Bu yöntemlerin geliştirilmesi sırasında birçok yararlı tartışmalar Kopito, Luo ve Pearce Labs'in üyeleri teşekkür ediyoruz. Biz de bu el yazması eleştirel okuma için Brian Temsamrit teşekkür ederim. Bu eser Üniversitesi Bilimler ve chilling Smith hayırsever güven fonlarından desteklenen bir durumdu.

Yazarlar ifşa gerek yok.

Nörodejeneratif hastalıklardan muzdarip hastaların sayıları artmaya devam ettikçe, böylece daha iyi tedaviler geliştirilen bu hastalıkların moleküler patogenezi anlayışı artırmak için acil bir ihtiyaç vardır. Burada, patojenik protein toplamları model organizma, Drosophila melanogasterfarklı hücre türleri arasında deli dana gibi iletimi izlemek için izin yöntemleri açıklanmaktadır. Biz son zamanlarda mutant Htt toplamları vivo içinde iletimini deli dana gibi göstermek ve nöronlar üzerinden bu toplamları glia27yayılmasını aracılık eder bir fagositik reseptör belirlemek için bu yöntemi kullandık. Genetik insan hastalık çalışmaya Drosophila kullanmanın birçok yararları yaklaşımımız patlatır: onun kısa hayat döngüsü ve tedavi amaçlı ilgili temel biyolojik bilgi keşfi hızlandırabilir büyük genetik araç seti.
Biz burada tarif yöntemleri varolan diğer hayvan iki büyük avantajlar sunuyor ve kültür modelleri deli dana gibi iletimi için hücre: (1 toplayarak etken (örneğin, mutant Htt) sağlam bir doku ve (2) ikamet eden bir hücrede üretilen ifade bir ayrı hücre nüfus aynı protein (örneğin, vahşi tipi Htt) normalde katlanmış sürümünün kolayca erişilebilir bir "muhabir" deli dana gibi etkinlikler için sağlar. Drosophila40köklü gelişmiş genetik araçlar kullanılarak mutant ve vahşi-türü Htt proteinler hücre popülasyonlarının üst üste aynı organizma içinde ifade elde ettik. Birçok farklı doku özgü Gal4 ve QF sürücü hazır olduğundan, aslında uçmak vücuttaki herhangi bir farklı hücre tipleri arasında deli dana gibi transferi incelenmesi mümkün olabilir.
Kritik bir bileşeni yaklaşımının mutant ve vahşi-türü Htt proteinler arasında farklı hücre popülasyonlarının aynı hayvan içinde ayrılmış ifade gerçekleştirmektedir. Herhangi bir ifade örtüşme böylece yaban tipi Htt toplama alıcı hücrelerdeki doğru sitoplazmik penetrasyon donör hücreleri9,12',27kaynaklanan deli dana gibi toplamları raporları bertaraf edilmesi gerekiyor, 41. Bu ek genetik araçları (örneğin, Gal80 ve QS repressors40) bu sorunu hafifletmek için tanıtarak yapılabilir. Bir kez ideal genotip tasarlanmış ve seçili, puncta miktarının için sistematik bir yöntem oluşturulmuş olmalıdır. Bu büyük ölçüde etiketlenir hücre sayısı, görüntülenen toplamları sayısı ve sinyal-gürültü oranı örnek üzerinde bağlıdır. Biz burada şekil 4' te açıklandığı gibi ortak Yerelleştirme ve/veya pozitif perde gibi ölçütleri verileri analiz etmek için kullanılabilir. Bazı mutant Htt toplama tohumları confocal mikroskop tespiti sınırın altına düşme olabilir beri Ancak, vahşi tipi Htt yelpazesi sınırlama bu özelliklerini temel alarak toplamları için deli dana benzeri transfer olayların küçümseme neden olabilir.
Burada açıklanan vivo içinde yaklaşım deli dana gibi davranış HD veya bile diğer polyQ bozuklukları ile ilişkili toplamları için özel değildir. Transgenik sinekler Alfa-synuclein PD, tau yılında, içinde deli dana gibi yayılan incelemek için geliştirilen ve SOD1 veya TDP-43 aynı deneysel paradigması kullanarak ALS içinde. Donör hücreleri ve ne zaman parçalanmayabilir tek toplamları alıcı hücrelerde ifade edilmelidir çözünür bir versiyonu aynı proteinin her bu proteinler için toplama eğilimli bir mutant ifade edilmelidir. Bu deneysel bir paradigma da patojen proteinler farklı hastalıklar ile ilişkili bir çapraz-tohum mekanizması47ile etkileşim ortaya çıkan fikir soruşturma için yararlı olabilir. Son olarak, sayısız genetik araçlarını Drosophila içinde araştırmak ve moleküler mechanism(s) bu ölümcül hastalıklar ile ilişkili patojenik protein toplamları sitoplazma sitoplazma yayılan temel belirlemek için uygulanır.

