Hayvan çalışmaları yönergeleri ve İleri Kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi Texas A & M Üniversitesi tarafından belirlenen düzenlemelere uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Gözden geçirme ve onay bir biohazard emniyet amiri veya komite toplantısında, kurum-ebilmek var olmak gerekli.
Dikkat: Tüm yordamlar BSL3 koruma gerektirir. Personel her zaman kişisel koruyucu ekipman giymek için gereklidir. Tüm manipülasyonlar Biyogüvenlik Kabini (BSC) içinde gerçekleştirilir ve tüm "Sharps", "Sharps" kaplarda imha. Çalışma yüzeyleri ve BSC tamponlu fenol ve % 70 etanol ile iş başlatma öncesi ve işten sonra temizlenir. Yordamlar normalde 3 Biyogüvenlik düzeyinde Mycobacterium tüberkülozbitmiş olurdu ama illüstrasyon ve filme amacıyla yazarlar Biyogüvenlik seviye 2 daha az öldürücü bakteri ile bu yordamlar göstermektedir.
1. suşları ve kültür koşulları
Not: M. tuberculosis zorlanma CDC1551 bu çalışmada kullanılır, ancak herhangi bir M. tuberculosis zorlanma aynı şekilde kullanılabilir.
<ol><li>M-OADC-TW içinde bakteri büyümesi (7H %9 0.5 gliserol, oleik asit cinsinden % 10 dekstroz katalaz karmaşık ve 0,05 ile desteklenmiş suyu % ara-80) 37 ° c 0,5 OD600 ile orta ayakta (~ 0.2 x 107 CFU).</li>
	<li>M-OADC-TW içinde kültür seyreltik (1:10 dizi dilutions bakteri). Bakteri dilutions plaka (105, 106, 107, 108) nüsha CFU belirlenmesi izin vermek için seçici 7H 11 plakaları üzerine içinde.</li>
	<li>Tabakları dört hafta 37 ° C'de veya koloniler doğru sayabiliriz kadar kuluçkaya.</li>
	<li>Bakteriyel inoculum 8,534 x g bir Pelet elde etmek 5 min için de santrifüj kapasitesi. Pelet kez 10 mL serum fizyolojik ile yıkayın (% 0.9 NaCl) ve Pelet 15 mL serum fizyolojik yeniden askıya alma (% 0.9 NaCl).</li>
</ol>2. aerosol enfeksiyon bir Madison odaya kullanarak fare
<ol><li>Fareler yeni çevre için bir hafta boyunca alışmana izin.</li>
	<li>Odanın içine yükleme önce fareler tartın.</li>
	<li>Üç ses tellerini güç uzatma kablosuna takın: Ana odaya güç, vakum pompası ve o sırada hava kompresörü.</li>
	<li>Cam Kavanoz dikkatlice sökün. Cam Kavanoz Biyogüvenlik kabine getirmek ve serum 15 mL askıya meydan inoculum ekleyin (% 0.9 NaCl) elde etmek için ~ 104 - 106 CFU bakteri akciğerlerde.</li>
	<li>Biyogüvenlik kabini cam kavanoza kapağını kapatın. Kavanoz Nebulizatör birimine bağlamak ve alt (alımı) son çeyrek inç kavanozun içinde sıvı seviyesinin altında Dikey paslanmaz çelik boru ayarlamak.</li>
	<li>Odanın içine (odası 90 fareler tutabilir) deney için gerekli bütün hayvanlar takın ve tüm kilitler kapısını kapatın.</li>
	<li>(Oda) ana kontrol hava AKIS METRESI. Float (top) ortasına yaklaşık 50 L/soldaki ölçekte ölçülen min çalıştığından emin olun.</li>
	<li>Odası kontrol panelindeki Başlat düğmesine basın. Kompresör hava AKIS METRESI (sol küçük metre) aracılığıyla hava debisi oranı 4 L/dak ölçek üzerinde ayarlayın. Görsel meydan inoculum nebulize olduğunu emin olun.</li>
	<li>15 dk sonra kırmızı ışık ön kontrol panelinin görünür ve sesli bir sinyal Çalıştır sonunu gösterir zaman Sayaçlarý sýfýrlamak için kontrol panelinin sağ alt köşesinde sıfırlama düğmesine basın.</li>
	<li>Vakum serbest bırakmak için odasının kapısında küçük kırmızı düğmeye basılı tutun.</li>
	<li>Odası kapıyı aç ve hayvanlar kaldırın. Fareler onların kafes yerleştirin.</li>
	<li>Nebulizatör cam kaldırmak ve bir kapalı, sızıntı geçirmez taşıma kapsayıcısına getirin. Biyo-güvenlik kabini kapsayıcı yerleştirin ve meydan okuma süspansiyon belirlenmiş bir atık konteyner içine atın.</li>
	<li>Bir biohazard çanta içinde kullanılan Nebulizatör kavanoz yerleştirin ve çantayı otoklav taşınmaya mühür.</li>
	<li>Enfeksiyon yordamın sonundaki odasının içi tampon fenol ve % 70 etanol ile sprey ve 10 dakikadır oturacak odası sağlar.</li>
	<li>Ardından, tüm erişilebilir iç yüzeyleri çok iyice silin. Tüm kirli kağıt havlu vb.atmayın. biohazard çöpe. Otoklav Çöp konteyner atık ve Nebulizatör kavanoz kullanılır.</li>
	<li>Hayvanlar koruma odasına görüntüleme saat noktaya kadar yerleştirin.</li>
	<li>Görüntüleme günü, ikincil bir kapsayıcı hayvanlarda görüntüleme odasına aktar.</li>
</ol>3. hayvan anestezi
<ol><li>Fareyi kullanarak özelleştirilmiş gaz anestezi sistemi isoflurane ile anestezi.</li>
	<li>Her bir anestezi ünitesi üzerinde bulunan iki kömür filtre teneke kutu tartın.</li>
	<li>Ağırlığı 50 g ilk ağırlık yukarıda ise yeni bir tüple değiştirin.</li>
	<li>Buharlaştırıcı birim yordamı için yeterli isoflurane emin olmak için denetleyin.</li>
	<li>Burun konisi tutucu görüntüleme odası yerleştirin. Burun koni yordamı için gerekli sayıda koyun ve burun konisi blokerleri ile kalan açıklıklar mühür.</li>
	<li>Yüksek basınç silindir oksijen kaynağından açmak ve 55 PSI ayarlayın.</li>
	<li>Anestezi biriminin önünde bulunan tahliye pompası açmak ve 8 L/dak için ayarlayın.</li>
	<li>Anestezi biriminin önünde bulunan oksijen iki durumlu açın.</li>
	<li>1, 5 L/dak dönüş gaz akışını gaz akışı yola anestezi indüksiyon odasına gaz akışını açın.</li>
	<li>Gaz akışı 0,25 L/dak dönüş gaz akışını yola görüntüleme odasına gaz akışını açın.</li>
	<li>İsoflurane Buharlaştırıcı açın ve 2-%2,5 olarak ayarlayın. Sayı ve ağırlık denemenin yanında dönme isoflurane Buharlaştırıcı (~ 20 g ağırlığında bir fare için % 2-2.5; %4 300 gr ağırlığında bir kobay için) aramada kullanılan hayvanların göre isoflurane düzeyini ayarlayın.</li>
	<li>Fareler anestezi odasında yerleştirin ve kapağını kapatın. Anestezi indüksiyon odasına gaz akışını açın.</li>
	<li>5-10 dk kadar tamamen anestezi anestezi indüksiyon odasında fareyi bırakın.</li>
	<li>Fareler anestezi sonra görüntüleme sırasında onları korumak için göz optik bir merhem uygulamak.</li>
	<li>Öyle ki burunlarını görüntüleme işlemi sırasında anestezi farelerin kolaylaştırmak için burun konisi yerleştirilir fareler ventral veya sternal recumbency yerleştirin.</li>
</ol>4. gazeteci enzim floresan (REF) görüntüleme
<ol><li>Belgili tanımlık substrate (20 µM, ağırlığının 2,5 µL/g) enfekte içine mayi enjeksiyon yanı sıra kontrol fareler tarafından enjekte. Fareler görüntüleme odası için az 1 dk içinde anestezi altında değildir.</li>
	<li>Görüntüleme sistemini başlatın.</li>
	<li>Sistem başlatma üzerinde tıklatarak başlatın. Sıcaklık çubuğu yeşile döner kadar bekleyin. Not: Görüntüleme sırasında hayvanın vücut ısısını korumak için ısıtmalı bir platform görüntüleme odası oluşmaktadır.</li>
	<li>Satın alma ayarı görüntüleme için floresan seçin | Bütün hayvan ya da akciğer dokusu, yapısı ve edinme Denetim Masası'ndaki yerleşimi için Epi-aydınlatma için Trans-aydınlatma.</li>
	<li>Görüş alanı tek fare ve lamba düzeyini Yüksek B olarak ayarlayın.</li>
	<li>Pozlama süresi için otomatik, orta binning, 2-3 f/durdur ve uyarma süzgeci 745 nm ve emisyon filtreleri, 780--dan ayarla nm 840 için nm.</li>
	<li>Sıra kurulumu için sıra yapısı'nı tıklatın, 9-12 Trans-aydınlatma noktaları akciğer alanında seçin.</li>
	<li>Al üzerinde resim alma için düğmesini tıklatın.</li>
	<li>Fare geri kafes sonrası görüntüleme içine yerleştirin.</li>
	<li>Tamamen iyileşti kadar fareler izlemek veya bir zaman-noktada deneme Imaging Eğer CFU miktarının için feda. Farelerin sonrası görüntüleme esenlik izlemek için değiştirilmiş bir Karnofsky skoru gerçekleştirin.</li>
</ol>5. REF görüntüleme analizi
<ol><li>Görüntüleme yazılımını açın.</li>
	<li>Görüntü dosyaları Gözat simgesini tıklatarak yükleyin.</li>
	<li>Spektral unmixing, spektral Unmixing üzerinde araç paleti tıklatın ve ayıramayacağız için gerekli spectra'ı tıklatın. Başlangıç unmixing'ı tıklatın.</li>
	<li>Optik yüzey imar için yüzey topografya üzerinde'yi tıklatın.</li>
	<li>Dorsal, kürk fare tabi yönlendirmeye seçin ve Generate yüzey'i tıklatın.</li>
	<li>Görüntüyü Kırp çizmek ve ilgi bir bölge için eşik resmi. Bitti'yi tıklatın.</li>
	<li>Organ kayıt için 3D optik araçlar açılan menüsü kayıt sekmesine gidin.</li>
	<li>Organları bir organ atlas ilgi kayıt.</li>
	<li>Organ boyutu veya açık/kapalı paneli-kayıt araçlar üzerinde bulunan dönüştürme aracı kullanarak oluşturulan yüzey topografyası konuma ayarlayın.</li>
	<li>Floresan tomografi (ZAMMINI) 3D imar gidin ve seçin sekmesini analiz için dahil edilmesi, resim türü normalleştirilmiş iletim floresan (NTF) verimlilik için Başlat'ı tıklatın için görüntüleri analiz.</li>
	<li>Tümünü Seç denetleyin ve veri Önizleme sekmesinde yeniden.</li>
	<li>Floresans miktar için faiz bölge (ROI) araçlar için yatırım Getirisi küp faiz organ için ekleme ve küp boyutu faiz organı kapsayacak şekilde ayarlamak gidin. Tıkırtı üstünde 3D ROIs ölçmek.</li>
	<li>Yatırım Getirisi ölçümleri penceresinde, 3D ROI ölçümleri için et, kaynak pmolM-1cm-1voxels ve ölçüm birimine için veri türü seçin.</li>
	<li>Kaydetmek ve/veya ZAMMINI 3D imar analizi sonucu bir şekil veya veri dosyasına verir.</li>
</ol>6. miktar CFU bakteri
<ol><li>Fareler 0.1 mL Fentobarbital sodyum (390 mg/mL) mayi enjeksiyonu ile ötenazi.</li>
	<li>İçin pedal refleks ayak refleks tepki yok olduğundan emin olmak için fare yastıkları sıkarak kontrol edin.</li>
	<li>Steril forseps ve makas kullanarak fare akciğer dokusundan explant. 1 mL 1 x fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) akciğer dokusunda lunaparkçı.</li>
	<li>Akciğer homogenate 10 kat seri dilutions steril 1 x PBS içinde olun.</li>
	<li>Kaplama, 20 µL her ilgili seyreltme üç aliquots agar plaka üzerinde spot.</li>
	<li>Plakayı Bakteriyel büyüme için bir kuluçka-37 ° C ve monitör kuluçkaya.</li>
	<li>Koloniler halinde her noktaya kuluçka süre sonra ve CFU hızlı sayısı / mL cilt ve seyreltme için düzeltme tarafından aşağıdaki denklemi kullanarak: CFU / mL (C/V) = M x Nerede C koloni sayıları başına nokta, V = hacim = her plaka (mL) ve M aşı Örnek çarpım faktörü (devrik değerlerin kullanılan seyreltme) =. Not: 0.002 mL Numune dilüsyonu, 10-4, örnek hacmi için bir noktada 11 koloniler sayılır Eğer denklemi kullanarak koloni sayısı olarak hesaplanır. (11/0,02) x 104 = 5.5 x 106 CFU / mL</li>
</ol>

