Bu eser Deutsche Forschungsgemeinschaft SFB688 (için A.G.) tarafından desteklenmiştir.

Fare üreme Regierung Unterfranken tarafından kabul edildi ve tüm analizler tüm Alman ve Avrupa Birliği yasalara ve yönetmeliklere bakım ve laboratuvar hayvanlarının kullanımı ile ilgili sıkı doğrultusunda gerçekleştirilmiştir.
1. Microtiter kaplama α4β1 Integrin ile Eski Utero Allantois Explant kültür için tabaklar
<ol><li>200 µg/mL steril fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS), fare α4β1 liyofilize integrin sulandırmak. Önceden ısıtılmış (37 ° C) PBS 10 µg/mL nihai bir konsantrasyon oranında seyreltin. Pipet 20 µL/kuyu kuyu microtiter plaka (1 allantois/de) gerekli sayıda seyreltilmiş α4β1 integrin çözümde. Not: microtiter plaka kuyu kaplama hava kabarcıklarının oluşumunu önlemek.</li>
	<li>37 ° C'de 60 dk microtiter plakaları bir oksijen doku kültürü kuluçka makinesine yerleştirerek kuluçkaya.</li>
	<li>Dikkatle süpernatant bir pipet ile Aspire edin. Pipet ucu iyi alt dokunmadan önlemek için plaka eğim ve yumuşak emici kullanın. İki kez Önceden ısıtılmış (37 ° C) kültür ortamının gibi Dulbecco'nın modifiye kartal orta (DMEM) 50 µL ekleyerek Wells yıkama ve çamaşır orta yumuşak emici tarafından kaldırın.</li>
	<li>Kritik adım: ücretsiz siteleri 50 µL/kuyu %0,1 (w/v) sığır serum albumin (BSA) ekleyerek bağlama blok / DMEM ve oksijen doku kültürü kuluçka makinesine microtiter plakaları yerleştirerek ≥ 37 ° C'de 30 dk için kuluçkaya. Not: Allantois explants varlığında serum çeşitli yüzeyler ekleyebilirsiniz. Bu nedenle non-spesifik bağlayıcı siteleri engellemek için şarttır, kaplama sonra kuyu integrin ile disseke allantois eklemeden önce serum içeren kültür explant orta (bkz. Adım 4.4).</li>
	<li>Kaplamalı wells adım 4.4 gerekinceye kadar 37 ° C'de engelleme çözümde tutun.</li>
</ol>2. rahim diseksiyon Dpc 8, hamile bir fareden
Not: ağırlık kazanç ayrımcılık15tarafından yanlış pozitif gebelik oranları azaltmak.
<ol><li>Fare tarafından servikal çıkığı kurban. Karın bölgesi kürkle % 70 (v/v) etanol ile püskürtülerek dezenfekte. Not: fareler işlerken eldiven. Ötenazi anestezi olmadan servikal çıkığı tarafından allantois eki ile girişime neden olabilir allantois kimyasal kirlenme engeller.</li>
	<li>Karın deri makasla orta hat küçük bir kesi yaparak dosyayı açtı. Cilt kesi altında ve üstünde tutmak için eldivenli parmak kullanmak ve cilt göğüs ve fare kuyruğu doğru ayır.</li>
	<li>Karın zarını Forseps ile kavramak. Diğer el ile yapmak bir V şeklinde kesi gelen ön arka doğru makas kullanarak ve karın boşluğu açıklamakla doku taşıyın. Forseps bağırsak rahim erişim kazanmak için bir kenara itmek için kullanırız.</li>
	<li>İki rahim korna bulun. Forseps ile serviks (Kaudal kesim) tutun ve ligament iyi makasla kesme. Sonra her iki rahim boynuzları makasla oviducts kesilmesinin tarafından bağlantısını kesin.</li>
	<li>Forseps oda sıcaklığında (RT) PBS içeren bir steril 10 cm çanak içine steril, rahim aktarmak için kullanın. Yağ dokusu, damarları ve sinirleri çevreleyen güzel forseps ve/veya makas (şekil 1A) ile rahim boynuzları kaldırın.</li>
</ol>3. embriyo diseksiyon
Not: bir 8:1 zum mesafesi ile donatılmış bir stereomicroscope altında aşağıdaki adımları gerçekleştirin.
<ol><li>Embriyo implantasyonu siteler arasında keserek makas ile ayırın. Kas rahim astarı rahim tomurcukları Forseps ile tutun ve decidua (şekil 1B) ortaya çıkarmak için ayrı çekin.</li>
	<li>Forseps kullanarak, rahim tomurcukları RT PBS steril, içeren yeni bir 10 cm tabak içine aktarın.</li>
	<li>Decidua embriyo çevresinde forseps ipuçları ile düzeltmek.</li>
	<li>Bir kesik decidua anti-mesometrial tarafında iyi forseps (şekil 1 c) ile yapmak ve decidua peel away Forseps ile embriyo (şekil 1 d) ortaya çıkarmak için. Not: Decidua mesometrial pole son derece skarların ve embriyo içerir ve solgun görünür en anti-mesometrial kısmı, onun temel geniş olabilir.</li>
	<li>Embriyo forseps (şekil 1E, F) ile incelemek.</li>
	<li>Bir mikro-kaşık kullanarak, steril PBS bir steril 3.5 cm tabak içinde yer alan bir damla içine embriyo transfer.</li>
	<li>PBS bir mikro-kaşık kullanarak aynı 3.5 cm tabak taze bir damla içine embriyo transfer ve embriyo forseps (şekil 1G, H) kullanarak sarısı sac dan incelemek.</li>
	<li>İsteğe bağlı olarak, (örneğin, Genotipleme Polimeraz zincir reaksiyonu tarafından için) gerekirse, sarısı sac steril tüpe bununla aspirating tarafından transfer ~ 5 µL PBS büyük delik 200 µL pipet ucu içine. -20 ° C'de mağaza Not: sarısı sac hazırlama kontamine anne doku (Yani, parietal sarısı Reichert'ın membran ve ectoplacental koni gibi sac) hatalı Genotipleme sonuçlara yol açabilir. Bu doku kaldırılması embriyo diseksiyon sarısı sac dan önce en kolay yoldur.</li>
</ol>4. allantois diseksiyon ve Eski Utero kültür immobilize α4β1 Integra üzerinde
<ol><li>Allantois iyi forseps (şekil 1 H) kullanarak embriyo posterior sonundaki Bazal ekleme sitesinden kesti.</li>
	<li>İsteğe bağlı olarak, gelişimsel evreleme gerekiyorsa, embriyo somite çift faz kontrast optik ve 5 × ve 10 × amacı ile donatılmış bir mikroskop kullanarak görsel denetim tarafından saymak. Not: Embriyo somite sayma kolaylaştırmak için Forseps ile uzatılabilir. Chorioallantoic eki ve füzyon E 8.0 ve E 9.0 arasında embriyo ≥ 6 somite çiftleri ile oluşur. Dönüm embriyo 6-8 somite çiftleri ile başlar.</li>
	<li>Pipet 40 µL/kuyu % 10 (v/v) fetal sığır serum, L-glutamine ve önceden kaplanmış microtiter plaka wells (bkz. Bölüm 1) gerekli sayıda antibiyotik ile takıma DMEM.</li>
	<li>Bununla aspirating tarafından kayan allantois toplamak ~ 5 µL PBS 200 µL pipet ucu büyük bir delik içine. 1 allantois/iyi transfer.</li>
	<li>Örneğiniçin bir oksijen doku kültürü kuluçka (37 ° C, % 5 CO2) microtiter tabak koyarak allantoides kuluçkaya 6, 12 ve 24 h. Allantois eki ile etkilenmemesi için microtiter plakaları bu zaman puan arasında hareket.</li>
	<li>Her zaman noktada allantois ek (örneğin, hiçbir eki/yüzer allantois kısmi veya tam olarak ekli allantois; tam yayılmış allantois) puan edinildi faz kontrast veya diferansiyel girişim kontrast optik ile donatılmış bir mikroskop kullanarak ve 5 × veya 10 × hedef (Şekil 2). Not: Taze izole ve tam olarak ekli allantoides temsilcisi örnekleri Şekil 2' de gösterilmiştir. Allantoides wildtype C57BL/6J fareler izole distal ucu rahim, verdiği 4-6 h (Bu adlandırılır allantois kısmi ek olarak) içinde ve tüm allantois tam eki içinde elde ~ kültür 12 h. Explant tarafından 18-24 h, basık ve dairesel bir şekil (tam olarak allantois yaymak için denir) ile bir CD31 pozitif vasküler pleksus9,16kabul.</li>
</ol>5. doğrulama Explanted Allantois endotel hücre işaretçisi CD31 için boyama
<ol><li>Tam yayılmış explants kültür orta Aspire edin ve hücreleri % 4 (w/v) paraformaldehyde/PBS 40 µL/kuyu ekleyerek düzeltmek. Not: Paraformaldehyde zehirlidir. Cilt ve göz teması önlemek için koruyucu gözlük ve eldiven giymek.</li>
	<li>RT, 10 min için kuluçkaya sonra süpernatant Aspire edin. PBS 40 µL/kuyu ekleyerek üç kez yıkama ve çamaşır orta yumuşak emici tarafından kaldırın.</li>
	<li>Hücreleri permeabilize ve non-spesifik bağlayıcı siteleri blok 40 µL/iyi % 0.1 (v/v) dik yıkama 30 dk için PBS içinde Triton X-100/0.1% (w/v) BSA/10% (v/v) normal keçi serum ekleyerek iki kez PBS 40 µL/kuyu ekleyerek ve çamaşır orta yumuşak emici tarafından kaldırın. Not: Protokol gecede bu noktada duraklatılmış.</li>
	<li>Hücreleri 20 µL/iyi birincil anti-CD31 antikorların 1:50 % 0,1 (w/v) BSA/PBS içinde seyreltilmiş ekleyerek gecede 4 ° C'de leke PBS 40 µL/kuyu ekleyerek üç kez yıkama ve çamaşır orta yumuşak emici tarafından kaldırın.</li>
