokuların bütün hücre duvarları büyük polisakarit polimer (Şekil 5 ve Şekil 6, sırasıyla) ve selüloz içeren nedeni olduğunu. Bunun aksine ksilem ve interfasiküler liflerin daha iyi beyaz, Kongo kırmızı lekeli polisakaritler Kalkofluor ve daha az lignin mevcudiyetinde (Şekil 5 ve Şekil 6) 10,11 etkilenir görünmektedir. Kesitleri 5X, 10X, 20X altında analiz edildi, ve (6 Paneller A, B, C, ve DE, sırasıyla Şekil 5 ve) daha iyi bir kök ve büyük üzerinde beyaz ve Kongo Kırmızı leke dağılımları Kalkofluor 40X büyütme görselleştirmek Kök dokuların (ksilem ve interfasiküler elyaf, özü ve korteks ve epidermis). Toluidin Blue O ile Vitray Kök Kesitleri Gözlem: Farklı kimyasal farklı hücre bileşenleri ve sonuçlar ile reaksiyona girer, çünkü Toluidin mavisi O polikromatik bir boya olarak sınıflandırılırçok renkli bir numunesi (Şekil 7). Üretilen renk ve hücre duvarları doğası hakkında bilgi sağlayabilir. Toluidin mavisi O 5 negatif yüklü gruplar bağlanan katyonik bir boyadır. Bu boyanın sulu bir çözeltisi, mavi, ama boya hücre 6,9 farklı anyonik grup ile bağlar farklı renk oluşturulur. Boya gibi pektik asit gibi karboksilatlı polisakkaritler ile reaksiyona girdiğinde, örneğin, bir pembemsi mor renk görünecektir; yeşil, yeşilimsi mavi, ya da lignin ve tanen gibi poli aromatik maddeler ile parlak mavi; ve morumsu veya nükleik asitler ile yeşilimsi mavi. Kök kesitlerinin Toluidin mavisi O ksilem ve interfasiküler elyaflar UV ve Ph-HCl boyama gözlemler, (Şekil 2 ile uyum içinde olan, yeşilimsi mavi veya mavi renklenme (Şekil 7, Panel C) gösterir bu yana lignified ve ortaya çıkarmıştır 3). Buna karşılık olarak, öz ve<html> onlar lignified olmasa da, onların hücre duvarlarında bazı pektin polimerler içerir, çünkü korteks ve epidermis dokular yeşilimsi mavi veya mavi renklenme gösterir. Kök kesitleri 5X, 10X, 20X altında analiz edildi ve 40X büyütme (Şekil 7 Panel A, B, C, ve D - E, sırası ile) daha iyi bir kök üzerinde Toluidin mavisi O leke dağıtım görselleştirmek için ve büyük dokuları ayırt etmek için . <img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51381/51381fig1highres.jpg" width="500" /> .. Sol tarafta kaynaklanıyor gömmek için Şekil 1 Homemade kalıp; 2 ml vidalı kapak mikrosantrifüj tüpü (Kısım A) ve 0.6 ml mikrosantrifüj tüpü (Bölüm B) alt üst. Sağ tarafta; iki parça tutan Parafilm; Nihai kalıp oluşturmak için A ve B. ntent &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Şekil 2," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51381/51381fig2highres.jpg" width="500" /> A. Şekil 2,. UV floresan thaliana kök kesitleri. vahşi tip A. enine kesitler Sadece interfasiküler elyaf ve ksilem hücrelerinde (- E A) duvarlarında lignin içeren aromatik bileşiklerin, varlığını gösteren UV ışığı floresan altında thaliana kök. Epidermis ve korteks (Ep), interfasiküler liflerden (Fi), özü (Pi) ve ksilem, (XY) konumları belirtilmiştir. Büyütme: Panel A: 5X; Panel B: 10X; Panel C: 20X; Paneller D ve E: 40X. Bar = 100 mikron. <img alt="Şekil 3," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51381/51381fig3highres.jpg" width="500" /><br/&gt; Şekil 3,. A. Phloroglucinol-HCl