<ol>
	<li>Lewinson, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Official+American+thoracic+society/infectious+diseases+society+of+America/+centers+for+disease+control+and+prevention+clinical+practice+guidelines:+diagnosis+of+tuberculosis+in+adults+and+children.">Official American thoracic society/infectious diseases society of America/ centers for disease control and prevention clinical practice guidelines: diagnosis of tuberculosis in adults and children.</a> Clin Infect Dis. 64 (2), 1-33 (2017).</li><li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensititre+MYCOTB+MIC+plate+for+testing+Mycobacterium+tuberculosis+susceptibility+to+first-+and+second-line+drugs.">Sensititre MYCOTB MIC plate for testing Mycobacterium tuberculosis susceptibility to first- and second-line drugs.</a> Antimicrob Agents Ch. 58 (1), 11-18 (2014).</li><li>Dheda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidemiology,+pathogenesis,+transmission,+diagnosis,+and+management+of+multidrug-resistant,+extensively+drug-resistant,+and+incurable+tuberculosis.">The epidemiology, pathogenesis, transmission, diagnosis, and management of multidrug-resistant, extensively drug-resistant, and incurable tuberculosis.</a> Lancet Resp Med. 5 (4), 291-360 (2017).</li><li>Behr, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+of+Mycobacterium+tuberculosis+from+patients+smear-negative+for+acid-fast+bacilli.">Transmission of Mycobacterium tuberculosis from patients smear-negative for acid-fast bacilli.</a> Lancet. 353 (9151), 444-449 (1999).</li><li>Cruz, A. T., Revell, P. A., Starke, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gastric+aspirate+yield+for+children+with+suspected+pulmonary+tuberculosis.">Gastric aspirate yield for children with suspected pulmonary tuberculosis.</a> J Pediatric Infect Dis Soc. 2 (2), 171-174 (2013).</li><li>Monkongdee, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yield+of+acid-fast+smear+and+mycobacterial+culture+for+tuberculosis+diagnosis+in+people+with+human+immunodeficiency+virus.">Yield of acid-fast smear and mycobacterial culture for tuberculosis diagnosis in people with human immunodeficiency virus.</a> Am J Resp Crit Care. 180, 903-908 (2009).</li><li>Karstaedt, A. S., Jones, N., Crewe-Brown, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bacteriology+of+pulmonary+tuberculosis+in+a+population+with+high+human+immunodeficiency+virus+seroprevalence.">The bacteriology of pulmonary tuberculosis in a population with high human immunodeficiency virus seroprevalence.</a> Int J Tuberc Lung D. 2 (4), 312-316 (1998).</li><li>Yang, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+Mycobacterium+tuberculosis,+using+a+novel+near-infrared+fluorescent+substrate.">Real-time imaging of Mycobacterium tuberculosis, using a novel near-infrared fluorescent substrate.</a> J Infect Dis. 215 (3), 405-414 (2017).</li><li>Nooshabadi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+excitation+increases+detection+sensivity+for+pulmonary+tuberculosis+by+whole-body+imaging+with+&#946;-lactamase+reporter+enzyme+fluorescence.">Intravital excitation increases detection sensivity for pulmonary tuberculosis by whole-body imaging with &#946;-lactamase reporter enzyme fluorescence.</a> J Biophotonics. , (2016).</li><li>Chang, M. H., Cirillo, S. L. G., Cirillo, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+luciferase+to+image+bacterial+infections+in+mice.">Using luciferase to image bacterial infections in mice.</a> J Vis Exp. (48), (2011).</li><li>Kong, Y., Subbian, S., Cirillo, S. L. G., Cirillo, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+optical+imaging+to+study+of+extrapulmonary+spread+by+tuberculosis.">Application of optical imaging to study of extrapulmonary spread by tuberculosis.</a> Tuberculosis. 89 (1), 15-17 (2009).</li><li>Andreu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+in+vivo+assessment+of+drug+efficacy+against+Mycobacterium+tuberculosis+using+an+improved+firefly+luciferase.">Rapid in vivo assessment of drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis using an improved firefly luciferase.</a> J Antimicrob Chemoth. 68 (9), 2118-2127 (2013).</li><li>Andreu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimisation+of+bioluminescent+reporters+for+use+with+Mycobacteria.">Optimisation of bioluminescent reporters for use with Mycobacteria.</a> PLoS ONE. 5 (5), 10777 (2010).</li><li>Nooshabadi, F., Yang, H. Y., Bixler, J. N., Kong, Y., Cirillo, J. D., Maitland, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+fluorescence+excitation+in+whole-animal+optical+imaging.">Intravital fluorescence excitation in whole-animal optical imaging.</a> PLoS ONE. 11 (2), 0149932 (2016).</li><li>Bixler, J. N., Kong, Y., Cirillo, J. D., Matiland, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-scale+fluorescence+imaging+of+bacterial+infections+in+animal+models.">Multi-scale fluorescence imaging of bacterial infections in animal models.</a> Proc. SPIE 8565, Photonic Therapeut Diagnos IX. , 856537 (2013).</li><li>Mufti, N., Kong, Y., Cirillo, J. D., Maitland, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+bacterial+infection+with+a+fiber+optic+microendoscope.">Detection of bacterial infection with a fiber optic microendoscope.</a> Proc. SPIE 8092, Med Laser Appl Laser-tissue Interac V. , 80920A (2011).</li><li>Zelmer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+in+vivo+model+to+test+anti-tuberculosis+drugs+using+fluorescence+imaging.">A new in vivo model to test anti-tuberculosis drugs using fluorescence imaging.</a> J Antimicrob Chemoth. 67 (8), 1948-1960 (2012).</li><li>Yang, D., Ding, F., Mitachi, K., Kurosu, M., Lee, R. E., Kong, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescent+probe+for+detecting+Mycobacterium+tuberculosis+and+identifying+genes+critical+for+cell+entry.">A fluorescent probe for detecting Mycobacterium tuberculosis and identifying genes critical for cell entry.</a> Front. Microbiol. 7, (2016).</li><li>Ordonez, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Model+of+pulmonary+cavitary+tuberculosis+and+expression+of+matrix+metalloproteinase-9.">Mouse Model of pulmonary cavitary tuberculosis and expression of matrix metalloproteinase-9.</a> Dis Model Mech. 9, 778-779 (2016).</li><li>Mills, B., Bradley, M., Dhaliwal, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+bacterial+infections.">Optical imaging of bacterial infections.</a> Clin Transl Imaging. 4, 163-174 (2016).</li><li>Calderon, V., Valbuena, G., Goez, Y., Endlsey, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+humanized+mouse+model+of+tuberculosis.">A humanized mouse model of tuberculosis.</a> PLoS ONE. 8 (5), 63331 (2013).</li><li>Vergne, I., Chua, J., Lee, H. H., Lucas, M., Belisle, J., Deretic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+phagolysosome+biogenesis+block+by+viable+Mycobacterium+tuberculosis.">Mechanism of phagolysosome biogenesis block by viable Mycobacterium tuberculosis.</a> P Natl Acad Sci Usa. 102 (11), 4033-4038 (2004).</li><li>Kong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+tuberculosis+with+endogenous+&#946;-+lactamase+reporter+enzyme+fluorescent+in+live+mice.">Imaging tuberculosis with endogenous &#946;- lactamase reporter enzyme fluorescent in live mice.</a> P Natl Acad Sci Usa. 107 (27), 12239-12244 (2010).</li><li>Kong, Y., Cirillo, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reporter+enzyme+fluorescence+(REF)+imaging+and+quantification+of+tuberculosis+in+live+animals.">Reporter enzyme fluorescence (REF) imaging and quantification of tuberculosis in live animals.</a> Virulence. 1 (6), 558-622 (2010).</li><li>Skoura, E., ZumLa, A., Bomanji, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+in+tuberculosis.">Imaging in tuberculosis.</a> Int J Infect Dis. 32, 87-93 (2015).</li><li>Lee, K. S., Im, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CT+in+adults+with+tuberculosis+of+the+chest:+characteristic+findings+and+role+in+management.">CT in adults with tuberculosis of the chest: characteristic findings and role in management.</a> Am J Roentgenol. 164, 1361-1367 (1995).</li><li>Hoffman, E. B., Crosier, J. H., Cremin, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+in+children+with+spinal+tuberculosis.+A+comparison+of+radiography,+computed+tomography+and+magnetic+resonance+imaging.">Imaging in children with spinal tuberculosis. A comparison of radiography, computed tomography and magnetic resonance imaging.</a> J Bone Joint Surg Br. 75 (2), 233-239 (1993).</li><li>Soussan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patterns+of+pulmonary+tuberculosis+on+FDG-PET/CT.">Patterns of pulmonary tuberculosis on FDG-PET/CT.</a> Eur J Radiol. 81 (10), 2872-2876 (2012).</li><li>Sule, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+directions+using+reporter+enzyme+fluorescence+(REF)+as+a+tuberculosis+diagnostic+platform.">New directions using reporter enzyme fluorescence (REF) as a tuberculosis diagnostic platform.</a> Tuberculosis. 101, 78-82 (2016).</li><li>Heuts, F., Carow, B., Wigzell, H., Rottenberg, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+non-invasive+bioluminescent+imaging+to+assess+mycobacterial+dissemination+in+mice,+treatment+with+bactericidal+drugs+and+protective+immunity.">Use of non-invasive bioluminescent imaging to assess mycobacterial dissemination in mice, treatment with bactericidal drugs and protective immunity.</a> Microbes Infect. 11 (14-15), 1114-1121 (2009).</li><li>Kong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+fluorescent+protein+expressing+strains+to+evaluation+of+anti-tuberculosis+therapeutic+efficacy+in+vitro+and+in+vivo.">Application of fluorescent protein expressing strains to evaluation of anti-tuberculosis therapeutic efficacy in vitro and in vivo.</a> PLoS ONE. 11 (3), 0149972 (2016).</li><li>Xie, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+point-of-care+detection+of+the+tuberculosis+pathogen+using+a+BlaC-specific+fluorogenic+probe.">Rapid point-of-care detection of the tuberculosis pathogen using a BlaC-specific fluorogenic probe.</a> Nature Chem. 4, 802-809 (2012).</li><li>Nooshabadi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-animal+imaging+of+bacterial+infection+using+endoscopic+excitation+of+&#946;-lactamase+(BlaC)-+specific+fluorogenic+probe.">Whole-animal imaging of bacterial infection using endoscopic excitation of &#946;-lactamase (BlaC)- specific fluorogenic probe.</a> Proc SPIE. 9715, 97150 (2016).</li><li>Ghiasi, M., Pande, T., Pai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+tuberculosis+diagnostics.">Advances in tuberculosis diagnostics.</a> Curr Trop Med Rep. 2 (2), 54-61 (2015).</li><li>Rao, J., Andrasi, A. D., Yao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+imaging+in+vivo:+recent+advances.">Fluorescence imaging in vivo: recent advances.</a> Curr Opin Biotech. 18 (1), 17-25 (2007).</li><li>Marshall, M. V., Draney, D., Sevick-Muraca, E. M., Olive, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-dose+intravenous+toxicity+study+of+IRDye+800CW+in+Sprague-Dawley+rats.">Single-dose intravenous toxicity study of IRDye 800CW in Sprague-Dawley rats.</a> Mol Imaging Biol. 12 (6), 583-594 (2010).</li><li>Zhan, L., Tang, J., Sun, M., Qin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+for+tuberculosis+in+translational+and+precision+medicine.">Animal models for tuberculosis in translational and precision medicine.</a> Front Microbiol. 8, 717 (2017).</li><li>Rao, J., Xie, H., Cheng, Y., Cirillo, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2,7-disubstituted+cephalosporin+derivatives+as+beta-lactamase+substrates+and+methods+for+their+use+for+the+diagnosis+of+tuberculosis.">2,7-disubstituted cephalosporin derivatives as beta-lactamase substrates and methods for their use for the diagnosis of tuberculosis.</a> US patent. , (2015).</li><li>Shao, Q., Zheng, Y., Dong, X., Tang, K., Yan, X., Xing, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Covalent+Reporter+of+&#946;-Lactamase+Activity+for+Fluorescent+Imaging+and+Rapid+Screening+of+Antibiotic-Resistant+Bacteria.">A Covalent Reporter of &#946;-Lactamase Activity for Fluorescent Imaging and Rapid Screening of Antibiotic-Resistant Bacteria.</a> Chem Eur J. 19 (33), 10903-10910 (2013).</li><li>Li, L., Li, Z., Shi, W., Li, X., Ma, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sensitive+and+Selective+Near-Infrared+Fluorescent+Off-On+Probe+and+Its+Application+to+Imaging+Different+Levels+of+&#946;-Lactamase+in+Staphylococcus+aureus.">Sensitive and Selective Near-Infrared Fluorescent Off-On Probe and Its Application to Imaging Different Levels of &#946;-Lactamase in Staphylococcus aureus.</a> Anal Chem. 86 (12), 6115-6120 (2014).</li><li>Ashizawa, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coexistence+of+lung+cancer+and+tuberculoma+in+the+same+lesion:+demonstration+by+high+resolution+and+contrast-enhanced+dynamic+CT.">Coexistence of lung cancer and tuberculoma in the same lesion: demonstration by high resolution and contrast-enhanced dynamic CT.</a> BRIT J RADIOL. 77 (923), 959-962 (2004).</li><li>Figueroa, C. J., Riedel, E., Glickman, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+and+radiographic+differentiation+of+lung+nodules+caused+by+mycobacteria+and+lung+cancer:+a+case-control+study.">Clinical and radiographic differentiation of lung nodules caused by mycobacteria and lung cancer: a case-control study.</a> BMC Infect Dis. 15 (482), (2015).</li></ol>