	<li>İlişkili birincil antikorlar %0,1 (w/v) BSA/PBS RT. koru microtiter plakaları ışık alüminyum folyo sarma veya yerleştirerek, 1 h için bir karanlık oda içinde ikincil keçi fluorescently etiketli Anti-sıçan antikorlar seyreltilmiş 1: 200 20 µL/kuyu ekleyerek algılamak. PBS 40 µL/kuyu ekleyerek üç kez yıkama ve çamaşır orta yumuşak emici tarafından kaldırın.</li>
	<li>Hücreleri 20 µL/iyi montaj orta ekleyerek gömün. İçin kuluçkaya ~ 1 h montaj orta katılaşmış kadar RT olarak. Microtiter plakaları RT veya ışıktan korunan 4 ° C'de depolayın.</li>
	<li>Görüntü allantois vasküler pleksus 5 × veya 10 × objektif ve uygun floresan filtre ile donatılmış bir floresan mikroskop altında explants. Not: Tam yayılmış allantois CD31 pozitif vasküler pleksus temsilcisi görüntülerini şekil 3' te gösterilmektedir. Diğer işaretler için antikorlar gibi vasküler pleksus Flk-1 karşı Flt, yönetmen kravat-1 veya kravat-2 iyi16olarak kullanılabilir.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rossant, J., Cross, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Placental+development:+lessons+from+mouse+mutants.">Placental development: lessons from mouse mutants.</a> Nat Rev Genet. 2 (7), 538-548 (2001).</li><li>Segerer, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+essential+developmental+function+for+murine+phosphoglycolate+phosphatase+in+safeguarding+cell+proliferation.">An essential developmental function for murine phosphoglycolate phosphatase in safeguarding cell proliferation.</a> Sci Rep. 6, 35160 (2016).</li><li>Kane, S. V., Acquah, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Placental+transport+of+immunoglobulins:+a+clinical+review+for+gastroenterologists+who+prescribe+therapeutic+monoclonal+antibodies+to+women+during+conception+and+pregnancy.">Placental transport of immunoglobulins: a clinical review for gastroenterologists who prescribe therapeutic monoclonal antibodies to women during conception and pregnancy.</a> Am J Gastroenterol. 104 (1), 228-233 (2009).</li><li>Xu, X., Vugmeyster, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Challenges+and+opportunities+in+absorption,+distribution,+metabolism,+and+excretion+studies+of+therapeutic+biologics.">Challenges and opportunities in absorption, distribution, metabolism, and excretion studies of therapeutic biologics.</a> AAPS J. 14 (4), 781-791 (2012).</li><li>Wesolowski, S. R., Kasmi, K. C., Jonscher, K. R., Friedman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+origins+of+NAFLD:+a+womb+with+a+clue.">Developmental origins of NAFLD: a womb with a clue.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 14 (2), 81-96 (2017).</li><li>Racicot, K., Mor, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risks+associated+with+viral+infections+during+pregnancy.">Risks associated with viral infections during pregnancy.</a> J Clin Invest. 127 (5), 1591-1599 (2017).</li><li>Grandjean, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Life-Long+Implications+of+Developmental+Exposure+to+Environmental+Stressors:+New+Perspectives.">Life-Long Implications of Developmental Exposure to Environmental Stressors: New Perspectives.</a> Endocrinology. 156 (10), 3408-3415 (2015).</li><li>Inman, K. E., Downs, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+murine+allantois:+emerging+paradigms+in+development+of+the+mammalian+umbilical+cord+and+its+relation+to+the+fetus.">The murine allantois: emerging paradigms in development of the mammalian umbilical cord and its relation to the fetus.</a> Genesis. 45 (5), 237-258 (2007).</li><li>Arora, R., Papaioannou, V. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+murine+allantois:+a+model+system+for+the+study+of+blood+vessel+formation.">The murine allantois: a model system for the study of blood vessel formation.</a> Blood. 120 (13), 2562-2572 (2012).</li><li>Watson, E. D., Cross, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+structures+and+transport+functions+in+the+mouse+placenta.">Development of structures and transport functions in the mouse placenta.</a> Physiology (Bethesda). 20, 180-193 (2005).</li><li>Yang, J. T., Rayburn, H., Hynes, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion+events+mediated+by+alpha+4+integrins+are+essential+in+placental+and+cardiac+development.">Cell adhesion events mediated by alpha 4 integrins are essential in placental and cardiac development.</a> Development. 121 (2), 549-560 (1995).</li><li>Gurtner, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+disruption+of+the+murine+VCAM1+gene:+essential+role+of+VCAM-1+in+chorioallantoic+fusion+and+placentation.">Targeted disruption of the murine VCAM1 gene: essential role of VCAM-1 in chorioallantoic fusion and placentation.</a> Genes &amp; development. 9 (1), 1-14 (1995).</li><li>Kwee, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+development+of+the+embryonic+and+extraembryonic+circulatory+systems+in+vascular+cell+adhesion+molecule+(VCAM-1)+deficient+mice.">Defective development of the embryonic and extraembryonic circulatory systems in vascular cell adhesion molecule (VCAM-1) deficient mice.</a> Development. 121 (2), 489-503 (1995).</li><li>Downs, K. M., Gardner, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+investigation+into+early+placental+ontogeny:+allantoic+attachment+to+the+chorion+is+selective+and+developmentally+regulated.">An investigation into early placental ontogeny: allantoic attachment to the chorion is selective and developmentally regulated.</a> Development. 121 (2), 407-416 (1995).</li><li>Heyne, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+and+reliable+method+for+early+pregnancy+detection+in+inbred+mice.">A simple and reliable method for early pregnancy detection in inbred mice.</a> J Am Assoc Lab Anim Sci. 54 (4), 368-371 (2015).</li><li>Downs, K. M., Temkin, R., Gifford, S., McHugh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+the+murine+allantois+by+allantoic+explants.">Study of the murine allantois by allantoic explants.</a> Dev Biol. 233 (2), 347-364 (2001).</li><li>Hou, W., Sarikaya, D. P., Jerome-Majewska, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+culture+of+pre-placental+tissues+reveals+that+the+allantois+is+required+for+maintained+expression+of+Gcm1+and+Tpbpalpha.">Ex vivo culture of pre-placental tissues reveals that the allantois is required for maintained expression of Gcm1 and Tpbpalpha.</a> Placenta. 47, 12-23 (2016).</li><li>Zeigler, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+allantois+and+chorion,+when+isolated+before+circulation+or+chorio-allantoic+fusion,+have+hematopoietic+potential.">The allantois and chorion, when isolated before circulation or chorio-allantoic fusion, have hematopoietic potential.</a> Development. 133 (21), 4183-4192 (2006).</li><li>Zaidel-Bar, R., Itzkovitz, S., Ma'ayan, A., Iyengar, R., Geiger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+atlas+of+the+integrin+adhesome.">Functional atlas of the integrin adhesome.</a> Nature cell biology. 9 (8), 858-867 (2007).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Yanlısı yapıştırıcı hücre dışı matriks moleküllerini fibronektin gibi zengin bir kaynağıdır, serum huzurunda allantois explants kolayca çeşitli plastik, cam veya filtre yüzeyler9,16eklemek olacaktır. Böylece, gerçekleştirilen tahlil amacı özellikle bir genetik değişiklik etkisini araştırmak için veya başka bir tedavi allantois eki için immobilize α4β1 ise, non-spesifik bağlayıcı siteleri (örneğin, sığır serum ile engellemek için kritik Albümin) integrin ve serum içeren ile kuluçka önce yüzey kaplama sonra medya.