Deli dana hipotez devletlerin bulaşıcı transmissible spongiform Encephalopathy (örneğin, Creutzfeldt - Jakob hastalığı insanlarda, koyun, geyik ve elk kronik israf hastalığı ve "deli dana hastalığı" sığır büyük sorumlu ) sadece protein ve nükleik asitler1yoksun oluşmaktadır. Prion hastalıkları, hücresel prion protein (PrPC) son derece beta sayfa zengini ve dönüştürme ve monomeric PrPC molekülleri istikrarlı amiloid işe alma tarafından kendi kendine yayabilirsiniz bir yerel olmayan, istikrarlı kat (PrPSc) varsayar. toplar. PrPSc toplamları bu kendini çoğaltan mekanizması bir canlı farklı hücreler arasında ve hatta bireysel organizmaların2arasında yaymak için kullanın.
Protein misfolding ve toplama Ayrıca merkezi bir özelliğidir çoğu nörodejeneratif hastalıklar (Alzheimer hastalığı (Ah), Parkinson hastalığı (PD), Huntington hastalığı (HD) ve amyotrofik lateral skleroz (ALS))3. Bu hastalıklar derlemelerde içi veya ekstra cellular toplanan protein oluşumunu saat5, yakından ile sitotoksisite4 ve beyin ile son derece tekrarlanabilir ve hastalığa özgü yolları boyunca ilerledikçe ilişkilidir 6. patojen toplamları bu bozuklukları ile ilişkili deli dana gibi özelliklere sahip bu kalıpları yayılan öneririz. Şimdi güçlü desteği vardır deli dana gibi iletim reklam ile ilgili toplamları için PD, HD ve ALS - onlar yaymak hücre-hücre ve şablon monomeric formları daha önce etkilenmemiş hücreleri7, aynı proteinin konformasyon Değiştir 8.
Deli dana gibi protein toplamları bugüne yayılmasını araştıran çalışmalar çoğunluğu memeli hücre kültür modelleri, ekstrasellüler boşluk veya başka bir hücrenin toplamları saf hücre sitoplazma nerede Aktarım'ı kullanarak gerçekleştirilen sitoplazma9,10,11,12,13,14,15, veya toplama içeren malzeme fare beyin enjekte ve izleme Toplu Görünüm dışında Enjeksiyon Makinası16,17,18,19,20,21,22, 23. son zamanlarda Transjenik hayvanlar sağlam beynini24,25,26,27, içinde diğer hücrelere yayılan hücre içi toplamları göstermek için kullanılmıştır 28,29,30. Burada, doğrudan görselleştirme Drosophila melanogastersağlam beynini tek tek hücreleri arasında toplu aktarım için bir yöntem açıklanmaktadır. Drosophila modelleri HD/polyglutamine (polyQ) hastalıkların ilk geliştirilmiş olup, tüm yaklaşık iki yıl önce31,32 ve bu bozuklukların altında yatan patojenik mekanizmaların birçok çok değerli anlayışlar hazırladık 33. HD için protein huntingtin (Htt)34kodları gen bir otozomal dominant mutasyon neden bir devralınan nörodejeneratif bozukluğu olduğunu. Genişleme polyQ abartılı Htt'ın N-terminus bir patojen eşiğinde ötesinde yakınındaki bu mutasyon sonucunda ~ misfold ve toplam35,36protein neden 37 glutamines. Vahşi-türü Htt protein içeren < bu streç içinde 37 glutamines kendi yerel kat elde, ama için indüklenen bir Htt toplama "tohum"12,27,37ile doğrudan fiziksel temas üzerine toplamak. Biz bu homotipik, vahşi tipi Htt çekirdekli toplama deli dana benzeri transfer için bir okuma olarak ve diğer hücrelerde kaynaklanan mutant Htt toplamları sitoplazmik giriş yararlanmak.
Mekanizmaları göre hangi deli dana gibi toplamları belirleme seyahat hücreler arasında tedavi edilemez nörodejeneratif hastalıklar için yeni tedavi hedefleri tanımlaması yol açabilir. Biz almak avantajı hızlı yaşam döngüsünün, kullanım kolaylığı ve hücre-hücre mutant Htt toplamları yayılması için moleküler mekanizmaları tanımlamak için Drosophila melanogaster genetik tractability. Deneysel stratejimiz iki ikili ifade sistemleri Drosophila, köklü Gal4 özgü ters yönde harekete geçirmek sıra (Gal4-UAS) sistem38 ve son zamanlarda geliştirilen QF-QUAS sistemi39uygun kullanmaktadır. Bu iki bağımsız sistem kaplin mutant ve vahşi-type Htt transgenes ifadesi aynı sinek40içinde farklı hücre popülasyonlarının sınırlama sağlar. Bu yaklaşımı kullanarak, biz normalde diffüz, çözünür durumuna gelen sitoplazmik vahşi tipi Htt toplanan bir devlet, önceden biçimlendirilmiş bir mutant Htt ile fiziksel temas doğrudan bir sonucu yeniden dağıtılması izleyerek mutant Htt deli dana gibi yayılan incelemek toplama "tohum." Biyokimyasal kullanarak dönüşüm vahşi tipi Htt mutant Htt tarafından onaylanabilir veya floresan rezonans enerji gibi protein-protein etkileşimleri rapor biyofiziksel teknikleri (FRET)9,27,41 transfer .
Da önemlisi, aynı zamanda genetik genler ve/veya protein toplamları yayılmasını deli dana benzeri aracılık yolları tanımlamak için Drosophila araçlarında çok sayıda erişebilirsiniz. Biz son zamanlarda önemli bir rol için hücre yüzey çöpçü reseptör, mutant Htt toplamları Drosophila Merkezi yakındaki fagositik glia nöronal aksonlar aktarılması içinde Draper42,43, açıklayacak bu yaklaşım kullanılan sinir sistemi (MSS)27. Böylece, biz burada tarif genetik ve görüntüleme tabanlı yaklaşım için kullanımı kolay ama güçlü model organizma, Drosophilahastalık ilgili bir fenomen hakkında önemli temel biyolojik bilgi ortaya çıkarabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:849px;" width="849">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Phosphate buffered saline (PBS), 10X, pH 7.4</td>
			<td style="width:123px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">AM9625</td>
			<td style="width:167px;">Dilute to 1X</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:344px;">T9284-1L</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Kimwipes</td>
			<td style="width:123px;">Thomas Scientific</td>
			<td style="width:344px;">2904F24</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">20% paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td style="width:123px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:344px;">15713-S</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Normal Goat Serum (NGS), filtered</td>
			<td style="width:123px;">Lampire Biological Laboratories</td>
			<td style="width:344px;">7332500</td>
			<td style="width:167px;">Aliquot and freeze upon receipt</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Chicken anti-GFP</td>
			<td style="width:123px;">Aves Labs</td>
			<td style="width:344px;">GFP-1020</td>
			<td style="width:167px;">Use at 1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Rabbit anti-DsRed</td>
			<td style="width:123px;">Clontech</td>
			<td style="width:344px;">632496</td>
			<td style="width:167px;">Use at 1:2000 dilution; can recognize DsRed-based fluorescent proteins (e.g. mCherry, mStrawberry, tdTomato, etc.)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Mouse anti-Bruchpilot</td>
			<td style="width:123px;">Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:344px;">nc82</td>
			<td style="width:167px;">Use at 1:100 dilution; will label active pre-synaptic structures thoughout the fly brain</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">FITC anti-chicken</td>
			<td style="width:123px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">SA1-7200</td>
			<td style="width:167px;">Use at 1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Alexa Fluor 568 anti-rabbit</td>
			<td style="width:123px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:344px;">A11011</td>
			<td style="width:167px;">Use at 1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Alexa Fluor 647 anti-mouse antibody</td>
			<td style="width:123px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:344px;">A21235</td>
			<td style="width:167px;">Use at 1:250 dilution</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Slowfade Gold Antifade Reagent</td>
			<td style="width:123px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:344px;">S36936</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Microscope Slides (25 x 75 x 1.0 mm)</td>
			<td style="width:123px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:344px;">12-550-143</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Cover Glass (22 x 22 mm)</td>
			<td style="width:123px;">Globe Scientific</td>
			<td style="width:344px;">1404-15</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Dumont Biology Grade Forceps, Style 3</td>
			<td style="width:123px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:344px;">503</td>
			<td style="width:167px;">use in non-dominant hand</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Dumont Biology Grade Forceps, Style 5</td>
			<td style="width:123px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:344px;">505</td>
			<td style="width:167px;">use in dominant hand</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">LAS X image analysis software</td>
			<td style="width:123px;">Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Imaris image analysis software</td>
			<td style="width:123px;">Bitplane</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring cell-to-cell transmission of prion-like protein aggregates in drosophila melanogaster