boyama thaliana kök kesitleri. Bir vahşi tip A. Phloroglucinol-HCl boyama (pembe ya da fuşya renkli) interfasiküler elyaf ve ksilem hücrelerinde (- E A) duvarlarında normal lignin birikmesini arası thaliana kök bölümü. Epidermis ve korteks (Ep), interfasiküler liflerden (Fi), özü (Pi) ve ksilem, (XY) konumları belirtilmiştir. Büyütme: Panel A: 5X; Panel B: 10X; Panel C: 20X; Paneller D ve E: 40X. Bar = 100 mikron. <img alt="Şekil 4," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51381/51381fig4highres.jpg" width="500" /> Şekil 4,. A. Maule boyama thaliana kök kesitler. vahşi tip A. Maule boyama (kırmızı renk) thaliana &lt;/ Em&gt; interfasiküler elyaflar ve ksilem hücrelerinde (A - E) duvarlarında normal lignin birikmesini gösterilen sap bölümü. Epidermis ve korteks (Ep), interfasiküler liflerden (Fi), özü (Pi) ve ksilem, (XY) konumları belirtilmiştir. Büyütme: Panel A: 5X; Panel B: 10X; Panel C: 20X; Paneller D ve E: 40X. Bar = 100 mikron. <img alt="Şekil 5," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51381/51381fig5highres.jpg" width="500" /> Şekil 5,. A. Kalkofluor beyaz boyama Bir vahşi tip A. thaliana kök kesitleri. Kalkofluor beyaz boyama epidermis, korteks, özü, interfasiküler lifler ve ksilem (- E A) hücrelerin hücre duvarlarında selüloz birikmesini gösteren thaliana kök bölümü. Positiepidermis ve korteks (AP) ons, interfasiküler lifler (Fi), öz (Pi) ve ksilem (Xy) gösterilir. Büyütme: Panel A: 5X; Panel B: 10X; Panel C: 20X; Paneller D ve E: 40X. Bar = 100 mikron. <img alt="Şekil 6," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51381/51381fig6highres.jpg" width="500" /> Şekil 6,. A. Kongo kırmızı boyama Bir vahşi tip A. thaliana kök kesitleri. Congo kırmızı boyama epidermis, korteks, özü, interfasiküler lifler ve ksilem (- E A) hücrelerin hücre duvarlarında selüloz birikmesini gösteren thaliana kök bölümü. Epidermis ve korteks (Ep), interfasiküler liflerden (Fi), özü (Pi) ve ksilem, (XY) konumları belirtilmiştir. Büyütme: Panel A: 5X; Panel B </strong&gt;: 10X; Panel C: 20X; Paneller D ve E: 40X. Bar = 100 mikron. <img alt="Şekil 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51381/51381fig7highres.jpg" width="500" /> A. Şekil 7. Toluidin mavisi O lekeleme Bir vahşi tip A. thaliana kök kesitleri. Toluidin mavisi O lekeleme interfasiküler elyaf ve ksilem hücrelerinde (- E A) duvarlarında normal lignin birikmesini arası thaliana kök bölümü. Epidermis ve korteks (Ep), interfasiküler liflerden (Fi), özü (Pi) ve ksilem, (XY) konumları belirtilmiştir. Büyütme: Panel A: 5X; Panel B: 10X; Panel C: 20X; Paneller D ve E: 40X. Bar = 100 mikron. <img alt="Tablo 1" fo:content-width = &quot;6in&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51381/51381table1.jpg&quot; width = &quot;600&quot; /&gt; Görüntüleme için Tablo 1. Mikroskop ve kamera ayarları. Floresan filtreleri ve aydınlık alan görüntüleme ile çalışmak için yönergeler. <a href="https://www-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/51381/51381table1.jpg" target="_blank">, bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements at JoVE.com