Allantois explants ilk eki için immobilize α4β1 integrin hareketi çok hassastır ve doku kültürü plakaları bu nedenle allantois puanlama önce (örneğin, 12 h için) bir önceden belirlenmiş zaman dönem için rahatsız edilmeden bırakılmalıdır Eki. Kararlı kişi için gereken süre belgili tanımlık substrate kurmasıyla analiz fare zorlanma veya immobilize α4β1 integrin yoğunluğuna bağlı olarak değişebilir.
Sıkıca kurulan11,12,13hücreler arası VCAM-1/α4β1-etkileşim için başarılı chorioallantoic füzyon gereksinimdir. Buna ek olarak, hücre dışı matriks moleküllerin fibronektin, collagens ve diğer moleküller ilgi Ayrıca immobilize ve "chorio mimetic" yüzeylerde kullanılır.
Chorioallantoic eki VCAM-1 ve onun bağlama ortak integrin α4β1 arasındaki hücreler arası etkileşimi bağlıdır. Rahim içindechorioallantoic eki ve sonraki fusion sadece oluşabilir allantois yeterince yapmak için genişlettiği zaman koryon ile temas. Fizyolojik değişkenliğine allantois boyutlarda belirli bir gelişim aşamasında göz önüne alındığında, chorioallantoic eki ve füzyon E 8.0 ve E 9.0 (Aralık, E 7.5-E 9,25) arasında yer almaktadır14,16. Özellikle yaşam Mouse koryonik plaka rahim içinde allantois ek geçici sürecinin, hazır olmayan çalışma yöntemleri mevcut. Aksine, analizleri çoğunlukla örneğindeğerlendirilmesi histolojik tarafından chorioallantoic füzyon zahmetli belirlenmesi odaklandık, allantoic koryon yüzeyi ve tek bir labirent katmanında gelişimi yaymak, önceden belirlenen zaman noktası11,12,13,16. Bu bitiş noktası analizi allantois Engelli eki koryon ve koryon bağımlı etkileri nedeniyle özellikle ve embriyo gelişim dönemleri doğal değişkenlik tarafından sınırlı ve allantoic kusurları arasında ayırımcılık değil boyutları. Temsilcisi sonuçlarıaltında açıklandığı gibi fizyolojik değişkenliğine allantois boyutlarda chorioallantoic erime içinde göreli bir gecikme neden olabilir ~ C57BL/6J wildtype embriyo, % 26. İstatistiklere göre neredeyse iki yedi hamile fareler bu nedenle kurban çok erken (61 embriyo üzerinden yedi çöp, ortalama çöp boyutu 8.7), hangi daha büyük ölçekli çalışmalar için aşırı yetiştiriciliği önemli bir gerekliliği anlamına olurdu. İlginçtir, mikrocerrahi deneyler koryon zaten allantois ile 1 somite çifti aşamada sigorta yetkili olduğunu ve allantois embriyo 3-5 somite çiftleri14ile maksimal füzyon kapasite sergileyen ortaya çıkardı. Bu nedenle, allantois hücrelerinin chorioadhesive kurulan ve işlevsel olarak yetkili gerçek chorioallantoic eki içinde vivoönce vardır. Rahim allantois eki immobilize ligandlar, burada anlatılan gibi bu nedenle verilen allantois boyutunu nispeten bağımsız analizidir. Bu nedenle, bu yöntemin bir avantajı bu allantois uzama hatalarını atlar ve plasenta oluşumu, Yani, chorioallantois eki sonraki adımda odaklanmaktadır olduğunu. Bu yaklaşım böylece allantois uzama kusur ve chorioallantois ek olarak genetik fare mutantlar arasında ayırt etmek için kullanılır.
Aksine onun eki noktadan allantois aspirasyon bir ağız pipet16kullanarak embriyo için geleneksel yöntem, geçerli iletişim kuralı el ile kesme yaklaşım kullanır ve allantois daha sonra büyük delik pipet ipuçlarını kullanarak ele alınır . Allantois aspirasyon önemli bir avantajı bu yöntemi doğrudan doku işleme engeller olduğunu. Kesme ve allantois manipüle allantoic mesothelium dış kılıf chorioadhesive hücrelere zarar verebilir. Yine de, allantois Forseps ile kesme başarıyla kullanılan önce ex vivo pre-placental doku17kültürlerde ve Kinetik allantoic explant ekin ve morfolojisi explant kültürlerin açıklanan Bu da çalışmanın üzerinde allantois yalıtım temel aspirasyon16tarafından yayımlanan verileri benzer. Bu bulgular CD31 pozitif endothelia oluşumu ile belirtildiği gibi chorioadhesive hücreleri yeterince iyi allantois el ile kesme üzerine korunur ve bu explant farklılaşma fena halde tedirgin değil, tavsiye ederim. Allantois Ayrıca kesme sadece üst VCAM-113ifade üçte ikisi allantois incelemek imkanı sunuyor ve daha az kirlilik uzak tabanı kesildikten gerekebilir sarısı sac kaynaklı hücreler sağlar doğrudan allantois allantois aspirasyon18sonra.
Allantoic explant yapışma immobilize rahim analizi, rekombinant α4β1 integrin chorioallantoic füzyon, Yani, hücreler arası etkileşim için gerekli olan bir önemli, ilk adım bir nitel okuma sağlar. allantois üzerinde VCAM-1 arasında ifade ve α4β1 integrin extraembryonic mesoderm türetilmiştir koryonik mesothelium yerelleştirilmiş. Yine de, her ne kadar bu iki adezyon molekülleri chorioallantoic Fusion, ilke oyuncular kabul edilmektedir ~ embriyo VCAM-1 veya α4 integrin mutasyonların homozigoz nakavt ile % 50'si chorioallantoic füzyon vivo içinde11 geçmesi ,12,13. Bu eksik alellerle nedeniyle mevcut iletişim kuralında tanımlanan ex vivo yöntemi chorioallantoic füzyon bu iki adezyon molekülleri bir hata ile genetik modelleri için bir gereklilik ekarte etmek yeterli olmayabilir.
Fizyolojik koşullarda α4β1 integrinler koryonik trophoblasts plazma zarı içinde gömülü ve hücre-hücre (ve hücre vuruşlu) yapışma düzenleyen işbirliği yapısal ve sinyal proteinleri karmaşık bir ağ içinde dahil edilmiştir 19. gibi çoğu indirgemeci vitro yaklaşımlar ile koryonik VCAM-1 bağlama arabirimi karmaşıklığı sadece çok sınırlı bir ölçüde immobilize α4β1 integrin tarafından modellenmiştir. Diğer önemli yapısal veya sinyal girdilerin sağlam koryon bu sistemde türetilmiş potansiyel eksikliği yanı sıra, katı, iki boyutlu bir yüzeye immobilize integrinler yalnızca bir kısmını etkin mevcut olasıdır, bağlama yetkili, "açık" uyum.
Sunulan yöntem erken eki ve allantois adım koryon için yayılan yaklasik ve -ebilmek da rapor allantoic vasküler pleksus damar oluşumu9analizi ile birleştirildiğinde geliştirilmesi. Ancak, mevcut yaklaşım koryon işgali allantoic endotel hücreleri tarafından aracılı angiogenez çimlenme tarafından model değil, ne de chorioallantoic füzyon için gerekli bir süreçtir koryon tarafından dallanma morfogenez yansıtacak ve plasental labirent10sonraki gelişimi.
Faz kontrast veya fark girişim mikroskobu (yarı-) ile birlikte kullanarak otomatik görüntü analizi, daha büyük ölçekli ekranlarda gecikmeli "veya" hatalı allantoic eki içinde vitroilk analizi için sunulan yöntem uygulanabilir. Fare mutantlar analiz yanı sıra, yöntem allantoic eki uyuşturucu, patojenler, metabolitleri veya çevre ajanlar etkileri ekran ilgi olabilir.
Allantois ve koryon normalde geliştirdik gibi görünmesine karşın çok sayıda fare mutantlar gerçekleşmesi, chorioallantoic ek başarısız olur. Ayrıca, genellikle chorioallantoic ek hataları gösteren mutantlar eksik alellerle1,2,10ekran. Bu işlevsel olarak Görünüşe göre çok farklı genler ortak moleküler yolları ve/veya hücresel etkisi olup olmadığını araştırmak önemli olacaktır. Fare mutantlar türetilmiş allantois explants canlı görüntüleme böyle mekanizmaları aydınlatmak potansiyeline sahiptir. Örneğin, disseke allantois dış kılıf hücreleri (örneğin dıı veya DiO lipofilik carbocyanine izleyicileri16,18) hayati floresan boyalar ile görüntü için denetimin etiketi olabilir yapışma ve olayları, yayılan veya hücre izlemek için gerçek zamanlı geçiş. Buna ek olarak, sitoiskeleti veya yapışma proteinler görselleştirmek floresan gazetecilere bilgilendirici olduğunu kanıtlayabilir.
Son zamanlarda, bir ex vivo ortak kültür sistemi ön eki fare allantoides ve chorions için açıklanan ve bu yaklaşım başarılı bir şekilde chorioallantoic eki, Labirent katman gibi sonra meydana gelen olayları araştırmak için kullanılan oluşumu17. Allantois eki verimliliği üzerinde immobilize chorions (genetiği değiştirilmiş çeşitliörneğin) izole analizini fare modelleri yeni yorumlara moleküler oyuncular ve gelişiminde ilk adımları yöneten yollar verim fare plasenta.