Hakem gibi görüntüleme teknikleri kullanırken üretimi, sağlam ve tutarlı veriler izin anahtar stratejiler vardır. Optik görüntüleme her yöne yayılan ışık yakalamak zor olduğundan hangi penetrasyon, derinliği etkileyebilir dokularda dağınık ışık üretir. Kullanım bir yakın kızıl ötesi fluorophore (Nur) substrat 700-900 nm Querange içinde bir uyarma ve emisyon dalga boyuna sahip Imaging REF için floresan sinyal minimal absorpsiyonu memeli dokular ile kolaylaştırır. Özel tasarlanmış substrat bir nur fluorophore, IRDye 800Cw bir içki için bağlama tarafından inşa edilmiş IRDye QC-1, Floresans rezonans enerji transferi tabanlı Şoklama izin laktam halkası. IRDye mükemmel doku penetrasyonu ve özellikleri saçılma ışık ve memeliler36üzerinde belirgin herhangi bir zararlı etkisi yok, kan ve organları oluşmuş 24 h floresan işaretli sinyal önemli ölçüde artar 4 h sonra başlayan substrat yönetim, maksimal ulaşan 6 h sonra Yönetim düzeyleri.
Bakteriyel enfeksiyon doz, bulaşıcı doz ve substrat İdaresi hem de zaman-mesaj enfeksiyon pilot çalışmalar gerçekleştirerek Imaging Puan şekli üzerinde büyük, karmaşık, deney başlamadan önce standart. Pilot çalışmalar büyük ölçüde zaman ve maliyet Standart bir prosedür anahtar deney yaparken önce optimize edilebilir çünkü çok sayıda hayvan Imaging küçültebilirsiniz. Bakteriyel yükler ve organ/dokularda tüm vücut görüntülemesi trans-aydınlatma ve ex vivo akciğer görüntüleme sinyalin kaynağını doğrulamak ve korelasyon kalitesini belirlemek için epi-aydınlatma kullanarak kullanarak aşağıdaki ilgi tespit edilmelidir Bakteriyel numaraları ile mevcut8. Pilot çalışmalar algılama eşiğinin, dinamik alan tekniği yanı sıra görüntüleme için en iyi deneysel koşullar belirlenmesi görmemizi sağlar.
Birincil olarak Imaging REF kullanmanın avantajları diğer floresan ve kollarındaki stratejileri için karşılaştırılır, yüksek hassasiyet ve doğal M. tuberculosis resim yeteneği suşları. Imaging REF catalytically sağlam enzim tüm M. tuberculosis klinik yalıtır ve Tüberküloz Kompleks suşları korunmuş BlaC kullanır. Imaging REF büyük duyarlılık hızlı katalitik oranı BlaC birlikte ile saklama cleaved floresan ürünün ana hücre kaynaklanmaktadır. Belgili tanımlık substrate enfekte hücreleri ve doku içinde sinyal neredeyse sınırsız birikmesi debisi olduğu sürece sürekli artar sinyal. Imaging REF artan bu duyarlılığını görüntüleme alternatif yaklaşımlar için karşılaştırıldığında M. tuberculosis belirli algılama her iki vitro sağlar ve in vivo8,23,24, 29.
Imaging REF-ebilmek var olmak kullanılmış için bakteriyel algılama genetik değişiklik herhangi bir enfeksiyon, her iki laboratuvar hayvanları8,37 veya insan klinik malzeme29,38 için doğrudan uygulama etkinleştirme olmadan . REF algılayıp fluorogenic yüzeylerde proteaz, kinaz, ureases ve β-galactosidases gibi BlaC dışında birçok enzimatik hedefleri için geliştirilen bu yana patojenler39,40, geniş bir dizi görüntü için kullanılabilir. Ancak, dikkatli düşünce emin olmak için hedefe verilmesi gerektiğini bu görüntüleme için en uygun özellikleri görüntüler. BlaC iyi model enzim bu stratejinin başarılı uygulama sağlayacak özellikleri için temsil eder. Imaging REF hemen bir eşleştirmeyi bakteri yükü akciğerlerde mevcut enfeksiyonlar sırasında ilerleme çalışmada, tüberküloz Patogenez, bakteriyel numaraları belirlenmesi normalde üç ila altı hafta gerektirdiğinden, fakat bile daha büyük ölçüde hızlandıran sağlar Bu yaklaşım çok şey kazandıracak hızlı büyüyen organizmalar zaman. REF tüberküloz, hastaların41,42Nodüler lezyonlar tanısında önemli bir sorun gelen karsinomlar ayırımcılık için de kullanılabilir. REF translasyonel tüberküloz görüntüleme hızlandırmak için yeni bir araç olarak hizmet vermektedir ve hatta potansiyel olarak tedavi edici sonuçlar hızlı tahmin izin insanlar için uygulanabilir.