Protein toplama Alzheimer hastalığı (Ah), Parkinson hastalığı (PD), Huntington hastalığı (HD) ve amyotrofik lateral skleroz (ALS) de dahil olmak üzere çoğu nörodejeneratif hastalıkların merkezi bir özellik olur. Protein toplamları nevropatoloji bu hastalıklarda ile yakından ilişkili olmakla birlikte hangi normal hücresel homeostazı anormal protein toplama bozan kesin mekanizması bilinmiyor. Veri ortaya çıkan güçlü bir destek hipotez için reklam, PD, HD o patojenik toplamları sağlayan, ve ALS Prionlar, sadece protein bulaşıcı ajanlar için bulaşıcı spongiform Encephalopathy sorumlu birçok benzerlikler. Prionlar şablonu tarafından yerel olarak katlanmış sürümleri toplama fenotip yayılmasını neden aynı Protein çevrimi kendini çoğaltır. Nasıl Prionlar ve deli dana gibi proteinler yılında, PD, HD ve ALS bir hücreden diğerine harekettir şu anda yoğun araştırma alanıdır. Burada, deli dana gibi hücre hücre iletim HD ile ilişkili mutant huntingtin (Htt) toplamları izleme izni Drosophila melanogaster modeli kullanılmıştır. Bu model birçok farklı Drosophila dokularda transgene ifade değiştirmek için güçlü araçlar yararlanır ve doğrudan rapor deli dana benzeri transfer mutant Htt toplamları fluorescently öğesini sitoplazmik protein kullanır. Önemlisi, biz burada tarif yaklaşım roman genler ve protein toplamları farklı hücre türleri içinde vivoarasında yayılan aracılık yollar tanımlamak için kullanılabilir. Bu çalışmalardan elde edilen bilgilerden nörodejeneratif hastalıkların altında yatan ve terapötik müdahale için yeni fırsatlar ortaya patojenik mekanizmaların sınırlı anlayış genişletir.

Yöntem tanımlamak burada sağlam veri bozulmamış anında CNS alanında bir hücre popülasyondan deli dana benzeri transfer Htt protein toplamları gösteren üretmek. Dönüştürülmesine ilişkin yaban tipi Htt diffüz punctate için bu YFP füzyon proteinin doğrudan Floresans tarafından alıcı glia donör ORNs (Resim 2A-C ve şekil 4A, B) HttQ91-mCherry ifade sonucu olarak görülmektedir. Bu iki hücre popülasyonlarının arasında deli dana benzeri transfer olayların doğru raporlama transgenik sinekler ve mutasyona uğramış ve vahşi-type Htt transgenes sırasında herhangi bir çakışma olmadan düzeyde güçlü ifade üretmek için Gal4/QF sürücüleri dikkatli seçimi gerektirir geliştirme veya erişkin dönemde. Buna ek olarak, floresan protein-Htt füzyon transgenes düşünceli tasarımını güçlü aşağı akım analizleri etkinleştirebilirsiniz. Örneğin, mutant ve vahşi-türü Htt toplamları olabilir punctate nesneleri olarak da el ile (Şekil 2C ve şekil 4A) sayısal veya görüntü analiz yazılımı (şekil 3A, B) kullanarak, ölçülebilir ve toplam nüfus (şekil 3C) olarak karakterize, mutant ve vahşi-türü proteinler (şekil 4A) arasında ortak yerelleştirme için değerlendirildi ve perde27 için (şekil 4 için analiz edilebilir B). Bu analizler FRET donör ve alıcısı çiftleri arasında (örneğin, CFP/YFP9 etkinleştirmek için mutant ve vahşi-type Htt floresan protein etiketlerle yeterince ayrılmış Floresans özelliklere sahip, ancak yeterli spektral örtüşme ile füzyonu gerektirir veya YFP/mCherry27)
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56906/56906fig2.jpg"> Resim 2 . Deli dana gibi dönüşüm gliyal HttQ25-YFP nöronal HttQ91-mCherry toplamları tarafından confocal görüntülerini. (A)maksimum yoğunluk projeksiyon ~ confocal dilim bir antennal LOB HttQ91-mCherry ifade bir erkek sinek (kırmızı) Or67d-QF ve HttQ25-YFP (yeşil) repo-Gal4 kullanarak glia kullanarak DA1 ORN aksonlar içinde gösterilen 30 µm. Antennal LOB ve nerede DA1 ORN aksonlar, bitirmek DA1 glomerulus yaklaşık sınırları sırasıyla katı ve noktalı çizgilerle gösterilir. (B) maksimum yoğunluk projeksiyon üzerinden ~ confocal dilimleri tek bir HttQ25-YFP puncta ve onun ilişkili HttQ91-mCherry sinyal (gösterilen A. (C) A tek 0,35 µm confocal dilim DA1 glomerular bölgesinden büyütülmüş bir görünümünü gösteren 20 µm Her kanaldaki bir ok ile gösterilen). Kırmızı kanal sinyal HttQ25-YFP ve HttQ91-mCherry sinyalleri arasında ortak yerelleştirme görselleştirmek için geliştirilmiş oldu. Tüm görüntüleri bir 40 X 1.4NA petrol hedefi kullanarak elde. Ölçek çubukları 10 µm. = <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56906/56906fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56906/56906fig3.jpg"> Şekil 3 . HttQ91-mCherry toplamları DA1 ORN aksonlar üç boyutlu analizi. (A) bir 3D DA1 glomerulus Or67d-QF istimal ayni Şekil 2' deBgösterilen veriler üzerinden ifade HttQ91 mCherry toplamları tasviri. (B) A screenshot gösterilen tek tek nesneler veya "bir görüntü analiz yazılım paketi kullanarak ham veriler(a)belirlenen noktalar". Yazılım bu kanal/resim farklı boyutlarda 56 nesneleri tespit. Ok ucu (B) ile gösterilen spot çapı için ölçüldü ~ 1.2 µm. oklar işaret nerede iki nesne yanlış birleştirilir bir nokta içine belgili tanımlık bilgisayar yazılımı, bireysel puncta yakınlığı nedeniyle büyük olasılıkla tarafından yerlere. Bu sorunu gidermek için yazılımı farklı eşik ayarları test edilmelidir ve/veya birleştirilmiş noktalar el ile mümkünse ayrılmalıdır. Ölçek çubukları = 10 µm. (C) Histogram çapları dağılımını gösteren ölçülen yazılım tarafından HttQ91-mCherry "(B) gösterilen noktalar" için. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56906/56906fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56906/56906fig4.jpg"> Şekil 4 . Co Yerelleştirme ve perde analizini indüklenen HttQ25-YFP toplamları. 4 bireysel 0,35 µm confocal z-dilim--dan HttQ91-mCherry DA1 glia repo-Gal4 kullanarak Or67d-QF ve HttQ25-YFP kullanarak ORNs içinde ifade bir erkek sinek beyin (A) A montaj. Sinyalleri bile küçük HttQ91-mCherry toplamları görülebilir ve diffüz sinyal çevreleyen indüklenen HttQ25-YFP toplamları öne ayarlandı. Gösterilen dilimleri her ayrılır ~ 1.0 µm (birleştirilen görüntülerin alt sağ köşede belirtilen dilim numarasını) böylece birden çok toplam görülebilmektedir. Oklar veya bu belirli z-dilimi odakta yakınında el ile z-yığın içinde hareket ettirerek olduğu tespit HttQ25-YFP puncta gösterir. Burada yedi HttQ25-YFP puncta altı detectably HttQ91-mCherry sinyal ilişkilendirilmiş olan (Yani, HttQ25-YFP toplamları % 86'sı ortak yerelleştirmek HttQ91-mCherry ile). HttQ25-YFP puncta ile ilişkili mCherry sinyal kez DA1 glomerulus mCherry pozitif puncta çoğunluğu daha zayıf olduğunu unutmayın. Ölçek çubuğu 5 µm. (B) A HttQ25-YFP/HttQ91-mCherry-co-lokalize dallarin önce (sol kapı aynası) = ve (doğru panelleri) mCherry (alıcısı) photobleaching sonra. YFP (donör) floresan elde edilen artış ImageJ46için AccPbFRET eklentisi kullanarak bir piksel piksel FRET verimliliği (FRETeff) görüntü üretmek için kullanıldı. Bu belirli toplama %61 genel bir FRETeff vardır. Ölçek çubuğu 1 µm. = <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56906/56906fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Cell-to-cell Transmission of Prion-like Protein Aggregates in Drosophila Melanogaster at JoVE.com

Monitoring Cell-to-cell Transmission of Prion-like Protein Aggregates in Drosophila Melanogaster

Kanıt biriken patojenik protein toplamları deli dana gibi özelliklere sahip hücreleri arasında yaymak nörodejeneratif hastalıklar ile ilgili fikir destekler. Burada, hücre hücre yayılma model organizma, Drosophila melanogasterdeli dana gibi toplamları görselleştirme sağlar bir yöntemi açıklanmaktadır.

Drosophila Melanogaster deli dana gibi Protein toplamları izleme hücre hücre iletim

Protein aggregation is a central feature of most neurodegenerative diseases, including Alzheimer&#39;s disease (AD), Parkinson&#39;s disease (PD), ...

monitoring-cell-to-cell-transmission-prion-like-protein-aggregates

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Monitoring Cell-to-cell Transmission of Prion-like Protein Aggregates in Drosophila Melanogaster

7.9K Görüntüleme.  University of the Sciences. Kanıt biriken patojenik protein toplamları deli dana gibi özelliklere sahip hücreleri arasında yaymak nörodejeneratif hastalıklar ile ilgili fikir destekler. Burada, hücre hücre yayılma model organizma, Drosophila melanogasterdeli dana gibi toplamları görselleştirme sağlar bir yöntemi açıklanmaktadır.

Video: Monitoring Cell-to-cell Transmission of Prion-like Protein Aggregates in Drosophila Melanogaster

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed in sensory hairs called sensilla, which cover the surface of olfactory organs. The surface of each sensillum is covered with tiny pores, through which odorants pass and dissolve in a fluid called sensillum lymph, which bathes the sensory dendrites of the OSNs housed in a given sensillum. The OSN dendrites express odorant receptor (OR) proteins, which in insects function as odor-gated ion channels4, 5. The interaction of odorants with ORs either increases or decreases the basal firing rate of the OSN. This neuronal activity in the form of action potentials embodies the first representation of the quality, intensity, and temporal characteristics of the odorant6, 7.
Given the easy access to these sensory hairs, it is possible to perform extracellular recordings from single OSNs by introducing a recording electrode into the sensillum lymph, while the reference electrode is placed in the lymph of the eye or body of the insect. In Drosophila, sensilla house between one and four OSNs, but each OSN typically displays a characteristic spike amplitude. Spike sorting techniques make it possible to assign spiking responses to individual OSNs. This single sensillum recording (SSR) technique monitors the difference in potential between the sensillum lymph and the reference electrode as electrical spikes that are generated by the receptor activity on OSNs1, 2, 8. Changes in the number of spikes in response to the odorant represent the cellular basis of odor coding in insects. Here, we describe the preparation method currently used in our lab to perform SSR on Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae, and show representative traces induced by the odorants in a sensillum-specific manner.

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

Electrophysiological responses of olfactory sensory neurons to odorants can be measured in insects using single sensillum recordings. In this video article we will demonstrate how to perform single sensillum recordings in the antennae of the vinegar fly (Drosophila melanogaster) and the maxillary palps of the malaria mosquito (Anopheles gambiae).

Böcekler Tek Sensillum Kayıtlar Drosophila melanogaster Ve Anofel gambiae</em

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed ...

Nörobilim

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

In this article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the lipophilic fluorescent membrane marker DiI. This method allows the visualization of neuronal cell morphology in great detail. It is possible to label any cell in the CNS: cell bodies of target neurons are visualized under DIC optics or by expression of a fluorescent genetic marker such as GFP. After labeling, the DiI can be transformed into a permanent brown stain by photoconversion to allow visualization of cell morphology with transmitted light and DIC optics. Alternatively, the DiI-labeled cells can be observed directly with confocal microscopy, enabling genetically introduced fluorescent reporter proteins to be colocalised. The technique can be used in any animal, irrespective of genotype, making it possible to analyze mutant phenotypes at single cell resolution.

Labeling of Single Cells in the Central Nervous System of Drosophila melanogaster

We present a technique for labeling single neurons in the central nervous system (CNS) of Drosophila embryos, which allows the analysis of neuronal morphology by either transmitted light or confocal microscopy.

Merkez Sinir Sistemi Tek Hücreler Etiketleme<em&gt; Drosophila melanogaster</em

In this  article we describe how to individually label neurons in the embryonic CNS of Drosophila melanogaster by juxtacellular injection of the ...

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

A growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive manipulation of the neural activity of specific neurons in Drosophila melanogaster1. Chief among these are optogenetic tools, which enable the activation or silencing of specific neurons in the intact and freely moving animal using bright light. Channelrhodopsin (ChR2) is a light-activated cation channel that, when activated by blue light, causes depolarization of neurons that express it. ChR2 has been effective for identifying neurons critical for specific behaviors, such as CO2 avoidance, proboscis extension and giant-fiber mediated startle response2-4. However, as the intense light sources used to stimulate ChR2 also stimulate photoreceptors, these optogenetic techniques have not previously been used in the visual system. Here, we combine an optogenetic approach with a mutation that impairs phototransduction to demonstrate that activation of a cluster of loom-sensitive neurons in the fly's optic lobe, Foma-1 neurons, can drive an escape behavior used to avoid collision. We used a null allele of a critical component of the phototransduction cascade, phospholipase C-&beta;, encoded by the norpA gene, to render the flies blind and also use the Gal4-UAS transcriptional activator system to drive expression of ChR2 in the Foma-1 neurons. Individual flies are placed on a small platform surrounded by blue LEDs. When the LEDs are illuminated, the flies quickly take-off into flight, in a manner similar to visually driven loom-escape behavior. We believe that this technique can be easily adapted to examine other behaviors in freely moving flies.

Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster

Genetically encoded optogenetic tools enable noninvasive manipulation of specific neurons in the Drosophila brain. Such tools can identify neurons whose activation is sufficient to elicit or suppress particular behaviors. Here we present a method for activating Channelrhodopsin2 that is expressed in targeted neurons in freely walking flies.

Yılında Escape Davranış Optogenetic Uyarım<em&gt; Drosophila melanogaster</em

A  growing number of genetically encoded tools are becoming available that allow non-invasive  manipulation of the neural activity of specific neurons in ...

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such behavior is spontaneous locomotor activity. Here we describe our protocol that utilizes Drosophila population monitors and a tracking system that allows continuous monitoring of the spontaneous locomotor activity of flies for several days at a time. This method is simple, reliable, and objective and can be used to examine the effects of aging, sex, changes in caloric content of food, addition of drugs, or genetic manipulations that mimic human diseases.

Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster are useful in studying genetic or environmental manipulations that affect behaviors such as spontaneous locomotor activity.&#160; Here we describe a protocol that utilizes monitors with infrared beams and data analysis software to quantify spontaneous locomotor activity.&#160;

Olarak spontan lokomotor aktivitenin belirlenmesi<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Drosophila melanogaster has been used as an excellent model organism to study environmental and genetic manipulations that affect behavior. One such ...

Straightforward Assay for Quantification of Social Avoidance in Drosophila melanogaster

Drosophila melanogaster is an emerging model to study different aspects of social interactions. For example, flies avoid areas previously occupied by stressed conspecifics due to an odorant released during stress known as the Drosophila stress odorant (dSO). Through the use of the T-maze apparatus, one can quantify the avoidance of the dSO by responder flies in a very affordable and robust assay. Conditions necessary to obtain a strong performance are presented here. A stressful experience is necessary for the flies to emit dSO, as well as enough emitter flies to cause a robust avoidance response to the presence of dSO. Genetic background, but not their group size, strongly altered the avoidance of the dSO by the responder flies. Canton-S and Elwood display a higher performance in avoiding the dSO than Oregon and Samarkand strains. This behavioral assay will allow identification of mechanisms underlying this social behavior, and the assessment of the influence of genes and environmental conditions on both emission and avoidance of the dSO. Such an assay can be included in batteries of simple diagnostic tests used to identify social deficiencies of mutants or environmental conditions of interest.

Straightforward Assay for Quantification of Social Avoidance in Drosophila melanogaster

Here, we present a protocol to quantify the avoidance of stressed individuals. This paradigm is powerful yet user-friendly and can be used to assess the influence of genes and environment on one kind of social interaction in Drosophila melanogaster.

Sosyal Kaçınma Niceleme için Basit Testi<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Drosophila melanogaster is an emerging model to study different aspects of social interactions. For example, flies avoid areas previously occupied by ...

Conditions Affecting Social Space in Drosophila melanogaster

The social space assay described here can be used to quantify social interactions of Drosophila melanogaster &#8212; or other small insects &#8212; in a straightforward manner. As we previously demonstrated 1, in a two-dimensional chamber, we first force the flies to form a tight group, subsequently allowing them to take their preferred distance from each other. After the flies have settled, we measure the distance to the closest neighbor (or social space), processing a static picture with free online software (ImageJ). The analysis of the distance to the closest neighbor allows researchers to determine the effects of genetic and environmental factors on social interaction, while controlling for potential confounding factors. Diverse factors such as climbing ability, time of day, sex, and number of flies, can modify social spacing of flies. We thus propose a series of experimental controls to mitigate these confounding effects. This assay can be used for at least two purposes. First, researchers can determine how their favorite environmental shift (such as isolation, temperature, stress or toxins) will impact social spacing 1,2. Second, researchers can dissect the genetic and neural underpinnings of this basic form of social behavior 1,3. Specifically, we used it as a diagnostic tool to study the role of orthologous genes thought to be involved in social behavior in other organisms, such as candidate genes for autism in humans 4.

Conditions Affecting Social Space in Drosophila melanogaster

The effect of genes and environment on social space of Drosophila melanogaster can be quantified through a powerful but straightforward analytical paradigm. We show here different factors that can affect this social space, and thus need to be taken into consideration when designing experiments in this paradigm.

Sosyal Space Etkileyen Koşullar<em&gt; Drosophila melanogaster</em

The social space assay described here can be used to quantify social interactions of Drosophila melanogaster &#8212; or other small insects &#8212; in a ...

A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster

Because of the structural and functional homology to the hair cells of the mammalian inner ear, the neurons that innervate the Drosophila external sense organs provide an excellent model system for the study of mechanosensation. This protocol describes a simple touch behavior in fruit flies which can be used to identify mutations that interfere with mechanosensation. The tactile stimulation of a macrochaete bristle on the thorax of flies elicits a grooming reflex from either the first or third leg. Mutations that interfere with mechanotransduction (such as NOMPC), or with other aspects of the reflex arc, can inhibit the grooming response. A traditional screen of adult behaviors would have missed mutants that have essential roles during development. Instead, this protocol combines the touch screen with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) to allow for only limited regions of homozygous mutant cells to be generated and marked by the expression of green fluorescent protein (GFP). By testing MARCM clones for abnormal behavioral responses, it is possible to screen a collection of lethal p-element mutations to search for new genes involved in mechanosensation that would have been missed by more traditional methods.

A Behavioral Assay for Mechanosensation of MARCM-based Clones in Drosophila melanogaster

In order to identify novel mutations affecting mechanosensation, we designed an assay that measures the behavioral response to tactile stimulation of fly bristles in mutant clones generated by the MARCM method. The combination of techniques allows for the identification of mechanosensitive mutations that would otherwise be lethal.

Arasında Mechanosensation için bir davranış tahlilinde klonlarda MARCM tabanlı<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Because of the structural and functional homology to the hair cells of the mammalian inner ear, the neurons that innervate the Drosophila external sense ...

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

The Drosophila melanogaster larval path-length phenotype is an established measure used to study the genetic and environmental contributions to behavioral variation. The larval path-length assay was developed to measure individual differences in foraging behavior that were later linked to the foraging gene. Larval path-length is an easily scored trait that facilitates the collection of large sample sizes, at minimal cost, for genetic screens. Here we provide a detailed description of the current protocol for the larval path-length assay first used by Sokolowski. The protocol details how to reproducibly handle test animals, perform the behavioral assay and analyze the data. An example of how the assay can be used to measure behavioral plasticity in response to environmental change, by manipulating feeding environment prior to performing the assay, is also provided. Finally, appropriate test design as well as environmental factors that can modify larval path-length such as food quality, developmental age and day effects are discussed.

Foraging Path-length Protocol for Drosophila melanogaster Larvae

We provide a detailed protocol for a Drosophila melanogaster foraging path-length assay. We discuss the preparation and handling of test animals, how to perform the assay and analyze the data.

için yiyecek arama yolu uzunluğu Protokolü<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larva

The Drosophila melanogaster larval path-length phenotype is an established measure used to study the genetic and environmental contributions to behavioral ...

The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster

For most animals, feeding is an essential behavior for securing survival, and it influences development, locomotion, health and reproduction. Ingestion of the right type and quantity of food therefore has a major influence on quality of life. Research on feeding behavior focuses on the underlying processes that ensure actual feeding and unravels the role of factors regulating internal energy homeostasis and the neuronal bases of decision-making. The model organism Drosophila melanogaster, with its great variety of genetically traceable tools for labeling and manipulating single neurons, allows mapping of neuronal networks and identification of molecular signaling cascades involved in the regulation of food intake. This report demonstrates the CApillary FEeder assay (CAFE) and shows how to measure food intake in a group of flies for time spans ranging from hours to days. This easy-to-use assay consists of glass capillaries filled with liquid food that flies can freely access and feed on. Food consumption in the assay is accurately determined using simple measurement tools. Herein we describe step-by-step the method from setup to successful execution of the CAFE assay, and provide practical examples to analyze the food intake of a group of flies under controlled conditions. The reader is guided through possible limitations of the assay, and advantages and disadvantages of the method compared to other feeding assays in D. melanogaster are evaluated.

The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster

The CApillary FEeder (CAFE) assay is a simple, budget-friendly, highly reliable method for investigating mechanisms underlying food intake. Used with the highly versatile genetic model organism Drosophila melanogaster, it provides a powerful means of gaining new insights into regulatory mechanisms of food intake.

Kılcal Besleyici Testi Gıda Alımını içinde Tedbirler<em&gt; Drosophila melanogaster</em

For most animals, feeding is an essential behavior for securing survival, and it influences development, locomotion, health and reproduction. Ingestion of ...

Measuring and Altering Mating Drive in Male Drosophila melanogaster

Despite decades of investigation, the neuronal and molecular bases of motivational states remain mysterious. We have recently developed a novel, reductionist, and scalable system for in-depth investigation of motivation using the mating drive of male Drosophila&#160;melanogaster (Drosophila), the methods for which we detail here. The behavioral paradigm centers on the finding that male mating drive decreases alongside fertility over the course of repeated copulations and recovers over ~3 d. In this system, the powerful neurogenetic tools available in the fly converge with the genetic accessibility and putative wiring diagram available for sexual behavior. This convergence allows rapid isolation and interrogation of small neuronal populations with specific motivational functions. Here we detail the design and execution of the satiety assay that is used to measure and alter courtship motivation in the male fly. Using this assay, we also demonstrate that low male mating drive can be overcome by stimulating dopaminergic neurons. The satiety assay is simple, affordable, and robust to influences of genetic background. We expect the satiety assay to generate many new insights into the neurobiology of motivational states.

Measuring and Altering Mating Drive in Male Drosophila melanogaster

This article describes a behavioral assay that uses male mating drive in Drosophila melanogaster to study motivation. Using this method, researchers can utilize advanced fly neurogenetic techniques to uncover the genetic, molecular, and cellular mechanisms that underlie this motivation.