Bu eser için bilimsel araştırma (NWO; Hypatia bursu Radboud Üniversitesi Tıp Merkezi, kariyer geliştirme Ödülü insan sınır bilim programı, yerçekimi programı 2013 Hollanda organizasyon tarafından desteklenmiştir ICI-024.002.009), bir VIDI vermek NWO (ALW VIDI 864.14.001) ve bir başlangıç Grant Avrupa Birliği'nin yedinci çerçeve programı (hibe sözleşmesi numarası 336479) altında Avrupa Araştırma Konseyi (ERC) üzerinden.

1. mikroskop örnekleri hazırlanması
<ol>
	<li>Qa-tuzak sözdiziminin 4 ifade mCitrine (sözdiziminin 4-mCitrine; donör fluorophore) erimiş ve R-tuzak VAMP3 mCherry (VAMP3-mCherry) erimiş Not: Diğer tuzaklarına onların C-terminal transmembran sarmal erimiş floresan proteinler ile de kullanılabilir. MCitrine-mCherry yerine hayalice ayrı fluorophores diğer donör-alıcısı çiftlerini de kullanılan (örneğin, CFP-YFP) olabilir.<ol>
		<li>HeLa hücreleri büyümek ve üç 35 mm çaplı cam alt yemekleri mikroskopi için uygun üzerinden 900.000 HeLa hücreleri bölmek. Not: ilke olarak, bu iletişim kuralı diğer ökaryotik hücre tipleri ve mikroskopi yemekleri için adapte edilebilir.<ol>
			<li>T75 Şişeler 10 mL Dulbecco'nın modifiye kartal orta (DMEM), % 10 fetal buzağı serum (FCS) ve % 1 antibiyotik antimycotic (içeren Amfoterisin B, penisilin ve streptomisin) 37 ° C'de ve % 5 ile desteklenmiş yüksek glikoz ile HeLa hücre kültürleri korumak CO 2 hücre kültür kuluçka.</li>
			<li>Orta haftada iki kez doldurmak ve hücreleri 1:10 haftada bir kez veya hücreleri confluency yeni T75 şişeler (500.000 hücreler/flask, ortalama) % 85-90 ulaştığınız zaman bölünmüş.</li>
			<li>DMEM kaldırmak ve HeLa monolayers 8 mL steril fosfat tamponlu tuz (PBS) 3 dakika ile iki kez yıkayın.</li>
			<li>PBS kaldırın ve PBS 2 mL 2 mM ethylenediaminetetraacetic asitle (EDTA) ekleyin.</li>
			<li>Hücreleri hücre kültür kuluçka 37 ° C ve % 5 CO2 5 min için kuluçkaya ve daha sonra hafifçe şişeye HeLa hücreleri balonun altından ayırmak için tahrik.</li>
			<li>Orta 10 mL ile hücreleri temizlemek, süspansiyon 15 mL tüp aktarmak ve sayımı için 10 µL aliquot kaldırmak.</li>
			<li>Aliquot 1: %0,4 trypan mavi leke ile 1 sulandırmak ve Bürker hemasitometre9hücreleri saymak. Not: 10.000 hücre/mL sayısı için tarafından iki 4 x 4 kareler ve birden çok hücre sayı saymak.</li>
			<li>Sonra sayım 15 mL tüp almak 900.000 hücreleri hücre (bkz. Adım 1.1.1) 3 cam alt yemekleri onları bölmek ve transfection için hazır olun.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Hücre çoğalmasıyla10 tarafından transfect ( Tablo malzemelerigörmek) sahip sözdiziminin 4-mCitrine yapı (yalnızca, donör Örnek #1), sözdiziminin 4-mCitrine VAMP3-mCherry (örnek 2) ve sözdiziminin 3 ile birlikte erimiş mCitrine ve mCherry () için Örnek 3). Not: Diğer hücre transfection yöntemleri de kullanılan11olabilir. Örnek #3 tandem inşa kısa ömrü expectable (Yani, maksimal expectable perde) tahmin etmek için olumlu bir denetimdir.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Yüksek glikoz % 10 FCS ve antibiyotik-antimycotic % 5 CO2 hücre kültür kuluçka 37 ° C'de % 1 ile birlikte gelen DMEM hücreleri gecede kültür.</li>
	<li>DMEM Aspire edin ve bir kez canlı hücre orta Imaging hücrelerle yıkayın (140 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1.8 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 20 mM HEPES, pH 7.4, mOsm = 300 =; Tablo reçetesibakın) 2 min için ve daha sonra hücreleri taze görüntülemede yer Orta.</li>
</ol>
2. veri yazmak için FLIM
<ol>
	<li>Yer Örnek #2 saat-alan FLIM confocal mikroskop altında pulsed uyarma kaynağı ile donör fluorophore (örneğin, mCitrine) ve zaman çözülmüş veri toplama için. Isıtmalı bir sahne ile 37 ° C'de hücreler tutmak. Not: Bu protokol için kullanılan confocal mikroskop bir 63 X 1,20 NA su daldırma amacı ile de, bir beyaz ışık lazer bulunuyor (80 MHz darbe, &#60; 100 ps darbe süresi), bir foton çarpanı tüp (PMT) ve bir Time-Correlated tek foton sayma (TCSPC ) sistemi ( Tablo malzemeler kullanılan özel kurulum için bakınız). Diğer FLIM mikroskoplar kullanılan (örneğin, PMTs, tek dalga boyu pulsed lazerler bir beyaz ışık pulslu lazer yerine yerine tek foton çığ diyotlar (SPAD)) da olabilir.</li>
	<li>MCitrine ve mCherry etiketli SNARE proteinler görünür ifadesi içeren bir hücreyi seçin ve her FLIM ölçü önce her iki fluorophores aynı anda uyarma 256 × 256 piksel olan confocal bir resmi kaydetmek. Yaklaşık 2 kat kırınım mikroskop Uzaysal çözünürlük sınırlı daha küçük bir piksel adım (~ 200 nm) kullanılmalıdır. 516 nm ve 521-565 nm toplamak emisyon mCitrine için heyecanlandırmak; 613-668 nm 610 nm ve toplamak emisyon, mCherry için heyecanlandırmak. Not: görüntüleme uçak çok yakın çanak alt konum yapmak (içinde ~ 2 µm mesafe), bu bir yansıma tepe Floresans ömür boyu histogram da yol açar. Bu örnek hareket olası sorunu aşmak için donör ve alıcısı fluorophores eşzamanlı uyarma tercih edilen, önemlidir. Ancak, sıralı uyarma de kullanılabilir.</li>
	<li>Kayıt aynı boyutlara ve confocal resmi olarak Uzaysal çözünürlük ile kaydedilen FLIM görüntü ile Çalıştırmak FLIM tıklayarak bir FLIM görüntü adım 2.2. Bütün hücre FLIM çözümleme veya en az 400 fotonlar/piksel görüntü en az 50.000 fotonlar kaydedin. Sadece mCitrine donör fluorophore ve değil mCherry alıcısı fluorophore heyecanlandıracak ve böylece 521-565 nm 516 nm ve toplamak emisyon, heyecanlandırmak.</li>
	<li>Çoklu hücrelerdeki ve diğer örnek #1 (sadece donör) ve örnek #3 (mCitrine-mCherry tandem yapı) 2.1-2.3 adımları yineleyin.</li>
	<li>Bir enstrüman yanıt işlevi (IRF) kaydedin. Uyarma dalga boyu (örneğin, 510-550 nm kayıt emisyon) için emisyon dedektörü monokromatör ayarlamak ve sonra geri bir temiz cam kapak kayma FLIM Çalıştırdüğmesini tıklatarak saçılma ile bir FLIM görüntü kaydetmek. Aynı uyarma dalga kullanın (516 nm) ve lazer gibi adımlar 2,1-2.4 hücre veri kaydetmek için kullanılan güç. Not: birden fazla doruklarına IRF içinde görünür durumdaysa ya da emisyon monochromators ayarlı, IRF da floresan boya ile ultrafast ömür boyu, bir çözüm ile örneğin bir organik boya ile doymuş bir sulu Floresans Şoklama tarafından ölçülebilir Potasyum iyodür çözüm. Ayrıca, Floresans histogramlar çürüme eğimi de IRF deconvolution monte edilebilir çünkü bir IRF kaydetmek için kesinlikle gerekli değildir. Ancak, bir IRF kullanılan foton dedektörü zamanlama özellikleri için düzeltmek için sağlar ve böylece ömür boyu histogramlar krizleri daha doğru olmasını sağlar.</li>
</ol>
3.Foton kayıtları FLIM görüntülere dönüştürme
<ol>
	<li>Karşıdan yükleyip PT32ICS dönüşüm yazılım5. Not: Ömür boyu veri da bilgisayar yazılımı--dan çeşitli mikroskop satıcılar da dahil olmak üzere diğer yazılımlar tarafından analiz edilebilir.</li>
	<li>PT32ICS yazılım yapılandırın.<ol>
		<li>256 × 256 piksel görüntü boyutu Ayarları üzerinden boyutu ayarlamak | Boyutu.</li>
		<li>2 ayarları kanal ayarla | Boyutu. Not: Kanal mCitrine emisyon sadece mikroskop yapılandırmasına bağlıdır. Hatalı bir kanal bir FLIM görüntü yok fotonlar (Yani, siyah görüntü) ve sonuç olarak boş bir 'LifetimeTable.txt' neden olur-dosya. Doğru kanal deneme-yanılma tarafından tespit edilebilir.</li>
		<li>ImageJ (xyz) için Çıkış ayarla (veya TRI2 (xyt)) FLIM görüntüleri (Adım 3.4) oluşturmak için.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Convert tuşuna basın ve bir veya daha fazla foton izlemeler (.pt3 dosyaları) yükleyin. Birden fazla foton izleme seçmek için Ctrl tuşunu basılı tutun. Not: Daha yeni 64 bit .ptu biçimi de dönüştürülebilir.</li>
	<li>PT32ICS yazılım pt3 dosyalarının kaydedildiği yer olarak aynı klasörde aşağıdaki dosyaları oluşturur emin olmak: bir foton yığın .pt3 foton izlemesinde resim sitometresi standart biçimi (.ics), .pt3 foton izleme (.bmp) her bir bit eşlem dosyası, metin dosyası dönüşüm başına ücret (_Report.txt) içeren bilgi içeren toplam foton istatistikleri (Yani, her .pt3 foton izleme, zaman çözünürlüğü Dedektör fotonlar toplam sayısı) ve ikinci bir metin dosyası dönüştürme (_LifetimeTable.txt) başına Floresans ömür boyu çubuk grafikler her .pt3 foton izleme için sekmeyle ayrılmış biçimde. Not: .ics dosyası FLIM görüntülerle, örneğin TRI2 yazılım12,13 ya da Kütüphane FIJI ImageJ14,15dakika sonra uygun ince eğri oluşturmak için uygun tek piksel için kullanılabilir. Bu dosyayı da Fazör analiz16için örneğin FIJI Spechron üzerinden zaman Gated Fazör eklentisi ile kullanılabilir. Bit eşlem dosyası ömür boyu bilgiler içermez. İkinci metin dosyası 4. adımda bütün hücreli FLIM analizi için kullanılır.</li>
</ol>
4. uygun floresan ömür boyu histogramlar bütün hücreli FLIM analizi için
Not: Bu adımı (deconvoluted provası IRF) yazılımı deconvoluted provası kapasitesine sahiptir gerektirir. IRF deconvolution olmadan Floresans histogramlar yamaçları uygun diğer yazılımlar ile de yapılabilir.
<ol>
	<li>Veri analizi yazılım programı deconvolution (Malzeme tablo) ile uygun yetenekli açın ve her foton izleme (_LifetimeTable.txt) dosya üzerinden için çubuk içeren metin dosyası alma | Alma | Tek ASCII.</li>
	<li>IRF ( Kopyala ve Yapıştırkullanarak) tablonun ikinci sütununda öyle ki tabloyu yeniden düzenlemek. IRF ikinci sütununda B a ilk sütunundaki zaman değerleri yanında yer</li>
	<li>Ctrl + A tuşlarına basıp arsa seçerek tüm sütunları seçerek kaydedilen foton izlemeler kalitesini belirlemek | Paneli çoklu | 9 paneli. Foton izleri bir yüksek yansıma tepe (şekil 4F) ile analiz etmiyorsun.</li>
	<li>Seçin Ctrl kullanarak B sütunundaki IRF yanı sıra monte edilebilir kalite kontrollü ömür boyu çubuk grafikler içeren tüm sütunları anahtar ve doğrusal olmayan uydurma analiz üzerinden yüklemek | Uygun | Doğrusal olmayan eğri Fit | Açık iletişim.</li>
	<li>Analiz yazılımı için bu işlev ekleyerek deconvoluted uygun işlev ( ek dosya 1' kullanılabilir) yük ( Kategori üzerinden | Kullanıcı tanımlı | İşlev | Ekle). 'FLIM_convoluted_IRF.fdf' uygun işlev dosyayı seçin. Bu işlev uygun floresan ömür boyu histogramlar bir mono üstel çürüme fonksiyonu ile deconvoluted (Yani, tabloda ikinci sütun B) IRF ile (Denklem 1): 
	<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56745/56745eq1.jpg">(Denklem 1) t ile belgili tanımlık zaman, τ belirgin Floresans ömür boyu, A genlik ve y0 uzaklık. Not: Başka bir ömür boyu histogramlar BI üstel uygun fonksiyon (Denklem 2) ile uygun seçenektir: 
	<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56745/56745eq2.jpg">(Denklem 2) Donör tek şart yavaş bileşenine (τ1) ömrünü sabitleme tarafından (Adım 1.1.2: Örnek #1) ve hızlı bileşeninin (τ2) tandem yapı (örnek 3) için bu kısmını tahmini sağlar TUZAK protein kompleksi (F) üzerinden genlikleri yavaş (A1) ve hızlı bileşenleri (A2; bkz: tartışma; Denklem 3): 
	<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56745/56745eq3.jpg">(Denklem 3) Deconvoluted BI üstel uygun 'FLIM_convoluted_IRF_biexp.fdf' için uygun fonksiyon dosyası ek dosya 2' kullanılabilir.</li>