M. tuberculosis yavaş büyüme oranı büyük bir barikat tüberküloz1,2,3hızlı tanı olduğunu. Tanı sonuçları üretmek için hafta sürer kültür dayalı iken, acid-fast smear tanılama sınırlamalar4 çocuklar5 ve insan immün yetmezlik virüsü6,7ile koenfekte Hastalar vardır. Optik görüntüleme teknolojileri son zamanlarda geleneksel tanı yöntemleri tüberküloz8,9için alternatif olarak kabul edilmiştir. Floresan ve bioluminescence optik, gerçek zamanlı10,-11,12,13,14Canlı hayvanlarda M. tuberculosis görüntü için kullanılabilir, 15,16,17,18,19. Optik görüntüleme bir enfeksiyon M. tuberculosis20,21,22ile hızlı ve spesifik bir değerlendirmenin yararı vardır.
M. tuberculosis optik görüntüleme ürün kodu kullanarak canlı farelerde ayrıntılarını anahat. Bu yöntem çok özel ve hassas23,24 ve, daha az görme duyusuyla ilgili diğer yöntemlere benzer diğer yöntemler tüberküloz (TB)25Bilgisayarlı Tomografi (CT)26, manyetik dahil olmak üzere, görüntüleme daha pahalı rezonans görüntüleme (MRG)27ve F-florodeoksiglikoz Pozitron emisyon tomografi/CT (F-FDG PET/BT)28. REF bir floresan ürün8,29üreten bir bakteriyel enzim tarafından bölünme üzerine özel floresan veya kollarındaki yüzeylerde kullanır. Bu nedenle, bir rekombinant Mikobakteriyel muhabir zorlanma30,31gerektirmeyen bir avantaja sahiptir. Açıklanan FRET substrat, bir fluorochrome ve BlaC (β-lactamase), doğal olarak yapısal Tüberküloz Kompleks Mycobacterium8tarafından, ifade tarafından hidrolize bir β-laktam halkası ile bağlı bir içki oluşur 32. bakteri doğrudan sinyal nedeniyle birçok büyüklük ve hassas M. tuberculosistespiti tarafından amplifikasyon sağlar REF katalitik aktivitesi oluşturmak.
Bu çalışmada kullanılan REF substrat canlı hayvan mükemmel doku penetrasyonu vardır ve arka plan nedeniyle, uzun dalga boyu düşük. Bu uzun dalga boyu substrat ile yaklaşık 100 M. tuberculosis için algılama eşik ulaşmak mümkündür birimleri (CFU) vitro oluşturan colony ve < 1000 CFU fareler vivo içinde (bütün hayvan)8, akciğerlerde 33. REF bir tanı aracı balgam, klinik malzemeler için ve hatta doğrudan onun yüksek duyarlılık ve özgüllük nedeniyle mikro endoskopik sistemleri16,32,33,34 olan hastalarda kullanılabilir. Tüm suşların mevcut algılama için doğal olarak üretilen bakteriyel enzim, BlaC, kullandığı için REF herhangi bir tüberküloz klinik zorlanma için uygulanabilir. Bu özellikleri önceden klinik tüberküloz araştırmasında değerli bir araç genel olarak tedavi kolaylaştırmak için Imaging REF ve aşı değerlendirme aynı zamanda Patogenez analizini yapmak, ama da sonuçta tüberküloz tanısında uygulanabilir hastalar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:664px;" width="664">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:163px;">VETONE</td>
			<td align="right" style="width:119px;">501027</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:216px;">CNIR800</td>
			<td style="width:163px;">Custom synthesized</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:216px;">Fatal Plus solution</td>
			<td style="width:163px;">Vortech Pharmaceutical Ls, Ltd</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">7H9 Middlebrook broth</td>
			<td style="width:163px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:119px;">271310</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">OADC Middlebrook enrichment</td>
			<td style="width:163px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:119px;">212351</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sporcidin</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:119px;">RE-1284F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">7H11 Middlebrook Agar</td>
			<td style="width:163px;">BD</td>
			<td align="right" style="width:119px;">212203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Madison Chamber</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">IVIS Spectrum</td>
			<td style="width:163px;">Perkin Elmer</td>
			<td align="right">124262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">XGI-8-gas Anesthesia System</td>
			<td style="width:163px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Living Imaging software</td>
			<td style="width:163px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Transparent nose cones</td>
			<td style="width:163px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">M. tuberculosis strain CDC1551</td>
			<td style="width:163px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Female BALB/C mice, 5-7 weeks</td>
			<td style="width:163px;">Jackson Laboratory</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging mycobacterium tuberculosis in mice with reporter enzyme fluorescence