Plasenta embriyonik gelişim ve rahim ortamı için vazgeçilmezdir. Endokrin ve bağışıklık organ oksijen, metaboliti ve maternal ve fetal dolaşım ve ayrıca işlevleri arasında besin alışverişini arabirimdeki oluşturmaktadır. Plasental geliştirme bozar endojen veya eksojen hakaret intrauterin büyüme geriliği, gebelik kaybı veya gebelik komplikasyonları, fareler ve insanlar1yol açabilir. Anormal plasental Fizyoloji neden hedeflenen fare mutasyonlar sayısı ile şu anda fare genom Bilişim (MGI) Web sitesinde listelenen 219 genotip2, artmaya devam ederken (http://www.informatics.jax.org/vocab/ mp_ontology / MP:0010038), bu fenotipleri birçoğu iyi mekanik açısından anlaşılmış değil. Genetik değişikliklere ek olarak, küçük molekül uyuşturucu, monoklonal antikorlar, toksinler, patojenler, aşırı metabolitleri veya çeşitli çevresel aracıları plasenta geliştirme ve işlev3,4,5 etkileyebilir , 6 , 7. henüz, plasenta geliştirme modeli eleştirel adımları azdır basit vitro deneyleri.
Allantois (göbek kordonu gelişimsel habercisi) embriyo posterior ucundan doğru koryon8büyür bir tomurcuk olarak ortaya çıkıyor zaman fare plasental geliştirme erken midgestation içinde başlatılır. Allantoic tomurcuk dış tabakası hücrelerde Chorioadhesive eki ve allantois koryon (chorioallantoic "füzyon") yüzeyi ile yayılan aracılık. Koryon villus içine Labirent, besin ve oksijen anne kan yakından bitişik sinusoids ve embriyonik damarları9 arasında değişen nerede iç plasental katman oluşturmak üzere allantois damarlara büyür içine daha sonra pas geçiyor ,10.
Allantois eki koryon için labirent oluşumu içinde belgili tanımlık ilk ve önemli adım, ve kusurları bu süreçte embriyonik ölümcül en sık karşılaşılan nedenleri arasında midgestation1'. Her ne kadar bir dizi fare mutantlar var nerede chorioallantoic eki10gerçekleşmesi başarısız olur ve MGI veritabanı şu anda anormal chorioallantoic füzyon (http:// tarafından karakterize 108 fare mutantlar listeler tarif edilmiştir www.informatics.Jax.org/Vocab/mp_ontology/MP:0002824), vasküler hücre adezyon molekülü-1 (VCAM-1, allantoic mesoderm ifade) ve (olan koryonik mesothelium ifade α4β1 integrin arasındaki hücreler arası etkileşimi extraembryonic mesoderm türetilmiş) chorioallantoic eki ve füzyon11,12,13için vazgeçilmez gibi görünüyor. İmmunohistokimyasal bütün Dağı yaban tipi embriyoların boyama olduğunu göstermiştir VCAM-1 yaklaşık embriyonik gününde (E) 7.5 distal üçte içinde allantoic SAP ifade edilir13 (1-4 somite sahne) ve onun ifade yüksek kalır chorioallantoic eki ve füzyon11,12sırasında-. Koryon allantoic eki başarısızlık genellikle rahim tomurcukları histolojik analizler tarafından algılanır. Ancak, allantois boyutları fizyolojik arasında ve aynı gelişimsel sahne14çöp içinde bile çok değişkendir ve fiziksel temas yapmak için yeterli bir boyuta ulaştığında allantois sadece için koryon ekleyebilirsiniz. Bu doğal değişkenlik yansıtan, chorioallantoic ek bir ara arasında gerçekleşir ~ E 8.0 ve E 9.0 rahim içindeve bu işlem Histoloji tarafından istatistiksel olarak güvenilir bir şekilde değerlendirilmesi bağlıdır bu nedenle çok sayıda analizi conceptuses uygun gelişim aşamasında yeterli örnekler almak için.
Burada, biz daha az allantois boyutuna bağlıdır allantoic eki rahim değerlendirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Biz hamile fareler uteri fare embriyo ve onların allantoides diseksiyon göstermek ~ 8 gün coitum post (dpc; dpc 0,5 belirtir bir vajinal fiş tespiti), ve allantois sonraki kültür üzerinde immobilize α4β1 explants integrinler. Bu yöntem ekler ve birden çok allantois explants paralel ve farklı her başarılı zaman noktalarda davranışını yayılan bir hızlı, işlevsel değerlendirme sağlar. Protokol kullanılabilir için ekran allantois eki ex vivohedeflenen mutasyonlar, uyuşturucu veya çeşitli çevresel faktörlerin etkileri.