	<li>Seçin donatılmış eğrileri | Veri türü x olarak giriş veri olarak aynı. Not: Bu xuygun yol açar-monte eğrileri eksen ölçeklendirme.</li>
	<li>Eğrileri uygunbasarak uygun. Not: Bu uygun dönüştürmek ve bir 'raporu sayfası' dizisinde Floresans yaşam süreleri, ofset ve genlikleri içeren bir tabloyla birlikte oluşturmak. Ayrıca monte eğrileri ve fazlalıklar uygun veri sayfasıyla oluşturacaktır.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Jahn, R., Scheller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SNAREs+-+engines+for+membrane+fusion.">SNAREs - engines for membrane fusion.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 7 (9), 631-643 (2006).</li><li>Hong, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SNAREs+and+traffic.">SNAREs and traffic.</a> Biochim Biophys Acta. 1744 (2), 120-144 (2005).</li><li>van den Bogaart, G., Jahn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Counting+the+SNAREs+needed+for+membrane+fusion.">Counting the SNAREs needed for membrane fusion.</a> J Mol Cell Biol. 3 (4), 204-205 (2011).</li><li>Bethani, I., Werner, A., Kadian, C., Geumann, U., Jahn, R., Rizzoli, S. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosomal+fusion+upon+SNARE+knockdown+is+maintained+by+residual+SNARE+activity+and+enhanced+docking.">Endosomal fusion upon SNARE knockdown is maintained by residual SNARE activity and enhanced docking.</a> Traffic. 10 (10), 1543-1559 (2009).</li><li>Verboogen, D. R. J., Gonz&#225;lez Mancha, N., Ter Beest, M., van den Bogaart, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+lifetime+imaging+microscopy+reveals+rerouting+of+SNARE+trafficking+driving+dendritic+cell+activation.">Fluorescence lifetime imaging microscopy reveals rerouting of SNARE trafficking driving dendritic cell activation.</a> eLife. 6, (2017).</li><li>Degtyar, V., Hafez, I. M., Bray, C., Zucker, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dance+of+the+SNAREs:+assembly+and+rearrangements+detected+with+FRET+at+neuronal+synapses.">Dance of the SNAREs: assembly and rearrangements detected with FRET at neuronal synapses.</a> J Neurosci. 33 (13), 5507-5523 (2013).</li><li>Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FRET+imaging.">FRET imaging.</a> Nat Biotechnol. 21 (11), 1387-1395 (2003).</li><li>Wallrabe, H., Periasamy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+protein+molecules+using+FRET+and+FLIM+microscopy.">Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy.</a> Curr Opin Biotechnol. 16 (1), 19-27 (2005).</li><li>JoVE Science Education Database Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+a+Hemacytometer+to+Count+Cells.">Using a Hemacytometer to Count Cells.</a> JoVE. , (2017).</li><li>Thermo Fisher Scientific. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NEON transfection system cell protocols HeLa. , (2017).</li><li>Kim, T. K., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+cell+transfection:+the+present+and+the+future.">Mammalian cell transfection: the present and the future.</a> Anal Bioanal Chem. 397 (8), 3173-3178 (2010).</li><li>Barber, P. R., Ameer-Beg, S. M., Gilbey, J. D., Edens, R. J., Ezike, I., Vojnovic, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+and+pixel+kinetic+data+analysis+for+FRET+detection+by+multi-photon+time-domain+FLIM.">Global and pixel kinetic data analysis for FRET detection by multi-photon time-domain FLIM.</a> Proc. SPIE. 5700, 171 (2005).</li><li>Barber, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+time-domain+fluorescence+lifetime+imaging+microscopy:+practical+application+to+protein-protein+interactions+using+global+analysis.">Multiphoton time-domain fluorescence lifetime imaging microscopy: practical application to protein-protein interactions using global analysis.</a> J R Soc Interface. 6 (Suppl 1), S93-S105 (2009).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li><li>Hinde, E., Digman, M. A., Welch, C., Hahn, K. M., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biosensor+F&#246;rster+resonance+energy+transfer+detection+by+the+phasor+approach+to+fluorescence+lifetime+imaging+microscopy.">Biosensor F&#246;rster resonance energy transfer detection by the phasor approach to fluorescence lifetime imaging microscopy.</a> Microsc Res Tech. 75 (3), 271-281 (2012).</li><li>Stein, A., Weber, G., Wahl, M. C., Jahn, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helical+extension+of+the+neuronal+SNARE+complex+into+the+membrane.">Helical extension of the neuronal SNARE complex into the membrane.</a> Nature. 460 (7254), 525-528 (2009).</li><li>Barstow, B., Ando, N., Kim, C. U., Gruner, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+citrine+structure+by+hydrostatic+pressure+explains+the+accompanying+spectral+shift.">Alteration of citrine structure by hydrostatic pressure explains the accompanying spectral shift.</a> PNAS. 105 (36), 13362-13366 (2008).</li><li>Shu, X., Shaner, N. C., Yarbrough, C. A., Tsien, R. Y., Remington, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+chromophores+and+buried+charges+control+color+in+mFruits.">Novel chromophores and buried charges control color in mFruits.</a> Biochemistry. 45 (32), 9639-9647 (2006).</li><li>Veale, K. J., Offenh&#228;user, C., Lei, N., Stanley, A. C., Stow, J. L., Murray, R. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VAMP3+regulates+podosome+organisation+in+macrophages+and+together+with+Stx4/SNAP23+mediates+adhesion,+cell+spreading+and+persistent+migration.">VAMP3 regulates podosome organisation in macrophages and together with Stx4/SNAP23 mediates adhesion, cell spreading and persistent migration.</a> Exp Cell Res. 317 (13), 1817-1829 (2011).</li><li>G&#243;mez-Jaramillo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syntaxin-4+is+implicated+in+the+secretion+of+antibodies+by+human+plasma+cells.">Syntaxin-4 is implicated in the secretion of antibodies by human plasma cells.</a> J Leukoc Biol. 95 (2), 305-312 (2014).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu iletişim kuralı FRET-FLIM görselleştirme SNARE sözdiziminin 4 ve VAMP3 canlı HeLa hücreleri arasında bir köprü işlevi için kullanımı gösterilmiştir. Sözdiziminin 4 ağırlıklı olarak nerede ekzositozu1,2,20,21aracılık eder plazma zarı bulma Qa-tuzak bir proteindir. VAMP3 esas olarak endosomal bölmeleri geri dönüştürme bulmak için açıklanan ve diğer endosomes de plazma zarı1,2,20olarak kaçakçılığı aracılık eder R bir tuzak var. Ancak, FRET-FLIM tahlil diğer SNARE proteinler eğitimi için kolayca adapte edilebilir. Bu tuzaklarına hangi çoğu SNARE proteinler tarafından uzak1,2için geçerli bir C-terminal transmembran heliks içeren tek durumdur. Ayrıca, burada açıklanan protokol SNARE kompleksleri bitki ve Maya da dahil olmak üzere herhangi bir ökaryotik hücre tipinde görselleştirme için adapte edilebilir. Bu protokol için donör fluorophore floresan ömrünü kısalma perde ölçüsü olarak kullanılan. Tamamlayıcı bir yaklaşım olarak alıcısı fluorophore ömrünü muayene, kesin kanıt bu rezonans enerji transferi sağlayan duyarlilasmis emisyon belirgin artış faz nedeniyle oluşur.
Şu anda, FRET-FLIM tekniği lizozomal bölmeleri SNARE kompleksleri görselleştirmek mümkün olmayabilir. Sözdiziminin 3-mCitrine-mCherry tandem inşa etmek için mCherry floresan kez mCitrine sinyal içinde cep daha bol ise büyük olasılıkla lizozomal bölmeleri için karşılık gelen bir juxtanuclear alanı, daha fazla birikmiş bulunabilir çevre5. Aynı SNARE protein flüoresan bu proteinler erimiş co ifade5yaşındayken mCitrine için karşılaştırıldığında mCherry benzer bir juxtanuclear birikimi gözlenmiştir. Organellerin karakterize tarafından son derece düşük bir pH (&#60; 4) ve proteolitik enzim yüksek bir etkinlik. MCherry juxtanuclear birikimi büyük olasılıkla mCherry fluorophore mCitrine fluorophore göre lizozomal bozulması için daha yüksek bir direnç nedeniyle oluşur. MCherry juxtanuclear birikimi de hücreleri5fiksasyonu gerçekleştiği sırada için pH-Şoklama nedeniyle mCitrine, biri değil. Bu nedenle, FRET-FLIM tekniği FRET juxtanuclear (lizozomal) bölgelerde miktarı hafife ve bu organellerin sert şartları Lümen içinde hayatta diğer floresan muhabir proteinler gerektirir.
FRET-FLIM ilke (yarı-) kantitatif tahmin karmaşık5tuzaklarına fraksiyonunun elde etmek için izin verir. Bu protokol için açıklandığı gibi bu gerektirir Floresans ömür boyu histogramlar (Denklem 2), çift üstel çürüme işlevleriyle uygun hızlı bileşeni genliği tuzaklarına kısmını orantılı nerede karmaşık () içinde Denklem 3). Ancak, böyle uygun bir iki model ile teknik olarak zordur. Montaj birden fazla ücretsiz uygun parametreleri (iki floresan hayat ve iki genlikleri) ile çok sayıda fotonlar, özellikle parametreleri birbirlerini etkiler ve ömür boyu küçük hataları genlikleri ve Yardımcısı etkiler gerektirir çok yönlü. Bu uydurma sorunların üstesinden gelmek için Floresans yaşam süreleri yavaş bileşeninin donör tek şart (Yani, hiçbir FRET; sadece mCitrine mevcut) ömür boyu sabit olabilir ve bu tandem ömrünü hızlı bileşenine () inşa maksimal expectable perde). Floresans yaşam süreleri bu denetim durumları ile aynı olmayabilir ve birden çok nedenlerle (kendi kendine Şoklama, dipol yönlendirme, microenvironment değişimler) sapma çünkü ancak, bu aynı zamanda bakım ile yorumlanmalıdır. Yakın bir konumda birden fazla tuzak kompleksleri (&#60; 10 nm) mesafe bağımlı perde, perde "moleküler cetvel" kullanılmak üzere izin verir aynı ilke sonuç ama bu durumda, gizlemektedir SNARE kompleksleri miktar. Çünkü etiketli tuzaklarına endojen (etiketsiz) tuzaklarına ile rekabet Ayrıca, nicel bir tahmin her zaman anlamlı değildir. Sonuç olarak, ifade mCherry etiketli SNARE yüzdesinin FRET5temel belirleyici düzeydir. Bu uyarılar yüzünden bu mono üstel çürüme fonksiyonu (Denklem 1) ile floresan ömür boyu histogramlar sığdırmak için tavsiye edilir. Bu yaşam bir temanın herhangi bir bilgi gerektirmez ve elde edilen belirgin ortalama floresan ömür boyu sağlam bir ölçü için tuzak kompleks5sağlar avantajı vardır.
Yine de, bu iki bileşenli uygun modelleri tarafından nicel FRET-FLIM görüntüleme güçlü gelecekteki uygulamalar olacaktır bekleniyor. TUZAK-encoding genlerin kromozom içinde floresan muhabir proteinler ile örneğin CRISPR/CAS9 tarafından erimiş. Bu endojen protein düzeyleri ve etiketsiz tuzaklarına, hiçbir arka plan ile endojen SNARE proteinlerin floresan etiketleme içinde neden olur ve böylece SNARE kompleksleri tarafından FRET-FLIM fraksiyonunun anlamlı bir nicel tahmini için sağlar. Endojen tuzaklarına ifade düzeyleri oldukça düşük olabilir ve vermek floresan sinyallerini nispeten düşük, bu fotonlar yeterli sayıda, özellikle tüm cep telefonu için (ki sadece birkaç 1.000 s fotonlar, gerektirir) FLIM elde edilebilir olduğunu bekleniyor. Ayrıca, bu perde-FLIM ölçümler de daha yüksek floresan sinyallerini ve daha iyi foton istatistikleri neden olur daha duyarlı çığ fotodiyot dedektörleri ile gerçekleştirilebilir.

