Bu eser Chang Gung tıbbi Vakfı (grant numarası CMRPG3C1771, CMRPG3C1772, CMRPG3E0631, CMRPG3E0632 ve CMRPG3E0633) tarafından desteklenmiştir.

Çalışma kurumsal inceleme kurulu, Chang Gung Memorial hastanede Linkuo, Taoyuan, Tayvan (102-2577A3) tarafından kabul edildi.
1. NR1-GFP ifade plazmid hazırlanması
<ol><li>NR1-GFP plazmid Mix 10 ng ile 100 µL Escherichia coli yetkili hücreleri zorlanma DH5α steril bir 1,5 ml tüp, damlalıklı karışımı yavaşça kadar santrifüj kapasitesi ve aşağı 4 - 6 kez ve buz için 20 dk metroyla kuluçkaya.</li>
	<li>Tüp bir su banyosunda 1 dk 42 ° C'de kuluçkaya, su banyosundan tüpü çıkarması, 1 mL lysogeny suyu (LB) orta tüpün içine ekleyin ve tüp 37 ° c için 1 h sallayarak ile bir kuluçka kuluçkaya.</li>
	<li>50 µL Ampisilin (0.1 mg/mL) içeren bir LB agar plaka üzerine karışımı spread ve LB agar plaka bir kuluçka 37 ° C'de gecede kuluçkaya.</li>
	<li>Bir koloni steril ucu kullanarak gecede LB agar plaka almak ve belgili tanımlık uç girdap bir 5 mL LB orta ve Ampisilin (0.1 mg/mL) de içeren bir bakteri kültürü tüp. Gecede sallayarak ile bir kuluçka 37 ° C'de tüp kuluçkaya.</li>
	<li>Aliquot 3 mL 250 mL steril LB orta ve Ampisilin (0.1 mg/mL) içeren bir 500 mL şişe içine gecede bakteri kültürü. Şişeye 37 ° C'de sallayarak ile kuluçkaya. Dalga boyu 600 adlı bakteri kültürü optik yoğunluk (OD) düzenli olarak kontrol OD600 0,6-1.0 ulaşıncaya kadar bir Spektrometre kullanılarak nm. Not: gece bakteriyel kültürünün de 800 µL gliserol hisse senedi hazırlamak ve gliserol hisse senedi altında-80 ° C ileride kullanmak üzere saklamak için 200 µL gliserol ile karıştırın.</li>
	<li>Nr1-GFP ifade plazmid ile 250 mL bakteriyel kültür hazırlamak<ol>
<li>Santrifüjü 6.000 x g 4 ° C'de 15 dakika de tarafından hücreleri toplamak</li>
		<li>Bakteri Pelet RNase A içeren 10 mL resuspension arabellekte resuspend; hiçbir yığın iyice görmüş kadar girdap.</li>
		<li>10 mL lizis arabellek bakteriyel süspansiyon eklemek, hafifçe karışım 4 - 6 kez ters ve lysate, oda sıcaklığında (RT) 5 min için kuluçkaya.</li>
		<li>10 mL önceden soğutulmuş yağış arabellek için lysate ekleyin, 4 - 6 kez karışımı yavaşça tersine çevirin.</li>
		<li>Lysate kapaklı bir filtre kartuşu varil içine dökün; RT, 10 dk bekleyin</li>
		<li>Kartuş çıkış meme kapağını çıkarın, bir dalgıç kartuşu takın ve pistonu hafifçe bastırın. Filtre uygulanmış toplamak bir 50 mL tüp içine lysate.</li>
		<li>Tüpü yaklaşık 10 kat ters çevirme tarafından karışımı karıştırın ve karışımı 30 dk için buz üzerinde kuluçkaya 2.5 mL özel arabelleğe üretici süzülmüş lysate ekleyin.</li>
		<li>Filtre uygulanmış lysate karışımı ile 10 mL denge tampon ön dengelenmiş bir filtre sütun uygulanır. Yerçekimi tarafından boşaltmak sütun izin.</li>
		<li>Sütun 30 mL yıkama arabellek ile iki kez yıkayın, sonra 15 mL elüsyon tampon kullanarak sütundan DNA elute.</li>
		<li>10.5 mL (0.7 birimler) isopropanol eluted DNA arabelleğe ekleyin, karıştırın ve 20.000 x g 4 ° C'de 30 dk için karisimin santrifüj kapasitesi</li>
		<li>Süpernatant özenle dikkatle boşaltmak, DNA Pelet 5 mL endotoksin-Alerjik % 70 etanol ile bir kez yıkama ve 20.000 x g 10 dk de santrifüj kapasitesi.</li>
		<li>Süpernatant dikkatle boşaltmak, 5-10 dk bir kimyasal başlıklı Pelet Makinası ve 300-500 µL endotoksin-Alerjik arabelleği Pelet geçiyoruz.</li>
		<li>Belgili tanımlık eriyik vasıl bir Spektrofotometre kullanarak UV 260/280 nm emilimini ölçerek plazmid konsantrasyonu belirlemek. Not: ifade plazmid aynı iletişim kuralını kullanarak GFP hazırlık.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. transfection HEK293 hücre NR1-GFP ifade plazmid ile
<ol><li>Aliquot 200 µL % 2 jelatin çözüm her bir 48-şey kültür tabak iyi ve plaka için en az 30 dk. 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
	<li>200 µL % 10 fetal sığır serum (FBS) her iyi içeren hücre kültür ortamının iyi ve tohum 5 x 104 HEK293 hücrelerinde jelatin çözümden Aspire edin. Gecede %5 CO2 ile sağlanan bir oksijen kuluçka 37 ° C'de plaka kuluçkaya. Not: Bir hemasitometre kullanarak hücreleri sayıldı.</li>
	<li>Ertesi gün, taze kültür orta % 10 içeren 200 µL ile harcanan kültür orta yerine FBS iyi başına.</li>
	<li>Her, tek şey, hazırlamak çözüm A 100 karıştırılarak NR1-tGFP plazmid 20 µL kültür orta ve 0.8 µL transfection reaktif 20 µL kültür orta ile karıştırma tarafından çözüm B ng. Toplam hacim her deneme için hazırlamak için gerekli olan kuyu sayısını çarpın.</li>
	<li>Çözüm C çözüm A ve çözüm B karıştırarak hazırlayın ve RT karisimin 20-30 dk için kuluçkaya.</li>
	<li>Her şey HEK293 hücreleri içeren için çözüm C aliquot 40 µL plaka yavaşça girdap ve plaka gecede %5 CO2 ile sağlanan bir oksijen kuluçka 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
	<li>Ifade NR1-GFP rekombinant protein 40 X-200 X büyütme ile floresan mikroskop altında ana bilgisayar hücrelerdeki kontrol (uyarma/emisyon: 482/502 nm) ve hücre tabanlı ayirt tahlil için devam edin. Not: aynı iletişim kuralını kullanarak HEK293 hücre içine ifade plazmid GFP Transfect.</li>
</ol>3. hücre tabanlı ayirt tahlil
<ol><li>Kuyulardan harcanan orta Aspire edin, sonra yıkama her şey ile fosfat 200 µL serum fizyolojik (PBS) üç kez arabelleğe alınmış.</li>
	<li>Her şey için 200 µL % 4 paraformaldehyde çözüm ekleyin; RT plaka 15dk için kuluçkaya.</li>
	<li>Paraformaldehyde çözüm kuyulardan Aspire edin ve her yıkama PBS 200 µL ile üç kez iyi.</li>
	<li>PBST içinde 200 µL % 10 yağsız süt ekleyin (% 0,1 ara-20 PBS) her şey ve RT plaka nazik sallayarak ile 1 h için kuluçkaya çözüm.</li>
	<li>% 10 yağsız süt kuyudan PBST çözümünde Aspire edin, sonra 200 µL PBST Wells'le bir kez yıkayın.</li>
	<li>Nazik RT için 1 h sallayarak ile birincil antikor olarak seyreltilmiş plazma (1: 100 PBST içinde) Wells'le kuluçkaya. Not: Otoimmün beyin iltihabı için şüpheli hastaların kan plazma elde edilir.</li>
	<li>Kuyulardan seyreltilmiş plazma Aspire edin ve her yıkama PBST 200 µL ile üç kez iyi.</li>
	<li>Keçi Anti-insan IgG Alexa Fluor 594 (1:1, 000 seyreltme PBST) ile her şey için Birleşik 200 µL ekleyin ve nazik için 1 h sallayarak ile kültür plaka RT, kuluçkaya.</li>
	<li>IgG Birleşik Alexa Fluor 594 Çözümle keçi Anti-insan Aspire edin ve her yıkama PBST 200 µL ile üç kez iyi.</li>
	<li>100 µL gliserol çözüm (PBS ve 1:100,000, 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) % 50 gliserol) her şey için ekleyin.</li>
	<li>Gözlemlemek ve hücreleri kullanarak bir 10 X mercek ve 4 X, 10 X ve 20 X hedefleri floresan mikroskop altında görüntü. Not: her boya için doğru filtre kullanın: NR1-GFP için (uyarma/emisyon 482/502 = nm), Alexa Fluor 594 için (uyarma/emisyon 561/594 = nm), DAPI için (uyarma/emisyon 358/461 = nm). GFP aynı şekilde ifade HEK hücreleri kullanarak negatif kontrol kuralları.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Linnoila, J. J., Rosenfeld, M. R., Dalmau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+surface+antibody-mediated+autoimmune+encephalitis.">Neuronal surface antibody-mediated autoimmune encephalitis.</a> Semin Neurol. 34 (4), 458-466 (2014).</li><li>Lancaster, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+diagnosis+and+treatment+of+autoimmune+Encephalitis.">The diagnosis and treatment of autoimmune Encephalitis.</a> J Clin Neurol. 12 (1), 1-13 (2016).</li><li>Pruss, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrospective+analysis+of+NMDA+receptor+antibodies+in+encephalitis+of+unknown+origin.">Retrospective analysis of NMDA receptor antibodies in encephalitis of unknown origin.</a> Neurology. 75 (19), 1735-1739 (2010).</li><li>Leypoldt, F., Armangue, T., Dalmau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoimmune+encephalopathies.">Autoimmune encephalopathies.</a> Ann N Y Acad Sci. 1338, 94-114 (2015).</li><li>Dalmau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-NMDA-receptor+encephalitis:+case+series+and+analysis+of+the+effects+of+antibodies.">Anti-NMDA-receptor encephalitis: case series and analysis of the effects of antibodies.</a> Lancet Neurol. 7 (12), 1091-1098 (2008).</li><li>Titulaer, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+and+prognostic+factors+for+long-term+outcome+in+patients+with+anti-NMDA+receptor+encephalitis:+an+observational+cohort+study.">Treatment and prognostic factors for long-term outcome in patients with anti-NMDA receptor encephalitis: an observational cohort study.</a> Lancet Neurol. 12 (2), 157-165 (2013).</li><li>Chapman, M. R., Vause, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-NMDA+receptor+encephalitis:+diagnosis,+psychiatric+presentation,+and+treatment.">Anti-NMDA receptor encephalitis: diagnosis, psychiatric presentation, and treatment.</a> Am J Psychiatry. 168 (3), 245-251 (2011).</li><li>Gable, M., Glaser, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-n-methyl-d-aspartate+receptor+encephalitis+appearing+as+a+new-onset+psychosis:+disease+course+in+children+and+adolescents+within+the+california+encephalitis+project.">Anti-n-methyl-d-aspartate receptor encephalitis appearing as a new-onset psychosis: disease course in children and adolescents within the california encephalitis project.</a> Pediatr Neurol. 72, 25-30 (2017).</li><li>Dalmau, J., Lancaster, E., Martinez-Hernandez, E., Rosenfeld, M. R., Balice-Gordon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+experience+and+laboratory+investigations+in+patients+with+anti-NMDAR+encephalitis.">Clinical experience and laboratory investigations in patients with anti-NMDAR encephalitis.</a> Lancet Neurol. 10 (1), 63-74 (2011).</li><li>Dalmau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Paraneoplastic+anti-N-methyl-D-aspartate+receptor+encephalitis+associated+with+ovarian+teratoma.">Paraneoplastic anti-N-methyl-D-aspartate receptor encephalitis associated with ovarian teratoma.</a> Ann Neurol. 61 (1), 25-36 (2007).</li><li>Irani, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-methyl-D-aspartate+antibody+encephalitis:+temporal+progression+of+clinical+and+paraclinical+observations+in+a+predominantly+non-paraneoplastic+disorder+of+both+sexes.">N-methyl-D-aspartate antibody encephalitis: temporal progression of clinical and paraclinical observations in a predominantly non-paraneoplastic disorder of both sexes.</a> Brain. 133 (Pt 6), 1655-1667 (2010).</li><li>Suh-Lailam, B. B., Haven, T. R., Copple, S. S., Knapp, D., Jaskowski, T. D., Tebo, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-NMDA-receptor+antibody+encephalitis:+performance+evaluation+and+laboratory+experience+with+the+anti-NMDA-receptor+IgG+assay.">Anti-NMDA-receptor antibody encephalitis: performance evaluation and laboratory experience with the anti-NMDA-receptor IgG assay.</a> Clin Chim Acta. 421, 1-6 (2013).</li><li>Mayer, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+biology+of+glutamate+receptor+ion+channel+complexes.">Structural biology of glutamate receptor ion channel complexes.</a> Curr Opin Struct Biol. 41, 119-127 (2016).</li><li>Ramberger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+diagnostic+accuracy+of+microscopy+and+flow+cytometry+in+evaluating+n-methyl-d-aspartate+receptor+antibodies+in+serum+using+a+live+cell-based+assay.">Comparison of diagnostic accuracy of microscopy and flow cytometry in evaluating n-methyl-d-aspartate receptor antibodies in serum using a live cell-based assay.</a> PLoS One. 10 (3), e0122037 (2015).</li><li>Wandinger, K. P., Saschenbrecker, S., Stoecker, W., Dalmau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-NMDA-receptor+encephalitis:+a+severe,+multistage,+treatable+disorder+presenting+with+psychosis.">Anti-NMDA-receptor encephalitis: a severe, multistage, treatable disorder presenting with psychosis.</a> J Neuroimmunol. 231 (1-2), 86-91 (2011).</li><li>Dahm, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seroprevalence+of+autoantibodies+against+brain+antigens+in+health+and+disease.">Seroprevalence of autoantibodies against brain antigens in health and disease.</a> Ann Neurol. 76 (1), 82-94 (2014).</li><li>J&#233;z&#233;quel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-+and+single+molecule-based+methods+to+detect+anti-n-methyl-d-aspartate+receptor+autoantibodies+in+patients+with+first-episode+psychosis+from+the+OPTiMiSE+project.">Cell- and single molecule-based methods to detect anti-n-methyl-d-aspartate receptor autoantibodies in patients with first-episode psychosis from the OPTiMiSE project.</a> Biol Psychiatry. , (2017).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Orada canlı hücre tabanlı ayirt tahlil11hücre tabanlı ayirt tahlil9 sabit, dahil olmak üzere literatürde bildirilen NMDA reseptör karşı otoantikorlar varlığı ekran için çeşitli hücre tabanlı immünolojik deneyleri , ve Akış Sitometresi tabanlı tahlil14. Canlı hücre tabanlı ayirt tahlil Akış Sitometresi tabanlı tahlil eğitimli personel ve özel ekipman gerekirken NR1 protein ectopically ifade hücreleri hazırlık kısa bir süre sonra yapılmalıdır. Bir sabit hücre tabanlı ayirt tahlil için klinik ayarları yapılabilir daha uygun bir tahlil olduğunu. Bu nedenle, birçok çalışma ticari dolaylı sabit hücre tabanlı ayirt tahlil ekran anti-NMDA reseptör antikor serum ve CSF numuneler12,15için kullanılır. Paketi kullanılan (bkz: malzemelerin tablo) rekombinant NR1 alt birim NMDA reseptör ectopically hızlı sabit HEK293 hücreler içeriyor. Tahlil içinde anti-NMDA reseptör IgG antikor serum ve CSF numuneler12hafiye mükemmel performansa sahip değerlendirilmiştir. NR1-GFP ifade plazmid kullandığımız dışında bizim iletişim kuralında, biz aynı yaklaşımı seti üreticisi tarafından önerilen olarak kullanılır. NR1-GFP protein transfection verimliliği ve dağıtım NR1 protein her denemede izlemek için kullanılabilir. Bu nedenle, tahlil kalite kullanılabilir.
NR1-GFP ifade plazmid transfection verimliliğini HEK293 hücre içine ayirt tahlil için yeterli burada anlatılan protokolündeki yaklaşık % 30 değil. Ancak, yeşil floresan yoğunluğuna eşit olarak transfected hücreler arasında dağıtılmış değil transfection veya ifade yeteneği bireysel hücrelerin verimliliğini farklılıkları düşündüren bulduk. Rekombinant NR1-GFP farklı hücrelerinde farklı ifade düzeyde hànzú yoğunluğu neden yeşil görüntü Alexa Fluor 594 kırmızı görüntü ile birleşti. IgG Alexa Fluor 594 ile Birleşik keçi Anti-insan ikincil antikor insan antikor IgG sınıfı olup olmadığını belirlemek için kullanıldı. Biz Alexa Fluor 594 parlaklığını yeşil flüoresan protein nispeten zayıf olduğunu fark ettik. Sinyal şiddeti IgG Alex Fluor 594 ile ancak, de arttı arka plan Birleşik Anti-insan konsantrasyonunu artırarak optimize etmek çalıştık. Bu nedenle, en iyi anti-IgG Alex Fluor 594 ile Birleşik insan için 1:1,000 bu laboratuvar bölgedir. Ayrıca, bazı plazma numuneleri önemli ölçüde yüksek bir arka plan vardı Alexa Fluor 594 resimdeki sinyal. Farklı dilutions plazma test edildi ve en az bir seyreltme 1: 100 örneklerin çoğu için temiz bir arka plan elde etmek gerekli bulundu. Bu nedenle, bu iletişim kuralı standart aşama olarak plazma 1: 100 seyreltme öneririz. Serum örneği kan örneği11,161:10 ve 1:20 seyreltme tespit edebilen diğer hücre tabanlı deneyleri ile karşılaştırıldığında, bu geçerli protokol düşük titresi anti-NMDA reseptör otoantikorlar algılamak için yeterli duyarlılığa sahip değil, Bu bir protokol kısıtlamasıdır.
Geçerli bir sabit hücre tabanlı ayirt tahlil protokolüdür. Kültür plaka fiksasyon ilâ 1 ay ile karşılaştırıldığında uzun süre saklanamaz canlı hücre tabanlı tahlil için daha sonra kullanmak sonra 4 ° C buzdolabında saklanabilir. Ancak, NR1 protein denatüre ve onun doğal uyum için anti-NMDA reseptör otoantikorlar bağlar epitope biçimi etkileyebilir fiksasyon işlemi sırasında kaybetmek. Bu nedenle, bazı çalışmalarda canlı hücre tabanlı immunofluorescene11,17kabul etmiştir. Bizim iletişim kuralı, eğer biz ilk canlı hücreler plazma örnekle kuluçkaya ve sonra hücreleri tamir NR1 proteinin doğal uyum korumak için canlı hücre tabanlı ayirt tahlil olmak için alternatif olarak değiştirilebilir. Böylece, deneme ihtiyacı karşılamak için iletişim kuralında esneklik vardır.
NMDA reseptör NR1, NR2A, NR2B, NR2C ve NR2D oluşan heterotetramer karmaşık bir proteindir. Geçerli protokol NR1 alt birim NMDA reseptör karşı antikor IgG sınıfının algılamak için tasarlanmıştır. Anti-insan IgG ikincil antikorlar ikincil antikorlar belirli diğer sınıfı tarafından değiştirilir sürece protokolü de otoantikorlar, farklı isotypes algılamak için değiştirilebilir. Ayrıca, geçerli protokol NR1-GFP ifade plazmid ile ilgili ifade plazmid, sırasıyla yerine NR2A, NR2B, NR2C ve NR2D, karşı otoantikorlar olup olmadığını belirlemek için değiştirilebilir.
Bu protokol için bir plazma örnek serum yerine, çünkü biz düzenli olarak çeşitli eğitim amaçlar için kan örneği ile Anti-koagulant toplamak, ancak protokol serum veya CSF numuneler için uygulayabilirsiniz kullandık. Plazma otoantikorlar titresi örnek seri seyreltme tarafından sayısal. Laboratuvarda da aynı iletişim kuralını kullanarak konak hücreleri Afrika yeşil maymun böbrek fibroblast benzeri hücre kültürünü (COS1) sınav. COS1 hücreleri HEK293 hücreleri daha biraz daha düşük bir transfection verimliliği sahip dışında aynı olan HEK293 hücreleri kullanarak sonuçlarıdır.
Anti-NMDA reseptör otoantikorlar varlığı tespit için bu kemirgen beyin dokuları kullanarak immünhistokimya gibi ek deneyler tahlil ve5 immunocytochemistry nöronlar olmak birincil kültürlü kemirgen kullanarak gerçekleştirilen önerilmektedir ,9. Bu nedenle, geçerli protokol yalnızca bir tarama yöntemi kabul edilebilir. Her ne kadar deneysel geçerliliğini olumlu denetimi örneğini kullanarak bu çalışmada, duyarlılık doğrulandı ve klinik ayarları bu testin özgüllüğü gerekir gelecekte kurulacak eğitim.

Anti-NMDA reseptör otoimmün ensefalit her yaştaki hastalarda gelişebilir ve ağırlıklı olarak kadın hasta1,2etkiler bir yeni tanınan hastalığı varlıktır. Ensefalit3ilk bilinmeyen etiyolojisi olan hastalarda en sık tanı konmuş ensefalit biridir. Hastalar genellikle Anti-NMDA reseptör ensefalit ile etkilenen bir baş ağrısı ya da ateş, bilinç düzeyini değiştirmek ve ajitasyon, sinirlilik gibi akut nöropsikiyatrik belirtiler çeşitli hızlı geliştirme tarafından takip prodromal belirtiler var , anksiyete, uykusuzluk, Varsanılar, sanrılar, saldırganlık, tuhaf davranışlar, hareketi anormallikleri, otonomik bozukluk ve nöbet saldırıları4,5. Bu koşul ve immünoterapi ile zamanında tedavi erken tanınması daha iyi sonuç ve etkilenen hastalar6bile tam kurtarma için önemlidir. Bu nedenle, bu anti-NMDA reseptör otoimmün beyin iltihabı akut veya yeni başlangıçlı psikotik özellikler7,8ile başvuran hastaların önemli bir ayırıcı tanı olarak düşünülmesi gereken önerilmektedir.
Klinik özelliklerin yanında hafiye-in kan veya CSF NMDA reseptör karşı antikor anti-NMDA reseptör otoimmün ensefalit9doğru tanı için önemlidir. Anti-NMDA reseptör antikor algılamaya immünolojik testler çoğu birkaç araştırma laboratuvarları10,11' kullanılabilir ve tek bir piyasada bulunan hücre tabanlı ayirt tahlil için tarama olduğunu Anti-NMDA reseptör otoantikorlar12. Bu çalışmanın amacı uygun laboratuvar olarak anti-NMDA reseptör klinik araştırma kolaylaştırmak için anti-NMDA reseptör otoantikorlar varlığı ekran için kullanılan basit içi hücre tabanlı ayirt tahlil geliştirmektir Otoimmün ensefalit. NMDA reseptör özellikle beyin ve ifade bir heterotetramer iyon kanal protein kompleksi var. Bu iki zorunlu NR1 alt birimleri ve NR2A, NR2B, NR2C veya NR2D13bir ya da iki alt birimleri ile birlikte yapılır. Bir önceki çalışma antikorlar tarafından hedef ana epitope NR1 alt birim5ekstraselüler N-terminal etki olduğunu bildirdi. Bu nedenle, bu iletişim kuralı, biz insan rekombinant NR1 alt birim proteini insan embriyonik böbrek epitel hücre satırı (HEK293) yeşil flüoresan protein (GFP) tagged NMDA reseptör hızlı ve algılamak için bir hücre tabanlı ayirt testi geliştirmek anti-NMDA reseptör otoantikorlar kan IgG sınıf.

<table><tbody><tr><td>GRIN1 (GFP-tagged) - Human glutamate receptor, ionotropic, N-methyl D-aspartate 1 (GRIN1), transcript variant NR1-1</td><td>Origene (Rockville, MD, USA)</td><td>RG219368</td><td>NR1-cDNA clone tagged with C-terminal tGFP sequences</td></tr><tr><td>pCMV6-AC-GFP</td><td>Origene (Rockville, MD, USA)</td><td>PS100010</td><td>mammalian vector with C-terminal tGFP tag</td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td><td>Qiagen (Hilden Germany)</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td><td>Invitrogen (Carlsbad, CA, USA)</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td><td>Thermo Fisher</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, High Glucose, Pyruvate</td><td>Thermo Fisher</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>Characterized Fetal Bovine Serum, US Origin</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30071.01</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Human IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 594 conjugate</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-11014</td><td></td></tr><tr><td>Positive control: anti-glutamate receptor (type NMDA)</td><td>Euroimmun AG, L&amp;uuml;beck, Germany</td><td>CA 112d-0101</td><td></td></tr><tr><td>Euroimmun Assay Kit</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a simple cell-based immunofluorescence assay to detect autoantibody against the n-methyl-d-aspartate (nmda) receptor in blood

Anti-NMDA reseptör antikor varlığı çeşitli nöropsikiyatrik belirtiler etkilenen hastalarda anti-NMDA reseptör otoimmün ensefalit olarak adlandırdığı, neden olabilir. NMDA reseptör kan veya beyin-omurilik sıvısı (bos) karşı belirli antikor tespiti bu durumun doğru tanı için önemlidir. NMDA reseptör iki zorunlu NMDA reseptör alt birim 1 (NR1) ve bir ya da iki NMDA reseptör dahil olmak üzere dört alt birimleri içeren bir iyon kanal karmaşık proteindir alt birim 2A (NR2A), NMDA reseptör alt birim 2B (NR2B), NMDA reseptör alt birim 2C (NR2C), veya NMDA reseptör alt birim 2D (NR2D). Anti-NMDA reseptör antikor epitope bir NMDA reseptör NR1 alt birimi hücre dışı N-terminal etki mevcut olduğu bildirildi. Bu çalışmanın amacı bir tarama testi klinik ve temel araştırma kolaylaştırmak için kanda NR1 alt birim NMDA reseptör karşı otoantikorlar olup olmadığını belirlemek için kullanılan bir basit hücre tabanlı ayirt tahlil geliştirmektir Anti-NMDA reseptör otoimmün ensefalit.

Ortalama olarak, biz 200-300 µg endotoksin ücretsiz ifade plazmid NR1-GFP ve GFP 250 mL bakteriyel kültüründen Protokolü'nün 1 bölümünde açıklanan yordamı edinebilir. Bir miktar 100 ng/iyi ifade plazmid 48-şey plaka protokol 2 bölümde açıklandığı gibi kültürlü HEK293 hücre transfection için kullanıldı. 24-30 h transfection sonra hücreleri NR1 GFP ifade ve GFP rekombinant proteinler floresan mikroskop altında tespit edilemedi. Şekil 1A şekil 1 d GFP ifade hücreleri gösterirken NR1-GFP, hızlı ana hücreleri görüntüsünü gösterir. Yeşil sinyal tahlil kalite denetleyicisi olarak kullanılabilir: hücreleri yaklaşık % 30 floresan mikroskop altında yeşil sinyalleri vardı. Şekil 1A ve 1B NR1 GFP hızlı konak hücreleri görüntüsünü göster. Yeşil sinyal tahlil kalite denetleyicisi olarak kullanılabilir: hücreleri yaklaşık % 30 floresan mikroskop altında yeşil sinyalleri vardı. Nr1-GFP ifade hücreleri anti-NMDA reseptör otoantikorlar insan plazma örnek varlığı için eleme.
İletişim kuralı 3 bölümde açıklandığı gibi hücre tabanlı ayirt assay olarak olumlu örnek kontrol (ticari bir kaynaktan elde edilen, Tablo malzemelerigörmek) için havuza alınan plazma 1:10 eklendi göre seyreltme prosedürü yerine getirin. Havuza alınan plazma 5 Yetişkin erkek ve 5 Yetişkin kadın hazırlanmıştır. 1e rakam olumlu denetimi örneğini Alexa Fluor-594 görüntü hücre ifade GFP ile kuluçka sonra iken şekil 1B Alexa Fluor-594 olumlu denetimi örneğini kuluçka hücreleri ifade NR1-GFP, ile sonra görüntüsüdür. Şekil 1 c bir birleştirilmiş görüntü şekil 1A ve şekil 1B: yeşil sinyalleri ve aynı hücrede kırmızı sinyalleri NR1-GFP co lokalizasyonu ve NMDA NR1 altbirim karşı antikor gösteren önemli programların çakışmasını vardır reseptör (oklar). 30 %'den büyük gösteren bir plazma örnek yeşil ile çakışıyor ve kırmızı sinyalleri olumlu olarak bu durumda yorumlanır. Şekil 1F şekil 1 d ve negatif kontrol şekil 1 ciçin hizmet verdiği rakam 1E birleştirilmiş görüntüdür. Zayıf kırmızı renk arka plan Floresans Alexa Fluor-594 resmin var. Anti-NMDA reseptör antikor rekombinant protein karşı hiçbir bağlama gösteren yeşil ve kırmızı sinyallerin küçük örtüşme vardır.
Plazma numuneleri test edildi zaman deneysel prosedürler kurulması sırasında biz bir düşük sinyal-gürültü oranı Alexa Fluor-594 gözlenen. Plazma formu 1:10, 1:50, 1: 100, seri bir seyreltme yaparak sinyal-gürültü oranı en iyi duruma getirmek için çalıştı ve 1: 200 ve Alex Fluor-594 farklı konsantrasyonlarda test ikincil 1:500 1:2, 000 antikor etiketli. O 1: 100 seyreltme Alexa Fluor-594 plazma ve 1:1,000 veya 1:2,000 seyreltme, verilerin yorumlanması için uygun koşulları bulunmuştur.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56676/56676fig1v3.jpg"> Şekil 1: anti-NMDA reseptör antikor algılamak için hücre tabanlı ayirt testin temsilcisi görüntüler. (A)görüntü NR1-GFP hızlı HEK293 hücre. (B) olumlu denetim örneği ile kuluçka sonra a aynı alandan alınan Alexa Fluor-594 görüntü. Kırmızı sinyal anti-NMDA reseptör otoantikorlar HEK293 hücrelerde ifade NR1 için bağlama gösterir. (C) A ve Bbirleştirilen görüntü. Sarı renk NR1 co lokalizasyonu gösterir (yeşil sinyal) ve anti-NMDA reseptör otoantikorlar (kırmızı sinyal). Oklar co yerelleştirme NR1-GFP ve anti-NMDA reseptör otoantikorlar gösterilen bazı önemli hücre örnekleri gösterir. HEK293 (D) görüntü ifade NR1-GFP hücreleri. (E) olumlu denetim örneği ile kuluçka sonra D aynı alandan alınan Alexa Fluor-594 görüntü. Zayıf kırmızı sinyal Alexa Fluor-594 görüntünün arka plan gürültü gösterir. (F) D ve EBirleştirilen görüntüyü. Olarak küçük sarı sinyal gözlenen bu görüntü bir negatif kontrol hizmet vermektedir. Negatif kontrol görüntü anti-NMDA özel bağlayıcı reseptör antikorları NR1 GFP için tahlil gösterir. Tüm görüntüleri küçük 10 X gözü lens ve 20 X lens objektif alındı. <a href="https://cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56676/56676fig1v3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Simple Cell-based Immunofluorescence Assay to Detect Autoantibody Against the N-Methyl-D-Aspartate NMDA Receptor in Blood at JoVE.com

A Simple Cell-based Immunofluorescence Assay to Detect Autoantibody Against the N-Methyl-D-Aspartate NMDA Receptor in Blood

NR1 alt birim NMDA reseptör karşı otoantikorlar ile otoimmün ensefalit şüphesi hastaların kan algılamak için antijen olarak insan embriyonik hücreleri (HEK293) yeşil flüoresan protein tagged NMDA reseptör ectopically dile getirdi. Bu basit yöntem klinik ayarları, amacıyla filtreleme için uygun olabilir.

N-metil-D-Aspartat (NMDA) reseptör karşı antikor kanında tespit etmek için basit hücre tabanlı ayirt tahlil

The presence of anti-NMDA receptor autoantibody can cause various neuropsychiatric symptoms in the affected patients, termed anti-NMDA receptor autoimmune ...

a-simple-cell-based-immunofluorescence-assay-to-detect-autoantibody

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

A Simple Cell-based Immunofluorescence Assay to Detect Autoantibody Against the N-Methyl-D-Aspartate (NMDA) Receptor in Blood

9.8K Görüntüleme.  Chang Gung Memorial Hospital-Linkou. NR1 alt birim NMDA reseptör karşı otoantikorlar ile otoimmün ensefalit şüphesi hastaların kan algılamak için antijen olarak insan embriyonik hücreleri (HEK293) yeşil flüoresan protein tagged NMDA reseptör ectopically dile getirdi. Bu basit yöntem klinik ayarları, amacıyla filtreleme için uygun olabilir.

Video: A Simple Cell-based Immunofluorescence Assay to Detect Autoantibody Against the N-Methyl-D-Aspartate NMDA Receptor in Blood

Detection of MicroRNAs in Microglia by Real-time PCR in Normal CNS and During Neuroinflammation

Microglia are cells of the myeloid lineage that reside in the central nervous system (CNS)1. These cells play an important role in pathologies of many diseases associated with neuroinflammation such as multiple sclerosis (MS)2. Microglia in a normal CNS express macrophage marker CD11b and exhibit a resting phenotype by expressing low levels of activation markers such as CD45. During pathological events in the CNS, microglia become activated as determined by upregulation of CD45 and other markers3. The factors that affect microglia phenotype and functions in the CNS are not well studied. MicroRNAs (miRNAs) are a growing family of conserved molecules (~22 nucleotides long) that are involved in many normal physiological processes such as cell growth and differentiation4 and pathologies such as inflammation5. MiRNAs downregulate the expression of certain target genes by binding complementary sequences of their mRNAs and play an important role in the activation of innate immune cells including macrophages6 and microglia7. In order to investigate miRNA-mediated pathways that define the microglial phenotype, biological function, and to distinguish microglia from other types of macrophages, it is important to quantitatively assess the expression of particular microRNAs in distinct subsets of CNS-resident microglia. Common methods for measuring the expression of miRNAs in the CNS include quantitative PCR from whole neuronal tissue and in situ hybridization. However, quantitative PCR from whole tissue homogenate does not allow the assessment of the expression of miRNA in microglia, which represent only 5-15% of the cells of neuronal tissue. Hybridization in situ allows the assessment of the expression of microRNA in specific cell types in the tissue sections, but this method is not entirely quantitative. In this report we describe a quantitative and sensitive method for the detection of miRNA by real-time PCR in microglia isolated from normal CNS or during neuroinflammation using experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), a mouse model for MS. The described method will be useful to measure the level of expression of microRNAs in microglia in normal CNS or during neuroinflammation associated with various pathologies including MS, stroke, traumatic injury, Alzheimer's disease and brain tumors.

Microglia are resident macrophages that provide the first line of defense and immune surveillance of the central nervous system. MicroRNAs are regulatory molecules that play an important role in many physiological processes including activation and differentiation of macrophages. In this article, we describe the method for measurement of microRNAs in microglia.

Normal MSS Real-time PCR ve Nöro sırasında mikroglia içinde microRNA tespiti

Microglia are cells of the myeloid lineage that reside in the central nervous system (CNS)1. These cells play an important role in pathologies of many ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases in children and adults. These antibodies have been used to guide diagnosis and treatment. Cell-based assays have improved the detection of antibodies in patient serum. They are based on the surface expression of brain antigens on eukaryotic cells, which are then incubated with diluted patient sera followed by fluorochrome-conjugated secondary antibodies. After washing, secondary antibody binding is then analyzed by flow cytometry. Our group has developed a high-throughput flow cytometry live cell-based assay to reliably detect antibodies against specific neurotransmitter receptors. This flow cytometry method is straight forward, quantitative, efficient, and the use of a high-throughput sampler system allows for large patient cohorts to be easily assayed in a short space of time. Additionally, this cell-based assay can be easily adapted to detect antibodies to many different antigenic targets, both from the central nervous system and periphery. Discovering additional novel antibody biomarkers will enable prompt and accurate diagnosis and improve treatment of immune-mediated disorders.

Over the recent years, live cell-based assays have been used successfully to detect antibodies against surface and conformational antigens. Here, we describe a method using high-throughput flow cytometry enabling the analysis of large cohorts of patients. Detection of novel antibodies will improve diagnosis and treatment of immune-mediated disorders.

İnsan Serum içinde N-metil-D-aspartat reseptör ya da dopamin-2 reseptör antikorları algılamak üzere yüksek verimli Flow Cytometry hücre bazlı bir deneyde

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

Tıp

Generation of Two-color Antigen Microarrays for the Simultaneous Detection of IgG and IgM Autoantibodies

Autoantibodies, which are antibodies against self-antigens, are present in many disease states and can serve as markers for disease activity. The levels of autoantibodies to specific antigens are typically detected with the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) technique. However, screening for multiple autoantibodies with ELISA can be time-consuming and requires a large quantity of patient sample. The antigen microarray technique is an alternative method that can be used to screen for autoantibodies in a multiplex fashion. In this technique, antigens are arrayed onto specially coated microscope slides with a robotic microarrayer. The slides are probed with patient serum samples and subsequently fluorescent-labeled secondary antibodies are added to detect binding of serum autoantibodies to the antigens. The autoantibody reactivities are revealed and quantified by scanning the slides with a scanner that can detect fluorescent signals. Here we describe methods to generate custom antigen microarrays. Our current arrays are printed with 9 solid pins and can include up to 162 antigens spotted in duplicate. The arrays can be easily customized by changing the antigens in the source plate that is used by the microarrayer. We have developed a two-color secondary antibody detection scheme that can distinguish IgG and IgM reactivities on the same slide surface. The detection system has been optimized to study binding of human and murine autoantibodies.

We describe here a method to generate customizable antigen microarrays that can be used for the simultaneous detection of serum IgG and IgM autoantibodies from humans and mice. These arrays allow for high-throughput and quantitative detection of antibodies against any antigens or epitopes of interest.

IgG ve IgM Antikorlarının Eşzamanlı Algılama için İki Renkli Antijen Mikroarray&#39;ler Üretimi

Autoantibodies, which are antibodies against self-antigens, are present in many disease states and can serve as markers for disease activity. The levels ...

Simultaneous Distinction of Monospecific and Mixed DFS70 Patterns During ANA Screening with a Novel HEp-2 ELITE/DFS70 Knockout Substrate

Systemic autoimmune connective tissue disorders are characterized by circulating antinuclear antibodies (ANA). Although there are several technologies available for ANA screening, indirect immunofluorescence (IIF) using Human epithelial cells-2 (HEp-2) substrate remains the primary and recommended method because of its superior sensitivity. HEp-2 substrates can detect a multitude of patterns resulting from autoantibody binding to various protein and nucleic acid autoantigens distributed throughout the nucleus and cytoplasm of the cells. The great diversity of monospecific and mixed patterns resulting from positive reactions on HEp-2 substrate also complicate the interpretation and accuracy of reporting. One specific example which received utmost attention recently is the dense fine speckled 70 (DFS70) pattern resulting from autoantibodies that specifically bind to a protein called lens epithelium derived growth factor (LEDGF). Lack of clear association with a specific systemic autoimmune disease and high prevalence in healthy populations have made accurate interpretation of DFS70 pattern important. Accurate distinction of DFS70 pattern from disease-associated patterns using conventional HEp-2 substrate is challenging. Moreover, frequent co-occurrence of DFS70 pattern along with disease-associated patterns such as homogeneous, speckled, and mixed homogeneous-speckled patterns complicate the IIF interpretation. The goal of this paper is to demonstrate the utility of a novel engineered HEp-2 IIF substrate that retains all advantages of conventional HEp-2 substrate while simultaneously providing the ability to distinguish DFS70 pattern with high confidence in both monospecific and mixed ANA positive examples. The new substrate is further able to unmask disease-associated ANA patterns previously concealed by DFS70 pattern.

DFS70 autoantibodies mimic common disease-associated antinuclear antibody patterns making accurate interpretation challenging when using conventional HEp-2 substrates. The protocol describes advantages of novel engineered HEp-2 substrate over conventional HEp-2 in ANA screening and distinguishing DFS70 patterns with high confidence in both monospecific and mixed ANA positive cases.

Monospecific ve karışık DFS70 desen bir roman hepatit-2 ELITE/DFS70 nakavt substrat ile birlikte ANA tarama sırasında eşzamanlı ayrım

Systemic autoimmune connective tissue disorders are characterized by circulating antinuclear antibodies (ANA). Although there are several technologies ...

Human Serum Anti-aquaporin-4 Immunoglobulin G Detection by Cell-based Assay

Anti-aquaporin-4 (AQP4) immunoglobulin G (IgG) is the core diagnostic biomarker for neuromyelitis optica spectrum disorders (NMOSD). The cell-based assay (CBA) is a widely used method to detect anti-AQP4 IgG in human serum with high sensitivity and specificity. Briefly, serum anti-AQP4 IgG is captured by AQP4-transfected cell that is fixed on the biochip then detected by a fluorescein-labelled secondary antibody. Fluorescence microscopy is utilized to visualize the fluorescence, and the intensity of fluorescence is evaluated by at least two experienced clinicians. A final diagnosis of NMOSD can be made based on the combination of anti-AQP4 IgG detection results, clinical manifestations, and neuroradiological findings. According to previous studies, CBA is more sensitive and specific than other anti-AQP4 IgG detection methods, and it can be applied to both clinical diagnosis and studies of NMOSD. The method has limitations; for example, an international scale to evaluate serum anti-AQP4 IgG titers is still lacking. Here, a detailed protocol for human serum anti-AQP4 IgG detection using CBA is described.

Cell-based assay is a widely used method to detect serum anti-aquaporin-4 immunoglobulin G. This method could be applied to clinical diagnosis and scientific researches of neuromyelitis optical spectrum disorders.

İnsan Serum Anti-aquaporin-4 immünoglobulin G algılama hücre tabanlı tahlil tarafından

Anti-aquaporin-4 (AQP4) immunoglobulin G (IgG) is the core diagnostic biomarker for neuromyelitis optica spectrum disorders (NMOSD). The cell-based assay ...

A High-throughput Calcium-flux Assay to Study NMDA-receptors with Sensitivity to Glycine/D-serine and Glutamate

N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors (NMDAR) are classified as ionotropic glutamate receptors and have critical roles in learning and memory. NMDAR malfunction, expressed as either over- or under-activity caused by mutations, altered expression, trafficking, or localization, can contribute to numerous diseases, especially in the central nervous system. Therefore, understanding the receptor&#39;s biology as well as facilitating the discovery of compounds and small molecules is crucial in ongoing efforts to combat neurological diseases. Current approaches to studying the receptor have limitations including low throughput, high cost, and the inability to study its functional abilities due to the necessary presence of channel blockers to prevent NMDAR-mediated excitotoxicity. Additionally, the existing assay systems are sensitive to stimulation by glutamate only and lack sensitivity to stimulation by glycine, the other co-ligand of the NMDAR. Here, we present the first plate-based assay with high-throughput power to study an NMDA receptor with sensitivity to both co-ligands, glutamate and D-serine/glycine. This approach allows the study of different NMDAR subunit compositions and allows functional studies of the receptor in glycine- and/or glutamate-sensitive modes. Additionally, the method does not require the presence of inhibitors during measurements. The effects of positive and negative allosteric modulators can be detected with this assay and the known pharmacology of NMDAR has been replicated in our system. This technique overcomes the limitations of existing methods and is cost-effective. We believe that this novel technique will accelerate the discovery of therapies for NMDAR-mediated pathologies.

The goal of this protocol is to facilitate the study of NMDA-receptors (NMDAR) at a larger scale and allow the examination of modulatory effects of small molecules and their therapeutic applications.

NMDA reseptörleri glisin/D-serin ve glutamat duyarlılık ile çalışmak için bir yüksek-den geçerek kalsiyum-flux tahlil

N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptors (NMDAR) are classified as ionotropic glutamate receptors and have critical roles in learning and memory. NMDAR ...

Nörobilim

Anti-Nuclear Antibody Screening Using HEp-2 Cells

The American College of Rheumatology position statement on ANA testing stipulates the use of IIF as the gold standard method for ANA screening1. Although IIF is an excellent screening test in expert hands, the technical difficulties of processing and reading IIF slides &#8211; such as the labor intensive slide processing, manual reading, the need for experienced, trained technologists and the use of dark room &#8211; make the IIF method difficult to fit in the workflow of modern, automated laboratories.
The first and crucial step towards high quality ANA screening is careful slide processing. This procedure is labor intensive, and requires full understanding of the process, as well as attention to details and experience.
Slide reading is performed by fluorescent microscopy in dark rooms, and is done by trained technologists who are familiar with the various patterns, in the context of cell cycle and the morphology of interphase and dividing cells. Provided that IIF is the first line screening tool for SARD, understanding the steps to correctly perform this technique is critical.
Recently, digital imaging systems have been developed for the automated reading of IIF slides. These systems, such as the NOVA View Automated Fluorescent Microscope, are designed to streamline the routine IIF workflow. NOVA View acquires and stores high resolution digital images of the wells, thereby separating image acquisition from interpretation; images are viewed an interpreted on high resolution computer monitors. It stores images for future reference and supports the operator&#8217;s interpretation by providing fluorescent light intensity data on the images. It also preliminarily categorizes results as positive or negative, and provides pattern recognition for positive samples. In summary, it eliminates the need for darkroom, and automates and streamlines the IIF reading/interpretation workflow. Most importantly, it increases consistency between readers and readings. Moreover, with the use of barcoded slides, transcription errors are eliminated by providing sample traceability and positive patient identification. This results in increased patient data integrity and safety.
The overall goal of this video is to demonstrate the IIF procedure, including slide processing, identification of common IIF patterns, and the introduction of new advancements to simplify and harmonize this technique.

Indirect immunofluorescent (IIF) assays have traditionally been used for the detection of antinuclear antibodies (ANA) in human serum. The presence of these antibodies can aid in the diagnosis of systemic autoimmune rheumatic diseases (SARD). This protocol demonstrates how to effectively perform the IIF technique to accurately detect these autoantibodies.

Anti-Nükleer Antikor HEp-2 hücreleri kullanarak Eleme

The American College of Rheumatology position statement on ANA testing stipulates the use of IIF as the gold standard method for ANA screening1. Although ...

Biyoloji

Otoimmün Demiyelinizasyonda Humoral Yanıtın İncelenmesi

Quantification of Autoreactive Antibodies in Mice upon Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is a disease model that recapitulates the autoimmune disorder multiple sclerosis (MS) at histopathological and molecular levels. EAE is induced by immunizing experimental animals via subcutaneous injection of short myelin peptides together with specific adjuvants to boost the immune response. Like the human counterpart, EAE mice develop demyelinating lesions, immune cell infiltration into the central nervous system (CNS), glia activation and neuronal injury. A consistent body of evidence also supports a mechanistic role for B cell dysfunction in the etiology of both MS and EAE. B cells can serve as antigen-presenting cells as well as a primary source of pro-inflammatory cytokines and autoantibodies. In EAE, antibodies are generated against the myelin peptides that were employed to induce the disease. Such autoantibodies have been shown to mediate either myelin loss or pathogenic T cell reactivation into the CNS. This article describes an efficient ELISA-based protocol to quantify autoantibodies in the serum of C57BL/6J mice immunized with the myelin oligodendrocyte glycoprotein 35-55 (MOG35-55) peptide. The proposed method serves as a powerful tool to investigate the specificity and magnitude of the aberrant humoral response in the context of autoimmune demyelination.

Yazar Spotlight: Multipl Skleroz Araştırmalarında B Hücresi Yanıtlarını İncelemek İçin Yeni Test

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is an animal model of multiple sclerosis (MS), which shares with the human disease a robust humoral autoimmune response. Here, we report a simple and flexible ELISA protocol to quantify autoantibodies in the serum of EAE immunized mice.

Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelit Üzerine Farelerde Otoreaktif Antikorların Miktar Tayini

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is a disease model that recapitulates the autoimmune disorder multiple sclerosis (MS) at histopathological ...

N-metil-D-Aspartat (NMDA) reseptör karşı antikor kanında tespit etmek için basit hücre tabanlı ayirt tahlil

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Normal MSS Real-time PCR ve Nöro sırasında mikroglia içinde microRNA tespiti

İnsan Serum içinde N-metil-D-aspartat reseptör ya da dopamin-2 reseptör antikorları algılamak üzere yüksek verimli Flow Cytometry hücre bazlı bir deneyde

IgG ve IgM Antikorlarının Eşzamanlı Algılama için İki Renkli Antijen Mikroarray'ler Üretimi

Monospecific ve karışık DFS70 desen bir roman hepatit-2 ELITE/DFS70 nakavt substrat ile birlikte ANA tarama sırasında eşzamanlı ayrım

İnsan Serum Anti-aquaporin-4 immünoglobulin G algılama hücre tabanlı tahlil tarafından

NMDA reseptörleri glisin/D-serin ve glutamat duyarlılık ile çalışmak için bir yüksek-den geçerek kalsiyum-flux tahlil

Anti-Nükleer Antikor HEp-2 hücreleri kullanarak Eleme

Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelit Üzerine Farelerde Otoreaktif Antikorların Miktar Tayini

Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelit Üzerine Farelerde Otoreaktif Antikorların Miktar Tayini

Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelit Üzerine Farelerde Otoreaktif Antikorların Miktar Tayini