<table><tbody><tr><td>C57BL/6J wildtype mice</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>Stock No:&amp;nbsp;000664</td><td></td></tr><tr><td>70 % (v/v) Ethanol</td><td>VWR International</td><td>930031006</td><td></td></tr><tr><td>Standard pattern forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-12</td><td>Forceps used to open the abdominal cavity.</td></tr><tr><td>Micro dissecting forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td>Dumont # 5 medical biology forcepts with fine, sharp tip.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fine scissors&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>14094-11</td><td>Straight blades.</td></tr><tr><td>Spring scissors&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>15012-12</td><td>Noyes spring scissors with 14 mm blades for the dissection of uterus buds.</td></tr><tr><td>Microspoon</td><td>Carl Roth</td><td>AT18.1</td><td>5 mm Spoon diameter.</td></tr><tr><td>Microtiter plates</td><td>ibidi</td><td>81501</td><td>We use uncoated, sterile angiogenesis slides (internal volume 50 &amp;micro;L) with a hydrophobic surface that is not tissue-culture treated to reduce non-&amp;#945;4&amp;#946;1-mediated binding to plastic.</td></tr><tr><td>10 cm dish</td><td>Nunc</td><td>150350</td><td>Sterile tissue culture dishes.</td></tr><tr><td>3.5 cm dish</td><td>Nunc</td><td>150288</td><td>Sterile tissue culture dishes.</td></tr><tr><td>Large orifice pipette tips&amp;nbsp;</td><td>Biozym</td><td>VT0140X</td><td>Low binding pipette tips, 200 &amp;micro;L.</td></tr><tr><td>&amp;#945;4&amp;#946;1 integrin</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>6054-A4</td><td>Murine &amp;#945;4&amp;#946;1 integrin recombinantly expressed and purified from a Chinese hamster ovary cell line.</td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8537</td><td>Without Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; and Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;.</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-03600</td><td>The formulation contains 4.5 g/L glucose, 110 mg/L sodium pyruvate and 3.7 g/L NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; but no L-glutamine, which is added separately.</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Gibco (ThermoFisher Scientific)</td><td>15140-122</td><td>100 x (10,000 U/mL Penicillin and 10,000 &amp;micro;g/mL streptomycin) stock solution.&amp;nbsp;Prepare and store aliquots at -20 &amp;deg;C to avoid freeze/thaw.</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-80100</td><td>100 x (200 mM) Stock solution. Prepare and store aliquots at -20 &amp;deg;C to avoid freeze/thaw.</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum&amp;nbsp;</td><td>Biochrom</td><td>S 0115</td><td>We use heat-inactivated FBS (heated to 56 &amp;deg;C for 30 min with mixing to inactivate complement).</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7030</td><td>We use protease- and fatty acid-free albumin. Prepare a 0.1 % (w/v) solution in DMEM. Sterile filter the solution through a disposable cell culture filter with a 0.22 &amp;micro;m pore size and low protein-binding membrane, and store aliquots at -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;para&lt;/em&gt;-Formaldehyde</td><td>Carl Roth</td><td>0335.2</td><td>To make a formaldehyde solution in PBS, weigh &lt;em&gt;para&lt;/em&gt;-formaldehyde powder in a ventilated hood, and add it to PBS preheated to ca. 60 &amp;deg;C in a beaker on a stir plate. Add 1 N NaOH dropwise until solution clears. Let solution cool to room temperature, and filter through 0.22 mm filter syringe. Adjust pH with diluted HCl to ca. 6.9, and adjust to final volume with PBS. We aliquot and freeze the solution, but it can also be stored at 4 &amp;deg;C for approximately four weeks.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td>Use wide-orifice pipette tips to handle undiluted Triton X-100.</td></tr><tr><td>Normal goat serum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9023</td><td>To block non-specific binding of antibodies in immunofluorescence analyses.</td></tr><tr><td>&amp;#945;-CD31 Antibodies</td><td>BD Biosciences</td><td>550274</td><td>Purified rat anti-mouse monoclonal antibodies, clone MEC 13.3.</td></tr><tr><td>Secondary goat anti-rat antibodies</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-11006</td><td>Goat anti-rat IgG (heavy and light chains), cross-adsorbed, fluorescently labeled with Alexa Fluor 488. Other fluorescent labels are also possible.</td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Sigma Aldrich</td><td>81381</td><td>Mounting medium for cytochemistry. MW ~31,000</td></tr><tr><td>Labovert&amp;nbsp;</td><td>Leitz</td><td>Labovert&amp;nbsp;</td><td>Inverted phase contrast microscope equipped with a 4 x and 10 x objective for somite pair counting. Other phase contrast microscopes (such as those that are routinely used in tissue culture) are also suitable.&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>M80</td><td>Leica Microsystems</td><td>M80</td><td>Stereomicroscope with 8 : 1 zoom range (yielding a magnification between 7.5 x and 60 x) for embryo and allantois dissection.</td></tr><tr><td>DM4000B</td><td>Leica Microsystems</td><td>DM4000B</td><td>Microscope system for histology with LED illumination. We use HCX PL FLUOTAR 5 x/0.15 and HC PL FLUOTAR 10 x/0.30 objectives. Other microscopes equipped phase contrast and fluorescence optics can be used to score allantois attachment.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Digital camera</td><td>JVC</td><td>KY-F75U</td><td>3-CCD digital capture camera attached to the DM4000B LED microscope. We use Diskus software (Hilgers) to operate both the microscope and the camera.</td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Leica Microsystems</td><td>SP5</td><td>Confocal microscope for higher-resolution imaging of endothelia in the vascular plexus of allantois explants. Immunofluorescence images were taken with a 40 x objective.</td></tr></tbody></table>