Membran kaçakçılığı nerede membran veziküller kapalı bir donör organel bud ve sonra taşımak ve bir hedef organel1,2ile sigorta ökaryotik hücrelerin merkezi bir özelliktir. Mitokondri hariç, tüm bu membran füzyon adımları SNARE proteini aile1,2üyeleri tarafından katalize. Memeli hücrelerinde yaklaşık 36 üye ve Maya2yaklaşık 20 üye SNARE proteini aile oluşur. TUZAK proteinler SNARE-motifler denilen bir veya iki ~ 52 artıkları-uzun, yerel olarak yapılandırılmamış bölgeler, içerir. TUZAK proteinler kez bir C-terminal transmembran heliks1,2tarafından membranlar için gergin. Tuzaklarına katkıda bulundukları karmaşık tuzak arginin (R) ve glutamin (Q) tuzaklarına1,2olarak Merkezi artıkları göre sınıflandırılabilir. Membran füzyon birlikte 4 SNARE-motifler katkıda bulunmak ve üzerinde donör ve alıcısı membran1,2dağıtılan 3 ya da 4 soydaş tuzaklarına etkileşim tarafından tahrik edilmektedir. Bir tuzak kompleks bir R-tuzak motif ve üç Q-tuzak motifleri (kalite güvence, oyun kurucu ve Qc olarak adlandırılan) oluşur. Karmaşık oluşumu başlar SNARE-motifler, sözde transşekillendirme termini N-tuzak-karmaşık ve CISdenilen bir sıkı α-Helisel dolandı-bobin paket oluşturan C termini doğru gelirleri-tuzak-karmaşık. Hatta tek bir tuzak karmaşık karmaşık oluşumu donör ve alıcısı membranlar birlikte sürükler ve membran fusion3için enerji bariyeri üstesinden gelir.
Hücrelerin içindeki belirli ulaşım yolları ayrı SNARE kompleksleri atama kez teknik olarak zordur. Tuzaklarına açıkça kaçakçılığı membran özgüllük katkıda rağmen önüne gelenle yatıp kalkan, işlevsel olarak gereksiz olduğu ve bunların işlevlerini1,2örtüşmesi. Bu nedenle, pertürbasyon deneyler tuzaklarına, gibi hedefleyerek gen nakavt, RNA müdahale, tanıtım antikorlar engelleme ya da baskın negatif hareket çözünür SNARE parçaları ile sık sık diğer açık fenotipleri neden değil Tuzaklarına telafi etmek2,4. Ayrıca, tuzaklarına birden çok taşıma yolları2' dahil belirli membran füzyon adımları ters yönde kaçakçılığı olaylardan ayırt etmek zordur. Tuzaklarına yerelleştirme çalışmalarının mikroskobu yaklaşımlarla, immunolabeling veya floresan muhabir proteinler, genetik fusion kullanarak sorunları muzdarip bu: (i) tuzaklarına bulmak için birden fazla organelleri kez birden çok kaçakçılığı adımları ve (ii) arabuluculuk gibi onların yerelleştirmeler otomatik olarak işlevsel olarak tuzak karmaşık oluşumunda nişanlandıklarını anlamına gelmez. Son olarak, tuzak kompleksleri tuzaklarına birini kullanarak yem ve diğer tuzaklarına hedef olarak immunoprecipitation deneyler kullanılarak belirlenebilir ama bu özel organelleri veya ticaret yolları bu komplekslerin atama izin vermez. Böylece, şu anda, tuzak kompleksleri ile organellar kararlılık görselleştirmek için alternatif hiçbir tekniği yoktur. Ayirt SNARE etkileşimleri kanıtlamak mümkün değil ama sadece varlığı ya da yokluğu co yerelleştirme gösterebilir, immunoprecipitation sadece gösterebilir iken SNARE etkileşimler tüm hücre nüfus ama organelleri atamak değil nerede bunlar etkileşimler meydana gelir.
Bu sınırlamayı aşmak için tuzak kompleksleri organellar çözünürlük ile canlı hücrelerdeki nicel görselleştirme için izin veren bir roman yöntemi son zamanlarda Verboogen ve ark. tarafından geliştirildi 5 bu yöntemi C-ölümcül onların transmembran sarmal erimiş hayalice değiştirdi floresan proteinler ile tuzaklarına çiftlerini ifade üzerinde temel alır. Membran fusion ve CISoluşumu tamamlanmasından sonra-karmaşık tuzak, bu fluorophores C-termini transmembran sarmal, hemen birbirine bitişik. Fluorophores sonra iyi Förster mesafesindedir (genellikle &#60; 5 nm), sonuçlanan FRET yeşil kaymıştır donör fluorophore gelen kırmızı kaymıştır alıcısı fluorophore5,6. Donör fluorophore ve donör ve alıcısı emisyon (ratiometric perde) oranları ölçülebilir alıcısı fluorophore artan bir emisyon Şoklama sonuçlarındaki FRET. Ancak, ratiometric iki farklı molekül arasında perde, Floresans donör ve alıcısı tuzaklarına farklı organelleri ve hücreleri7,8arasında çapraz-hadis ve farklı düzeylerde nedeniyle meydan okuyor. PERDE uyarma ve bir foton emisyon arasındaki zamanı Floresans Lifetime ölçülebilir. Donör fluorophore enerjisini tarafından serbest bırakabilirsiniz Eğer FRET, belirgin bir kısalma Floresans ömür boyu rakip bu işlem sonucu. Bu FLIM7,8tarafından ölçülebilir. Ömür boyu perde perde ratiometric çok daha sağlam Floresans ömür boyu bir fluorophore, içsel bir özelliktir ve onun konsantrasyon için büyük küçük harf duyarlı olarak iki farklı molekül, arasındaki etkileşimler ölçmek için. Ayrıca, FRET yaklaşım nicel, çünkü FRET verimliliğini donör ve alıcısı fluorophores (aslında bir basamak fonksiyonu) arasındaki mesafe altıncı gücüne ters orantılıdır. Bu nedenle, bir çift bileşenli çürüme modeli ile FLIM tarafından kaydedilen Floresans ömür boyu histogramlar yaklaştırarak, FRET-FLIM (yarı-) kantitatif tahmini SNARE karmaşık oluşumu5' te nişanlı SNARE moleküllerin fraksiyonunun için sağlar.
Son zamanlarda, bu perde-FLIM yöntemi Verboogen vd tarafından kullanıldı SNARE karmaşık oluşumu birincil dendritik hücreler bağışıklık sistemi5görselleştirmek için. Bu patojen bir uyarıcı gelince, dendritik hücreler kendi membran ile özellikle, Qa-tuzak sözdiziminin 4 R-tuzak vezikül ilişkili membran proteini (VAMPİR) 3 artan bir kompleks eşliğinde ticareti yeniden yönlendirme olduğunu gösterildi Plazma zarı. Bu artan SNARE karmaşık oluşumu büyük olasılıkla İnterlökin-65gibi inflamatuar sitokinlerin salgılanmasını artmış salgı kapasitesini karşılamak için gereklidir. Bu iletişim kuralı SNARE kompleksleri görselleştirme ve (yarı-) kantitatif ölçüm için FRET-FLIM veri edinimi için deneysel adımları açıklar.Bu nasıl için bütün hücreli Floresans ömür boyu histogramlar SNARE etkileşimlerine belirgin Floresans ömür boyu nicel bir tahmin olarak sonuçlanan mono ve BI üstel çürüme işlevleriyle uygun açıklanmıştır. Bu iletişim kuralı, yaygın olarak kullanılan HeLa hücre örnek olarak kullanılır, ancak yöntem SNARE kompleksleri diğer ökaryotik hücrelerde çalışma için kolayca genişletilebilir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Plasmid DNA &#39;syntaxin 4-mCitrine&#39;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>ID 92422</td>
			<td>Other SNAREs with fluorescent proteins fused to their C-terminal transmembrane helices can also be used. Instead of mCitrine-mCherry, other donor-acceptor pairs of spectrally separated fluorophores can also be used (e.g., CFP-YFP).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid DNA &#39;VAMP3-mCherry&#39;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>ID 92423</td>
			<td>Other SNAREs with fluorescent proteins fused to their C-terminal transmembrane helices can also be used. Instead of mCitrine-mCherry, other donor-acceptor pairs of spectrally separated fluorophores can also be used (e.g., CFP-YFP).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasmid DNA &#39;syntaxin 3-mCitrine-mCherry&#39;</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>ID 92426</td>
			<td>Positive control for maximum achievable FRET.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hela cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mm glass bottom dishes&#160;</td>
			<td>Willco Wells</td>
			<td>HBST-3522</td>
			<td>Other live cell imaging chambers will work as a substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>31966-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal calf serum</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>758093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-antimycotic solution</td>
			<td>Gibco, Life Technologies</td>
			<td>15240-062</td>
			<td>Pen/Strep will work as a substitute</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live cell imaging medium</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>A14291DJ</td>
			<td>Any other live cell imaging solution will work, as long as fluorescence from the medium is prevented</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica SP8 confocal microscope with a 63x 1.20 NA water immersion objective</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP8</td>
			<td>Other confocal microscopes capable of time-domain FLIM can also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pulsed white light laser</td>
			<td>Leica</td>
			<td>SP8</td>
			<td>Other pulsed laser sources can also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Time-Correlated Single Photon Counting (TCSPC) system</td>
			<td>PicoQuant</td>
			<td>PicoHarp 300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PT32ICS conversion software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Available at the &#39;Software&#39;-section of www.membranetrafficking.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>data analysis software programme capable of deconvolution</td>
			<td>Originlabs</td>
			<td>OriginPro 2016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji ImageJ</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Custom-made Fiji ImageJ macro for convolution of FLIM image with Intensity</td>
			<td>Fiji ImageJ</td>
			<td></td>
			<td>Available at the &#39;Software&#39;-section of www.membranetrafficking.com</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B&#252;rker Haemocytometer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>630-1541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC&#160;CCL-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>B Braun Melsungen&#160; AG</td>
			<td>362 3140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA 2 mM</td>
			<td>Merck</td>
			<td>108417</td>
			<td>CAS: 60-00-4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL tubes</td>
			<td>Greiner Bio-one</td>
			<td>188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>93595</td>
			<td>CAS: 72-57-1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEON cell electroporation device</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>MPK5000S</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualizing intracellular snare trafficking by fluorescence lifetime imaging microscopy

Ökaryotik hücrelerde membran füzyon katalizler çözünür N- ethylmaleimide hassas füzyon proteini (NSF) ek protein reseptörü (tuzak) proteinler membran kaçakçılığı için anahtar şunlardır. SNARE proteini aile 36 farklı üyeleri için oluşur. Belirli hücre içi ulaşım yolları böylece özgüllük katkıda 3 ya da 4 SNARE proteinler belirli kümelerini ve membran ticareti sadakat tarafından katalize. Çünkü tuzaklarına birden fazla olması ve işlevleri üst üste çoğu tuzaklarına ile son derece bol ve işlevsel olarak gereksiz, ancak, tuzak proteinlerin hassas işlev eğitim teknik olarak, meydan okuyor. Bu protokol için görselleştirme canlı hücrelerdeki SNARE karmaşık oluşumu için yeni bir yöntem açıklanır. Bu yöntem SNARE protein C-ölümcül floresan proteinler için erimiş ifade üzerinde temel alır ve onların etkileşim Förster rezonans enerji tarafından ölçme transfer (FRET) istihdam Floresans ömür mikroskobu (FLIM) görüntüleme. Floresans ömür boyu histogramlar özellikli bir uygulamasının çürüme yaklaştırarak, FRET-FLIM farklı veziküller (yarı-) kantitatif tahmini SNARE karmaşık oluşumu kısmını sağlar. Bu iletişim kuralı SNARE karmaşık oluşumu plazma zarı ve endosomal bölmeleri memeli hücre satırları ve birincil bağışıklık hücreleri görselleştirmek için başarıyla uygulandı ve SNARE işlevler diğer organelleri, çalışmaya kolayca genişletilebilir Hayvan, bitki ve mantar hücreleri.