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Plant cell wall composition varies between tissue types and can include lignin, cellulose, hemicelluloses, and pectin. Various staining techniques have been developed to visualize differences at the cell-type level. This paper is a compilation of commonly used cell wall staining techniques.

Histokimyasal boyama<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Ortaöğretim Hücre Duvar Elemanları

Arabidopsis thaliana is a model organism commonly used to understand and manipulate various cellular processes in plants, and it has been used extensively ...

histochemical-staining-arabidopsis-thaliana-secondary-cell-wall

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

40.3K Görüntüleme.  Joint Bioenergy Institute. Plant cell wall composition varies between tissue types and can include lignin, cellulose, hemicelluloses, and pectin. Various staining techniques have been developed to visualize differences at the cell-type level. This paper is a compilation of commonly used cell wall staining techniques.

Video: Histochemical Staining of Arabidopsis thaliana Secondary Cell Wall Elements

Isolation of Protoplasts from Tissues of 14-day-old Seedlings of Arabidopsis thaliana

Protoplasts are plant cells that have had their cell walls enzymatically removed. Isolation of protoplasts from different plant tissues was first reported more than 40 years ago 1 and has since been adapted to study a variety of cellular processes, such as subcellular localization of proteins, isolation of intact organelles and targeted gene-inactivation by double stranded RNA interference (RNAi) 2-5. Most of the protoplast isolation protocols use leaf tissues of mature Arabidopsis (e.g. 35-day-old plants) 2-4. We modified existing protocols by employing 14-day-old Arabidopsis seedlings. In this procedure, one gram of 14-day-old seedlings yielded 5 106-107 protoplasts that remain intact at least 96 hours. The yield of protoplasts from seedlings is comparable with preparations from leaves of mature Arabidopsis, but instead of 35-36 days, isolation of protoplasts is completed in 15 days. This allows decreasing the time and growth chamber space that are required for isolating protoplasts when mature plants are used, and expedites the downstream studies that require intact protoplasts.

Isolation of Protoplasts from Tissues of 14-day-old Seedlings of Arabidopsis thaliana

This video shows a procedure for isolating intact protoplasts from tissues of 14-day-old seedlings of Arabidopsis. Given that the isolated protoplasts remain intact for at least 96h and are isolated from seedlings instead of one-month-old mature plants, this procedure expedites assays requiring intact protoplasts.

14 gün eski Fideler Dokular protoplast izolasyonu Arabidopsis thaliana</em

Protoplasts are plant cells that have had their cell walls enzymatically removed. Isolation of protoplasts  from different plant tissues was first ...

Biyoloji

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called photoreceptors to sense and adapt to light. The red/far-red light-absorbing phytochrome photoreceptors have been studied extensively. Phytochromes exist as a family of proteins with distinct and overlapping functions in all higher plant systems in which they have been studied1. Phytochrome-mediated light responses, which range from seed germination through flowering and senescence, are often localized to specific plant tissues or organs2. Despite the discovery and elucidation of individual and redundant phytochrome functions through mutational analyses, conclusive reports on distinct sites of photoperception and the molecular mechanisms of localized pools of phytochromes that mediate spatial-specific phytochrome responses are limited. We designed experiments based on the hypotheses that specific sites of phytochrome photoperception regulate tissue- and organ-specific aspects of photomorphogenesis, and that localized phytochrome pools engage distinct subsets of downstream target genes in cell-to-cell signaling. We developed a biochemical approach to selectively reduce functional phytochromes in an organ- or tissue-specific manner within transgenic plants. Our studies are based on a bipartite enhancer-trap approach that results in transactivation of the expression of a gene under control of the Upstream Activation Sequence (UAS) element by the transcriptional activator GAL43. The biliverdin reductase (BVR) gene under the control of the UAS is silently maintained in the absence of GAL4 transactivation in the UAS-BVR parent4. Genetic crosses between a UAS-BVR transgenic line and a GAL4-GFP enhancer trap line result in specific expression of the BVR gene in cells marked by GFP expression4. BVR accumulation in Arabidopsis plants results in phytochrome chromophore deficiency in planta5-7. Thus, transgenic plants that we have produced exhibit GAL4-dependent activation of the BVR gene, resulting in the biochemical inactivation of phytochrome, as well as GAL4-dependent GFP expression. Photobiological and molecular genetic analyses of BVR transgenic lines are yielding insight into tissue- and organ-specific phytochrome-mediated responses that have been associated with corresponding sites of photoperception4, 7, 8. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) of GFP-positive, enhancer-trap-induced BVR-expressing plant protoplasts coupled with cell-type-specific gene expression profiling through microarray analysis is being used to identify putative downstream target genes involved in mediating spatial-specific phytochrome responses. This research is expanding our understanding of sites of light perception, the mechanisms through which various tissues or organs cooperate in light-regulated plant growth and development, and advancing the molecular dissection of complex phytochrome-mediated cell-to-cell signaling cascades.