Muhabir enzim floresan (REF) için mevcut faiz hedef organizmalarda yansıması oluşturma veya floresan veya bioluminescence tarafından algılamayı enzimler belirli yüzeylerde kullanır. Biz BlaC, yapısal tüm M. tuberculosis suşlarının tarafından ifade edilen bir enzim kullanmaktadır. REF bakterilerin akciğerlerde virüslü fareleri hızlı miktar sağlar. Fareler aynı grup büyük ölçüde maliyetlerini azaltarak, bakteri daha hızlı numaralandırma, roman gözlemler ana bilgisayar-patojen etkileşimlerde izin ve istatistiksel güç, grup başına daha fazla hayvan kolayca korunur bu yana artan birçok zaman noktalarda, yansıma . REF son derece hassas BlaC enzimatik muhabir katalitik doğası gereği ve belirli özel flourescence rezonans enerji transferi (FRET) veya fluorogenic yüzeylerde kullanılan nedeniyle. REF rekombinant suşları, normal ev sahibi-patojen etkileşimleri sağlanması gerektirmez. M. tuberculosis enfeksiyonu ile 800 maksimal emisyon FRET substrat kullanarak görüntüleme tarif nm. Dalga boyu substrat memelilerde hassas derin doku görüntüleme sağlar. M. tuberculosis, anestezi farelerin, REF substrat ve optik görüntüleme yönetimi ile fareler aerosol enfeksiyon açıklayacağım. Bu yöntem, ana bilgisayar-patojen etkileşimleri ve M. tuberculosishedefleme antibiyotiklerin etkinliğini değerlendirmek için başarıyla uygulandı.