SNARE etkileşimler tarafından FRET-FLIM ölçmek için tahlil mantığı şekil 1' de gösterilen. C-termini soydaş SNARE proteinlerin transmembran sarmal hayalice değiştirdi floresan proteinler (örneğin, mCitrine ve mCherry) bir çift için erimiş. CISoluşumu-hemen birbirine bitişik olmak floresan bu proteinler membran füzyon sonuçlarında üzerine karmaşık tuzak ve YIPRATMAK. Şekil 2 SNARE proteinler fluorescently etiketli ifade HeLa hücreleri temsilcisi confocal görüntüleri gösterir. Bir hücre (alıcısı fluorophore), VAMP3-mCherry ile ifade sözdiziminin 4-mCitrine (donör fluorophore) yanı sıra denetim koşulları sadece sözdiziminin 4-mCitrine yapý (donör sadece; hiçbir perde) ve her iki mCitrine için erimiş sözdiziminin 3 ifade hücre gösterilen ve tandem (maksimal expectable perde) mCherry. Şekil 3 eşlik eden floresan ömür boyu ve ömür boyu histogramlar mono üstel çürüme fonksiyonları (şekil 3A-B) ve BI üstel çürüme işlevleri () ile her pikselin yaklaştırarak oluşturulan FLIM görüntüler gösterir Şekil 3 c - D). şekil 4A bir mikroskop cam arka saçılma tarafından ölçülen bizim ayarlarına IRF gösterir. Şekil 4B-E, temsilcisi Floresans ömür boyu histogramlar tüm cep telefonu ile birlikte uyum eşlik eden FLIM analiz, mono-üstel çürüme işlevleri için eğrileri gösterilmektedir. Şekil 4F bir önde gelen yansıma zirveye çıkan mikroskop kapak cam yüzeye çok yakın yansıma bir deney floresan ömür boyu histogramını gösterir. Şekil 4 g ile BI üstel çürüme işlev sığdırmak temsilcisi ile ömür boyu histogramını gösterir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56745/56745fig1.jpg"> 
Şekil 1: tuzak kompleksleri perde tarafından görüntülenmesi için mantığı düzeninin. (A)yapısal model nöronal tuzaklarına (protein veritabanı 3HD717) vezikül ilişkili membran proteini (VAMPİR) 2 (mavi; R), sözdiziminin 1 (kırmızı; Qa-SNARE) ve SNAP25 (yeşil; her iki bir oyun kurucu ve Qc SNARE motif içerir). C-terminus transmembran heliks sözdiziminin-1, mCitrine (donör fluorophore; protein veritabanı 3DQ118) Birleşik. C-terminus VAMP2 transmembran heliks, mCherry (alıcısı fluorophore; protein veritabanı 2H5Q19) Birleşik. (B) düzeni SNARE perde içinde sonucu membran füzyon aracılık. Membran füzyon oluşumu bir CIStarafından sonra-tuzak karmaşık, tuzaklarına hemen perde içinde kaynaklanan birbirine bitişik. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56745/56745fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56745/56745fig2.jpg"> 
Şekil 2: ifade SNARE proteinlerin erimiş floresan proteinler için. İlk sütun: donör fluorophore, 516 heyecanlı nm. İkinci sütun: alıcısı fluorophore, 610 heyecanlı nm. (A)donör sadece durumu. Bir HeLa hücre ifade sözdiziminin 4-mCitrine (donör fluorophore; yeşil birleştirmede) temsilcisi confocal görüntüsü. Alıcısı kanal (ikinci sütun) floresan çapraz-talk gösterir. (B) negatif kontrol (FRET). Her iki sözdiziminin 4-mCitrine VAMP3-mCherry (alıcısı fluorophore; kırmızı mektup birleştirme işleminde) ile ifade bir HeLa hücre temsilcisi confocal görüntüsü. (C) pozitif kontrolü (maksimal expectable perde). Bir HeLa hücre ifade sözdiziminin 3-mCitrine-mCherry tandem temsilcisi confocal görüntüsünü oluşturun. MCitrine ve mCherry Floresans sinyalinin değil tamamen örtüşme, mCitrine mCherry için karşılaştırıldığında lizozomal bozulması için daha düşük bir direnç nedeniyle büyük olasılıkla sinyalleri Not (tartışma bölümüne bakın). BF: parlak alan. Ölçek çubukları, 20 µm. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56745/56745fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56745/56745fig3.jpg"> 
Şekil 3: FLIM görüntüleri SNARE karmaşık oluşumu. (A)temsilcisi Floresans ömür boyu görüntüleri Şekil 2' de gösterilen hücre. Görüntüleri bir TCSPC sistemi (.pt3) tarafından kaydedilen foton izlemeler dönüştürerek PT32ICS yazılımını kullanarak görüntü sitometresi için standart (.ics) oluşturuldu. Tek piksel görüntüleri daha sonra TRI2 yazılım12,13 eşik 15-%100 yoğunluğu, 7 piksel dairesel binning ve monoexponential uygun algoritması (başta) ile kullanarak oluşturulan Floresans ömür boyu donatılmış. Rengi ortalama belirgin floresan ömür boyu gösterir. (B) FLIM görüntüleri nerede Floresans ömür boyu görüntüleri (gösterildiği Masası A) ( Şekil 2' de gösterilen) mCitrine donör fluorophore floresan yoğunluklarda ile kıvrık. Evrişim FIJI özel yapım bir makro kullanarak ImageJ ile gerçekleştirildi ( Tablo malzemelerigörmek). (C) floresan ömür boyu ve sözdiziminin 4-mCitrine ve VAMP3-mCherry A-B panelleri, ama şimdi BI üstel çürüme eğrileri ile uygun ile ifade HeLa hücre FLIM görüntüleri (bkz: ömürleriyle denetim koşulları için; sabit 4,4 inç adım iletişim kuralı). Tahmini kesirler F sözdiziminin 4 kompleks içinde VAMP3 ile piksel rengi belirtir (Denklem 3). (D) aynı panel B olarak ama BI üstel için uygun. Evrişim FIJI özel yapım bir makro kullanarak ImageJ ile gerçekleştirildi ( Tablo malzemelerigörmek). <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56745/56745fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56745/56745fig4.jpg"> 
Şekil 4: tüm cep telefonu FLIM analiz. (A) kurulum aracı yanıt fonksiyonu (IRF). IRF geri saçılma (su içeren bir temiz cam mikroskobu yemek kullanarak) cam-su arabirimi kullanılarak ölçüldü.(B-E) Bütün ömür boyu histogramlar Şekil 2 ve şekil 3' te gösterilen hücrelerin hücre. Tüm fotonlar görüntüleri mevcut havuzlu. Eğrileri ile IRF deconvoluted ve mono-üstel çürüme fonksiyonları (Denklem 1) ile donatılmış. Bu hücreler için 2,82 Floresans yaşam süreleri elde edilmiştir ns (ifade tek sözdiziminin 4-mCitrine; sadece donör; panel B hücreleri), 2.09 ns (sözdiziminin 4-mCitrine VAMP3-mCherry ile birlikte ifade hücreleri; Masası C) ve 2.08 ns (hücreleri ifade sözdiziminin 3 - mCitrine-mCherry tandem oluşturmak; maksimal expectable perde kontrolü; Panel D). Dişlerin ama şimdi y ekseni logaritmik ölçekleme ile aynı grafikler gösterirken. Panel E bir bindirme panelleri B-d çürüme eğrilerinin gösterir Bir floresan ömür boyu çubuk grafik örneği (F) mikroskop kapak notu yüzeye çok yakın kaydetti. Bir büyük yansıma tepe (sarı gölgeli alan tarafından tasvir) sonuçlanır. (G) şimdi ile yaşam süreleriyle BI üstel çürüme eğri uydurma ama C, panel gibi (bkz. Adım 4.4 protokolündeki) denetim koşulların sabit. Hızlı (A1) ve yavaş (A2) bileşenlerinin genlikleri 14.42 ve 0,01, sırasıyla, tuzaklarına karmaşık F 0,99 (Denklem 3) tahmini bir kısmını sonuçlanan idi. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56745/56745fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
Ek dosya 1. İşlevi dosya FLIM_convoluted_IRF <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56745/FLIM_convoluted_IRF.FDF">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>
Ek dosyası 2. İşlevi dosya FLIM_convoluted_IRF_biexp <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56745/FLIM_convoluted_IRF_biexp.FDF">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Visualizing Intracellular SNARE Trafficking by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy at JoVE.com

Visualizing Intracellular SNARE Trafficking by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Bu protokol bırakmak Förster rezonans enerji transferi ve floresan mikroskopi Imaging ömür boyu göre SNARE proteinlerin karmaşık oluşumu nicel görselleştirme için yeni bir yöntem açıklanır.

Hücre içi SNARE mikroskobu Imaging Floresans ömür tarafından kaçakçılığı görüntülenmesi

Soluble N-ethylmaleimide sensitive fusion protein (NSF) attachment protein receptor (SNARE) proteins are key for membrane trafficking, as they catalyze ...

visualizing-intracellular-snare-trafficking-fluorescence-lifetime

Nanyang Technological University

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Anatomy and Physiology

Immunology and Infection

Unit 1

Cell Membrane Structure and Functions

SCIENTISTS IN ACTION

9.4K Görüntüleme.  Radboud University Medical Center. Bu protokol bırakmak Förster rezonans enerji transferi ve floresan mikroskopi Imaging ömür boyu göre SNARE proteinlerin karmaşık oluşumu nicel görselleştirme için yeni bir yöntem açıklanır.

Video: Visualizing Intracellular SNARE Trafficking by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy

Visualisation and Quantification of Intracellular Interactions of Neisseria meningitidis and Human &alpha;-actinin by Confocal Imaging

The Opc protein of Neisseria meningitidis (Nm, meningococcus) is a surface-expressed integral outer membrane protein, which can act as an adhesin and an effective invasin for human epithelial and endothelial cells. We have identified endothelial surface-located integrins as major receptors for Opc, a process which requires Opc to first bind to integrin ligands such as vitronectin and via these to the cell-expressed receptors1. This process leads to bacterial invasion of endothelial cells2. More recently, we observed an interaction of Opc with a 100kDa protein found in whole cell lysates of human cells3. We initially observed this interaction when host cell proteins separated by electrophoresis and blotted on to nitrocellulose were overlaid with Opc-expressing Nm. The interaction was direct and did not involve intermediate molecules. By mass spectrometry, we established the identity of the protein as &alpha;-actinin. As no surface expressed &alpha;-actinin was found on any of the eight cell lines examined, and as Opc interactions with endothelial cells in the presence of serum lead to bacterial entry into the target cells, we examined the possibility of the two proteins interacting intracellularly. For this, cultured human brain microvascular endothelial cells (HBMECs) were infected with Opc-expressing Nm for extended periods and the locations of internalised bacteria and &alpha;-actinin were examined by confocal microscopy. We observed time-dependent increase in colocalisation of Nm with the cytoskeletal protein, which was considerable after an eight hour period of bacterial internalisation. In addition, the use of quantitative imaging software enabled us to obtain a relative measure of the colocalisation of Nm with &alpha;-actinin and other cytoskeletal proteins. Here we present a protocol for visualisation and quantification of the colocalisation of the bacterium with intracellular proteins after bacterial entry into human endothelial cells, although the procedure is also applicable to human epithelial cells.

Visualisation and Quantification of Intracellular Interactions of Neisseria meningitidis and Human &#945;-actinin by Confocal Imaging

Neisseria meningitidis (Nm), a gram negative human-specific respiratory pathogen, can bind to human &alpha;-actinin. Here we present a protocol for visualisation of colocalisation of the bacterium with intracellular &alpha;-actinin after bacterial entry into human brain microvascular endothelial cells (HBMECs).

Görselleştirme ve Miktar hücre içi Etkileşimleri Neisseria meningitidis</emKonfokal Görüntüleme α-aktinin> ve İnsan

The Opc protein of Neisseria meningitidis (Nm, meningococcus) is a surface-expressed integral outer membrane protein, which can act as an adhesin and an ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Microwave Assisted Rapid Diagnosis of Plant Virus Diseases by Transmission Electron Microscopy

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample preparation for transmission electron microscopy (TEM) such investigations can take several days1,2 and are therefore not suited for a rapid diagnosis of plant virus diseases. Microwave fixation can be used to drastically reduce sample preparation time for TEM investigations with similar ultrastructural results as observed after conventionally sample preparation3-5. Many different custom made microwave devices are currently available which can be used for the successful fixation and embedding of biological samples for TEM investigations5-8. In this study we demonstrate on Tobacco Mosaic Virus (TMV) infected Nicotiana tabacum plants that it is possible to diagnose ultrastructural alterations in leaves in about half a day by using microwave assisted sample preparation for TEM. We have chosen to perform this study with a commercially available microwave device as it performs sample preparation almost fully automatically5 in contrast to the other available devices where many steps still have to be performed manually6-8 and are therefore more time and labor consuming. As sample preparation is performed fully automatically negative staining of viral particles in the sap of the remaining TMV-infected leaves and the following examination of ultrastructure and size can be performed during fixation and embedding.

This study describes a method that allows the rapid and clear diagnosis of plant virus diseases in about half a day by using a combination of microwave assisted plant sample preparation for transmission electron microscopy and negative staining methods.

Mikrodalga Transmisyon Elektron Mikroskobu ile Bitki Virüs Hastalıkları Hızlı Tanı Destekli

Investigations of ultrastructural changes induced by viruses are often necessary to clearly identify viral diseases in plants. With conventional sample ...

Single Cell Measurements of Vacuolar Rupture Caused by Intracellular Pathogens

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed compartment allows bacteria to move within the cytosol, proliferate and further invade neighboring cells. Mycobacterium tuberculosis is phagocytosed by immune cells, and has recently been shown to rupture phagosomal membrane in macrophages. We developed a robust assay for tracking phagosomal membrane disruption after host cell entry of Shigella flexneri or Mycobacterium tuberculosis. The approach makes use of CCF4, a FRET reporter sensitive to &beta;-lactamase that equilibrates in the cytosol of host cells. Upon invasion of host cells by bacterial pathogens, the probe remains intact as long as the bacteria reside in membrane-enclosed compartments. After disruption of the vacuole, &beta;-lactamase activity on the surface of the intracellular pathogen cleaves CCF4 instantly leading to a loss of FRET signal and switching its emission spectrum. This robust ratiometric assay yields accurate information about the timing of vacuolar rupture induced by the invading bacteria, and it can be coupled to automated microscopy and image processing by specialized algorithms for the detection of the emission signals of the FRET donor and acceptor. Further, it allows investigating the dynamics of vacuolar disruption elicited by intracellular bacteria in real time in single cells. Finally, it is perfectly suited for high-throughput analysis with a spatio-temporal resolution exceeding previous methods. Here, we provide the experimental details of exemplary protocols for the CCF4 vacuolar rupture assay on HeLa cells and THP-1 macrophages for time-lapse experiments or end points experiments using Shigella flexneri as well as multiple mycobacterial strains such as Mycobacterium marinum, Mycobacterium bovis, and Mycobacterium tuberculosis.

We describe a method for tracking the endomembrane rupture elicited by the intracellular bacteria Shigella flexneri and Mycobacterium tuberculosis upon host cell invasion. Our assay makes use of CCF4, a host cytoplasmic FRET probe in live or fixed cells. This reporter is degraded by an enzyme activity present on the bacterial surface.

Vakuolar Kopma Tek Hücre ölçümleri Hücre içi patojenlerin neden

Shigella flexneri are pathogenic bacteria that invade host cells entering into an endocytic vacuole. Subsequently, the rupture of this membrane-enclosed ...

Discovery of New Intracellular Pathogens by Amoebal Coculture and Amoebal Enrichment Approaches

Intracellular pathogens such as legionella, mycobacteria and Chlamydia-like organisms are difficult to isolate because they often grow poorly or not at all on selective media that are usually used to cultivate bacteria. For this reason, many of these pathogens were discovered only recently or following important outbreaks. These pathogens are often associated with amoebae, which serve as host-cell and allow the survival and growth of the bacteria. We intend here to provide a demonstration of two techniques that allow isolation and characterization of intracellular pathogens present in clinical or environmental samples: the amoebal coculture and the amoebal enrichment. Amoebal coculture allows recovery of intracellular bacteria by inoculating the investigated sample onto an amoebal lawn that can be infected and lysed by the intracellular bacteria present in the sample. Amoebal enrichment allows recovery of amoebae present in a clinical or environmental sample. This can lead to discovery of new amoebal species but also of new intracellular bacteria growing specifically in these amoebae. Together, these two techniques help to discover new intracellular bacteria able to grow in amoebae. Because of their ability to infect amoebae and resist phagocytosis, these intracellular bacteria might also escape phagocytosis by macrophages and thus, be pathogenic for higher eukaryotes.

Amoebal coculture is a cell culture system using adherent amoebae to selectively grow intracellular pathogens able to resist phagocytic cells such as amoebae and macrophages. It thus represents a key tool to discover new infectious agents. Amoebal enrichment allows discovery of new amoebal species and of their specific intracellular bacteria.

Amoebal kokültürü ve Amoebal Zenginleştirme Yaklaşımlar New hücre içi patojenlerin keşif

Intracellular pathogens such as legionella, mycobacteria and Chlamydia-like organisms are difficult to isolate because they often grow poorly or not at ...

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target cells. Inside the host cell the effector proteins manipulate cellular functions to the benefit of the bacteria. To better understand the control of type III secretion during host cell interaction, sensitive and accurate assays to measure translocation are required. We here describe the application of an assay based on the fusion of a Yersinia enterocolitica effector protein fragment (Yersinia outer protein; YopE) with TEM-1 beta-lactamase for quantitative analysis of translocation. The assay relies on cleavage of a cell permeant FRET dye (CCF4/AM) by translocated beta-lactamase fusion. After cleavage of the cephalosporin core of CCF4 by the beta-lactamase, FRET from coumarin to fluorescein is disrupted and excitation of the coumarin moiety leads to blue fluorescence emission. Different applications of this method have been described in the literature highlighting its versatility. The method allows for analysis of translocation in vitro and also in in vivo, e.g., in a mouse model. Detection of the fluorescence signals can be performed using plate readers, FACS analysis or fluorescence microscopy. In the setup described here, in vitro translocation of effector fusions into HeLa cells by different Yersinia mutants is monitored by laser scanning microscopy. Recording intracellular conversion of the FRET reporter by the beta-lactamase effector fusion in real-time provides robust quantitative results. We here show exemplary data, demonstrating increased translocation by a Y. enterocolitica YopE mutant compared to the wild type strain.

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Effector translocation into host cells via a type III secretion system is a common virulence strategy among gram-negative bacteria. A beta-lactamase effector fusion based assay for quantitative analysis of translocation was applied. In Yersinia infected cells, conversion of a FRET reporter by the beta-lactamase is monitored using laser scanning microscopy.

Analizi<em&gt; Yersinia enterocolitica</emAna Hücreleri içine&gt; Efektör Translokasyon Beta-laktamaz Effector Fusions kullanma

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...

Measuring Phagosome pH by Ratiometric Fluorescence Microscopy

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or neutralize the ingested material, or to present it as antigens and initiate adaptive immune responses. The pH of phagosomes is a critical parameter regulating fission or fusion with endomembranes and activation of proteolytic enzymes, events that allow the phagocytic vacuole to mature into a degradative organelle. In addition, translocation of H+ is required for the production of high levels of reactive oxygen species (ROS), which are essential for efficient killing and signaling to other host tissues. Many intracellular pathogens subvert phagocytic killing by limiting phagosomal acidification, highlighting the importance of pH in phagosome biology. Here we describe a ratiometric method for measuring phagosomal pH in neutrophils using fluorescein isothiocyanate (FITC)-labeled zymosan as phagocytic targets, and live-cell imaging. The assay is based on the fluorescence properties of FITC, which is quenched by acidic pH when excited at 490 nm but not when excited at 440 nm, allowing quantification of a pH-dependent ratio, rather than absolute fluorescence, of a single dye. A detailed protocol for performing in situ dye calibration and conversion of ratio to real pH values is also provided. Single-dye ratiometric methods are generally considered superior to single wavelength or dual-dye pseudo-ratiometric protocols, as they are less sensitive to perturbations such as bleaching, focus changes, laser variations, and uneven labeling, which distort the measured signal. This method can be easily modified to measure pH in other phagocytic cell types, and zymosan can be replaced by any other amine-containing particle, from inert beads to living microorganisms. Finally, this method can be adapted to make use of other fluorescent probes sensitive to different pH ranges or other phagosomal activities, making it a generalized protocol for the functional imaging of phagosomes.

