Gauri Datta deneysel malzeme hazırlama konusunda ona yardım için teşekkür etmek istiyorum. Ayrıca el yazması eleştiri için Bettina Wittler ve James Mann için sana şükrediyoruz. Bu eser NSF hibe DBI-1049341 ve MCB-1143813 tarafından desteklenmiştir.

1. 1 x Murashige ve Skoog (MS) orta hazırlanması <ol><li>ekleyin 4,31 g MS Bazal tuz karışımı, 10 g Sükroz ve 0.5 g 2-(N-Morpholino) ethanesulfonic asit (MES) 0, 8 L distile su ve çözülmeye heyecan içeren bir ölçek için. Kontrol edin ve pH 1 M potasyum hidroksit (KOH) kullanarak 5,7 için ayarlayın. 1 yapmak için distile su ekleyin L.</li>
	<li>Medya iki 1 L şişe 500 mL bölün. Agar 5 g için her şişe ekleyin. Kapak serbest bırak.</li>
	<li>Otoklav 121 ° c, 15 şişe manyetik heyecan barda PSI 20 dk için.</li>
	<li>Isıyla sonra düşük hızda karıştırın tabakta şişe yerleştirin ve 45-50 ° C'ye kadar (şişe çıplak elle tutulabilen) soğutmak MS orta sağlar.</li>
	<li>Bu adımından başlayarak, laminar akış kukuIeta steril koşullarda tüm adımları uygulayın. 500 µL Ekle Gamborg &#39; s vitamini her şişe ve vitamini çözüm olarak dağıtabilmenizi MS orta heyecan için çözüm.</li>
	<li>Yeterli medya kalıplara yaklaşık yarım plaka derinliği karşılamak için dök.</li>
	<li>İzin plakaları agar kuvvetlendirmek izin vermek 1 h için oda sıcaklığında soğumaya. 
	Not: hemen kullanılmak üzere tabaklar, Plastik poşete ve 4 ° C'de (buzdolabı sıcaklığı) depolamak. Kapalı plakaları, kutuları veya katılaşmış agar tüplerini 4 ° c hava geçirmez bir kap içinde birkaç hafta saklanabilir.</li>
</ol> 2. Sterilizasyon Arabidopsis tohum çamaşır suyu ile <ol><li>hazırla MS plakaları Protokolü'nün 1 kısmı uyarınca. Otoklav MS Media aynı anda distile su 100 mL. Bu daha sonra durulama suyu olarak ve tohumlar askıya kaplama yardım etmek için kullanın. 
	Not: arzu edilirse, %0,8 agar karışım (w/v) (örneğin phytagar) da bu adımda autoclaved olabilir. Agar karışım için distile su kaplama sırasında yedek olabilir (Adım 2.5.3.). Agar karışım ilave viskozite alanı tohumlar plaka veya bitki üzerinde satırları gerekirse kolaylaştırır.</li>
	<li>Hazırla % 50 (v/v) tohumları sterilizasyon için kullanılmak üzere çözüm çamaşır suyu. Çamaşır suyu sulandırmak için 100 mL distile su 100 mL çamaşır suyu ekleyin. 50 µL ara 20 deterjan, çamaşır suyu çözüm. 
	Not:-Ebilmek var olmak stok hazır çamaşır suyu çözüm için yukarı bir ay için sadece steril koşullarda açıldığında sürece.</li>
	<li>Aliquot 100 tohum içine 1.5 mL microcentrifuge tüp.</li>
	<li>% 50 çamaşır suyu çözüm kullanarak tohum sterilize.
	<ol><li>Bir laminar akış başlık, tohum içeren microcentrifuge tüp 500 µL % 50 çamaşır suyu çözüm ekleyin. Tohumlar çamaşır suyu çözümde askıya için tüp alt dokunun. 
		Not: Alternatif olarak, bir rotator veya platform Çalkalayıcı askıya tohumlar tutmak için kullanılabilir.</li>
	</ol></li> <li>Çamaşır suyu çözüm tüp durulayın.
	<ol><li>10 dakika sonra bir pipet veya sonunda bir pipet ucu ile donatılmış bir aspiratör kullanarak microcentrifuge tüp çamaşır suyu çözüm kaldırmak.</li>
		<li>Ekle 500 µL steril distile su tüp. Tüp kapatın ve karıştırmak için tersine çevirin. Tohumları tüp altına yerleşmek için izin verir. Tohum dikkatle tüp altına yerleşmiş bir kez çamaşır suyu çözüm pipetting tarafından çıkarın. Bu işlem 6 kez durulama işlemi yineleyin.</li>
		<li>Tohum askıya için tüp autoclaved distile su 1 mL ekleyin.</li>
	</ol></li> <li>Sterilize tohumlar MS plakaları üzerinde plaka.
	<ol><li>Bir laminar akış başlık, hisse senedi adı ve geçerli tarihi ile MS plaka alt etiket.</li>
		<li>Tohum microcentrifuge tüp MS plaka üzerine dökün. Tohum steril, tek kullanımlık inoculating döngü veya steril pipet ucu kullanarak MS plaka çevresinde yayıldı. 
		Not: Eğer tohum satırları ekili olabilir için bir pipet ile 200 µL bahşiş tohumlar istenen pozisyonlarda ayrı ayrı yerleştirmek için kullanılabilir. Tohum akışını artırmak için 3-5 mm tarafından makas kullanarak sonuna pipet ucu kesilmiş olabilir. Herhangi bir yanlış yerleştirilmiş tohum veya kümeleri tohum sonra yeniden konumlandırılmış veya tek kullanımlık steril bir inoculating döngü kullanarak ayrılmış.</li>
		<li>Yer arka MS plaka laminar akış Hood yarısı kapalı kapak ile. MS plaka buharlaşır aşırı su izin.</li>
		<li>Kapağı MS tabağa yerleştirin. Mühür plaka gözenekli kağıt cerrahi ile sarma tarafından MS plaka bant (Tablo reçetesi görmek).</li>
	</ol></li></ol> 3. Sterilizasyon Arabidopsis tohum klor gazı ile <ol><li>hazırla MS plakaları Protokolü'nün 1 kısmı uyarınca. Otoklav MS Media aynı anda distile su 100 mL; Bu daha sonra tohum kaplama yardım askıya yardımcı olmak için kullanılacaktır. 
	Not: arzu edilirse, %0,8 agar karışım (w/v) (örneğin phytagar) da bu adımda autoclaved olabilir. Agar karışım için distile su kaplama sırasında yedek olabilir (Adım 3.6.2.). Agar karışım ilave viskozite alanı tohumlar plaka veya bitki üzerinde satırları gerekirse kolaylaştırır.</li>
	<li>Sterilizasyon işlemine geçmeden önce çamaşır suyu ve hidroklorik asit (HCl) klor gazı üretmek için gerekli miktarlarını hesaplamak.
	<ol><li>Sterilizasyon için gerekli % 6,1 Cl 2 üretmek için gerekli HCl miktarını hesaplamak.</li>
		<li>Aşağıdaki formülü kullanın: 
		<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56587/56587eq1.jpg" /> ile sterilizasyon konteyner hacmi olarak 7000 mL ve %6.1 Cl 2; olarak HCl hacminin 3 mL olmak hesaplanır. 
		Not: ek tablo 1 konteyner ve % Cl 2 farklı birimler için hesaplama gerçekleştirmek için programlanmış bir elektronik tablodan sağlanan.</li>
	</ol></li> <li>Aliquot 100 tohum 0.5 mL microcentrifuge tüp içine. Her şişe için Kapaklar kapatın, şişeleri plastik bir rafa yerleştirin ve bir kenara koyun. 
	Not: uygun şartlarda depolandıkları sürece tohum zaman bu noktada uzun süre saklanabilir. Saklama koşulları protokol bölümünde 3.3.2 Rivero ve arkadaşları 4 tarafından bulunabilir. 96-şey plaka biçim-ebilmek da var olmak kullanılmış.</li>
	<li>Klor gazı sterilizasyon gerçekleştirmek gerekli malzemeleri hazırlayın.
	<ol><li>Elde çamaşır suyu ve HCl depolama konumlarından.</li>
		<li>Büyük parafin bir şerit film (Tablo reçetesi görmek) 3.5.3. adımda kullanmak için kesim. sterilizasyon konteyner mühür için.</li>
		<li>Hangi sterilizasyon gerçekleşecek bir duman başlık içinde Kapaklı plastik kap yerleştirin. Tohum şişeleri üzerinde Kapakları açın ve tüm tohum raf plastik konteyner yerleştirin.</li>
	</ol></li> <li>Klor gazı sterilizasyon oda sıcaklığında gerçekleştirmek. 
	Dikkat: çamaşır suyu ve asit ile ayrı ayrı çalışır. Dökülen riskini azaltmak için kapağını her iki şişe bırakmayın. Uygun kişisel koruyucu ekipman (PPE) eldiven ve önlük dahil olmak üzere kullanın. Çamaşır suyu ya da asit eldiveni sıçramalarına, eldiven diğer malzemeler tutmadan önce değiştirin. Her zaman eldiven duman başlıklı çamaşır suyu ya da asit kirlenme durumunda kaldırın.
	<ol><li>250 mL kabı kapsayıcı içinde yerleştirin ve çamaşır suyu 100 mL ekleyin. 
		Not: Tepki HCl ve çamaşır suyu arasında en az 22 birimleri fazla çamaşır suyu gerektirir. Reaksiyon HCl tüketmek ve Cl 2 gaz su ve Sodyum Klorür (NaCl) yan serbest bırakarak çamaşır suyu. Çamaşır suyu büyük bir fazlalığı kullanarak ek HCl d tüketimi sağlarSodyum bikarbonat (NaHCO 3) azaltır havalandırma dönemi zamanlayıcısını ihtiyaç bertarafı için çözüm nötralize etmek. 
		Uyarı: En az iki kez toplam sıvı hacmini çamaşır suyu + HCl kabı olmalıdır. Bu zarar tohumlar, giyim çamaşır suyu veya maruz tenini yakabilecek kabı sonraki adımı sırasında kaçan su sıçramalarına engeller.</li>
		<li>Ekle 3 mL HCl çamaşır suyu içeren kabı. 
		Dikkat: İlk tepki kabarcıklar, özellikle de gaz konsantrasyonları 6.1 daha yüksek üretecek. Uzun kollu önlük için bu adım gereklidir.</li>
		<li>Sterilizasyon konteyner kapatın ve hemen parafin film ile mühür.</li>
		<li>İzlemek sterilizasyon konteyner gaz birikimi sağlamak için sterilizasyon zaman sırasında; klor gazı birikimi bir soluk sarı sis kapsayıcı içinde olarak görünür olmalıdır. 
		Dikkat: Sterilizasyon konteyner içinde basınç kapağı yendiniz değil emin olmak için düzenli olarak kontrol edin veya film alkol. Kapağı atından geldi veya parafin film gevşek geldi, kapağını kapatın ve dikkatle kapsayıcı ek katmanı parafin film ile sarın.</li>
		<li>Sonra 1 h-sterilizasyon konteyner parafin film kaldırma ve köşelerinden kapağını açarak dönemini, aç. 3 h reaksiyon tamamlayıp klor gazı ortadan kaldırmak havalandırma kapsayıcı izin.</li>
		<li>Microcentrifuge tüpler tohum rafa Kapaklar kapatın. 
		Not: Steril tohumları kuru durumda depolandıkları sürece kaplama, zamana kadar saklanabilir.</li>
		<li>Tohum rafa kaldırmak ve laminar akış mahallede yerleştirin.</li>
		<li>Klor gazı reaksiyon <ol><li>eklemek 1.5 g NaHCO 3 toz yavaş yavaş çamaşır suyu/HCl solüsyon içeren kabı için etkisiz hale getirmek ve çözüm NaHCO 3 çözülmeye bir cam çubuk ile karıştırın. Karbondioksit (CO 2) gaz kabarcıkları oluşturan durduruldu kadar NaHCO 3 eklemeye devam. 
			Uyarı: yavaş yavaş su sıçramalarına engellemek için ekleyin. Eldiven ve önlük gibi uygun KKE kullanın.</li>