dissection and explant culture of murine allantois for the in vitro analysis of allantoic attachment

Plasenta büyüme ve memeli embriyo gelişimi için önemlidir. Bu nedenle, çok sayıda genetik değişiklikler ve plasenta geliştirme veya işlev rahatsız büyük olasılıkla aynı zamanda çevre hakaret erken gebelik kaybı fareler ve insanlar neden olabilir. Yine de, basit vitro deneyleri plasenta oluşumu üzerindeki olası etkileri için ekran için eksik vardır. Burada, allantois ekin için koryon oluşur plasenta oluşumu ilk ve önemli adımda modelleme ele. Biz hızla allantoic explants chorio mimetic substrat hizmet vermektedir immobilize α4β1 Integra üzerinde eki değerlendirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu vitro yaklaşım eki ve birden çok allantois explants farklı ardışık zaman noktalarda davranışını yayılan nitel bir değerlendirme sağlar. Protokol hedeflenen fare mutasyonlar, uyuşturucu veya gebelik komplikasyonları veya fetal kayıp allantois eki ex vivoolarak bağlı çeşitli çevresel faktörlerin etkisini araştırmak için kullanılır.

Bu iletişim kuralı yalıtmak ve fare allantoides ex vivoexplant yöntemi açıklanır ve in vivo chorioallantoic füzyon sırasında α4β1 integrin allantois eki, kritik bir süreç değerlendirme nitel ayrıntıları. Şekil 1A-H temsilcisi sonuçlar allantois yalıtım hamile rahim başlayarak birbirini izleyen adımları göstermektedir. Rahim boynuzları, yağ dokusu ve gemiler (şekil 1A) gibi çevreleyen anne dokular kaldırılır ve embriyo endometrium step-wise bir moda dan sonra kas rahim Katmanı (şekil 1B- açılması disseke E). Daha sonra parietal sarısı sac ve ectoplacental koni gibi anne diğer dokulara kaldırıldı (şekil 1E, F). Şekil 1G - H teknik sarısı sac, başka bir extraembryonic ve son derece bozukluklarına doku uzak extraembryonic allantois diseksiyon oluşur gösterir. Böylece, bu protokole göre izole allantoides büyük ölçüde allantois dışında anne veya (ekstra) embriyonik doku bulaşıcı ücretsizdir.
Şekil 2 boyutunu ve şeklini allantoides bir tek çöp taze disseke embriyo üzerinden14önemli ölçüde değişebilir gösterir. Allantoides C57BL/6J wildtype embriyo E 8.5 disseke (45 61 analiz embriyo), vakaların % 74'Şekil 2 ve şekil 1 H' de gösterildiği gibi uzun bir kara delik vardı. Ancak, içinde % 15 (9/61) embriyo allantoides belirgin daha küçük ve daha fazla (bkz. başvuru14) yuvarlak ve % 11 (7/61) embriyo henüz görünür allantois diseksiyon anda oluşmuş değil. Türdeş olmayan şekil ve boyutlarda allantois başlangıç zaman noktasında rağmen kültür (Şekil 2, paneller bir-h), allantois eki explant ve tam immobilize α4β1 Integra üzerinde yayılan tüm 12 h içinde gözlenen 54 taze izole allantoides yedi çöp embriyo kesmiştim. Bununla birlikte, şekil ve boyutlarda explants kültürünün 12 h sonra biraz heterojen (Resim 2), kullanmıştır türleri farklı allantoic Morfoloji testin başlangıç noktasında yansıtan.
Şekil 3 explants bu zaman noktası olarak beklenen9 tarafından vasküler pleksus özenli doğruluyor explant kültürünün 24 saat sonra CD31 pozitif tam olarak ekli allantoides endotel hücrelerinde için boyama bir immunocytochemical gösterir , 16. böyle yapışık allantois kültürler damar oluşumu vitro9çalışma için kullanılabilir. Bu nedenle, kolayca kültürlü ex vivo, taleplere ile daha önce olabilir sunulan metodoloji verimleri allantois explants deneysel çalışmalar9,16yayınlandı.
Protokol çerçevesinde allantois eki mikroskobu tabanlı değerlendirilmesi için önceden belirlenmiş zaman noktalarda, gibi sonra 12 saat veya 24 saat explant kültürünün ayarlar. Sonuçları nitel bir şekilde (kısmi/tam ek veya tam yayılan bir belirli zamanda noktada-Evet/Hayır) değerlendirilebilir. Bu yana aynı explant tekrar tekrar görüntülenir ve attı, bu analiz bireysel allantois özellikleri kültürleri zamanla explant yansıtır. Buna ek olarak, sabit ve lekeli explants içinde bir vasküler pleksus oluşumu olabilir (şekil 3) değerlendirildi.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56712/56712fig1.jpg"> Şekil 1: temsilcisi adımlar allantois diseksiyon. (A)ayrıntı görüntülemek izole bir rahim boynuzu. Embriyo içeren rahim tomurcukları yıldız tarafından işaretlenir; yağ dokusu ve rahim boynuz çevresindeki damarları sol tarafta görülür. (B) decidua (endometrium) rahim kas tabakası çıkarıldıktan sonra bir bakış. Son derece bozukluklarına, decidua, mesometrial pole sola odaklı, embriyo içeren anti-mesometrial bölümü (bir yıldız ile işaretlenmiş) sağa doğru aydınlatmaktadır. (C) yan görüntüleyin (bir yıldız ile işaretlenmiş) decidua disseke anti-mesometrial kutup. Ok embriyo konumunu gösterir. (D) çevreleyen decidua kısmi kaldırıldıktan sonra parietal sarısı sac tarafından çevrili conceptus (ok) Top görünümünü. (E, F) Sonraki adımlar (ok) embriyo diseksiyon temsilcisi sayısı. Önizlemedeki sarısı sac gösterir. (E), ectoplacental Koni (epc) sağ tarafta görünür. (G) üzerinden sarısı sac (ok) (ok) embriyo kısmi diseksiyon. Allantois kırmızı yıldızla işaretlenir. (H) izole embriyo (ok) allantois (Kızıl Yıldız) ile. Nerede allantois kendi Bazal ekleme site embriyo arka sonunda kesilir nokta kırmızı kırık çizgi ile belirtilmiş. Görüntüler üzerinde bir 8:1 zum mesafesine sahip bir stereomicroscope alınmıştır. Tüm ölçek çubukları 1 mm. olan <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56712/56712fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56712/56712fig2.jpg"> Şekil 2: farklı şekil ve boyutlarda allantoides. Sekiz allantoides (bir-h) bir tek çöp embriyo izole edildi. Paneli yaptı, allantoides hemen sonra diseksiyon (0 h). Doğru kapı aynası, explant kültür 12 h sonra aynı allantoides. Explants sıkıca bağlı ve Mezenkimal hücreler yayıldı. Explants explant boyutları görselleştirmek için çember. Görüntüleri faz kontrast optik ve 5 × (sol kapı aynası) veya 10 × amaç (doğru kapı aynası) ile donatılmış bir mikroskop üzerine alındı. Tüm ölçek çubukları 500 µm. çoğu <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56712/56712fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56712/56712fig3.jpg"> Şekil 3: vasküler pleksus oluşumu allantois explant kültürlerde. Allantoides disseke ve mevcut protokolünde açıklandığı gibi immobilize α4β1 Integra üzerinde explanted. Explants 24 saat kültürlü ve endotel hücreleri vasküler pleksus içinde anti-CD31 birincil antikorları kullanarak ve fluorescently ikincil antikorlar etiketli lekeli. Endotel hücreleri yeşil görünür. Üst resim tüm vasküler pleksus temsilcisi allantois explant merkezi alanında gösterir. Görüntü üzerinde Floresans optik ve 5 × amacı ile donatılmış bir mikroskop atıldığını. Ölçek çubuğu, 500 µm. İki alt panel disseke ve aynı koşullar altında kültürlü başka bir allantois explant daha yüksek büyütme görüntülerdir. Gemi benzeri yapıları ve bireysel endotel hücreleri görülebilir. Görüntüleri confocal mikroskobunun alındı; ölçek çubukları, 25 µm. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56712/56712fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Dissection and Explant Culture of Murine Allantois for the In Vitro Analysis of Allantoic Attachment at JoVE.com

Dissection and Explant Culture of Murine Allantois for the In Vitro Analysis of Allantoic Attachment

Biz bir vitro tahlil modeli chorioallantoic ekte, plasenta oluşumu ilk adımda açıklanmaktadır. Protokol immobilize α4β1 Integra üzerinde fare allantoides diseksiyon ve explant kültür gösterir. Allantois ek olarak önceden belirlenmiş zaman noktalarda değerlendirilir.

Diseksiyon ve Explant kültür Allantoic eki Vitro analizi için fare Allantois ve

The placenta is essential for the growth and development of mammalian embryos. For this reason, numerous genetic alterations and likely also environmental ...

dissection-explant-culture-murine-allantois-for-vitro-analysis

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

Dissection and Explant Culture of Murine Allantois for the In Vitro Analysis of Allantoic Attachment

7.8K Görüntüleme.  University of Würzburg. Biz bir vitro tahlil modeli chorioallantoic ekte, plasenta oluşumu ilk adımda açıklanmaktadır. Protokol immobilize α4β1 Integra üzerinde fare allantoides diseksiyon ve explant kültür gösterir. Allantois ek olarak önceden belirlenmiş zaman noktalarda değerlendirilir.