Phagosomal pH influences phagosome maturation, oxidant production, phagosomal killing as well as antigen presentation. Here we describe a ratiometric method for measuring time-course and endpoint pH changes in individual phagosomes in living phagocytes using fluorescence microscopy.

Oranlı metrik Floresan Mikroskopi fagosom pH ölçümü

Phagocytosis is a fundamental process through which innate immune cells engulf bacteria, apoptotic cells or other foreign particles in order to kill or ...

Non-invasive In Vivo Fluorescence Optical Imaging of Inflammatory MMP Activity Using an Activatable Fluorescent Imaging Agent

This paper describes a non-invasive method for imaging matrix metalloproteinases (MMP)-activity by an activatable fluorescent probe, via in vivo fluorescence optical imaging (OI), in two different mouse models of inflammation: a rheumatoid arthritis (RA) and a contact hypersensitivity reaction (CHR) model. Light with a wavelength in the near infrared (NIR) window (650 - 950 nm) allows a deeper tissue penetration and minimal signal absorption compared to wavelengths below 650 nm. The major advantages using fluorescence OI is that it is cheap, fast and easy to implement in different animal models.
Activatable fluorescent probes are optically silent in their inactivated states, but become highly fluorescent when activated by a protease. Activated MMPs lead to tissue destruction and play an important role for disease progression in delayed-type hypersensitivity reactions (DTHRs) such as RA and CHR. Furthermore, MMPs are the key proteases for cartilage and bone degradation and are induced by macrophages, fibroblasts and chondrocytes in response to pro-inflammatory cytokines. Here we use a probe that is activated by the key MMPs like MMP-2, -3, -9 and -13 and describe an imaging protocol for near infrared fluorescence OI of MMP activity in RA and control mice 6 days after disease induction as well as in mice with acute (1x challenge) and chronic (5x challenge) CHR on the right ear compared to healthy ears.

Non-invasive In Vivo Fluorescence Optical Imaging of Inflammatory MMP Activity Using an Activatable Fluorescent Imaging Agent

This paper explains the application of fluorescent imaging using an activatable optical imaging probe to visualize the in vivo activity of key matrix metalloproteinases in two different experimental models of inflammation.

Non-invaziv<emIn vivo</em&gt; Aktive Edilebilir Floresan Görüntüleme Ajanını Kullanan İnflamatuvar MMP Aktivitesinin Flüoresan Optik Görüntülemesi

This paper describes a non-invasive method for imaging matrix metalloproteinases (MMP)-activity by an activatable fluorescent probe, via in vivo ...

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo Cell Trafficking by PET/CT

This protocol illustrates the production of 64Cu and the chelator conjugation/radiolabeling of a monoclonal antibody (mAb) followed by murine lymphocyte cell culture and 64Cu-antibody receptor targeting of the cells. In vitro evaluation of the radiolabel and non-invasive in vivo cell tracking in an animal model of an airway delayed-type hypersensitivity reaction (DTHR) by PET/CT are described.
In detail, the conjugation of a mAb with the chelator 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid (DOTA) is shown. Following the production of radioactive 64Cu, radiolabeling of the DOTA-conjugated mAb is described. Next, the expansion of chicken ovalbumin (cOVA)-specific CD4+ interferon (IFN)-&#947;-producing T helper cells (cOVA-TH1) and the subsequent radiolabeling of the cOVA-TH1 cells are depicted. Various in vitro techniques are presented to evaluate the effects of 64Cu-radiolabeling on the cells, such as the determination of cell viability by trypan blue exclusion, the staining for apoptosis with Annexin V for flow cytometry, and the assessment of functionality by IFN-&#947; enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Furthermore, the determination of the radioactive uptake into the cells and the labeling stability are described in detail. This protocol further describes how to perform cell tracking studies in an animal model for an airway DTHR and, therefore, the induction of cOVA-induced acute airway DHTR in BALB/c mice is included. Finally, a robust PET/CT workflow including image acquisition, reconstruction, and analysis is presented.
The 64Cu-antibody receptor targeting approach with subsequent receptor internalization provides high specificity and stability, reduced cellular toxicity, and low efflux rates compared to common PET-tracers for cell labeling, e.g.64Cu-pyruvaldehyde bis(N4-methylthiosemicarbazone) (64Cu-PTSM). Finally, our approach enables non-invasive in vivo cell tracking by PET/CT with an optimal signal-to-background ratio for 48 h. This experimental approach can be transferred to different animal models and cell types with membrane-bound receptors that are internalized.

Murine Lymphocyte Labeling by 64Cu-Antibody Receptor Targeting for In Vivo  Cell Trafficking by PET/CT

Following the preparation of a 64Cu-modified monoclonal antibody binding to a transgenic murine T cell receptor, T cells are radiolabeled in vivo, analyzed for viability, functionality, labeling stability and apoptosis, and adoptively transferred into mice with an airway delayed-type hypersensitivity reaction for non-invasive imaging by positron emission tomography/computed tomography (PET/CT).

tarafından Kemirgen Lenfosit Etiketleme<sup&gt; 64</sup&gt; Cu-Antikor Reseptör için hedefleme<em&gt; In Vivo</em&gt; PET / CT ile hücre Trafik

This protocol illustrates the production of 64Cu and the chelator conjugation/radiolabeling of a monoclonal antibody (mAb) followed by murine lymphocyte ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal microscopy methods to visualize macrophage extracellular traps (METs). These extracellular traps are defined by the presence of extracellular chromatin with co-expression of other components such as granule proteases, citrullinated histones, and peptidyl arginase deiminase (PAD). The expression of METs is generally measured after exposure to a stimulus and compared to un-stimulated samples. Samples are also included for background and isotype control. Cells are analyzed using well-defined image analysis software. Confocal microscopy may be used to define the presence of METs both in vitro and in vivo in lung tissue.

Macrophage extracellular traps are a newly described entity. This article will concentrate on confocal microscopy methods and how they are visualized in vitro and in vivo from lung samples.

Makrofaj hücre dışı tuzaklar Confocal mikroskobu kullanılarak görüntülenmesi

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

Integrate Imaging Flow Cytometry and Transcriptomic Profiling to Evaluate Altered Endocytic CD1d Trafficking

Populational analyses of the morphological and functional alteration of endocytic proteins are challenging due to the demand of image capture at a single cell level and statistical image analysis at a populational level. To overcome this difficulty, we used imaging flow cytometry and transcriptomic profiling (RNA-seq) to determine altered subcellular localization of the cluster of differentiation 1d protein (CD1d) associated with impaired endocytic gene expression in human dendritic cells (DCs), which were exposed to the common lipophilic air pollutant benzo[a]pyrene. The colocalization of CD1d and endocytic marker Lamp1 proteins from thousands of cell images captured with imaging flow cytometry was analyzed using IDEAS and ImageJ-Fiji programs. Numerous cellular images with co-stained CD1d and Lamp1 proteins were visualized after gating on CD1d+Lamp1+ DCs using IDEAS. The enhanced CD1d and Lamp1 colocalization upon BaP exposure was further demonstrated using thresholded scatterplots, tested with Mander&#39;s coefficients for co-localized intensity, and plotted based on the percentage of co-localized areas using ImageJ-Fiji. Our data provide an advantageous instrumental and bioinformatic approach to measure protein colocalization at both single and populational cellular levels, supporting an impaired functional outcome of transcriptomic alteration in pollutant-exposed human DCs.

Imaging flow cytometry provides an ideal approach to detect the morphological and functional alteration of cells at individual and populational levels. Disrupted endocytic function for lipid antigen presentation in pollutant-exposed human dendritic cells was demonstrated with a combined transcriptomic profiling of gene expression and morphological demonstration of protein trafficking.

Görüntüleme akış sitometresi ve değiştirilmiş endositik CD1d kaçakçılığı değerlendirmek için profil oluşturma Transcriptomic entegre

Populational analyses of the morphological and functional alteration of endocytic proteins are challenging due to the demand of image capture at a single ...