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

The molecular basis of spatial-specific phytochrome responses is being investigated using transgenic plants that exhibit tissue- and organ-specific phytochrome deficiencies. The isolation of specific cells exhibiting induced phytochrome chromophore depletion by Fluorescence-Activated Cell Sorting followed by microarray analyses is being utilized to identify genes involved in spatial-specific phytochrome responses.

Hücre tipi Özgül gösterilmeden FACS yardımlı kullanarak Doku ve Organ spesifik Fitokrom Yanıtları incelenmesi Arabidopsis thaliana</em

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called ...

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::&beta;-glucuronidase Reporter Gene Expression

The ability to introduce foreign genes into an organism is the foundation for modern biology and biotechnology. In the model flowering plant Arabidopsis thaliana, the floral-dip transformation method1-2 has replaced all previous methods because of its simplicity, efficiency, and low cost. Specifically, shoots of young flowering Arabidopsis plants are dipped in a solution of Agrobacterium tumefaciens carrying specific plasmid constructs. After dipping, the plants are returned to normal growth and yield seeds, a small percentage of which are transformed with the foreign gene and can be selected for on medium containing antibiotics. This floral-dip method significantly facilitated Arabidopsis research and contributed greatly to our understanding of plant gene function. In this study, we use the floral-dip method to transform a reporter gene, &beta;-glucuronidase (GUS), under the control of TSO2 promoter. TSO2, coding for the Ribonucleotide Reductase (RNR) small subunit3, is a cell cycle regulated gene essential for dNDP biosynthesis in the S-phase of the cell cycle. Examination of GUS expression in transgenic Arabidopsis seedlings shows that TSO2 is expressed in actively dividing tissues. The reported experimental method and materials can be easily adapted not only for research but also for education at high school and college levels.

Floral-dip Transformation of Arabidopsis thaliana to Examine pTSO2::&#946;-glucuronidase Reporter Gene Expression

This article illustrates the floral-dip method of Agrobacterium tumefaciens -mediated transformation of Arabidopsis thaliana. By introducing a cell-cycle regulated promoter-reporter, pTSO2::&beta;-glucuronidase (GUS), into Arabidopsis, we illustrates how one detects GUS reporter expression in transgenic seedlings.

Floral-daldırma Dönüşüm Arabidopsis thaliana Inceleyin PTSO2: β-glucuronidase Reporter Gen İfadesi

The ability to introduce foreign genes into an organism is the foundation for modern biology and biotechnology. In the model flowering plant Arabidopsis ...

Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling by Thin Layer Chromatography (TLC) Coupled with Gas-Liquid Chromatography (GLC)

Biological membranes separate cells from the environment. From a single cell to multicellular plants and animals, glycerolipids, such as phosphatidylcholine or phosphatidylethanolamine, form bilayer membranes which act as both boundaries and interfaces for chemical exchange between cells and their surroundings. Unlike animals, plant cells have a special organelle for photosynthesis, the chloroplast. The intricate membrane system of the chloroplast contains unique glycerolipids, namely glycolipids lacking phosphorus: monogalactosyldiacylglycerol (MGDG), digalactosyldiacylglycerol (DGDG), sulfoquinovosyldiacylglycerol (SQDG)4. The roles of these lipids are beyond simply structural. These glycolipids and other glycerolipids were found in the crystal structures of photosystem I and II indicating the involvement of glycerolipids in photosynthesis8,11. During phosphate starvation, DGDG is transferred to extraplastidic membranes to compensate the loss of phospholipids9,12.
Much of our knowledge of the biosynthesis and function of these lipids has been derived from a combination of genetic and biochemical studies with Arabidopsis thaliana14. During these studies, a simple procedure for the analysis of polar lipids has been essential for the screening and analysis of lipid mutants and will be outlined in detail. A leaf lipid extract is first separated by thin layer chromatography (TLC) and glycerolipids are stained reversibly with iodine vapor. The individual lipids are scraped from the TLC plate and converted to fatty acyl methylesters (FAMEs), which are analyzed by gas-liquid chromatography coupled with flame ionization detection (FID-GLC) (Figure 1). This method has been proven to be a reliable tool for mutant screening. For example, the tgd1,2,3,4 endoplasmic reticulum-to-plastid lipid trafficking mutants were discovered based on the accumulation of an abnormal galactoglycerolipid: trigalactosyldiacylglycerol (TGDG) and a decrease in the relative amount of 18:3 (carbons : double bonds) fatty acyl groups in membrane lipids 3,13,18,20. This method is also applicable for determining enzymatic activities of proteins using lipids as substrate6.

Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profiling by Thin Layer Chromatography TLC Coupled with Gas-Liquid Chromatography GLC

Composition of polar lipid extracts and the fatty acid composition of individual glycerolipids are determined in a simple and robust lipid profiling experiment. For this purpose, glycerolipids are isolated by thin layer chromatography and subjected to transmethylation of their acyl groups. Fatty acyl methylesters are quantified by gas-liquid chromatography.

İnce Tabaka Kromatografisi (TLC) tarafından Arabidopsis thaliana Polar Glycerolipid Profil Gaz-Sıvı Kromatografi (GLC) ile birleştiğinde

Biological membranes separate cells from the environment. From a single cell to multicellular plants and animals, glycerolipids, such as ...

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the Arabidopsis leaf is a complex organ made up of many different cell types and several structures. At the same time, the growing leaf contains cells at different stages of development, with the cells furthest from the petiole being the first to stop expanding and undergo senescence1. Different cells within the leaf are therefore dividing, elongating or differentiating; active, stressed or dead; and/or responding to stimuli in sub-sets of their cellular type at any one time. This makes genomic study of the leaf challenging: for example when analyzing expression data from whole leaves, signals from genetic networks operating in distinct cellular response zones or cell types will be confounded, resulting in an inaccurate profile being generated.
To address this, several methods have been described which enable studies of cell specific gene expression. These include laser-capture microdissection (LCM)2 or GFP expressing plants used for protoplast generation and subsequent fluorescence activated cell sorting (FACS)3,4, the recently described INTACT system for nuclear precipitation5 and immunoprecipitation of polysomes6.
FACS has been successfully used for a number of studies, including showing that the cell identity and distance from the root tip had a significant effect on the expression profiles of a large number of genes3,7. FACS of GFP lines have also been used to demonstrate cell-specific transcriptional regulation during root nitrogen responses and lateral root development8, salt stress9 auxin distribution in the root10 and to create a gene expression map of the Arabidopsis shoot apical meristem11. Although FACS has previously been used to sort Arabidopsis leaf derived protoplasts based on autofluorescence12,13, so far the use of FACS on Arabidopsis lines expressing GFP in the leaves has been very limited4. In the following protocol we describe a method for obtaining Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with FACS while minimizing the impact of the protoplast generation regime. We demonstrate the method using the KC464 Arabidopsis line, which express GFP in the adaxial epidermis14, the KC274 line, which express GFP in the vascular tissue14 and the TP382 Arabidopsis line, which express a double GFP construct linked to a nuclear localization signal in the guard cells (data not shown; Figure 2). We are currently using this method to study both cell-type specific expression during development and stress, as well as heterogeneous cell populations at various stages of senescence.

Cell Specific Analysis of Arabidopsis Leaves Using Fluorescence Activated Cell Sorting

A method for producing Arabidopsis leaf protoplasts that are compatible with fluorescence activated cell sorting (FACS), allowing for studies of specific cell populations. This method is compatible with any Arabidopsis line that expresses GFP in a subset of cells.

Hücre Özgül Analizi<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Floresans Aktif Hücre Ayırma kullanma Leaves

After initiation of the leaf primordium, biomass accumulation is controlled mainly by cell proliferation and expansion in the leaves1. However, the ...

Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers using Microarrays

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the raw materials for human societies (e.g. wood, paper, textile and biofuel industries)1,2. However, understanding the biosynthesis and function of these components remains challenging.
Cell wall glycans are chemically and conformationally diverse due to the complexity of their building blocks, the glycosyl residues. These form linkages at multiple positions and differ in ring structure, isomeric or anomeric configuration, and in addition, are substituted with an array of non-sugar residues. Glycan composition varies in different cell and/or tissue types or even sub-domains of a single cell wall3. Furthermore, their composition is also modified during development1, or in response to environmental cues4.
In excess of 2,000 genes have Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans been predicted to be involved in cell wall glycan biosynthesis and modification in Arabidopsis5. However, relatively few of the biosynthetic genes have been functionally characterized 4,5. Reverse genetics approaches are difficult because the genes are often differentially expressed, often at low levels, between cell types6. Also, mutant studies are often hindered by gene redundancy or compensatory mechanisms to ensure appropriate cell wall function is maintained7. Thus novel approaches are needed to rapidly characterise the diverse range of glycan structures and to facilitate functional genomics approaches to understanding cell wall biosynthesis and modification.
Monoclonal antibodies (mAbs)8,9 have emerged as an important tool for determining glycan structure and distribution in plants. These recognise distinct epitopes present within major classes of plant cell wall glycans, including pectins, xyloglucans, xylans, mannans, glucans and arabinogalactans. Recently their use has been extended to large-scale screening experiments to determine the relative abundance of glycans in a broad range of plant and tissue types simultaneously9,10,11.
Here we present a microarray-based glycan screening method called Comprehensive Microarray Polymer Profiling (CoMPP) (Figures 1 &amp; 2)10,11 that enables multiple samples (100 sec) to be screened using a miniaturised microarray platform with reduced reagent and sample volumes. The spot signals on the microarray can be formally quantified to give semi-quantitative data about glycan epitope occurrence. This approach is well suited to tracking glycan changes in complex biological systems12 and providing a global overview of cell wall composition particularly when prior knowledge of this is unavailable.

A technique called Comprehensive Microarray Polymer Profiling (CoMPP) for the characterisation of plant cell wall glycans is described. This method combines the specificity of monoclonal antibodies directed to defined glycan-epitopes with a miniature microarray analytical platform allowing screening of glycan occurrence in a broad range of biological contexts.

Mikroarray&#39;ler kullanarak Bitki Hücre Duvarı Polimerlerin glukanıdır Profilleme

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the ...

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a consequence, the isolation of plant embryos at early stages (1 cell to globular stage) is technically challenging due to their relative inaccessibility. Efficient manual dissection at early stages is strongly impaired by the small size of young Arabidopsis seeds and the adhesiveness of the embryo to the surrounding tissues. Here, we describe a method that allows the efficient isolation of young Arabidopsis embryos, yielding up to 40 embryos in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. Embryos are released into isolation buffer by slightly crushing 250-750 seeds with a plastic pestle in an Eppendorf tube. A glass microcapillary attached to either a standard laboratory pipette (via a rubber tube) or a hydraulically controlled microinjector is used to collect embryos from droplets placed on a multi-well slide on an inverted light microscope. The technical skills required are simple and easily transferable, and the basic setup does not require costly equipment. Collected embryos are suitable for a variety of downstream applications such as RT-PCR, RNA sequencing, DNA methylation analyses, fluorescence in situ hybridization (FISH), immunostaining, and reporter gene assays.

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

We report an efficient and simple method to isolate embryos at early stages of development from Arabidopsis thaliana seeds. Up to 40 embryos can be isolated in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. The procedure is suitable for transcriptome, DNA methylation, reporter gene expression, immunostaining and fluorescence in situ hybridization analyses.

Erken evre Embriyolar verimli ve hızlı İzolasyon<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Tohumlar

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling processes. Extracting sterol-enriched membrane microdomains from plant cells for proteomic analysis is a difficult task mainly due to multiple preparation steps and sources for contaminations from other cellular compartments. The plasma membrane constitutes only about 5-20% of all the membranes in a plant cell, and therefore isolation of highly purified plasma membrane fraction is challenging. A frequently used method involves aqueous two-phase partitioning in polyethylene glycol and dextran, which yields plasma membrane vesicles with a purity of 95% 1. Sterol-rich membrane microdomains within the plasma membrane are insoluble upon treatment with cold nonionic detergents at alkaline pH. This detergent-resistant membrane fraction can be separated from the bulk plasma membrane by ultracentrifugation in a sucrose gradient 2. Subsequently, proteins can be extracted from the low density band of the sucrose gradient by methanol/chloroform precipitation. Extracted protein will then be trypsin digested, desalted and finally analyzed by LC-MS/MS. Our extraction protocol for sterol-rich microdomains is optimized for the preparation of clean detergent-resistant membrane fractions from Arabidopsis thaliana cell cultures.
We use full metabolic labeling of Arabidopsis thaliana suspension cell cultures with K15NO3 as the only nitrogen source for quantitative comparative proteomic studies following biological treatment of interest 3. By mixing equal ratios of labeled and unlabeled cell cultures for joint protein extraction the influence of preparation steps on final quantitative result is kept at a minimum. Also loss of material during extraction will affect both control and treatment samples in the same way, and therefore the ratio of light and heave peptide will remain constant. In the proposed method either labeled or unlabeled cell culture undergoes a biological treatment, while the other serves as control 4.

Metabolic Labeling and Membrane Fractionation for Comparative Proteomic Analysis of Arabidopsis thaliana Suspension Cell Cultures

Here we describe a robust method for the fractionation of plant plasma membranes into detergent resistant and detergent soluble membranes based on a mixture of unlabeled and in vivo fully 15N labeled Arabidopsis thaliana cell cultures. The procedure is applied for comparative proteomic studies to understand signaling processes.

Mukayeseli Proteomik Analizi Metabolik Etiketleme ve Membran Fraksiyonasyon<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Süspansiyon Hücre Kültürleri

Plasma membrane microdomains are features based on the physical properties of the lipid and sterol environment and have particular roles in signaling ...

A Seed Coat Bedding Assay to Genetically Explore In Vitro How the Endosperm Controls Seed Germination in Arabidopsis thaliana

The Arabidopsis endosperm consists of a single cell layer surrounding the mature embryo and playing an essential role to prevent the germination of dormant seeds or that of nondormant seeds irradiated by a far red (FR) light pulse. In order to further gain insight into the molecular genetic mechanisms underlying the germination repressive activity exerted by the endosperm, a &#34;seed coat bedding&#34; assay (SCBA) was devised. The SCBA is a dissection procedure physically separating seed coats and embryos from seeds, which allows monitoring the growth of embryos on an underlying layer of seed coats. Remarkably, the SCBA reconstitutes the germination repressive activities of the seed coat in the context of seed dormancy and FR-dependent control of seed germination. Since the SCBA allows the combinatorial use of dormant, nondormant and genetically modified seed coat and embryonic materials, the genetic pathways controlling germination and specifically operating in the endosperm and embryo can be dissected. Here we detail the procedure to assemble a SCBA.

A Seed Coat Bedding Assay to Genetically Explore In Vitro How the Endosperm Controls Seed Germination in Arabidopsis thaliana

We present the procedure to assemble a seed coat bedding assay (SCBA) from Arabidopsis thaliana seeds. The SCBA was shown to be a powerful tool to explore genetically and in vitro how the endosperm controls seed germination in dormant seeds and in response to light cues. The SCBA is in principle applicable under any situation where the endosperm is suspected to influence embryonic growth.

Genetiği keşfedin A Tohum Kabuğunun Yatak Deneyi<em&gt; In Vitro</em&gt; Nasıl Endosperminde Denetimler Çimlenme içinde<em&gt; Arabidopsis thaliana</em

The Arabidopsis endosperm consists of a single cell layer surrounding the mature embryo and playing an essential role to prevent the germination of ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix containing polysaccharides that include cellulose microfibrils that form both crystalline structures and cellulose chains of amorphous organization. The orientation of the cellulose fibers and their concentrations dictate the mechanical properties of the cell. Several methods are used to determine the levels of crystalline cellulose, each bringing both advantages and limitations. Some can distinguish the proportion of crystalline regions within the total cellulose. However, they are limited to whole-organ analyses that are deficient in spatiotemporal information. Others relying on live imaging, are limited by the use of imprecise dyes. Here, we report a sensitive polarized light-based system for specific quantification of relative light retardance, representing crystalline cellulose accumulation in cross sections of Arabidopsis thaliana roots. In this method, the cellular resolution and anatomical data are maintained, enabling direct comparisons between the different tissues composing the growing root. This approach opens a new analytical dimension, shedding light on the link between cell wall composition, cellular behavior and whole-organ growth.

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Crystalline cellulose is an important constituent of the plant cell wall. However, its quantification at a cellular resolution is technically challenging. Here, we report the use of polarized light technology and root cross sections to obtain information of cell wall composition at a spatiotemporal resolution.

Kristalin Selüloz Birikimin Yüksek Çözünürlüklü Niceleme<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Kökler Doku spesifik Hücre Duvarı Değişiklikler Monitör

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...