REF görüntüleme bulaşmamış kontrol fare ile birlikte M. tuberculosis ile enfekte farelerin şekil 1içindeAgösterilir. Virüslü fareler üretilen bir anlamlı (P = 0.0057) akciğer 6 hafta sonrası enfeksiyon sonrasında substrat yönetim denetimi ile karşılaştırıldığında, daha yüksek Floresans sinyal. M. tuberculosis REF kullanarak karşı tedavi edici etkinliği çalışma için tipik süresi ders hafta görüntüleme 1, 2, 4, 6, 15, 24 sonrası enfeksiyon. Floresan yoğunluğu epi-aydınlatma akciğer dokusu (şekil 1B) kullanarak sayılabilir. Hafta 6 virüslü fareleri akciğerlerde için hafta 2 sinyal sürekli artan ürün kodu başarıyla M. tuberculosis içinde vivotespit etmek mümkün olduğunu göstermektedir. Bir damla daha sonraki bir zamanda noktada (şekil 1B) denetim farelerin arka plan sinyalinde vücut artış atfedilen olabilir kütlesi ve hacmi fareler böylece uyarma dalga boyu penetrasyon azaltarak 6 haftalık bir süre içinde. M. tuberculosis ile enfekte farelerde Floresans kaynaklarının 3D ZAMMINI imar Şekil 2içindeAtemsil edilir. Görüntü sıralarını fare aynı uyarma ve emisyon filtreleri bir dizi kullanarak birden çok trans-aydınlatma noktalarda elde edilir. Bu görüntü sıralarını daha sonra floresan kaynak paketinin içinde hayvan konu için 3D ZAMMINI yeniden inşası için kullanılır. Resim 2 A-D fare tomografi akciğer organ kaydı ile farklı yönlere (koronal, sagittal ve transaxial) gösterir. NTF verimliliği imar kalite Resim 2'Etemsil kontrol etmek için eşleştirir. NTF arka plan ışık sızıntısı ilave bir görüntü ile trans-aydınlatma görüntülerden çıkararak nötr yoğunluk filtresi ile yakalanan sağlar. Belirli uyarma filtre ile (Şekil 2E ölçülen) alınan görüntü aynı emisyon filtresi ve bir açık uyarma filtresi (vermek içinŞekil 2E - simüle) ile ölçülen iletim görüntü için normalleştirilmiş Yalnız substrat tarafından üretilen sinyal. Benzer ölçülen ve NTF verimlilik profili hem yatay (Şekil 2F) ve dikey (Şekil 2G) profilleri neredeyse % 0 yüzde hata (Şekil 2E-% hata) ile simüle kaliteli 3D imar kanıtı azaltılmış eserler ve geliştirilmiş sinyal Yerelleştirme ve duyarlılık ile sağlar.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56801/56801fig1.jpg"> Resim 1 . M. tuberculosis ile REF. görüntüleme (a) vivo görüntüleme bulaşmamış ve M. tuberculosis ile 2, 4 ve 6 hafta sonrası enfeksiyon enfekte farelerin. Renk çubuğunu fotonlar cm2 başına saniyede floresan sinyalin yoğunluğunu (sarı) düşük yüksek (kırmızı) temsil eder. (B) floresan yoğunluğu M. tuberculosisile enfekte fareler gelen miktar. Her iki denetim (siyah) floresan değer verir ve virüslü (kırmızı) her zaman için standart hata ile birlikte gösterilir. Sonuçları önemi öğrenciler ttarafından belirlendi-testi, p değerleri < 0,05 önemli kabul. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56801/56801fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56801/56801fig2.jpg"> Resim 2 . M. tuberculosisile enfekte farelerde Floresans kaynaklarının 3D ZAMMINI yeniden yapılanma. Fare tomografi farklı yönlere temsil; A) Koronal, B) sagittal ve C) transaxial D) akciğer organ kaydı ile. Faiz (ROI) 3D bölgenin kaynak ölçümleri için akciğer kırmızı bir küp olarak temsil edilir. (E) NTF verimliliği ölçülen ve yeniden yapılanma kalite kontrol etmek için benzetimli eşleştirir. 3D yeniden yapılanma (benzer ölçülen ve simüle NTF verimliliği) iyi kalite sağlayan ölçülü ve simüle NTF verimliliği profil karşılaştırıldı. F) yatay ve G) dikey sinyal temsil eden ölçülen (mavi) profilleri ve (kırmızı) NTF verimi eğrisi simüle. Yatay ve dikey Kırmızı çubuklar kaynak konumunu gösterir. Renk çubuğunu fotonlar cm2 başına saniyede floresan sinyalin yoğunluğunu (mavi) düşük yüksek (kırmızı) temsil eder. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56801/56801fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence at JoVE.com

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Biz gazeteci enzim floresan (REF) kullanarak Mycobacterium tüberküloz ile (M. tuberculosis) enfekte farelerin optik görüntüleme açıklar. Bu iletişim kuralı M. tuberculosis hassas ve belirli algılama Patogenez, tedavi ve aşı araştırma için önceden klinik hayvan modellerinde kolaylaştırır.

Mycobacterium tüberküloz ile muhabir enzim Floresans farelerde görüntüleme

Reporter enzyme fluorescence (REF) utilizes substrates that are specific for enzymes present in target organisms of interest for imaging or detection by ...

imaging-mycobacterium-tuberculosis-mice-with-reporter-enzyme

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

7.2K Görüntüleme.  Texas A&M Health Science Center. Biz gazeteci enzim floresan (REF) kullanarak Mycobacterium tüberküloz ile (M. tuberculosis) enfekte farelerin optik görüntüleme açıklar. Bu iletişim kuralı M. tuberculosis hassas ve belirli algılama Patogenez, tedavi ve aşı araştırma için önceden klinik hayvan modellerinde kolaylaştırır.

Video: Imaging Mycobacterium tuberculosis in Mice with Reporter Enzyme Fluorescence

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) drug-resistant strains threatens to derail current disease control efforts. Thus, there is an urgent need to develop drugs and vaccines that are more effective than those currently available. The genome of M. tuberculosis has been known for more than 10 years, yet there are important gaps in our knowledge of gene function and essentiality. Many studies have since used gene expression analysis at both the transcriptomic and proteomic levels to determine the effects of drugs, oxidants, and growth conditions on the global patterns of gene expression. Ultimately, the final response of these changes is reflected in the metabolic composition of the bacterium including a few thousand small molecular weight chemicals. Comparing the metabolic profiles of wild type and mutant strains, either untreated or treated with a particular drug, can effectively allow target identification and may lead to the development of novel inhibitors with anti-tubercular activity. Likewise, the effects of two or more conditions on the metabolome can also be assessed. Nuclear magnetic resonance (NMR) is a powerful technology that is used to identify and quantify metabolic intermediates. In this protocol, procedures for the preparation of M. tuberculosis cell extracts for NMR metabolomic analysis are described. Cell cultures are grown under appropriate conditions and required Biosafety Level 3 containment,1 harvested, and subjected to mechanical lysis while maintaining cold temperatures to maximize preservation of metabolites. Cell lysates are recovered, filtered sterilized, and stored at ultra-low temperatures. Aliquots from these cell extracts are plated on Middlebrook 7H9 agar for colony-forming units to verify absence of viable cells. Upon two months of incubation at 37 &deg;C, if no viable colonies are observed, samples are removed from the containment facility for downstream processing. Extracts are lyophilized, resuspended in deuterated buffer and injected in the NMR instrument, capturing spectroscopic data that is then subjected to statistical analysis. The procedures described can be applied for both one-dimensional (1D) 1H NMR and two-dimensional (2D) 1H-13C NMR analyses. This methodology provides more reliable small molecular weight metabolite identification and more reliable and sensitive quantitative analyses of cell extract metabolic compositions than chromatographic methods. Variations of the procedure described following the cell lysis step can also be adapted for parallel proteomic analysis.

Sample Preparation of Mycobacterium tuberculosis Extracts for Nuclear Magnetic Resonance Metabolomic Studies

The metabolomic profile of Mycobacterium tuberculosis is determined after growth in broth cultures. Conditions can be varied to test the effects of nutritional supplements, oxidants, and anti-tuberculosis agents on the metabolic profile of this microorganism. Procedure for extract preparation is applicable for both 1D 1H and 2D 1H-13C NMR analyses.

Numune Hazırlama<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</emNükleer Manyetik Rezonans metabolomik Araştırmaları&gt; özler

Mycobacterium tuberculosis is a major cause of mortality in human beings on a global scale. The emergence of both multi- (MDR) and extensively-(XDR) ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including antibiotics. Although stress tolerance of M. tuberculosis is one of the likely contributors to the 6-month long chemotherapy of tuberculosis 1, the molecular mechanisms underlying this characteristic phenotype of the pathogen remain unclear. Many microbial species have evolved to survive in stressful environments by self-assembling in highly organized, surface attached, and matrix encapsulated structures called biofilms 2-4. Growth in communities appears to be a preferred survival strategy of microbes, and is achieved through genetic components that regulate surface attachment, intercellular communications, and synthesis of extracellular polymeric substances (EPS) 5,6. The tolerance to environmental stress is likely facilitated by EPS, and perhaps by the physiological adaptation of individual bacilli to heterogeneous microenvironments within the complex architecture of biofilms 7.
In a series of recent papers we established that M. tuberculosis and Mycobacterium smegmatis have a strong propensity to grow in organized multicellular structures, called biofilms, which can tolerate more than 50 times the minimal inhibitory concentrations of the anti-tuberculosis drugs isoniazid and rifampicin 8-10. M. tuberculosis, however, intriguingly requires specific conditions to form mature biofilms, in particular 9:1 ratio of headspace: media as well as limited exchange of air with the atmosphere 9. Requirements of specialized environmental conditions could possibly be linked to the fact that M. tuberculosis is an obligate human pathogen and thus has adapted to tissue environments. In this publication we demonstrate methods for culturing M. tuberculosis biofilms in a bottle and a 12-well plate format, which is convenient for bacteriological as well as genetic studies. We have described the protocol for an attenuated strain of M. tuberculosis, mc27000, with deletion in the two loci, panCD and RD1, that are critical for in vivo growth of the pathogen 9. This strain can be safely used in a BSL-2 containment for understanding the basic biology of the tuberculosis pathogen thus avoiding the requirement of an expensive BSL-3 facility. The method can be extended, with appropriate modification in media, to grow biofilm of other culturable mycobacterial species.
Overall, a uniform protocol of culturing mycobacterial biofilms will help the investigators interested in studying the basic resilient characteristics of mycobacteria. In addition, a clear and concise method of growing mycobacterial biofilms will also help the clinical and pharmaceutical investigators to test the efficacy of a potential drug.

Growth of Mycobacterium tuberculosis Biofilms

Mycobacterium tuberculosis forms drug tolerant biofilms when cultured in certain conditions. Here we describe methods for culturing M. tuberculosis biofilms and determining the frequency of drug tolerant persisters. These protocols will be useful for further studies into the mechanisms of drug tolerance in M. tuberculosis.

Büyüme Mycobacterium tuberculosis Biyofilmler

Mycobacterium tuberculosis, the etiologic agent of human tuberculosis, has an extraordinary ability to survive against environmental stresses including ...

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the respective immune response to each single pathogen and may thereby affect pathogenesis and disease outcome. Coinfected patients may also respond differentially to anti-infective interventions. Coinfection between tuberculosis as caused by mycobacteria and the malaria parasite Plasmodium, both of which are coendemic in many parts of sub-Saharan Africa, has not been studied in detail. In order to approach the challenging but scientifically and clinically highly relevant question how malaria-tuberculosis coinfection modulate host immunity and the course of each disease, we established an experimental mouse model that allows us to dissect the elicited immune responses to both pathogens in the coinfected host. Of note, in order to most precisely mimic naturally acquired human infections, we perform experimental infections of mice with both pathogens by their natural routes of infection, i.e. aerosol and mosquito bite, respectively.

An Experimental Model to Study Tuberculosis-Malaria Coinfection upon Natural Transmission of Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium berghei

Tuberculosis and malaria are two of the most prevalent infections in humans and major causes of morbidity and mortality in impoverished populations in the tropics. We established an experimental model system to study outcome of malaria-tuberculosis coinfection in mice after challenge with both pathogens via their natural route of infection.

Doğal İletim üzerine Tüberküloz-Sıtma Koenfeksiyonu Çalışması için Deneysel Bir Model Mycobacterium tuberculosis Ve Plasmodium berghei</i

Coinfections naturally occur due to the geographic overlap of distinct types of pathogenic organisms. Concurrent infections most likely modulate the ...

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource environments. An amplification microarray combines asymmetric PCR amplification, target size selection, target labeling, and microarray hybridization within a single solution and into a single microfluidic chamber. A batch processing method is demonstrated with a 9-plex asymmetric master mix and low-density gel element microarray for genotyping multi-drug resistant Mycobacterium tuberculosis (MDR-TB). The protocol described here can be completed in 6 hr and provide correct genotyping with at least 1,000 cell equivalents of genomic DNA. Incorporating on-chip wash steps is feasible, which will result in an entirely closed amplicon method and system. The extent of multiplexing with an amplification microarray is ultimately constrained by the number of primer pairs that can be combined into a single master mix and still achieve desired sensitivity and specificity performance metrics, rather than the number of probes that are immobilized on the array. Likewise, the total analysis time can be shortened or lengthened depending on the specific intended use, research question, and desired limits of detection. Nevertheless, the general approach significantly streamlines microarray workflow for the end user by reducing the number of manually intensive and time-consuming processing steps, and provides a simplified biochemical and microfluidic path for translating microarray-based diagnostics into routine clinical practice.

Demonstrating a Multi-drug Resistant Mycobacterium tuberculosis Amplification Microarray

An amplification microarray combines asymmetric PCR amplification and microarray hybridization into a single chamber, which significantly streamlines microarray workflow for the end user. Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource environments.

Çok ilaca dirençli Demonstrating<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Amplifikasyon Microarray

Simplifying microarray workflow is a necessary first step for creating MDR-TB microarray-based diagnostics that can be routinely used in lower-resource ...