Video: Dissection and Explant Culture of Murine Allantois for the In Vitro Analysis of Allantoic Attachment

Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

The aorta is the largest artery in the body. The aortic wall is composed of an inner layer of endothelial cells, a middle layer of alternating elastic lamellae and smooth muscle cells (SMCs), and an outer layer of fibroblasts and extracellular matrix. In contrast to the widespread study of pathological models (e.g., atherosclerosis) in the adult aorta, much less is known about the embryonic and perinatal aorta. Here, we focus on SMCs and provide protocols for the analysis of the morphogenesis and pathogenesis of embryonic and perinatal aortic SMCs in normal development and disease. Specifically, the four protocols included are: i) in vivo embryonic fate mapping and clonal analysis; ii) explant embryonic aorta culture; iii) SMC isolation from the perinatal aorta; and iv) subcutaneous osmotic mini-pump placement in pregnant (or non-pregnant) mice. Thus, these approaches facilitate the investigation of the origin(s), fate, and clonal architecture of SMCs in the aorta in vivo. They allow for modulating embryonic aorta morphogenesis in utero by continuous exposure to pharmacological agents. In addition, isolated aortic tissue explants or aortic SMCs can be used to gain insights into the role of specific gene targets during fundamental processes such as muscularization, proliferation, and migration. These hypothesis-generating experiments on isolated SMCs and the explanted aorta can then be assessed in the in vivo context through pharmacological and genetic approaches.

Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

Protocols for studying the embryonic and perinatal murine aorta using in vivo clonal analysis and fate mapping, aortic explants, and isolated smooth muscle cells are detailed here. These diverse approaches facilitate the investigation of the morphogenesis of the embryonic and perinatal aorta in normal development and the pathogenesis in disease.

Morfogenez ve embriyonik ve Perinatal aort patogenezi okumaya vivo içinde ve doku ve hücre Explant yaklaşımları kullanma

The aorta is the largest artery in the body. The aortic wall is composed of an inner layer of endothelial cells, a middle layer of alternating elastic ...

Gelişim Biyolojisi

Application of Aorta-gonad-mesonephros Explant Culture System in Developmental Hematopoiesis

The limitation of using mouse embryos for hematopoiesis studies is the added inconvenience in operations, which is largely due to the intrauterine development of the embryo. Although genetic data from knockout (KO) mice are convincing, it is not realistic to generate KO mice for all genes as needed. In addition, performing in vivo rescue experiments to consolidate the data obtained from KO mice is not convenient. To overcome these limitations, the Aorta-Gonad-Mesonephros (AGM) explant culture was developed as an appropriate system to study hematopoietic stem cell (HSC) development. Especially for rescue experiments, it can be used to recover the impaired hematopoiesis in KO mice. By adding the appropriate chemicals into the medium, the impaired signaling can be reactivated or up-regulated pathways can be inhibited. With the use of this method, many experiments can be performed to identify the critical regulators of HSC development, including HSC related gene expression at mRNA and protein levels, colony formation ability, and reconstitution capacity. This series of experiments would be helpful in defining the underlying mechanisms essential for HSC development in mammals.

This protocol describes using cultured Aorta-Gonad-Mesonephros for expression analyses, colony-forming units in the culture and spleen, and long-term reconstitution to determine the effect of regulatory factors and signaling pathways on hematopoietic stem cell development. This has been demonstrated as an effective system for studying hematopoietic stem cell biology and function.

Aorta-erbezi-mesonephros Explant kültür gelişimsel Hematopoiesis sistemde uygulanması

The limitation of using mouse embryos for hematopoiesis studies is the added inconvenience in operations, which is largely due to the intrauterine ...

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing fetus. This tolerance is initiated during coitus, established during fecundation and implantation, and maintained throughout pregnancy. Active cellular and molecular mediators of maternal-fetal tolerance are enriched at the site of contact between fetal and maternal tissues, known as the maternal-fetal interface, which includes the placenta and the uterine and decidual tissues. This interface is comprised of stromal cells and infiltrating leukocytes, and their abundance and phenotypic characteristics change over the course of pregnancy. Infiltrating leukocytes at the maternal-fetal interface include neutrophils, macrophages, dendritic cells, mast cells, T cells, B cells, NK cells, and NKT cells that together create the local micro-environment that sustains pregnancy. An imbalance among these cells or any inappropriate alteration in their phenotypes is considered a mechanism of disease in pregnancy. Therefore, the study of leukocytes that infiltrate the maternal-fetal interface is essential in order to elucidate the immune mechanisms that lead to pregnancy-related complications. Described herein is a protocol that uses a combination of gentle mechanical dissociation followed by a robust enzymatic disaggregation with a proteolytic and collagenolytic enzymatic cocktail to isolate the infiltrating leukocytes from the murine tissues at the maternal-fetal interface. This protocol allows for the isolation of high numbers of viable leukocytes (&#62;70%) with sufficiently conserved antigenic and functional properties. Isolated leukocytes can then be analyzed by several techniques, including immunophenotyping, cell sorting, imaging, immunoblotting, mRNA expression, cell culture, and in vitro functional assays such as mixed leukocyte reactions, proliferation, or cytotoxicity assays.

Described herein is a protocol to isolate and analyze the infiltrating leukocytes of tissues at the maternal-fetal interface (uterus, decidua, and placenta) of mice. This protocol maintains the integrity of most cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications including flow cytometry analysis.

Maternal Fetal Arayüz at Fare Dokular lökosit İzolasyonu

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the complexities of the organoid growth characteristics carry significant caveats for the investigator. Specifically, the growth patterns of each individual organoid are highly variable and create a heterogeneous population of epithelial cells in culture. With such caveats, common tissue culture practices cannot be simply applied to the organoid system due to the complexity of the cellular structure. Counting and plating based solely on cell number, which is common for individually separated cells, such as cell lines, is not a reliable method for organoids unless some normalization technique is applied. Normalizing to total protein content is made complex due to the resident protein matrix. These characteristics in terms of cell number, shape and cell type should be taken into consideration when evaluating secreted contents from the organoid mass. This protocol has been generated to outline a simple procedure to culture and treat small intestinal organoids with microbial pathogens and pathogen associated molecular patterns (PAMPs). It also emphasizes the normalization techniques that should be applied when protein analysis are conducted after such a challenge.

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Here, a protocol to harvest, maintain, and treat mouse small intestinal organoids with pathogen associated molecular patterns (PAMPs) and Listeria monocytogenes is described, as well as emphasis on gene expression and proper normalization techniques for protein.

<em&gt; Ex Vivo</emFare Bağırsak Organoids ve&gt; Kültür ve Desen Tanıma Reseptör Uyarım

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is imperative to design experiments using human cells and tissues. An advantage of organ culture is maintenance of three-dimensional (3D) structural organization and extracellular matrix. The goal of the method described here is successful establishment of ex vivo human gestational tissue organ cultures and their healthy culture maintenance for 72-96 hr. The protocol details the immediate processing of research-consented, placental and decidual specimens fresh from the operating suite. These are abundant specimens that would otherwise be discarded. Detailed instructions on the sterile collection of these samples, including morphologic details on how to select appropriate tissues to establish 3D organ cultures, is provided. Placental villous and decidual tissues are microdissected into 2-3 mm3 pieces and placed separately on matrix-lined transwell filters and cultured for several days. Villous and decidual organ cultures are well suited for the study of human host-pathogen interaction. As compared to other model organisms, these human cultures are particularly advantageous to examine mechanism of infection for pathogens that demonstrate variable patterns of host specificity. As an example, we demonstrate infection of placental and decidual organ cultures with the clinically relevant, facultative intracellular bacterial pathogen Listeria monocytogenes.

A simple method to establish primary human placental (villous) and decidual organ cultures is described. Villous and decidual organ cultures are invaluable tools for studying pathogenesis at the human maternal-fetal interface. Infection with the facultative intracellular bacterium Listeria monocytogenes is demonstrated.