			<li>PH şeritler ya da bir pH metre kullanarak çözüm pH test. Gerektiği kadar çözüm pH nötr ise ek NaHCO 3 ekleyin (pH 7,0). Bu noktada çözüm duman hood kaldırıldı olabilir ve tüm uygulanabilir elden çıkarma kurallarına göre bertaraf. 
			Dikkat: Herhangi bir koku elden çıkarma sırasında fark varsa, o zaman çözüm hemen duman hood için döndürülmelidir.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Sterilize tohumlar MS plakaları üzerinde plaka.
	<ol><li>Bir laminar akış başlık, hisse senedi adı ve geçerli tarihi ile MS plaka alt etiket.</li>
		<li>Ekle 500 µL tohumlar askıya almak için her microcentrifuge Tube steril distile su. Tohum MS plaka üzerine dökün ve tohumlar eşit olarak steril, tek kullanımlık inoculating döngü veya steril pipet ucu kullanarak plaka çevresinde yayıldı.</li>
		<li>Yer arka MS plaka laminar akış Hood yarısı kapalı kapak ile. MS plaka buharlaşır aşırı su izin.</li>
		<li>Kapağı MS tabağa yerleştirin. Gözenekli kağıt cerrahi bant ile plaka sarma tarafından MS plaka mühür.</li>
	</ol></li></ol> 4. Arabidopsis büyüme MS plakaları <ol><li>4 ˚C ve ortam nemi üç gündür üst kapağı ile tabak yerleştirin. 
	Not: Bu işlem stratifikasyon denir ve bireysel tohumların çimlenme eşitlemek için hizmet vermektedir.</li>
	<li>Plakaları büyüme ortamına transfer.
	<ol><li>23 ° C sıcaklığında saklayın ve 120-150 µmol/m 2 s 16 h ışık / 8 saat karanlık ışık şiddeti photoperiod. Yer kaplamalar üst kapaklı grow ortamına düz kökleri orta büyümek bu yüzden.</li>
	</ol></li> <li>İzin plakaları fidan büyümek için 8 gün. 
	Not: Bir 8 günlük büyüyen süre geç tohum çimlenme takımıdır sağlar. Tabak attı 8 gün er eğer tüm tohumlar germinated.</li>
	<li>Çimlenme gore puan edinildi.
	<ol><li>Kaydı bu germinated ve bu değil germinated tohum sayısı. Germinated tohum sayısına bölünmesi ile çimlenme oranı hesaplamak tohum plaka üzerinde toplam sayısıyla. 
		Not: Radicle tohum kat dışında öngörülen ve iki cotyledons görülebilir zaman çimlenme sayılır.</li>
		<li>Ayrıca sterilizasyon şartları etkinliğini belirlemek için kalıp tarafından etkilenen tohum saymak.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Weigel, D., Glazebrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Arabidopsis: a laboratory manual. , (2002).</li><li>Koornneef, M., Meinke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+Arabidopsis+as+a+model+plant.">The development of Arabidopsis as a model plant.</a> Plant J. 61 (6), 909-921 (2010).</li><li>The Arabidopsis Genome Initiative. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=+Analysis+of+the+genome+sequence+of+the+flowering+plant+Arabidopsis+thaliana."> Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana.</a> Nature. 408 (6814), 796-815 (2000).</li><li>Rivero, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Handling+Arabidopsis+plants:+growth,+preservation+of+seeds,+transformation,+and+genetic+crosses.">Handling Arabidopsis plants: growth, preservation of seeds, transformation, and genetic crosses.</a> Methods Mol Biol. 1062, 3-25 (2014).</li><li>Yamada, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Empirical+analysis+of+transcriptional+activity+in+the+Arabidopsis+genome.">Empirical analysis of transcriptional activity in the Arabidopsis genome.</a> Science. 302 (5646), 842-846 (2003).</li><li>Alonso, J. M., Stepanova, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+transformation+with+large+bacterial+artificial+chromosomes.">Arabidopsis transformation with large bacterial artificial chromosomes.</a> Methods Mol Biol. 1062, 271-283 (2014).</li><li>Savage, L. J., Imre, K. M., Hall, D. A., Last, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+essential+Arabidopsis+nuclear+genes+encoding+plastid-targeted+proteins.">Analysis of essential Arabidopsis nuclear genes encoding plastid-targeted proteins.</a> PLoS One. 8 (9), e73291 (2013).</li><li>Podar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+growth+and+cultivation.">Plant growth and cultivation.</a> Methods Mol Biol. 953, 23-45 (2013).</li><li>Xu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved+agar-plate+method+for+studying+root+growth+and+response+of+Arabidopsis+thaliana.">An improved agar-plate method for studying root growth and response of Arabidopsis thaliana.</a> Sci Rep. 3, 1273 (2013).</li><li>Clough, S. J., Bent, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Floral+dip:+a+simplified+method+for+Agrobacterium-mediated+transformation+of+Arabidopsis+thaliana.">Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.</a> Plant J. 16, (1998).</li><li>Cederholm, H. M., Benfey, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+sensitivities+to+phosphate+deprivation+suggest+that+RGF+peptides+play+disparate+roles+in+Arabidopsis+thaliana+root+development.">Distinct sensitivities to phosphate deprivation suggest that RGF peptides play disparate roles in Arabidopsis thaliana root development.</a> New Phytol. 207 (3), 683-691 (2015).</li><li>Ye, G. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+ovule+is+the+target+for+Agrobacterium+in+planta+vacuum+infiltration+transformation.">Arabidopsis ovule is the target for Agrobacterium in planta vacuum infiltration transformation.</a> Plant J. 19 (3), 249-257 (1999).</li><li>Kuromori, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+collection+of+11+800+single-copy+Ds+transposon+insertion+lines+in+Arabidopsis.">A collection of 11 800 single-copy Ds transposon insertion lines in Arabidopsis.</a> Plant J. 37 (6), 897-905 (2004).</li><li>Fiers, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+14-amino+acid+CLV3,+CLE19,+and+CLE40+peptides+trigger+consumption+of+the+root+meristem+in+Arabidopsis+through+a+CLAVATA2-dependent+pathway.">The 14-amino acid CLV3, CLE19, and CLE40 peptides trigger consumption of the root meristem in Arabidopsis through a CLAVATA2-dependent pathway.</a> Plant Cell. 17 (9), 2542-2553 (2005).</li><li>Stepanova, A. N., Alonso, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PCR-based+screening+for+insertional+mutants.">PCR-based screening for insertional mutants.</a> Methods Mol Biol. 323, 163-172 (2006).</li><li>O'Malley, R. C., Alonso, J. M., Kim, C. J., Leisse, T. J., Ecker, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+adapter+ligation-mediated+PCR+method+for+high-throughput+mapping+of+T-DNA+inserts+in+the+Arabidopsis+genome.">An adapter ligation-mediated PCR method for high-throughput mapping of T-DNA inserts in the Arabidopsis genome.</a> Nat Protoc. 2 (11), 2910-2917 (2007).</li><li>L&#243;pez-Ribera, I., Vicient, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+ultrasonication+to+increase+germination+rates+of+Arabidopsis+seeds.">Use of ultrasonication to increase germination rates of Arabidopsis seeds.</a> Plant Methods. 13 (31), (2017).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Ne zaman Arabidopsis tohum steril ortamda büyüyen, sterilizasyon çeşit uygulanması gerekir. Çamaşır suyu ve klor gazı sterilizasyon uygulamaları benzer çimlenme oranı ve kalıp büyüme inhibisyon içinde neden. Ben de sterilizasyon yöntemi ile yüksek çimlenme potansiyel tohum çimlenme fiyatına belirgin bir şekilde azaltılmasına neden olur; Ancak, çamaşır suyu sterilizasyon önemli sigara da olsa, çimlenme oranı artış gaz sterilizasyon için (şekil 3A) karşılaştırıldığında daha düşük çimlenme potansiyeli (20-%70), küçük, nedeniyle hatları için önerilir.
40-%100 10 dakikaya kadar için çamaşır suyu konsantrasyonları ile Arabidopsis tohum sterilize tatmin edici çimlenme yüzdeleri ve etkili kalıp bastırma sağlar. Her ne kadar % 40 daha az çamaşır suyu konsantrasyonu sağlamak yeterli sterilizasyon % 40 bir konsantrasyon veya daha yüksek garanti etkili sterilizasyon bile ağır kirlenmiş tohum birçok kullanarak çoğu tohum birçok için. Sterilizasyon 10 dk çamaşır suyu konsantrasyonlarının eşit kullanırken aşmayacak şekilde önemli veya yüksek tohum mortalite ve fide geliştirme hataları önlemek için % 80 daha yüksek.
Arabidopsis tohumları % 6,1 veya %16,5 1s sonuçlarında yüksek çimlenme oranları ve yeterli kalıp ortadan kaldırılması için klor gazı konsantrasyonları ile tedavi. Düşük klor gazı konsantrasyonu (% 2.1) süresi sterilizasyon 3 h artırarak başarıyla kullanılabilir.
Birkaç satır sterilize edilecek gerektiğinde, bir çözümde sıvı sterilizasyon % 50 çamaşır suyu 10 min için önerilir. Kadar satır hızlı ve kolay bir daha az manipülasyon ile sterilize beri için daha fazla sayıda satır gaz sterilizasyon %6.1 1 h için bir gaz konsantrasyon ile daha iyi bir seçenektir.
Bizim sonuçlar farklı genotip tohumları çok sayıda ve daha düşük çimlenme potansiyel ile tohum sterilizasyon için standart koşullar sağlar. Tek sınırlama bu sterilizasyon tekniklerin onlar tohum çimlenme oranı nedeniyle geniş tohum mortalite % 20 daha az için uygulanamaz olduğunu. Sonication17sterilizasyon yokluğu çimlenme oranını artırmak için gibi alternatif yöntemler bu gibi durumlarda yararlı olabilir.

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) bitki Biyoloji1,2,3temel ve uygulamalı araştırma için ana model organizmadır. Ise Arabidopsis büyüme için standart koşullar iyi kurulmuş4olabilirdi, tohum sterilizasyon tohum canlılığı üzerinde etkisini titizlikle test edilmemiştir. Plakalar veya kutulara katı ortam rutin Arabidopsis fidan ateş ve kök fenotipleri gözlenmesi, erken yavru bir popülasyondaki homozigoz ölümcül mutantlar tanımlaması gibi birçok deneysel uygulamalar için büyüme kolaylaştırmak için kullanılır aşamaları, yalıtım patojen ücretsiz doku, fide doku, transformants veya ilaca dirençli bitkiler seçimi ve değerlendirmesi çimlenme1,2,3,4 büyük miktarda koleksiyonu . Bir serada yetiştirilen bitkiler tohum hasat veya büyüme odası zaman zaman mikroorganizmalar ve toz ile kirlenmiş. Arabidopsis fidan steril ortam türleri farklı büyüme önceki tohum sterilizasyon gibi mantar ve bakteri tohum yüzeyinde mevcut mikrobiyal kirleticiler kaldırmak için gerektirir. Bir etkili tohum sterilizasyon rejim kullanımı yüksek çimlenme, minimum kirlenme ve güçlü bitki büyüme dengesi için önemlidir.
Arabidopsis tohum sterilizasyon için kullanılan iki en yaygın yöntem ticari çamaşır suyu (sıvı fazlı) ve klor gazı (buharı fazlı) temel alır. Çeşitli prosedürler her iki sıvı fazlı sterilizasyon1,4,5,6,7,8,9 için istihdam edilmiştir , Arabidopsis 10 ve buharı fazlı sterilizasyon8,10,11,12,13,14,15 tohum ,16. Ancak, bu yordamları kullanılan genotip tohum sterilizasyon yerine getirmeye etkili olmuştur iken, tohumlar üzerinde farklı sterilizasyon tedavilerin farklı genotip etkisi ayrıntılı bir analizini bildirilmemiştir. Bu nedenle, bu sterilizasyon işlemleri en iyi duruma getirme etkin sterilizasyon yüksek çimlenme oranı ile birleştirilmiştir koşulları tanımlamak için gereklidir.
Arabidopsis biyolojik kaynak merkezi (ABRC) benzersiz bir) dahili olarak uygulanan kalite kontrol prosedürlerinin toplama ve b) take avantajı ve kullanıcı geribildirim yanıt olarak farklı genotip çeşitli tohum canlılığı sınamak için konumlandırılmış tohum çimlenme hakkında. Tohum çimlenme Arabidopsis aralığı genotip, çeşitli sterilizasyon yöntemleri etkilerini belirlemek için hedefleri burada sunulan deneyler idi. En az patojen bulaşma koruyarak yüksek tohum çimlenme fiyatlarına neden en iyi duruma getirilmiş sterilizasyon işlemleri çamaşır suyu ve klor gazı sterilizasyon için sunulmaktadır.

standardized method for high-throughput sterilization of arabidopsis seeds

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) fidan sık sık steril ortamda yetişkin olmak gerekir. Bu mikrobiyal kirleticiler tohum yüzeyinde mevcut gelişimini önlemek için önceden tohum sterilizasyon gerektirir. Şu anda, Arabidopsis tohum sterilize labs arasında biraz farklılık ve değil standart koşullarda iki ayrı sterilizasyon teknikleri kullanarak, genellikle yalnızca kısmen etkili sterilizasyon veya aşırı tohum mortalite kaynaklanan. Bu yöntemlerin çoğu Ayrıca çok sayıda farklı genotip tohum hatları kolayca ölçeklenebilir değildir. Teknolojileri Arabidopsis yüksek üretilen iş analizi için çoğalırlar devam ederken, çok sayıda farklı genotip tohumları sterilizasyon için standart teknikleri bu tür deneyler yürütmek için gerekli hale gelmektedir. Birkaç Arabidopsis satır yanıt iki farklı sterilizasyon teknikleri için tohum çimlenme oranı ve mikroplar ve diğer patojenleri ile tohum bulaşma düzeyine göre değerlendirilmiştir. Tedaviler ajanlar ve maruz kalma, Arabidopsis tohum sterilizasyon için en uygun koşulları belirlemek için kombine kez sterilize farklı konsantrasyonlarda dahil. En iyi duruma getirilmiş iletişim kuralları için iki farklı sterilizasyon yöntemleri geliştirilmiştir: çamaşır suyu (sıvı fazlı) ve her iki kaynaklanan yüksek tohum çimlenme oranları ve en az mikrobiyal kirlenme klor (Cl2) gaz (buharı fazlı). Bu iletişim kurallarının yardımcı programı hem vahşi türü ve mutasyona uğramış tohum çimlenme potansiyelleri bir dizi test aracılığıyla betimlenir. Bizim sonuçlar sterilizasyon zararlı etkileri ile optimum çimlenme potansiyeli daha düşük tohum için gözlendi, ancak tohum etkili olmadan aşırı tohum ölüm, iki yöntemden herhangi birini kullanarak sterilize olduğunu gösterir. Buna ek olarak, bir denklem araştırmacılar standart klor gazı sterilizasyon şartları hava geçirmez farklı boyutlarda kapsayıcılarına etkinleştirmek için geliştirilmiştir. Burada açıklanan protokollere izin ver kolay, etkili ve ekonomik tohum sterilizasyon çok sayıda Arabidopsis satırları için.

Bir açık alan, sera veya büyüme odasından toplanan Arabidopsis tohum bazen1,4mantar ve bakteri gibi çeşitli mikroorganizmalar tarafından kirlenmiş. Böylece, özellikle tohum arzı sınırlı olduğunda tohum steril ortamda takımıdır plakaları, kontaminasyon nedeniyle özellikle zor olabilir. Bunların sonuçlarını aşağıda sunulmuştur, çamaşır suyu ve klor gazı sterilizasyon için en iyi duruma getirilmiş iletişim kuralı bu sorunu en aza indirir ve yüksek üretilen işi uygulamalar için gereken tohum canlılığı korur.
Çamaşır suyu sterilizasyon Arabidopsis Col-0 tohumların çimlenmesi üzerine etkileri
Çamaşır suyu için tohum sterilizasyon çok sayıda bitki türleri içinde en sık kullanılan ajandır. Sterilizasyon ajanı ve maruz kalma süresi en iyi konsantrasyon türler arasında değişir. Bir dizi Protokolü Arabidopsis tohumlar1,4,5,6,7,8,9 sterilizasyon için çamaşır suyu kullanma istihdam edilmiştir , 10. çamaşır suyu ile beş farklı pozlama süresi dönemleri test edildi ve sonuçları dört farklı konsantrasyonları sunulmaktadır şekil 1. Tedaviler Columbia vahşi-tipi (Col-0) tohumları için uygulandı. Çamaşır suyu toplama Col-0 tohumların çimlenmesi üzerindeki etkisini çeşitli sterilizasyon saate bağlı olarak çamaşır suyu toplama ve sterilizasyon saat arasında önemli bir etkileşim gösterildiği şekilde (şekil 1, P &#60; 0,001, ANOVA-Varyans analizi).
Deneylerden sterilizasyon kez 5 ila 10 dk arasında eşit yüksek çimlenme oranı Col-0 tohum (şekil 1) tedavileri tüm çamaşır suyu konsantrasyonları ile sonuçlandı. Yüksek çimlenme oranları da her sterilizasyon zaman için % 40 ve % 50 konsantrasyonları ev çamaşır suyu için tespit edildi. 10 dakika uzun süre önemli bir sonuçlandı için Tedaviler % 80 ve % 100 çamaşır suyu ile azaltmak içinde daha kısa iliklerine Times'a göre çimlenme oranı (P &#60; 0,01, ANOVA). % 80 ve %100 20 dk tedavisi çamaşır suyu için Ayrıca, çimlenme önemli ölçüde karşılık gelen % 40 ve % 50 çamaşır suyu tedavileri karşılaştırıldığında azalma (P &#60; 0,001, ANOVA).
Tohum ağartma ve yüksek çamaşır suyu konsantrasyonları 15 dakika veya daha uzun kullanırken kuruyup çeşitli düzeyleri görüntülenir. Ek olarak nispeten yüksek (%32) tohum mortalite, germinated tohum kez büyüme kusurları, cotyledons ve hypocotyls açılmak ve uzamış, bir başarısızlık yansıyan gösterdi bu koşullarda sterilize gelişimsel durması sonucu. En tedaviler (20 dışarı-in 14) tamamen edildi kalıp-genel kalıp düzeyi ortalama %0,21 ± 0,003 (Tablo 1) kaynaklanan Alerjik,.
Çünkü yüksek çimlenme yüzdesi iyi yüzey patojen büyüme inhibisyonu ile kombine tedavi ile % 50 çamaşır suyu ve 10 dk sırılsıklam bir zaman en iyi sterilizasyon rejimi seçildi. Bu tedavi aşağıda açıklandığı gibi çamaşır suyu sterilizasyon farklı mutant satırlarındaki etkisini test etmek için seçilmiş.
Klor gazı sterilizasyon Col-0 tohumların çimlenmesi üzerine etkileri
Klor gazı sterilizasyon şartları en iyi duruma getirmek için klor gazı üç farklı konsantrasyonlarda Col-0 tohum iki süreler (Tablo 2) için sterilize etmek için kullanılmıştır. Gaz toplama göre konsantre HCl hacmi ve aşağıdaki denklemi kullanarak sterilizasyon konteyner hacmi da hesaplanır:
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56587/56587eq2.jpg">
Bu denklem varsayarak 12.3 M HCl, 23 ° C sıcaklık ve standart atmosfer basıncı 101.3 kPa, ideal gaz Yasası kullanılarak türetilmiştir.
Klor gazı konsantrasyonu Col-0 tohumların çimlenmesi üzerindeki etkisini sterilizasyon zaman zaman ve konsantrasyon faktörler arasında önemli bir etkileşim tarafından belirtildiği şekilde bağlı gösterilmiştir (şekil 2A, P &#60; 0,01, ANOVA) . Klor gazı konsantrasyonu 1 h sterilizasyon için tabi Col-0 tohumların çimlenme üzerinde önemli bir etkisi vardı. Bu sterilizasyon zamanla tüm klor gazı konsantrasyonları benzer şekilde çimlenme, % 85 üzerinde yüksek düzeyde terfi (P &#62; 0,05, ANOVA). Öte yandan, klor gazı, iki alt gaz konsantrasyonları ile karşılaştırıldığında en yoğun çimlenme oranı önemli bir azalma 3 h-uzun sterilizasyon sonuçlandı (P &#60; 0,05, ANOVA). Bu sonuçlar tedaviler Arabidopsis tohumların herhangi bir test klor gaz konsantrasyonları 1 h için veya 3 h için % 16,5'in altında gaz konsantrasyonları ile çimlenme oranları her zaman daha büyük olduğundan tohum canlılığı koruyarak eşit derecede etkili olduğunu gösteriyor %82. Ancak, tohum %16,5 gaz ile 3 h için sterilize tohum çimlenme için zararlı.
Kalıp insidansı da gaz konsantrasyonu ve çekim hızı bağımlı oldu. Küf gelişimi etkili 3 h (2B rakam) için tüm gaz konsantrasyonları ile % 6,1 ve %16,5 klor gazı 1 h-uzun tedavi için nispeten yüksek konsantrasyonları ile inhibe.
Bu sonuçlarına göre %6.1 1 h (Tablo 2) için bir gaz konsantrasyonu ile tedavi en iyi buharı fazlı sterilizasyon koşulu olarak bu kombine beri yüksek çimlenme oranı (gaz sterilizasyon farklı mutant satırlarındaki etkisini test etmek için seçilmiş yapıldı. % 85) küf kontaminasyon (%0.02) çok düşük düzeyine sahip.
Çamaşır suyu ve klor gazı sterilizasyon tohumları ile farklı çimlenme potansiyel etkileri
İstatistiksel analiz gösterdi sterilizasyon yöntemleri çimlenme cevaben satırları çimlenme potansiyelini bağımlı (şekil 3A, P &#60; 0,01, ANOVA). Ne çamaşır suyu ne de klor gazı sterilizasyon yüksek çimlenme potansiyel (gruplar 4 ve 5) ile tohumların çimlenme oranı azalır. Ben de tedavi en düşük çimlenme grubuyla zaten düşük çimlenme hızı üzerinde bir etkisi vardıpotansiyel (Grup 1). Buna ek olarak, önemli bir azalma yaklaşık 12-18 oranında klor gazı sterilizasyon sonuçlandı (P &#60; 0,01, ANOVA) ara çimlenme potansiyel (Grup 2 ve 3) ile tohum çimlenme içinde. Çamaşır suyu sterilizasyon da çimlenme oranı Grup 2 13 oranında azalmıştır. fakat bu grup 3 çimlenme oranı azaltamaz. Gaz tedaviler herhangi bir çimlenme grubunda çamaşır suyu ve klor arasında anlamlı bir fark çimlenme oranı olmasına rağmen (şekil 3A, P &#62; 0.442, ANOVA), çamaşır suyu kullanılarak sterilize tohum var biraz daha yüksek çimlenme oranı gaz sterilize tohumları tüm çimlenme gruplarında daha.
Önemli ölçüde değişmiş sterilizasyon tedaviler (P &#60; 0,001, ANOVA) kalıp (şekil 3B) tarafından etkilenen tohum yüzde. Daha az küf gelişimi her iki klor gazı ve çamaşır suyu sterilizasyon sonuçlandı (P &#60; 0,05, ANOVA) hiçbir sterilizasyon için karşılaştırıldığında. Gaz ve çamaşır suyu sterilizasyon herhangi bir grubunda arasında ortaya kalıp düzeyde fark yoktu (şekil 3B, P &#62; 0.4, ANOVA).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56587/56587fig1.jpg"> 
Şekil 1: çamaşır suyu konsantrasyon ve sterilizasyon zaman Arabidopsis Col-0 tohumların çimlenmesi üzerine etkisi. Anlamına gelir ± SD deney 5 bağımsız çoğaltmalar elde edilen değerlerdir. * 5 dk süresi çamaşır suyu konsantrasyonları bir dizi için iliklerine göre önemli farklılıklar gösterir (P &#60; 0,01, ANOVA). #zaman dilimi % 80 ve % 100 çamaşır suyu konsantrasyonu % 40 ve %50 20 dk için göre önemli farklılıklar gösterir (P &#60; 0,01, ANOVA). <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56587/56587fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56587/56587fig2.jpg"> 
Şekil 2: klor etkileri Arabidopsis Col-0 tohum toplama ve sterilizasyon zamanında gaz. (A)çimlenme oranı ve (B) kalıp düzeyi. Hata çubukları temsil anlamına gelir ± SD 5 biyolojik ve deneme 5 teknik çoğaltmalar elde. Önemli ölçüde farklı olduğu bir mektup paylaşmayın anlamına gelir (P &#60; 0,05, ANOVA). <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56587/56587fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56587/56587fig3.jpg"> 
Şekil 3: çamaşır suyu ve klor gazı sterilizasyon tohumları ile farklı çimlenme potansiyel etkileri. (A)çimlenme oranı ve (B) kalıp düzeyi. 100 SALK T-DNA satır çimlenme oranı diğer sterilizasyon ajanlarının yokluğu olarak tanımlanan beş gruplar halinde göre onların çimlenme potansiyel sınıflandırıldı. Grupları çimlenme oranına göre aşağıdaki gibidir: Grup 1 (0-%20), Grup 2 (21-%50), Grup 3 (51-%70), Grup 4 (71-%90) ve grup 5 (91-%100). Satırları rasgele seçilmiş ve onların çimlenme potansiyel üzerinde genotip bağlı değildir. Anlamına gelir ± SD deney üç bağımsız çoğaltmalar elde edilen değerlerdir. Harfler ("a", "ab", "c", vb) her değerin Kategorya istatistik grupları gösterir. Önemli ölçüde farklı olduğu bir mektup paylaşmayın anlamına gelir (P &#60; 0,05, ANOVA). <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56587/56587fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td rowspan="2">Sterilizasyon süresi (dk)</td>
			<td colspan="4">Çamaşır suyu toplama (%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40</td>
			<td>50</td>
			<td>80</td>
			<td>100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>%0.00</td>
			<td>%0.00</td>
			<td>%0.00</td>
			<td>%2.13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8</td>
			<td>%0.00</td>
			<td>%0.00</td>
			<td>%0.00</td>
			<td>%0.00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10</td>
			<td>%0.00</td>
			<td>% 0.50</td>
			<td>%0.00</td>
			<td>%0,36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15</td>
			<td>%0.00</td>
			<td>%0.00</td>
			<td>%0.00</td>
			<td>%0,68</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20</td>
			<td>%0,19</td>
			<td>%0,28</td>
			<td>%0.00</td>
			<td>%0.00</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tablo 1: Kalıp çamaşır suyu sterilize Col-0 tohum düzeyde.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Çamaşır suyu</td>
			<td>HCl</td>
			<td>Zaman</td>
			<td rowspan="2">% Klor gazı (mol Cl2/mol toplam gaz)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(mL)</td>
			<td>(mL)</td>
			<td>(h)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25</td>
			<td>1</td>
			<td>3</td>
			<td>2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100</td>
			<td>3</td>
			<td>1</td>
			<td>6.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100</td>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
			<td>6.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200</td>
			<td>9</td>
			<td>1</td>
			<td>16,5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200</td>
			<td>9</td>
			<td>3</td>
			<td>16,5</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tablo 2: Klor (Cl2) gaz Columbia vahşi tipi tohumlar 7 L kapsayıcı'ı kullanarak sterilizasyon tedavisi.
Ek tablo 1: Konteyner ve % Cl2farklı birimler için hesaplama gerçekleştirmek için programlanmış bir elektronik tablo. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56587/Supplemental_Table _1.xlsx" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Standardized Method for High-throughput Sterilization of Arabidopsis Seeds at JoVE.com

Standardized Method for High-throughput Sterilization of Arabidopsis Seeds

Yüksek işlem hacmi sterilizasyon Arabidopsis tohum için standart yöntem

Bu çalışmanın amacı çamaşır suyu ve klor gazı sterilizasyon steril ortam üzerinde yetiştirilen bir aralığı Arabidopsis genotip tohum çimlenmesi üzerindeki etkilerini belirlemek için yapıldı. En iyi duruma getirilmiş sterilizasyon protokolleri tatmin edici tohum hayatta kalma sağlarken mikrobiyal kirleticiler gelişimini engellemek için geliştirilmiştir.

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) seedlings often need to be grown on sterile media. This requires prior seed sterilization to prevent the growth of ...

standardized-method-for-high-throughput-sterilization-arabidopsis

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

29.3K Görüntüleme.  The Ohio State University. Bu çalışmanın amacı çamaşır suyu ve klor gazı sterilizasyon steril ortam üzerinde yetiştirilen bir aralığı Arabidopsis genotip tohum çimlenmesi üzerindeki etkilerini belirlemek için yapıldı. En iyi duruma getirilmiş sterilizasyon protokolleri tatmin edici tohum hayatta kalma sağlarken mikrobiyal kirleticiler gelişimini engellemek için geliştirilmiştir.

Video: Standardized Method for High-throughput Sterilization of Arabidopsis Seeds

Adherence of Bacteria to Plant Surfaces Measured in the Laboratory

This manuscript describes a method to measure bacterial binding to axenic plant surfaces in the light microscope and through the use of viable cell counts. Plant materials used include roots, sprouts, leaves, and cut fruits. The methods described are inexpensive, easy, and suitable for small sample sizes. Binding is measured in the laboratory and a variety of incubation media and conditions can be used. The effect of inhibitors can be determined. Situations that promote and inhibit binding can also be assessed. In some cases it is possible to distinguish whether various conditions alter binding primarily due to their effects on the plant or on the bacteria.

An easy method for measuring and characterizing bacterial adhesion to plants, particularly roots and sprouts, is described in this article.

Laboratuvarda ölçmek yüzeyler bitki bakterilerin bağlılık

This manuscript describes a method to measure bacterial binding to axenic plant surfaces in the light microscope and through the use of viable cell ...

Çevre

A Flexible Low Cost Hydroponic System for Assessing Plant Responses to Small Molecules in Sterile Conditions

A wide range of studies in plant biology are performed using hydroponic cultures. In this work, an in vitro hydroponic growth system designed for assessing plant responses to chemicals and other substances of interest is presented. This system is highly efficient in obtaining homogeneous and healthy seedlings of the C3 and C4 model species Arabidopsis thaliana and Setaria viridis, respectively. The sterile cultivation avoids algae and microorganism contamination, which are known limiting factors for plant normal growth and development in hydroponics. In addition, this system is scalable, enabling the harvest of plant material on a large scale with minor mechanical damage, as well as the harvest of individual parts of a plant if desired. A detailed protocol demonstrating that this system has an easy and low-cost assembly, as it uses pipette racks as the main platform for growing plants, is provided. The feasibility of this system was validated using Arabidopsis seedlings to assess the effect of the drug AZD-8055, a chemical inhibitor of the target of rapamycin (TOR) kinase. TOR inhibition was efficiently detected as early as 30 min after an AZD-8055 treatment in roots and shoots. Furthermore, AZD-8055-treated plants displayed the expected starch-excess phenotype. We proposed this hydroponic system as an ideal method for plant researchers aiming to monitor the action of plant inducers or inhibitors, as well as to assess metabolic fluxes using isotope-labeling compounds which, in general, requires the use of expensive reagents.

A simple, versatile, and low-cost in vitro hydroponic system was successfully optimized, enabling large-scale experiments under sterile conditions. This system facilitates the application of chemicals in a solution and their efficient absorption by roots for molecular, biochemical, and physiological studies.

Küçük moleküllere steril koşullarda bitki yanıt-e doğru değerlendirmek için Hydroponic sistemi esnek bir düşük maliyetli

A wide range of studies in plant biology are performed using hydroponic cultures. In this work, an in vitro hydroponic growth system designed for ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome affinity purification (TRAP) method and consecutive optimized low-input library preparation.
As starting material, we employ plant lines that express GFP-tagged ribosomal protein RPL18 in a cell type-specific manner by use of adequate promoters. Prior to immunopurification and RNA extraction, the tissue is snap frozen, which preserves tissue integrity and simultaneously allows execution of time series studies with high temporal resolution. Notably, cell wall structures remain intact, which is a major drawback in alternative procedures such as fluorescence-activated cell sorting-based approaches that rely on tissue protoplasting to isolate distinct cell populations. Additionally, no tissue fixation is necessary as in laser capture microdissection-based techniques, which allows high-quality RNA to be obtained.
However, sampling from subpopulations of cells and only isolating polysome-associated RNA severely limits RNA yields. It is, therefore, necessary to apply sufficiently sensitive library preparation methods for successful data acquisition by RNA-seq.
TRAP offers an ideal tool for plant research as many developmental processes involve cell wall-related and mechanical signaling pathways. The use of promoters to target specific cell populations is bridging the gap between organ and single-cell level that in turn suffer from little resolution or very high costs. Here, we apply TRAP to study cell-cell communication in lateral root formation.

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

Translating ribosome affinity purification (TRAP) offers the possibility to dissect developmental programs with minimal processing of organs and tissues. The protocol yields high-quality RNA from cells targeted with a green fluorescent protein (GFP)-labeled ribosomal subunit. Downstream analysis tools, such as qRT-PCR or RNA-seq, reveal tissue and cell type-specific expression profiles.

Bir Hücre Tipine Özel Ölçekte Arabidopsis thaliana Kök Gelişimini Araştırmak Için Ribozom Affinity Arınma (TRAP) Çevirisi

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome ...

Gelişim Biyolojisi

Monitoring Bacterial Colonization and Maintenance on Arabidopsis thaliana Roots in a Floating Hydroponic System

Bacteria form complex rhizosphere microbiomes shaped by interacting microbes, larger organisms, and the abiotic environment. Under laboratory conditions, rhizosphere colonization by plant growth-promoting bacteria (PGPB) can increase the health or the development of host plants relative to uncolonized plants. However, in field settings, bacterial treatments with PGPB often do not provide substantial benefits to crops. One explanation is that this may be due to loss of the PGPB during interactions with endogenous soil microbes over the lifespan of the plant. This possibility has been difficult to confirm, since most studies focus on the initial colonization rather than maintenance of PGPB within rhizosphere communities. It is hypothesized here that the assembly, coexistence, and maintenance of bacterial communities are shaped by deterministic features of the rhizosphere microenvironment, and that these interactions may impact PGPB survival in native settings. To study these behaviors, a hydroponic plant-growth assay is optimized using Arabidopsis thaliana to quantify and visualize the spatial distribution of bacteria during initial colonization of plant roots and after transfer to different growth environments. This system&#8217;s reproducibility and utility are then validated with the well-studied PGPB Pseudomonas simiae. To investigate how the presence of multiple bacterial species may affect colonization and maintenance dynamics on the plant root, a model community from three bacterial strains (an Arthrobacter, Curtobacterium, and Microbacterium species) originally isolated from the A. thaliana rhizosphere is constructed. It is shown that the presence of these diverse bacterial species can be measured using this hydroponic plant-maintanence assay, which provides an alternative to sequencing-based bacterial community studies. Future studies using this system may improve the understanding of bacterial behavior in multispecies plant microbiomes over time and in changing environmental conditions.

Monitoring Bacterial Colonization and Maintenance on Arabidopsis thaliana Roots in a Floating Hydroponic System

Here we describe a hydroponic plant growth assay to quantify species presence and visualize the spatial distribution of bacteria during initial colonization of plant roots and after their transfer into different growth environments.

Yüzen hidroponik sistemde Arabidopsis thaliana kökleri üzerinde bakteriyel kolonizasyon ve bakım izleme

Bacteria form complex rhizosphere microbiomes shaped by interacting microbes, larger organisms, and the abiotic environment. Under laboratory conditions, ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue patterning. During animal development, key cell proliferation and patterning events occur very quickly. For instance, in Caenorhabditis elegans all cell divisions required for the larval body plan are completed within six hours after fertilization, with seven mitotic cycles1; the sixteen or more mitoses of Drosophila embryogenesis occur in less than 24 hr2. In contrast, cell divisions during plant development are slow, typically on the order of a day 3,4,5 . This imposes a unique challenge and a need for long-term live imaging for documenting dynamic behaviors of cell division and differentiation events during plant organogenesis. Arabidopsis epidermis is an excellent model system for investigating signaling, cell fate, and development in plants. In the cotyledon, this tissue consists of air- and water-resistant pavement cells interspersed with evenly distributed stomata, valves that open and close to control gas exchange and water loss. Proper spacing of these stomata is critical to their function, and their development follows a sequence of asymmetric division and cell differentiation steps to produce the organized epidermis (Fig. 1).
This protocol allows observation of cells and proteins in the epidermis over several days of development. This time frame enables precise documentation of stem-cell divisions and differentiation of epidermal cells, including stomata and epidermal pavement cells. Fluorescent proteins can be fused to proteins of interest to assess their dynamics during cell division and differentiation processes. This technique allows us to understand the localization of a novel protein, POLAR6, during the proliferation stage of stomatal-lineage cells in the Arabidopsis cotyledon epidermis, where it is expressed in cells preceding asymmetric division events and moves to a characteristic area of the cell cortex shortly before division occurs. Images can be registered and streamlined video easily produced using public domain software to visualize dynamic protein localization and cell types as they change over time.

Long-term, High-resolution Confocal Time Lapse Imaging of Arabidopsis Cotyledon Epidermis during Germination

We describe a protocol using chamber slides and media to immobilize plant cotyledons for confocal imaging of the epidermis over several days of development, documenting stomatal differentiation. Fluorophore-tagged proteins can be tracked dynamically by expression and subcellular localization, increasing understanding of their possible roles during cell division and cell-type differentiation.

Uzun süreli, yüksek çözünürlüklü Konfokal Time Lapse Görüntüleme<em&gt; Arabidopsis Kotiledon</emÇimlenme sırasında&gt; Epidermis

Imaging in vivo dynamics of cellular behavior throughout a developmental sequence can be a powerful technique for understanding the mechanics of tissue ...

Biyoloji

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a consequence, the isolation of plant embryos at early stages (1 cell to globular stage) is technically challenging due to their relative inaccessibility. Efficient manual dissection at early stages is strongly impaired by the small size of young Arabidopsis seeds and the adhesiveness of the embryo to the surrounding tissues. Here, we describe a method that allows the efficient isolation of young Arabidopsis embryos, yielding up to 40 embryos in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. Embryos are released into isolation buffer by slightly crushing 250-750 seeds with a plastic pestle in an Eppendorf tube. A glass microcapillary attached to either a standard laboratory pipette (via a rubber tube) or a hydraulically controlled microinjector is used to collect embryos from droplets placed on a multi-well slide on an inverted light microscope. The technical skills required are simple and easily transferable, and the basic setup does not require costly equipment. Collected embryos are suitable for a variety of downstream applications such as RT-PCR, RNA sequencing, DNA methylation analyses, fluorescence in situ hybridization (FISH), immunostaining, and reporter gene assays.

Efficient and Rapid Isolation of Early-stage Embryos from Arabidopsis thaliana Seeds

We report an efficient and simple method to isolate embryos at early stages of development from Arabidopsis thaliana seeds. Up to 40 embryos can be isolated in 1 hr to 4 hr, depending on the downstream application. The procedure is suitable for transcriptome, DNA methylation, reporter gene expression, immunostaining and fluorescence in situ hybridization analyses.

Erken evre Embriyolar verimli ve hızlı İzolasyon<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Tohumlar

In flowering plants, the embryo develops within a nourishing tissue - the endosperm - surrounded by the maternal seed integuments (or seed coat). As a ...

A Seed Coat Bedding Assay to Genetically Explore In Vitro How the Endosperm Controls Seed Germination in Arabidopsis thaliana

The Arabidopsis endosperm consists of a single cell layer surrounding the mature embryo and playing an essential role to prevent the germination of dormant seeds or that of nondormant seeds irradiated by a far red (FR) light pulse. In order to further gain insight into the molecular genetic mechanisms underlying the germination repressive activity exerted by the endosperm, a &#34;seed coat bedding&#34; assay (SCBA) was devised. The SCBA is a dissection procedure physically separating seed coats and embryos from seeds, which allows monitoring the growth of embryos on an underlying layer of seed coats. Remarkably, the SCBA reconstitutes the germination repressive activities of the seed coat in the context of seed dormancy and FR-dependent control of seed germination. Since the SCBA allows the combinatorial use of dormant, nondormant and genetically modified seed coat and embryonic materials, the genetic pathways controlling germination and specifically operating in the endosperm and embryo can be dissected. Here we detail the procedure to assemble a SCBA.

A Seed Coat Bedding Assay to Genetically Explore In Vitro How the Endosperm Controls Seed Germination in Arabidopsis thaliana

We present the procedure to assemble a seed coat bedding assay (SCBA) from Arabidopsis thaliana seeds. The SCBA was shown to be a powerful tool to explore genetically and in vitro how the endosperm controls seed germination in dormant seeds and in response to light cues. The SCBA is in principle applicable under any situation where the endosperm is suspected to influence embryonic growth.

Genetiği keşfedin A Tohum Kabuğunun Yatak Deneyi<em&gt; In Vitro</em&gt; Nasıl Endosperminde Denetimler Çimlenme içinde<em&gt; Arabidopsis thaliana</em

The Arabidopsis endosperm consists of a single cell layer surrounding the mature embryo and playing an essential role to prevent the germination of ...

Lateral Root Inducible System in Arabidopsis and Maize

Lateral root development contributes significantly to the root system, and hence is crucial for plant growth. The study of lateral root initiation is however tedious, because it occurs only in a few cells inside the root and in an unpredictable manner. To circumvent this problem, a Lateral Root Inducible System (LRIS) has been developed. By treating seedlings consecutively with an auxin transport inhibitor and a synthetic auxin, highly controlled lateral root initiation occurs synchronously in the primary root, allowing abundant sampling of a desired developmental stage. The LRIS has first been developed for Arabidopsis thaliana, but can be applied to other plants as well. Accordingly, it has been adapted for use in maize (Zea mays). A detailed overview of the different steps of the LRIS in both plants is given. The combination of this system with comparative transcriptomics made it possible to identify functional homologs of Arabidopsis lateral root initiation genes in other species as illustrated here for the CYCLIN B1;1 (CYCB1;1) cell cycle gene in maize. Finally, the principles that need to be taken into account when an LRIS is developed for other plant species are discussed.

Lateral Root Inducible System in Arabidopsis and Maize

The Lateral Root Inducible System (LRIS) allows for synchronous induction of lateral roots and is presented for Arabidopsis thaliana and maize.

Lateral Kök İndüklenebilir Sistemi<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Ve Mısır

Lateral root development contributes significantly to the root system, and hence is crucial for plant growth. The study of lateral root initiation is ...

Hydroponics: A Versatile System to Study Nutrient Allocation and Plant Responses to Nutrient Availability and Exposure to Toxic Elements

Hydroponic systems have been utilized as one of the standard methods for plant biology research and are also used in commercial production for several crops, including lettuce and tomato. Within the plant research community, numerous hydroponic systems have been designed to study plant responses to biotic and abiotic stresses. Here we present a hydroponic protocol that can be easily implemented in laboratories interested in pursuing studies on plant mineral nutrition.
This protocol describes the hydroponic system set up in detail and the preparation of plant material for successful experiments. Most of the materials described in this protocol can be found outside scientific supply companies, making the set up for hydroponic experiments less expensive and convenient.
The use of a hydroponic growth system is most advantageous in situations where the nutrient media need to be well controlled and when intact roots need to be harvested for downstream applications. We also demonstrate how nutrient concentrations can be modified to induce plant responses to both essential nutrients and toxic non-essential elements.

Here, we present an easy-to-follow protocol to establish a successful hydroponic system for plant nutrition studies. This protocol has been extensively tested in Arabidopsis and can easily be adapted to other plant species to study specific nutritional requirements or the effect of non-essential elements on plant growth and development.

Topraksız: A yönlü Sistemi Toksik Elements Besin Uygunluk ve Pozlama Besin Tahsis ve Bitki Cevapları Eğitim için

Hydroponic systems have been utilized as one of the standard methods for plant biology research and are also used in commercial production for several ...

High-throughput, Robust and Highly Time-flexible Method for Surface Sterilization of Arabidopsis Seeds

Arabidopsis is by far the plant model species most widely used for functional studies. The surface sterilization of Arabidopsis seeds is a fundamental step required towards this end. Thus, it is paramount to establish high-throughput Arabidopsis seed surface sterilization methods to handle tens to hundreds of samples (e.g., transgenic lines, ecotypes, or mutants) at once. A seed surface sterilization method based on the efficient elimination of liquid in tubes with a homemade suction device constructed from a common vacuum pump is presented in this study. By dramatically reducing labor-intensive hands-on time with this method handling several hundreds of samples in one day is possible with little effort. Series time-course analyses further indicated a highly flexible time range of surface sterilization by maintaining high germination rates. This method could be easily adapted for surface sterilization of other kinds of small seeds with simple customization of the suction device according to the seed size, and the speed desired to eliminate the liquid.

A high-throughput protocol for the surface sterilization of Arabidopsisthaliana (Arabidopsis) seeds is provided, optimizing the liquid handling steps with a simple suction device constructed with a vacuum pump. Hundreds of seed samples can be surface-sterilized in one day.

Arabidopsis Tohumlarının Yüzey Sterilizasyonu için Yüksek Verimli, Sağlam ve Son Derece Esnek Yöntem

Arabidopsis is by far the plant model species most widely used for functional studies. The surface sterilization of Arabidopsis seeds is a fundamental ...

Yüksek işlem hacmi sterilizasyon Arabidopsis tohum için standart yöntem

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Laboratuvarda ölçmek yüzeyler bitki bakterilerin bağlılık

Küçük moleküllere steril koşullarda bitki yanıt-e doğru değerlendirmek için Hydroponic sistemi esnek bir düşük maliyetli

Bir Hücre Tipine Özel Ölçekte Arabidopsis thaliana Kök Gelişimini Araştırmak Için Ribozom Affinity Arınma (TRAP) Çevirisi

Yüzen hidroponik sistemde Arabidopsis thaliana kökleri üzerinde bakteriyel kolonizasyon ve bakım izleme

Uzun süreli, yüksek çözünürlüklü Konfokal Time Lapse Görüntüleme

Erken evre Embriyolar verimli ve hızlı İzolasyon

Genetiği keşfedin A Tohum Kabuğunun Yatak Deneyi

Lateral Kök İndüklenebilir Sistemi

Topraksız: A yönlü Sistemi Toksik Elements Besin Uygunluk ve Pozlama Besin Tahsis ve Bitki Cevapları Eğitim için

Arabidopsis Tohumlarının Yüzey Sterilizasyonu için Yüksek Verimli, Sağlam ve Son Derece Esnek Yöntem