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us understand the disease mechanisms and advance the discoveries of new treatment options. In vitro cell cultures of monolayers or co-cultures lack the three-dimensional (3D) environment and tissue responses. Herein, we describe an innovative in vitro model of a human lung tissue, which holds promise to be an effective tool for studying the complex events that occur during infection with Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis). The 3D tissue model consists of tissue-specific epithelial cells and fibroblasts, which are cultured in a matrix of collagen on top of a porous membrane. Upon air exposure, the epithelial cells stratify and secrete mucus at the apical side. By introducing human primary macrophages infected with M. tuberculosis to the tissue model, we have shown that immune cells migrate into the infected-tissue and form early stages of TB granuloma. These structures recapitulate the distinct feature of human TB, the granuloma, which is fundamentally different or not commonly observed in widely used experimental animal models. This organotypic culture method enables the 3D visualization and robust quantitative analysis that provides pivotal information on spatial and temporal features of host cell-pathogen interactions. Taken together, the lung tissue model provides a physiologically relevant tissue micro-environment for studies on TB. Thus, the lung tissue model has potential implications for both basic mechanistic and applied studies. Importantly, the model allows addition or manipulation of individual cell types, which thereby widens its use for modelling a variety of infectious diseases that affect the lungs.

A 3D Human Lung Tissue Model for Functional Studies on Mycobacterium tuberculosis Infection

Human tuberculosis infection is a complex process, which is difficult to model in vitro. Here we describe a novel 3D human lung tissue model that recapitulates the dynamics that occur during infection, including the migration of immune cells and early granuloma formation in a physiological environment.

Fonksiyonel Araştırmaları 3D İnsan Akciğer Doku Modeli<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em&gt; Enfeksiyon

Tuberculosis (TB) still holds a major threat to the health of people worldwide, and there is a need for cost-efficient but reliable models to help us ...

Intravital Imaging of Neutrophil Priming Using IL-1&#946; Promoter-driven DsRed Reporter Mice

Neutrophils are the most abundant leukocytes in human blood circulation and are quickly recruited to inflammatory sites. Priming is a critical event that enhances the phagocytic functionality of neutrophils. Although extensive studies have unveiled the existence and importance of neutrophil priming during infection and injury, means of visualizing this process in vivo have been unavailable. The protocol provided enables monitoring of the dynamic process of neutrophil priming in living animals by combining three methodologies: 1) DsRed reporter signal &#8212; used as a measure of priming 2) in vivo neutrophil labeling &#8212; achieved by injection of fluorescence-conjugated anti-lymphocyte antigen 6G (Ly6G) monoclonal antibody (mAb) and 3) intravital confocal imaging. Several critical steps are involved in this protocol: oxazolone-induced mouse ear skin inflammation, appropriate sedation of animals, repeated injections of anti-Ly6G mAb, and prevention of focus drift during imaging. Although a few limitations have been observed, such as the limit of continuous imaging time (~ 8 hr) in one mouse and the leakage of fluorescein isothiocyanate-dextran from blood vessels in the inflammatory state, this protocol provides a fundamental framework for intravital imaging of primed neutrophil behavior and function, which can easily be expanded to examination of other immune cells in mouse inflammation models.

This current protocol employs fluorescent reporters, in vivo labeling, and intravital imaging techniques to enable monitoring of the dynamic process of neutrophil priming in living animals.

IL-1β Promoter odaklı DsRed Muhabir Fare kullanma Nötrofil Hazırlama intravital Görüntüleme

Neutrophils are the most abundant leukocytes in human blood circulation and are quickly recruited to inflammatory sites. Priming is a critical event that ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

We have developed a modular high-throughput screening system for discovering novel compounds against Mycobacterium tuberculosis, targeting intracellular and in-broth growing bacteria as well as cytotoxicity against the mammalian host cell.

Hücre içi Hedefleme İnhibitörleri Etkinliği ve Sitotoksisite Taraması için sistem<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to effectiveness in the clinical setting. This is likely due to a lack of consideration for the physiologically relevant cellular penetration barriers that exist in the infected host. We recently established an alternative infection model that generates large macrophage aggregate structures containing densely packed M. tuberculosis (Mtb) at its core, which was suitable for drug susceptibility testing. This infection model is inexpensive, rapid, and most importantly BSL-2 compatible. Here, we describe the experimental procedures to generate Mtb/macrophage aggregate structures that would produce macrophage-passaged Mtb for drug susceptibility testing. In particular, we demonstrate how this infection system could be directly adapted to the 96-well plate format showing throughput capability for the screening of compound libraries against Mtb. Overall, this assay is a valuable addition to the currently available Mtb drug discovery toolbox due to its simplicity, cost effectiveness, and scalability.

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

New models and assays that would improve the early drug development process for next-generation anti-tuberculosis drugs are highly desirable. Here, we describe a quick, inexpensive, and BSL-2 compatible assay to evaluate drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis that can be easily adapted for high-throughput screening.

Bir Yüksek verim Uyumlu Deneyi Makrofaj, pasajlamaya karşı ilaç etkinliğini değerlendirmektir<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically relevant methods are needed that evaluate the disease process and screen for potential antibiotic and vaccine treatments. Positron Emission Tomography/Computed Tomography (PET/CT) has been established as a valuable tool for studying a number of afflictions such as cancer, Alzheimer&#39;s disease, and inflammation/infection. Outlined here are a number of strategies that have been employed to evaluate PET/CT images in cynomolgus macaques that are infected intrabronchially with low doses of M. tuberculosis. Through evaluation of lesion size on CT and uptake of 18F-fluorodeoxyglucose (FDG) in lesions and lymph nodes in PET images, these described methods show that PET/CT imaging can predict future development of active versus latent disease and the propensity for reactivation from a latent state of infection. Additionally, by analyzing the overall level of lung inflammation, these methods determine antibiotic efficacy of drugs against M. tuberculosis in the most clinically relevant existing animal model. These image analysis methods are some of the most powerful tools in the arsenal against this disease as not only can they evaluate a number of characteristics of infection and drug treatment, but they are also directly translatable to a clinical setting for use in human studies.

Analysis of 18FDG PET/CT Imaging as a Tool for Studying Mycobacterium tuberculosis Infection and Treatment in Non-human Primates

Here, we present a protocol to describe the analysis of 18F-FDG PET/CT imaging in non-human primates that have been infected with M. tuberculosis to study disease process, drug treatment, and disease reactivation.

Analiz 18FDG PET/BT uzmanı Mycobacterium tüberküloz enfeksiyon ve insan olmayan primatlarda tedavisi için bir araç olarak görüntüleme

Mycobacterium tuberculosis remains the number one infectious agent in the world today. With the emergence of antibiotic resistant strains, new clinically ...

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this bacterium causes a wide disease spectrum in humans ranging from a sterilized infection to an actively progressing deadly disease. The most common form is the latent tuberculosis, which is asymptomatic, but has the potential to reactivate into a fulminant disease. Adult zebrafish and its natural pathogen Mycobacterium marinum have recently proven to be an applicable model to study the wide disease spectrum of tuberculosis. Importantly, spontaneous latency and reactivation as well as adaptive immune responses in the context of mycobacterial infection can be studied in this model. In this article, we describe methods for the experimental infection of adult zebrafish, the collection of internal organs for the extraction of nucleic acids for the measurement of mycobacterial loads and host immune responses by quantitative PCR. The in-house-developed, M. marinum-specific qPCR assay is more sensitive than the traditional plating methods as it also detects DNA from non-dividing, dormant or recently dead mycobacteria. As both DNA and RNA are extracted from the same individual, it is possible to study the relationships between the diseased state, and the host and pathogen gene-expression. The adult zebrafish model for tuberculosis thus presents itself as a highly applicable, non-mammalian in vivo system to study host-pathogen interactions.

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Here, we present a protocol to model human tuberculosis in an adult zebrafish using its natural pathogen Mycobacterium marinum. Extracted DNA and RNA from the internal organs of infected zebrafish can be used to reveal the total mycobacterial loads in the fish and the host&#39;s immune responses with qPCR.

Tüberküloz Mycobacterium marinum enfekte yetişkin zebra balığı içinde modelleme

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this ...