İnsan Plasental ve Desidual Organ Kültürleri Maternal-Fetal Arayüz de Enfeksiyonlar Eğitim için

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

Microdissection and Dissociation of the Murine Oviduct: Individual Segment Identification and Single Cell Isolation

Mouse model systems are unmatched for the analysis of disease processes because of their genetic manipulability and the low cost of experimental treatments. However, because of their small body size, some structures, such as the oviduct with a diameter of 200-400 &#956;m, have proven to be relatively difficult to study except by immunohistochemistry. Recently, immunohistochemical studies have uncovered more complex differences in oviduct segments than were previously recognized; thus, the oviduct is divided into four functional segments with different ratios of seven distinct epithelial cell types. The different embryological origins and ratios of the epithelial cell types likely make the four functional regions differentially susceptible to disease. For example, precursor lesions to serous intraepithelial carcinomas arise from the infundibulum in mouse models and from the corresponding fimbrial region in the human fallopian tube. The protocol described here details a method for microdissection to subdivide the oviduct in such a way to yield a sufficient amount and purity of RNA necessary for downstream analysis such as reverse transcription-quantitative PCR (RT-qPCR) and RNA sequencing (RNAseq). Also described is a mostly non-enzymatic tissue dissociation method appropriate for flow cytometry or single cell RNAseq analysis of fully differentiated oviductal cells. The methods described will facilitate further research utilizing the murine oviduct in the field of reproduction, fertility, cancer, and immunology.

A method for microdissection of the mouse oviduct that allows collection of the individual segments while maintaining RNA integrity is presented. In addition, non-enzymatic oviductal cell dissociation procedure is described. The methods are appropriate for subsequent gene and protein analysis of the functionally different oviductal segments and dissociated oviductal cells.

Murine Oviduct'un Mikroseksiyonu ve Ayrışması: Bireysel Segment Tanımlama ve Tek Hücre İzolasyonu

Mouse model systems are unmatched for the analysis of disease processes because of their genetic manipulability and the low cost of experimental ...

An Explant Assay for Assessing Cellular Behavior of the Cranial Mesenchyme

The central nervous system is derived from the neural plate that undergoes a series of complex morphogenetic movements resulting in formation of the neural tube in a process known as neurulation. During neurulation, morphogenesis of the mesenchyme that underlies the neural plate is believed to drive neural fold elevation. The cranial mesenchyme is comprised of the paraxial mesoderm and neural crest cells. The cells of the cranial mesenchyme form a pourous meshwork composed of stellate shaped cells and intermingling extracellular matrix (ECM) strands that support the neural folds. During neurulation, the cranial mesenchyme undergoes stereotypical rearrangements resulting in its expansion and these movements are believed to provide a driving force for neural fold elevation. However, the pathways and cellular behaviors that drive cranial mesenchyme morphogenesis remain poorly studied. Interactions between the ECM and the cells of the cranial mesenchyme underly these cell behaviors. Here we describe a simple ex vivo explant assay devised to characterize the behaviors of these cells. This assay is amendable to pharmacological manipulations to dissect the signaling pathways involved and live imaging analyses to further characterize the behavior of these cells. We present a representative experiment demonstrating the utility of this assay in characterizing the migratory properties of the cranial mesenchyme on a variety of ECM components.

The cranial mesenchyme undergoes dramatic morphogenic movements that likely provides a driving force for elevation of the neural folds1,2. Here we describe a simple ex vivo explant assay to characterize the cellular behaviors of the cranial mesenchyme during neurulation. This assay has numerous applications including being amenable to pharmacological manipulations and live imaging analyses.

Kranial mesenchyme Hücresel Davranış Değerlendirme için bir Eksplantasyon Assay

The central nervous system is derived from the neural plate that undergoes a series of complex morphogenetic movements resulting in formation of the ...

Biyoloji

Co-Culture of Murine Small Intestine Epithelial Organoids with Innate Lymphoid Cells

Complex co-cultures of organoids with immune cells provide a versatile tool for interrogating the bi-directional interactions that underpin the delicate balance of mucosal homeostasis. These 3D, multi-cellular systems offer a reductionist model for addressing multi-factorial diseases and resolving technical difficulties that arise when studying rare cell types such as tissue-resident innate lymphoid cells (ILCs). This article describes a murine system that combines small intestine organoids and small intestine lamina propria derived helper-like type-1 ILCs (ILC1s), which can be readily extended to other ILC or immune populations. ILCs are a tissue-resident population that is particularly enriched in the mucosa, where they promote homeostasis and rapidly respond to damage or infection. Organoid co-cultures with ILCs have already begun shedding light on new epithelial-immune signaling modules in the gut, revealing how different ILC subsets impact intestinal epithelial barrier integrity and regeneration. This protocol will enable further investigations into reciprocal interactions between epithelial and immune cells, which hold the potential to provide new insights into the mechanisms of mucosal homeostasis and inflammation.

This protocol offers detailed instructions for establishing murine small intestine organoids, isolating type-1 innate lymphoid cells from the murine small intestine lamina propria, and establishing 3-dimensional (3D) co-cultures between both cell types to study bi-directional interactions between intestinal epithelial cells and type-1 innate lymphoid cells.

Murin İnce Bağırsak Epitel Organoidlerinin Doğuştan Lenfoid Hücrelerle Ko-Kültürü

Complex co-cultures of organoids with immune cells provide a versatile tool for interrogating the bi-directional interactions that underpin the delicate ...

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over developmental stages. Three-dimensional information from thin serial sections can be challenging to interpret because of the difficulty of reconstructing serial sections perfectly and maintaining proper orientation of the tissue over serial sections. Recent findings by Grosse et al., 2011 highlight the importance of three- dimensional information in understanding morphogenesis of the developing villi of the intestine1. Three-dimensional reconstruction of singly labeled intestinal cells demonstrated that the majority of the intestinal epithelial cells contact both the apical and basal surfaces. Furthermore, three-dimensional reconstruction of the actin cytoskeleton at the apical surface of the epithelium demonstrated that the intestinal lumen is continuous and that secondary lumens are an artifact of sectioning. Those two points, along with the demonstration of interkinetic nuclear migration in the intestinal epithelium, defined the developing intestinal epithelium as a pseudostratified epithelium and not stratified as previously thought1. The ability to observe the epithelium three-dimensionally was seminal to demonstrating this point and redefining epithelial morphogenesis in the fetal intestine. With the evolution of multi-photon imaging technology and three-dimensional reconstruction software, the ability to visualize intact, developing organs is rapidly improving. Two-photon excitation allows less damaging penetration deeper into tissues with high resolution. Two-photon imaging and 3D reconstruction of the whole fetal mouse intestines in Walton et al., 2012 helped to define the pattern of villus outgrowth2. Here we describe a whole organ culture system that allows ex vivo development of villi and extensions of that culture system to allow the intestines to be three-dimensionally imaged during their development.

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Improved imaging technology is allowing three-dimensional imaging of organs during development. Here we describe a whole organ culture system that allows live imaging of the developing villi in the fetal mouse intestine.

Için Fare Fetal Tüm Bağırsak Kültür Sistemi<em&gt; Ex vivo</em&gt; Sinyal facebook ve villus Kalkınma Üç boyutlu Canlı Görüntüleme Manipülasyon

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...

Establishing Villous and Decidual Organ Cultures as Ex Vivo Models of Human Maternal-Fetal Interface

Source: Rizzuto, G. A., et al. <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/54237">Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface.</a> J. Vis. Exp. (2016).
This video demonstrates the establishment of primary human placental villous and decidual organ cultures in ex vivo conditions. These models are well-suited for studying pathogenesis at the human maternal-fetal interface.

İnsan Maternal-Fetal Arayüzünün Ex Vivo Modelleri Olarak Villöz ve Desidual Organ Kültürlerinin Kurulması

All procedures involving human participants have been performed in compliance with the institutional, national, and international guidelines for human ...

Diseksiyon ve Explant kültür Allantoic eki Vitro analizi için fare Allantois ve

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler