Bu çalışmada İsveç Araştırma Kurumu tarafından desteklenmiştir (www.vr.se) ARC için verir (2014-6466 ve ark (ICA14-0060) için stratejik araştırma (www.stratresearch.se) İsveçli temeli. Chalmers Teknik Üniversitesi bu çalışmaları sırasında MKME için mali destek sağladı. Fon çalışma tasarım, veri toplama ve analizi, yayımlamaya karar veya el yazması hazırlanması herhangi bir rolü yoktu.

Bu iletişim kuralı şekil 1 ' de özetlenen ve gDNA, sindirim enzimleri hidrolize alkali ile tedavi ribonucleotides, sayısı quantitate edebilmek için ile yalıtım içerir gDNA, 5´-OH ücretsiz biter fosforilasyon, ssDNA ligasyonu bağdaştırıcıları, ikinci strand sentezi ve PCR güçlendirme sıralama önce içine dahil ribonucleotides fosfodiester bağları.
 1. bağdaştırıcıları ve dizin astar <ol><li>elde ARC49, ARC140 oligonucleotides, ARC76/77, bağdaştırıcı ve ARC78-ARC107 dizin Astar boyaları (bkz. Tablo 1). 
	Not: Oligonucleotides HPLC saf olmalıdır. ARC76/77 dubleks sipariş.</li>
	<li>Hazırlamak 100 µM hisse senedi çözümler her Oligonükleotid Tris-EDTA (TE) arabelleği (Tablo reçetesi görmek) ve depolamak -20 ° C.</li>
	<li>ARC67/77 10 µM çözümleri ve 2 µM çözümleri ARC49 ve dizin astar, elüsyon arabellekte (EB; bkz: Malzemeler tablo) sulandrarak hazırlayın. Mağaza-20 ° C'de</li>
</ol> 2. Büyüme ve hücre hasat <ol><li>büyümek HeLa hücreleri 70 ML Dulbecco &#39; s modifiye kartal orta (DMEM) ile % 10 fetal sığır serum 250 mL Spinner şişesi 37 olarak takıma ° C.</li>
	<li>Hücreleri saymak ve 5 x 10 6 hücreler bir 50 mL tüp, santrifüj, 200 x g, 5 min için toplamak ve süpernatant atın.</li>
	<li>20 mL 1 x PBS, santrifüj, 200 x g, 5 min için hücrelerle yıkayın ve süpernatant atın.</li>
	<li>Granül-20 ° C'de dondurmak veya DNA arıtma ile devam.</li>
</ol> 3. DNA arıtma ve Nefelometri <ol><li>gDNA fenol kloroform ayıklama aşağıda açıklandığı gibi kullanarak arındırmak.
	<ol><li>Resuspend 2 mL lizis arabellek hücrelerde (Tablo reçetesi görmek) ve Isıtma blokta 42 ° C'de 30 dk için kuluçkaya. 
		Dikkat: Lizis arabellek tehlikeli bileşenleri içerir. SDS çözüm rahatsız edici, İndinavir K duyarlılığı, rahatsız edici ve zehirli. Eldiven ve koruyucu giysiler giymek.</li>
		<li>İki 2 mL tüpler örnekte bölünmüş ve 1 birim (V) fenol kloroform izoamil alkol (25:24:1) eklemek. 
		Uyarı: Toksik, mutajenik, aşındırıcı ve su ortamları için tehlikeli fenol kloroform izoamil alkol. Kullanmak bir duman başlık, eldiven ve koruyucu giysiler giymek ve özel fenol kloroform israf içinde atmak.</li>
		<li>Mix inversiyon için 30-60 s ve santrifüj 15.000 x 5 min için g oda sıcaklığında. 
		Not: hangi sonuçları deforme rastgele kırılmalara, tanıtımı önlemek için DNA girdap mı.</li>
		<li>1 V fenol kloroform izoamil alkol (25:24:1) ekleyin ve yeni bir 2 mL tüp üst, sulu faz transfer.</li>
		<li>Mix inversiyon ve 15.000 x g 4 de 5 dk santrifüj ° C.</li>
		<li>Yeni bir 2 mL tüp ve 20 µL eklemek için üst, sulu faz transfer NaCl (5 M) ve 1 V / soğuk isopropanol. 
		Dikkat: Yanıcı, rahatsız edici ve zehirli Isopropanol. Havalandırılmış bir dolapta saklamak, eldiven ve koruyucu giysiler giymek ve ateş kaynaklarını hiçbir devam.</li>
		<li>Mix INVERSION tarafından ve en az 1 h -20 için kuluçkaya ° C.</li>
		<li>İçin 15.000 x g, 4 ° C ve atma süpernatant, 20 dk santrifüj.</li>
		<li>Yıkama DNA Pelet 200 µL soğuk % 70 etanol ile 15.000 x g 4 ° c de 20 dk santrifüj kapasitesi ve süpernatant atın. 
		Dikkat: % 70 etanol yanıcı ve rahatsız edici. Çalışma çözüm-20 ° C, başka türlü mağaza havalandırılmış kabine, aşınma koruyucu giysiler ve eldiven tutmak ve ateş kaynaklarını hiçbir devam.</li>
		<li>20-25 dakika süreyle oda sıcaklığında DNA Pelet Makinası</li>
		<li>Erimesi DNA parçaları 100 µL te tampon ve bir tüp örneklerinde havuz.</li>
	</ol></li> <li>Quantitate DNA toplama dsDNA Nefelometri reaktif üretici göre kullanarak &#39; s özellikleri (bkz. Tablo reçetesi). 
	Not: çünkü spektrofotometrik DNA Nefelometri artık fenol tarafından etkilenebilir dsDNA Nefelometri reaktif kullanın.</li>
	<li>Mağaza DNA-20 ° c veya HincII tedavi ile devam.</li>
</ol> 4. HincII tedavi ve alkali hidroliz <ol><li>bir tepki olarak DNA'ın Özet 1 µg karışımı 5 µL 10 x arabellek 3.1, 1 µL (10 U) içeren HincII ve nükleaz ücretsiz H 2 O son hacmiyle 50 µL. 
	Not: tüp ligasyonu için en uygun koşulları elde etmek için ikinci strand sentez ve PCR güçlendirme, bu DNA'yı ribonucleotides çok düşük bir dizi içerir beklenen giriş DNA miktarını artırmak gerekli olabilir. Benzer şekilde, ribonucleotides sayısı çok yüksek ise giriş DNA azaltmak gerekli olabilir.</li>
	<li>37 ° C'de 30 dk için kuluçkaya</li>
	<li>HincII arındırmak tedavi DNA ile paramagnetic boncuk. 
	Not: kapakları granül tüpler açarak değil rahatsız etmek için aşağıdaki adımları açmak tüp tutun.
	<ol><li>Ekleyin 1.8 V paramagnetic boncuk her örnek, dikkatle pipetting tarafından mix ve oda sıcaklığında 10 dakika süreyle kuluçkaya</li>
		<li>Boncuk 5 min için cips daha sonra kaldırmak ve süpernatant atmak için manyetik bir raf kullanın.</li>
		<li>Yaklaşık 30 s sonra Kaldır ve atma süpernatant için 150 µL % 70 etanol (oda sıcaklığında) ile Pelet yıkayın.</li>
		<li>Yıkama Pelet ile 200 µL % 70 etanol (oda sıcaklığında) yaklaşık 30 s sonra kaldırmak ve süpernatant atın. 
		Not: Artık etanol 10 µL pipet ile kaldırılabilir. Damlacıkları spun aşağı kısaca önceden.</li>
		<li>Kuru, oda sıcaklığında yaklaşık 15-20 dakika süreyle örnekleri 
		Not: Tam olarak ne zaman boncuk hacmi ve Pelet şeklinde bağlıdır, bu nedenle granül görsel olarak kontrol edilmelidir.</li>
		<li>Manyetik raf tüpler kaldırın ve Pelet 45 µL EB, tarafından dikkatle pipetting mix elute.</li>
		<li>5 dk sonra manyetik raf üstündeki cips ve saf DNA'ın 45 µL 4.4 adımda kullanmak için kuluçkaya.</li>
	</ol></li> <li>Ekleyin 5 µL KOH (3 M) veya KCl (3 M) toplam hacmi 50 µL oluşturma DNA için. 
	Dikkat: 3 M KOH aşındırıcı bir çözümdür. Eldiven ve koruyucu giysiler giymek.</li>
	<li>Incubate bir hibridizasyon 55 ° C'de 2 h için fırın buz üzerinde 5 min tarafından takip 
	Not: Tüp Tekdüzen bir Isıtma korumak ve kapağı, yoğunlaşma önlemek bir Isıtma blok yerine bir fırın KOH tedavi gerçekleştirmek için önerilir.</li>
	10 µL sodyum asetat ekleyerek <li>çökelti DNA (3 M, pH = 5,2) ve 125 µL soğuk % 100 etanol. 5 dakika süreyle buz üzerinde kuluçkaya 
	Dikkat: % 100 etanol yanıcı ve rahatsız edici. Saklamak havalandırılmış bir dolapta, eldiven ve koruyucu giysiler giymek ve ateş kaynaklarını hiçbir devam.</li>
	<li>Cips gDNA 21.000 x g, 5 min için 4 ° C de centrifuging tarafından ve süpernatant atın.</li>
	<li>Yıkama DNA Pelet 250 µL soğuk % 70 alkol, santrifüj kapasitesi 21.000 x g, 5 min için 4 ° C de ve süpernatant atın. 
	Not: damlacıkları çıkarmak, tüp aşağı kısaca tekrar döndü ve süpernatant kaldırılabilir 10 µl pipet ile.</li>
	<li>Yaklaşık 5-10 dakika için açık bir tüp içinde görünür herhangi bir sıvı buharlaşıp vardır kadar kuru Pelet izin.</li>
	<li>İzin DNA Pelet erime 20 µL EB, oda sıcaklığında 30 dakika içinde.</li>
</ol> 5. 5´ son fosforilasyon <ol><li>her örnek önceden eksilerini için tepki karışımı hazırlayın2.5 µL 10 x T4 polinükleotit kinaz tepki arabellek, 1 µL (10 U) 3´ fosfataz eksi T4 polinükleotit kinaz ve 2.5 µL ATP (10 mM) isting.</li>
	<li>Transfer 19 µL her DNA'ın örnek bir yeni 200 µL tüp içine ve termo cycler 85 ° C'de 3 min için denatüre.</li>
	<li>Serin DNA örnekleri buzda ve her örnek için 6 µL tepki Mix ekleyin.</li>
	<li>30 dk ve stop örnekleri 20 dk. 65 ° C'de kuluçka tarafından tepki için 37 ° C'de Incubate reaksiyon karışımları</li>
	<li>Arındırmak DNA olarak açıklanan 4,3, 1.8 V paramagnetic boncuk kullanarak ama 14 µL EB elute.</li>
</ol> 6. ssDNA tüp ligasyonu <ol><li>önceden 0.5 µL ATP (2 mM), 5 µL 10 x T4 RNA ligaz tepki arabellek, 5 µL CoCl 3 (NH 3) 6 (10 mM), oluşan her örnek için tepki karışımı hazırlayın 0.5 µL ARC140 (100 µM) ve %25 50 µL 8000 PEG. De pipetting tarafından Mix. 
	Dikkat: CoCl 3 (NH 3) 6 kanserojen, duyarlılığı ve su ortamında için tehlikeli olduğunu. Eldiven ve koruyucu giysiler giymek.</li>
	<li>Transfer 13 µL saf DNA'ın yeni bir 200 µL tüp 5.5 adım ve termo cycler 85 ° C'de 3 min için denatüre.</li>
	<li>Buz üzerinde DNA serin ve 36 µL pipetting tarafından mix, her örnek için tepki karışımı ekleyin ve spin aşağı kısaca.</li>
	<li>Her tepki için eklemek 1 µL (10 U) T4 RNA ligaz, mix pipetting tarafından ve spin aşağı kısaca.</li>
	<li>Örnekleri, oda sıcaklığında karanlık geceleme kuluçkaya.</li>
</ol> 7. İkinci-strand sentez <ol><li>arındırmak bakmaksızın DNA 4,3, açıklandığı gibi ama 0.8 V paramagnetic boncuk kullanın, boncuk 10 min için cips ve 20 µL EB elute. 
	Not: ilk Pelet adım nedeniyle daha yüksek viskozite ligasyonu tepki karışımı uzun.</li>
	DNA örneği yeni 200 µL PCR Tube <li>transfer 20 µL. 0.8 V paramagnetic boncuk üretici takip kullanarak arıtma adımı yineleyin &#39; s özellikleri ve 14 µL EB elute.</li>
	<li>Reaksiyon karışımı önceden 10 x T7 DNA polimeraz tepki arabellek, 2 µL 2 µL oluşan her örnek için hazırlamak ARC76/77 (2 µM), 2 µL dNTPs (2 mM) ve 0.8 µL BSA (1 mg/mL).</li>
	<li>Transfer 12,8 µL saf DNA bir yeni 200 µL tüp, termo cycler 85 ° C'de 3 min için denatüre.</li>
	<li>Buz üzerinde DNA serin ve her örnek, pipetting tarafından mix, spin aşağı kısaca ve oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya tepki karışımı 6.8 µL eklemek.</li>
	<li>0.4 µL (4 U) T7 DNA polimeraz her tepki ekleyin ve oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya.</li>
	<li>Arındırmak DNA olarak 4,3, açıklanan 0.8 V paramagnetic boncuk kullanarak ve 11 µL EB elute.</li>
</ol> 8. PCR güçlendirme ve Kütüphane Nefelometri <ol><li>hazırla yeni 200 her örnek için tepki karışımı µL tüp peşin 7.5 µL oluşan ARC49 (2 µM), 7.5 µL dizin astar (2 µM, her örnek için benzersiz) ve sıcak başlangıç x 25 µL 2 hazır karışım.</li>
	<li>Ekleyin 10 µL her tepki için DNA örneği. Aşağıdaki koşullar kullanarak kütüphane yükseltmek: 45 için 95 ° C'de denatüre 18 98 ° C devredir 15 ardından s, s, 30 65 ° C s, 30 72 ° C s, 72 ° C 2 dk. tutun örnekleri 4 ° için son bir uzama ile biten C amplifikasyon sonra.</li>
	<li>0.8 V paramagnetic boncuk, kullanma 4.3 içinde açıklandığı gibi kitaplıkları arındırmak ve 20 µL TE arabellekte elute.</li>
	<li>DsDNA Nefelometri reaktif kullanarak kütüphaneleri üretici göre quantitate &#39; s özellikleri (bkz. Tablo reçetesi).</li>
	<li>Saklamak-20 ° C'de örnekleri ya da kitaplık analizi ile devam.</li>
</ol> 9. Kütüphane analizi ve birbirinin <ol><li>Her kitaplık kalitesini belirlemek ve bir dijital Elektroforez sistemi kullanarak ortalama parça boyutu tahmin ediyoruz. 
	Not: Ortalama parça boyutu nereye electropherogram eğri altındaki alan yarıya, tahmin etme tarafından değerlendirilir doruklarına gelen işaretleri göz ardı ederek. Uygun Kütüphane profilleri KOH veya KCl tedaviden sonra temsilcisi sonuçları şekil 2A verilmiştir.</li>
	<li>Hesaplamak belgili tanımlık kütüphaneci konsantrasyonu (nM): 
	(c/10 3) /(p*650)] * 10 9 nerede c ng/µL kütüphanede konsantrasyon ve p kan basıncı, ortalama parça boyutu içinde tahmini 9.1.</li>
	<li>Havuzu eşit molar miktarda 24 Kitaplıklar farklı dizin astar için sıralama ile güçlendirilmiş. 25 µL son hacmi ve konsantrasyonu 10 TE arabellek eklemek nM. 
	Not: havuza alınmış için kitaplıklarına sayısına bağlı olarak, her kitaplık DNA'dan miktarı ayarlanır. Astar dimer algılanırsa 9.1 yaklaşık 130 farklı bir zirve adım'bp, Kütüphane havuzu son hacmi 25 µL, çünkü arıtma adım 0.8 V paramagnetic boncuk, kullanma 4.3 içinde açıklandığı gibi tekrarlanır ve DNA 25 µL TE buf eluted aşan fer.
	<ol><li>Belirleme dsDNA Nefelometri reaktif üretici göre kullanarak yeni kütüphane havuzu konsantrasyon &#39; s özellikleri ve ortalama zirve boyutu yukarıda açıklandığı gibi. Sıralama ve veri analizi (Bölüm 10 ve 11) devam.</li>
	</ol></li></ol> 10. Sıralama <ol><li>75-base eşleştirilmiş uç sıralama havuza alınan kütüphaneler 12 tarihinde gerçekleştirmek.</li></ol>
 11. veri analizi <ol><li>Trim bağdaştırıcısı dizileri, kaldırmak için tüm okuma filtre için kalite ve uzunluğu okuyun. 
	Not: Bu yapılabilir cutadapt 1.2.1 20 ile komutunu kullanarak ' cutadapt -f fastq--maç-okuma-joker - m 15 - q 10 - bir NNNNNNN sessiz &#60; dosya &#62;', nerede NNNNNNN gerçek bağdaştırıcı dizisi ile değiştirilir ve &#60; dosya &#62; olduğunu fastq dosya adıyla değiştirilir.</li>
	<li>Özel komut dosyaları kullanarak önceki adımda arkadaşları, atılan bir okuma kaldırmak.</li>
	<li>Kalan dostum 1 hizalamak çiftleri Kütüphane hazırlanmasında kullanılan tüm oligonucleotides dizisini içeren bir dizine (papyon 0.12.8 21 ve komut satırı kullanarak Örneğin, seçenekleri - m1-v2). Tüm çiftleri ile başarılı hizalamaları atın.</li>
	<li>Kalan çift papyon ile komut satırını kullanarak canlı referans genomunun büyüklüğü için hizalama seçenekleri - v2 -X 10000--en iyi.</li>
	<li>Harita okur arasında mitokondrial molekülü başında ve sonunda o span dostum 1 tüm hizalanmamış çiftlerinin hizalayarak (papyon ile komut satırını kullanarak seçenekleri - v2).</li>
	<li>5´-amaçları için tüm tek ve eşleştirilmiş son hizalamaları sayısını belirler. Bunlar bir baz akıntıya karşı tarafından konumunu nerede olduğunu hydrolyzed ribonucleotides konumuna kaydırmak.</li>
	Papyon dosya <li>verme verileri özel komut dosyaları kullanarak görselleştirme için ortak bir bedgraph dosya biçimine genom tarayıcılar biçimlendirin. Okuma her strand için okuma normalize milyon.</li>
	<li>Sayar ve pozisyon bedgraph dosyasını kullanarak başvuru Ltd.Şti kimliğini belirlemek için organizma genom dizisiorated ribonucleotides. 
	Not: bölgeleri 16,200-300 ve 5,747-5,847 için insan mitokondriyal genom okur için bu bölgelerdeki birçok ücretsiz 5´ biter ribonucleotide birleşme için DNA polimeraz γ tarafından ilgisiz içerdiğinden her strand çıkarılmalıdır.</li>
	<li>Okuma okuma ribonucleotides tek iplikçik sonu, (Yani mitokondrial molekülü başına ribonucleotides sayısı) başına sayısını elde etmek için HincII site başına ortalama sayısı ile onbir HincII sitelerde hariç toplam okuma bölmek.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Traut, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+Concentrations+of+Purines+and+Pyrimidines.">Physiological Concentrations of Purines and Pyrimidines.</a> Mol. Cell. Biochem. 140, 1-22 (1994).</li><li>McElhinny, S. A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abundant+ribonucleotide+incorporation+into+DNA+by+yeast+replicative+polymerases.">Abundant ribonucleotide incorporation into DNA by yeast replicative polymerases.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 4949-4954 (2010).</li><li>Williams, J. S., Lujan, S. A., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+ribonucleotides+incorporated+during+eukaryotic+DNA+replication.">Processing ribonucleotides incorporated during eukaryotic DNA replication.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 17, 350-363 (2016).</li><li>Clausen, A. R., Zhang, S., Burgers, P. M., Lee, M. Y., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribonucleotide+incorporation,+proofreading+and+bypass+by+human+DNA+polymerase+delta.">Ribonucleotide incorporation, proofreading and bypass by human DNA polymerase delta.</a> DNA Repair. 12, 121-127 (2013).</li><li>Potenski, C. J., Klein, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+the+misincorporation+of+ribonucleotides+into+genomic+DNA+can+be+both+harmful+and+helpful+to+cells.">How the misincorporation of ribonucleotides into genomic DNA can be both harmful and helpful to cells.</a> Nucleic Acids Res. 42, 10226 (2014).</li><li>Vengrova, S., Dalgaard, J. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNase-sensitive+DNA+modification(s)+initiates+S.+pombe+mating-type+switching.">RNase-sensitive DNA modification(s) initiates S. pombe mating-type switching.</a> Gene. Dev. 18, 794-804 (2004).</li><li>Lujan, S. A., Williams, J. S., Clausen, A. R., Clark, A. B., Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribonucleotides+Are+Signals+for+Mismatch+Repair+of+Leading-Strand+Replication+Errors.">Ribonucleotides Are Signals for Mismatch Repair of Leading-Strand Replication Errors.</a> Mol. Cell. 50, 437-443 (2013).</li><li>Ghodgaonkar, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribonucleotides+Misincorporated+into+DNA+Act+as+Strand-Discrimination+Signals+in+Eukaryotic+Mismatch+Repair.">Ribonucleotides Misincorporated into DNA Act as Strand-Discrimination Signals in Eukaryotic Mismatch Repair.</a> Mol. Cell. 50, 323-332 (2013).</li><li>DeRose, E. F., Perera, L., Murray, M. S., Kunkel, T. A., London, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solution+Structure+of+the+Dickerson+DNA+Dodecamer+Containing+a+Single+Ribonucleotide.">Solution Structure of the Dickerson DNA Dodecamer Containing a Single Ribonucleotide.</a> Biochemistry. 51, 2407-2416 (2012).</li><li>Li, Y. F., Breaker, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetics+of+RNA+degradation+by+specific+base+catalysis+of+transesterification+involving+the+2+'-hydroxyl+group.">Kinetics of RNA degradation by specific base catalysis of transesterification involving the 2 '-hydroxyl group.</a> J. Am. Chem. Soc. 121, 5364-5372 (1999).</li><li>McElhinny, S. A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+instability+due+to+ribonucleotide+incorporation+into+DNA.">Genome instability due to ribonucleotide incorporation into DNA.</a> Nat. Chem. Biol. 6, 774-781 (2010).</li><li>Berglund, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleotide+pools+dictate+the+identity+and+frequency+of+ribonucleotide+incorporation+in+mitochondrial+DNA.">Nucleotide pools dictate the identity and frequency of ribonucleotide incorporation in mitochondrial DNA.</a> Plos Genet. 13, (2017).</li><li>Brown, J. A., Suo, Z. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unlocking+the+Sugar+"Steric+Gate"+of+DNA+Polymerases.">Unlocking the Sugar "Steric Gate" of DNA Polymerases.</a> Biochemistry. 50, 1135-1142 (2011).</li><li>Sparks, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNase+H2-Initiated+Ribonucleotide+Excision+Repair.">RNase H2-Initiated Ribonucleotide Excision Repair.</a> Mol. Cell. 47, 980-986 (2012).</li><li>Miyabe, I., Kunkel, T. A., Carr, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Major+Roles+of+DNA+Polymerases+Epsilon+and+Delta+at+the+Eukaryotic+Replication+Fork+Are+Evolutionarily+Conserved.">The Major Roles of DNA Polymerases Epsilon and Delta at the Eukaryotic Replication Fork Are Evolutionarily Conserved.</a> Plos Genet. 7, (2011).</li><li>Clausen, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+replication+enzymology+in+vivo+by+genome-wide+mapping+of+ribonucleotide+incorporation.">Tracking replication enzymology in vivo by genome-wide mapping of ribonucleotide incorporation.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 22, 185-191 (2015).</li><li>Koh, K. D., Balachander, S., Hesselberth, J. R., Storici, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribose-seq:+global+mapping+of+ribonucleotides+embedded+in+genomic+DNA.">Ribose-seq: global mapping of ribonucleotides embedded in genomic DNA.</a> Nat. Methods. 12, 251 (2015).</li><li>Keszthelyi, A., Daigaku, Y., Ptasinska, K., Miyabe, I., Carr, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+ribonucleotides+in+genomic+DNA+and+exploring+replication+dynamics+by+polymerase+usage+sequencing+(Pu-seq).">Mapping ribonucleotides in genomic DNA and exploring replication dynamics by polymerase usage sequencing (Pu-seq).</a> Nat. Protoc. 10, 1786-1801 (2015).</li><li>Ding, J., Taylor, M. S., Jackson, A. P., Reijns, M. A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+mapping+of+embedded+ribonucleotides+and+other+noncanonical+nucleotides+using+emRiboSeq+and+EndoSeq.">Genome-wide mapping of embedded ribonucleotides and other noncanonical nucleotides using emRiboSeq and EndoSeq.</a> Nat. Protoc. 10, 1433-1444 (2015).</li><li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads.">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet.journal. 17, 10-12 (2011).</li><li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome.">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome Biol. 10, (2009).</li></ol>

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

Burada aynı anda harita ve ribonucleotides gDNA ve mtDNA özellikle, DNA dekolte, genom ek olarak oluşturulmuş HydEn seq protokol sırasını belirli sitelerdeki basit geçilmesi ölçmek için bir yöntem mevcut. Aslında bu çalışmada insan mtDNA üzerinde duruluyor olsa da, yöntemin çeviri diğer organizmaların12,16gösteren Saccharomyces cerevisiae, HydEn seq yöntemi geliştirildi.
Bu yaklaşımdan alınan güvenilir sonuçlar elde etmek için bazı önemli adımlar belirtmek gerekir: (A) tüm kullanılabilir 5´ uçları için sıralaması bağdaştırıcısı ligate bu yana, bu son derece sağlam DNA ile çalışmak çok önemli. DNA yalıtılması gerekir ve kitaplıkları tercihen hemen DNA izolasyon sonra yapılması gereken veya DNA-20 ° C'de depolanan Bu DNA buzdolabında uzun süre saklamak için veya tekrar tekrar donma ve bu yaz için tavsiye edilmez. (B) bu yöntem ile uygun kitaplıkları oluşturmak için tüm örnek ve nicel hidroliz homojen ısıtma temin bir Isıtma blok yerine bir kuluçka fırın içinde DNA'ın KOH tedavi gerçekleştirmek önemlidir. (C) Ayrıca, havuz ve sıralama önce kitaplıkları kalite kontrol için önemlidir. DNA sayısal ve Kütüphane DNA, yeterli miktarda emin olmak için bir otomatik Elektroforez sistemi kullanılarak analiz uygun parça boyutları onaylamak ve astar dimer için kontrol edin.
Anlamlı veri analizi için bu yöntemin bilgilendirici değeri arka plan sayar ve sıra veya strand önyargıları değerlendirmek için uygun denetimlere bağlı olduğunu unutmamak önemlidir. Biz düzenli olarak sadece sıra belirli endonükleaz (şekil 2B, sol kapı aynası) ile sindirerek zaman KCl örnekleri % 70'e yakın bir eşleme verimliliği elde. Buna ek olarak, endonükleaz tedavi genel etkilemiyor onaylamak önemlidir HincII karşılaştırarak anonim ribonucleotides tespiti tedavi ve tedavi edilmezse örnekleri (3B rakam). Diğer yüksek-sadakat enzimleri de kullanılabilir olsa bu deneylerde, biz HincII sahaya özel kesim, tanıtmak için kullandık.
Protokol adapte olabilir diğer tip-in 5´-fosfat ya da 5´-OH işlenebilir DNA lezyonlar çalışmaya biter. Sonuçlarının doğruluğunu işleme özgüllük bağlıdır ve uygun denetimler gerektirir (Örneğin, vahşi türü veya tedavi edilmemiş) doğrulaması için. Ayrıca, bu yöntem diğer uygulamalara veya diğer organizmalar ile kullanmak için adapte, biri onun geçerli kurulum yönteminde bir kitaplığı işlenen DNA'ın yaklaşık 1 µg gerektirir düşünmelisiniz. Biter sayısı katıştırılmış ribonucleotides sayısına bağımlı olduğundan, hangi örnek ribonucleotides daha düşük bir dizi dahil canlı veya mutant, bağlı olarak değişir daha DNA biter yeterli sayıda oluşturmak için giriş gerektirir Sonraki Kütüphane inşaat. DNA örnekleri ribonucleotides çok daha yüksek sayıda varsa, benzer şekilde, bu da tüp ligasyonu, ikinci strand sentezi ve PCR güçlendirme için en uygun koşulları elde etmek için daha az giriş DNA'yı kullanarak gerektirir. Bu protokol için açıklandığı gibi Kütüphane inşaat da nükleer genom ( 2D rakamgörüntülendiği gibi) kapsayan veri oluşturmak ve yalnızca veri analiz mtDNA üzerinde duruldu çekicidir. Bu orta alt ribonucleotide frekansları ile daha büyük genleri de bu yöntem tarafından yakalanır göstermektedir.
Bu yöntem dikkate alınarak, belirli sınırlamaları dikkate alınması: Bu yöntem teorik olarak, hemen her organizma için uygulanabilir olmalıdır ancak uygun başvuru genom okuma hizalama için gereklidir. Ayrıca, bizim iletişim kuralından elde edilen sonuçlar çok sayıda hücre okuma temsil eder. Belirli ribonucleotide birleşme kalıpları hücre alt grubunu bu yaklaşım tarafından tanımlanamaz. Ribonucleotides ribonucleotides çok düşük bir dizi ile daha büyük genleri eşleştirilirse, ribonucleotides gelen rasgele rumuz arasında ayırt etmek zor ve uygun denetimleri bu nedenle ihtiyaç vardır.
Biz burada, tarif yöntemi HydEn Seq16, riboz-Seq17, Pu-Seq18ya da emRiboSeq19gibi kullanılabilir vivo içinde teknikleri genişletir. Bu yaklaşımlar katıştırılmış ribonucleotides duyarlılık alkalin yararlanmak veya RNase H2 tedavi, sırasıyla, onların haritalama ve karşılaştırmasını sağlayan ribonucleotides genom genelindeki tanımlamak için yeni nesil sıralama istihdam göreli birleşme. DNA dizisi özellikle fizyon tarafından ek olarak, katıştırılmış ribonucleotides, alkali hidroliz yukarıda açıklandığı gibi ribonucleotides için okuma sadece kimlik izin ve eşleme bu bölünme siteleri için normalleştirilmiş ribonucleotides, aynı zamanda onların Nefelometri her DNA molekülü için. Bizim teknik hastalıklar bağlamında uygulama DNA ikileşmesi için ilgili DNA tamiri ve TLS moleküler mekanizmaları ve genom bütünlüğü genel olarak temel içinde ribonucleotides rolünün daha derin bir anlayış verebilir.

Bir ökaryotik hücre, ribonucleotides (rNTPs) konsantrasyonu deoxyribonucleotides (dNTPs)1konsantrasyon yüksektir. DNA polimeraz ribonucleotides karşı ayırımcılık ama bu ayrımcılık mükemmel değildir ve sonuç olarak, ribonucleotides deoxyribonucleotides yerine genleri DNA ikileşmesi sırasında dahil. Ribonucleotides en yaygın kanonik olmayan nükleotit genom2' ye dahil olabilir. Bu ribonucleotides çoğunu RNase H2 başlatılan ribonucleotide eksizyon tamir (RER) veya topoizomeraz (başvuru3gözden geçirme) 1 Okazaki parçası olgunlaşma sırasında kaldırılır. Kaldırılamaz ribonucleotides stabil DNA2,4 ' te anonim kalmak ve (gözden geçirilmiş5' te) zararlı ve yararlı şekillerde etkileyebilir. Olumlu sinyaller olarak hareket edebilecek olmanın yanı sıra, örneğin türü çiftleşme Schizosaccharomyces pombe6 ' geçiş ve doğmakta olan DNA dizisi sırasında uyuşmazlığı işaretleme onarım (MMR)7,8, ribonucleotides etkiler ikileştirici stres ve genom istikrarsızlık11' kaynaklanan çevre DNA onların riboz10, 2´-hidroksil grubuna nedeniyle kararlılığını ve yapı9 . Genomik DNA (gDNA) ribonucleotides ve kendi alaka çoğaltma ve tamir mekanizmaları yanı sıra genom istikrar, etkileri bereket onların hassas oluşumu ve frekans bir genom geniş şekilde araştırmak için neden verir.
İnsan mitokondri içinde RNase H2 etkinlik bulunamamıştır ve ribonucleotides bu nedenle değil verimli bir şekilde mitokondrial DNA (mtDNA) kaldırılır. Çeşitli yolları insan mitokondri nükleotit arzında söz konusu ve harita ve quantitate için bir protokol geliştirdiğimiz bozuklukları mitokondrial nükleotit havuzda insan mtDNA ribonucleotides yükseltilmiş bir dizi neden olup olmadığını araştırmak için Bu ribonucleotides insan mtDNA fibroblastlar, HeLa hücreleri ve hasta hücre hatları12izole içinde.
Çoğu vitro yaklaşımlar (gözden geçirilmiş13' te DNA polimerazlar seçicilik rNTPs karşı belirlemek için) tek ribonucleotide ekleme veya astar uzantısı deneyler nerede rakip rNTPs tepki olarak dahil edilen temel alır mix, kimlik veya ribonucleotide şirketleşme göreli Nefelometri kısa DNA şablonlarında izin verme. Kısa dizileri kantitatif yaklaşımlar değil dNTP ve rNTP havuzları hücresel konsantrasyonlarda yansıtmak ve bu nedenle polimeraz seçicilik içgörü ama bütün genleri ile ilgili sınırlı önemi sağlamak. Bu bir plazmid gibi daha uzun bir DNA şablonu çoğaltma sırasında dahil ribonucleotides göreli miktarını radiolabeled dNTPs kullanarak ve bir alkali ortamın14DNA'da hidrolize bir sıralama jel üzerinde görüntülenmeyecektir gösterilmiştir. Ayrıca, gDNA alkalin hidroliz takip, strand özgü sondalama ve mutlak ribonucleotide birleşme vivo içinde15oranda belirlenmesi izin Güney açıkları analiz edilmiştir. Bu yaklaşımlar birleşme sıklığı göreli bir karşılaştırma izin ama konumunu veya anonim ribonucleotides kimliğini yok içgörü sunmak. GDNA in vivo, HydEn Seq katıştırılmış ribonucleotides16, riboz-Seq17, Pu-Seq18ya da19emRiboSeq yararlanmak gibi ribonucleotide içeriğinde analiz etmek için daha yeni yaklaşımlar duyarlılık alkali veya RNase H2 tedavi, sırasıyla ve yeni nesil sıralama ribonucleotides genom çapında tanımlamak için kullanır. Bu yöntemler algılanan ribonucleotides mutlak birleşme sıklığı içgörü sağlamak değil. Adım sıra belirli enzimatik dekolte HydEn seq iletişim kuralına ekleyerek, biz burada uygun tarif yöntemi aynı anda eşleme sağlayan bir sıralama yaklaşımdan elde edilen bilgilerden genişletir ve Nefelometri ile gömülü ribonucleotides12. Bu yöntem son derece sağlam DNA özleri oluşturulabilir ve uygun başvuru genom kullanılabilir hemen her organizma için geçerlidir. Yöntem quantitate ve bir nükleaz tarafından sindirilmiş ve 5´ fosfat veya 5´-OH sonunda bırakır herhangi bir lezyon konumunu belirlemek için adapte olabilir.
Yöntem harita ve ribonucleotides genomik DNA'quantitate için bir dizi belirli endonükleaz tarafından bölünme birleştirir ve alkali hidroliz 5´-fosfat üreten sitelerinde endonükleaz için belirli tanıma sırası yerleştirildiği ve 5´ - biter OH ribonucleotides neredeydin pozisyonlarında sona erer. Bu yana oluşturulan ücretsiz biter daha sonra bağdaştırıcılarla bakmaksızın ve yeni nesil sıralama kullanarak sıralı, son derece sağlam DNA kullanın ve DNA ekstraksiyon ve Kütüphane hazırlık sırasında rasgele parçalanma önlemek için önem taşıyor. Bu okuma endonükleaz bölünme sitelerinde okuma için normalleştirilmiş değerlendirirken bir eşzamanlı Nefelometri ve algılanan ribonucleotides eşleme sağlar. Ücretsiz 5´-biter kontrol nerede DNA alkalin hidroliz KCl ile tedavi ile değiştirilir deneylerde tespit edilir. Alınan veri ribonucleotide konum ve miktar içgörü sağlamak ve analizler ribonucleotide içerik ve birleşme sıklığı ile ilgili sağlar.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x T4 Polynucleotide Kinase Reaction Buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B0201S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x T4 RNA Ligase Reaction Buffer</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B0216L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS</td>
			<td>Medicago</td>
			<td>09-9400-100</td>
			<td>dissolve 1 tablet in H2O to a final volume of 1 L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>33539-1L-GL-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2100 Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2940CA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Centrifuge Tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>525-0610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenosine 5&#39;-Triphosphate (ATP, 10 mM)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>P0756S</td>
			<td>dilute with EB to 2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 1000 Kit</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-1504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA, Molecular Biology Grade (20 mg/mL)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>B9000S</td>
			<td>diltue with nuclease-free H2O to 1 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer EB</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>19086</td>
			<td>referred to as EB</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CleanPCR paramagnetic beads</td>
			<td>CleanNA</td>
			<td>CPCR-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxynucleotide (dNTP) Solution Mix (10 mM each)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0447L</td>
			<td>dilute with EB to 2 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>61965026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynaMag 96 Side</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>12331D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 99.5% analytical grade</td>
			<td>Solveco</td>
			<td>1395</td>
			<td>dilute with milliQ water to 70%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid solution (EDTA, 0.5 M)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>03690-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10500056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES buffer pH 8.0 (1 M) sterile BC</td>
			<td>AppliChem</td>
			<td>A6906,0125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hexammine cobalt(III) chloride (CoCl3(NH3)6)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7891-5G</td>
			<td>dissolve in nuclease-free H2O for 10&#160;M solution, sterile filter. CAUTION: carcinogenic, sensitizing and hazardous to aquatic environment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HincII</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0103S</td>
			<td>supplied with NEBuffer 3.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridiser HB-1D</td>
			<td>Techne</td>
			<td>FHB4DD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X)</td>
			<td>Kapa Biosystems</td>
			<td>KK2602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysis buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>50 mM EDTA, 20 mM HEPES, NaCl 75 mM, Proteinase K (200 &#181;g/mL), 1% SDS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro tube 1.5 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.690.001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge 5424R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5404000014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge MiniStar silverline</td>
			<td>VWR</td>
			<td>521-2844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multiply&#160;&#181;StripPro 0.2 mL tube</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>72.991.992</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-free water</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol &#8211; chloroform &#8211; isoamyl alcohol (25:24:1)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>77617-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>26764.232</td>
			<td>dissolve in nuclease-free H2O for 3&#160;M solution, sterile filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium hydroxide (KOH)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>26668.296</td>
			<td>dissolve in nuclease-free H2O for 3&#160;M solution, sterile filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM2546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit 3.0 Fluorometer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q33216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Assay Tubes</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32856</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA BR Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32850</td>
			<td>CAUTION: Contains flammable and toxic components</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA HS Assay Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>Q32851</td>
			<td>CAUTION: Contains flammable and toxic components</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerated Centrifuge 4K15</td>
			<td>Sigma Laboratory Centrifuges</td>
			<td>No. 10740</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS Solution, 10%</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15553-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium acetate buffer solution, pH 5.2, 3 M (NaAc)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>27810.295</td>
			<td>dissolve in nuclease-free H2O for 5&#160;M solution, sterile filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T100 Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1861096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 Polynucleotide Kinase (3&#39; phosphatase minus)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0236L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0204L</td>
			<td>supplied with PEG 8000 (50%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T7 DNA Polymerase (unmodified)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>M0274S</td>
			<td>supplied with 10x T7 DNA Polymerase Reaction Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TE Buffer</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12090015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer F2.0</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5387000013</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous mapping and quantitation of ribonucleotides in human mitochondrial dna

Ribonucleotides bir genom mevcut sayısını tahmin etmek için kurulan yaklaşımlar kısa sentetik DNA parçalarının veya plazmid şablon olarak kullanarak ve sonra bütün sonuçları extrapolating anonim ribonucleotides Nefelometri ile sınırlıdır genom. Alternatif olarak, ribonucleotides bir genom mevcut sayısı alkalin jelleri veya Güney açıkları kullanarak tahmin. Daha yeni vivo içinde yaklaşımlar pozisyon ve katıştırılmış ribonucleotides kimliğini veren ribonucleotides, genom geniş eşleme sağlayan yeni nesil sıralama istihdam. Ancak, bunlar Nefelometri genom dahil ribonucleotides sayıda izin vermez. Burada aynı anda harita ve hangi insan mitokondriyal DNA ' vivo yeni nesil sıralama tarafından Birleşmiş ribonucleotides sayısı quantitate nasıl açıklar. Biz son derece sağlam DNA kullanın ve bir endonükleaz, daha sonra hidrolize anonim ribonucleotides alkali ile ile sindirerek tarafından sıra belirli Kişilik kırılmalara tanıtmak. Oluşturulan biter bağdaştırıcılarla bakmaksızın ve bu biter bir nesil sıralama makinede sıralanamadı. Ribonucleotides kesin sayısı için sıra belirli endonükleaz tanıma sitesi okuma ortalama sayısı tanıma alanında başı dışında okuma sayısı olarak hesaplanır. Bu iletişim kuralı Ayrıca harita ve ücretsiz nickler DNA'quantitate için kullanılması gereken ve işlenebilir diğer DNA lezyonlar 5´-OH için eşlemek uyum sağlar biter veya 5´-fosfat biter. Ayrıca, verilen bu uygun başvuru genom kullanılabilir herhangi bir organizma için bu yöntem uygulanabilir. Bu iletişim kuralı bu nedenle DNA ikileşmesi, 5´ uç işleme, DNA hasarı ve DNA tamir eğitim için önemli bir araç sağlar.

Yukarıda açıklanan, temsili veri HeLa insan mitokondriyal DNA analiz oluşturulan metodoloji gösteren12hücreleri. Şekil 2B özetlenen okuma hiç HincII siteleri ağır (HS) ve hafif iplikçik (LS) insan mtDNA KCl tedaviden sonra (sol kapı aynası) gösterir. Yaklaşık %70-in tüm algılanan 5´-uçları HincII sindirim yüksek verimliliğini gösteren kesim siteler için yerelleştirilmesine. KOH katıştırılmış ribonucleotides DNA hidrolize kitaplıklarıyla tedavi okuma sayısı yaklaşık % 40'a (şekil 2B, doğru kapı aynası) HincII sitelerdeki azalır. Bu 5´-uçları çok sayıda ribonucleotide birleşme sitelerinde oluşturulan bu yana beklenen ve yeterli bir kütüphane kalite göstergesidir. Sonra KCl tedavi ve okuma oluşturulan şekil 2C Yerelleştirme ve 5´-biter (yeşil) sıklığı HydEn-seq tarafından (macenta) KOH tedaviden sonra Ücretsiz 5´-biter ve ribonucleotides alkali hidroliz tarafından oluşturulan bitiş algılama göstermektedir. Ücretsiz 5´-biter ve insan mtDNA HS için yerelleştirme ribonucleotides sol panelinde gösterilir ve bu LS için yerelleştirme sağdaki bölmede gösterilir. Benzer bir önyargı için gözlenen değil ribonucleotides (2D rakam, üst panel) veya HincII sitelerinde (alt paneli) HS ve LS mtDNA, ham okuma göreli numaralarını, sırasıyla, LS HS, göreli bir 14-fold veya 31-fold daha güçlü kapsama gösterirken nükleer DNA. Bu strand önyargı iki iplikçiklerinin temel kompozisyon farklı farkı tarafından açıklanabilir ve okuma için normalleştirme HincII sitelerdeki önemini göstermektedir.
Okuma normalize HincII verir ribonucleotides mitokondrial genom (şekil 3A) başına sayısı niceliksel ölçüsüdür sayar. Şekil 3B' gösterildiği, KOH tedavi için her ribonucleotide her strand dizi kompozisyon için normalleştirilmiş sonra okuma bir oran 1, ayrı bir ribonucleotide düşündüren okur rasgele bir dağıtım gösteren kullanılandan farklı göstermek desen ve yüksek Kütüphane kalitesi. Bu oran HincII, enzim bölünme özgüllük doğrulama ile önceki sindirim tarafından etkilenmez. Katıştırılmış ribonucleotides bu HincII bölünme sitelerdeki yanı sıra genom nükleotit içerik sitelerinde okuma normalize kaç her ribonucleotide kişi 1000 tamamlayıcı üsleri ( dahil edilmiştir nicel bir ölçü oluşturur Şekil 3 c).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56551/56551fig1.jpg"> 
Şekil 1: DNA işleme ve Kütüphane hazırlık şematik. (1) bütün genomik DNA HincII tarafından ribonucleotides, sonraki Nefelometri normalleştirme için HincII siteleri (siyah ok ucu) künt ucunda üreten i ciddi. (2 DNA 2´, 3´-biter ve 5´-OH ücretsiz biter 3´ döngüsel fosfat (kırmızı pentagon) önde gelen, KOH ribonucleotide siteler, hidrolize ile tedavi edilir. (3) 5´-OH biter T4 polinükleotit kinaz 3´-fosfataz-eksi tarafından fosforile. (4) tüm 5´ uçları bir fosfat grubu taşıyan ARC140 Oligonükleotid T4 RNA ligaz tarafından tane. (5) ikinci strand kullanarak T7 DNA polimeraz ve rasgele N6 dizileri içeren ARC76-77 oligonucleotides sentezlenir. (6) Kütüphane ARC49 ve ARC78 ARC107 dizin astar çoğullama için benzersiz bir barkod içeren için birini kullanarak bir yüksek-sadakat DNA polimeraz tarafından güçlendirilmiş. (7) 5´-uçları eşleştirilmiş uç sıralama tarafından bulunur. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56551/56551fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56551/56551fig2.jpg"> 
Şekil 2: yöntemi doğrulama. (A)temsilcisi electropherograms kalitesini belirlemek için bir otomatik Elektroforez sistemi kullanılarak oluşturulan oluşturulan kitaplıkları KOH veya KCl. (B) Summarized sinyal, HincII sitelerdeki ağır (HS) ve hafif strand (LS) ile tedavi insan mtDNA KCl (sol kapı aynası) veya KOH (doğru panelleri) tedavi sonra. (C) Circos Ücretsiz 5´-biter (yeşil) ve HydEn-Seq (Ücretsiz 5´-biter ve ribonucleotides, kırmızı) HS (sol paneli) ve LS (doğru kapı aynası) insan mtDNA gelen rakam. Tepeler milyon okuma için normalleştirilmiş ve en yüksek tepe HydEn seq kütüphanesinin okuma sayısı üst sınırı için ayarlanır. Ribonucleotides (üst paneli) ve ağır (H) ve (L) ışık strand insan mtDNA (Mito.) veya ters (RV) veya ileri (FW) iplikçik nükleer (Nuc.) HincII siteleri (alt paneli), (D) Summarized ham okur DNA'SI. Rakamlar B, C ve D başvuru12den adapte olmuşlardır. Hata çubukları ortalama standart hatasını temsil eder. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56551/56551fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56551/56551fig3.jpg"> 
Şekil 3: temsilcisi sonuçları. (A) göreli sayısı ribonucleotides HincII sitelerde ağır (H) veya ışık (L) strand üzerinde tedavi KOH kitaplıkları için okuma için normalleştirilmiş. Ribonucleotide kimlik mtDNA genom kompozisyon KOH için (B) oranı (KOH) tedavi ve HincII tedavi KOH ile (HincII + KOH) ağır (H) veya hafif (L) iplikçik mtDNA arşivini i ciddi. (C) Ribonucleotide frekans HincII ve KOH kitaplıkları ağır (H) veya ışık (L) iplikçik mtDNA tedavi için 1.000 tamamlayıcı bazlar için normalleştirilmiş. Rakamlar referans12den adapte olmuşlardır. Hata çubukları ortalama standart hatasını temsil eder. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56551/56551fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adı</td>
			<td colspan="4">Sıra</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC49</td>
			<td colspan="4">AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC76</td>
			<td colspan="4">GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNN * N * N</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC77</td>
			<td colspan="4">AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTC * A * C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC78</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC84</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC85</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC86</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC87</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGA</td></tr></tbody></table>HM PLAKETLİ DELİKLİ
		
		<tr>
			<td>ARC88</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTGGCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC89</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGATCTGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC90</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCAAGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC91</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTGATCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC93</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAGCTAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC94</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTAGCCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC95</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTACAAGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC96</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGTTGACTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC97</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACGGAACTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC98</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCTGACATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC99</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGGGACGGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC100</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTGCGGACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC101</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTTTCACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC102</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAGGCCACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC103</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCCGAAACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC104</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTACGTACGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC105</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATCCACTCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC106</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATATCAGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC107</td>
			<td colspan="4">CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAAGGAATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ARC140</td>
			<td colspan="4">/ 5AmMC6/ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT</td>
		</tr>
	

Tablo 1: Oligonucleotides. HydEn-devamı için kullanılan oligonucleotides vardır Cesur yüzünü dizin oluşturma gösterir. * bir phosphorothioate bağ gösterir. ARC140 C6 bağlayıcı ile birlikte bir 5´-OH grubu yerine bir 5´ amino grubu içerir. Bu değişiklik ARC140 concatemers oluşumu sırasında ligasyonu azaltır.

Watch this Scientific Journal Video about Simultaneous Mapping and Quantitation of Ribonucleotides in Human Mitochondrial DNA at JoVE.com

Simultaneous Mapping and Quantitation of Ribonucleotides in Human Mitochondrial DNA

Eş zamanlı haritalama ve Nefelometri Ribonucleotides insan mitokondriyal DNA'ın

Burada tarif biz aynı anda quantitate için müsait bir yöntem ve genomik DNA'ın enzimatik bölünme onun alkalin hidroliz ve sonraki 5´ uç ile birleştirerek tek nükleotid çözünürlükte son derece sağlam DNA genom geniş harita ribonucleotides sıralama.

Established approaches to estimate the number of ribonucleotides present in a genome are limited to the quantitation of incorporated ribonucleotides using ...

simultaneous-mapping-quantitation-ribonucleotides-human-mitochondrial

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biology

9.4K Görüntüleme.  University of Gothenburg. Burada tarif biz aynı anda quantitate için müsait bir yöntem ve genomik DNA'ın enzimatik bölünme onun alkalin hidroliz ve sonraki 5´ uç ile birleştirerek tek nükleotid çözünürlükte son derece sağlam DNA genom geniş harita ribonucleotides sıralama.

Video: Simultaneous Mapping and Quantitation of Ribonucleotides in Human Mitochondrial DNA

Probing for Mitochondrial Complex Activity in Human Embryonic Stem Cells

Mitochondria are cytoplasmic organelles that have a primary role in cellular metabolism and homeostasis, regulation of the cell signaling network, and programmed cell death. Mitochondria produce ATP, regulate the cytoplasmic redox state and Ca2+ balance, catabolize fatty acids, synthesize heme, nucleotides, steroid hormones, amino acids, and help assemble iron-sulfur clusters in proteins. Mitochondria also have an essential role in heat production. Mutations of the mitochondrial genome cause several types of human disorder. The accumulation of mtDNA mutations correlates with aging and is suspected to have an important role in the development of cancer. Due to their vitally important role in all cell types, the function of mitochondria must also be critical for stem cells. Key advances have been made in our understanding of stem cell viability, proliferation, and differentiation capacity. But the functional activity of stem cells, in particular their energy status, was not yet been studied in detail. Almost nothing is known about the mitochondrial properties of human embryonic stem cells (hESCs) and their differentiated precursor progeny. One way to understand and evaluate the role of mitochondria in hESC function and developmental potential is to directly measure the activity of mitochondrial respiratory complexes. Here, we describe high resolution clear native gel electrophoresis and subsequent in gel activity visualization as a method for analyzing the five respiratory chain complexes of hESCs.

In this video, we will show you how the mitochondrial respiratory chain complexes of human embryonic stem cells can be analyzed using in gel activity assays.

İnsan Embriyonik Kök Hücreleri Mitokondrial Kompleksi Aktivite araştırmayı

Mitochondria are cytoplasmic organelles that have a primary role in cellular metabolism and homeostasis, regulation of the cell signaling network, and ...

Biyoloji

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation 

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three embryonic germ layers (1). Directed differentiation of hESCs into specific cell types has generated much interest in the field of regenerative medicine (e.g., (2-5)), and methods for determining the in vivo fate of selected or manipulated hESCs are essential to this endeavor. We have adapted a highly efficient teratoma formation assay for this purpose. A small number of specifically selected hESCs is mixed with undifferentiated wild type hESCs and Phaseolus vulgaris lectin to form a cell pellet. This is grafted beneath the kidney capsule in an immunodeficient mouse. As few as 2.5 x 105 hESCs are needed to form a 16 cm3 teratoma within 8-12 weeks. The fate of the originally selected hESCs can then be determined by immunohistochemistry. This method provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Directed differentiation of hESCs into specific cells has generated much interest in regenerative medicine. We provide a concise, step-by-step protocol for determining the in vivo fate of selected hESCs that provides a valuable tool for characterizing tissue-specific reagents for cell-based therapy.

Teratom Oluşumu İnsan Embriyonik Kök Hücre Kader Haritalama

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three ...

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) processes or by exogenous factors, particularly ionizing radiation and radiomimetic compounds. Phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX, is an early response to DNA double-strand breaks1. This phosphorylation event is mediated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PI3K) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Overall, DSB induction results in the formation of discrete nuclear &gamma;H2AX foci which can be easily detected and quantitated by immunofluorescence microscopy2. Given the unique specificity and sensitivity of this marker, analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in biomedical research, particularly in radiation biology and nuclear medicine. The quantitation of &gamma;H2AX foci has been most widely investigated in cell culture systems in the context of ionizing radiation-induced DSBs. Apart from cellular radiosensitivity, immunofluorescence based assays have also been used to evaluate the efficacy of radiation-modifying compounds. In addition, &gamma;H2AX has been used as a molecular marker to examine the efficacy of various DSB-inducing compounds and is recently being heralded as important marker of ageing and disease, particularly cancer3. Further, immunofluorescence-based methods have been adapted to suit detection and quantitation of &gamma;H2AX foci ex vivo and in vivo4,5. Here, we demonstrate a typical immunofluorescence method for detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in mouse tissues.

Quantitation of &#947;H2AX Foci in Tissue Samples

Quantitation of DNA double-strand breaks on the basis of &gamma;H2AX foci has become an invaluable tool, particularly in radiation biology, for the evaluation of tissue radiosensitivity and effects of radiation modifying compounds. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantitation of &gamma;H2AX foci in tissue samples.

Doku Örnekleri γH2AX Foci kantitasyonu

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene expression, maintenance of genome integrity, parental imprinting, X-chromosome inactivation, regulation of development, aging, and cancer1. Recently, the presence of an oxidized 5-mC, 5-hydroxymethylcytosine (5-hmC), was discovered in mammalian cells, in particular in embryonic stem (ES) cells and neuronal cells2-4. 5-hmC is generated by oxidation of 5-mC catalyzed by TET family iron (II)/&alpha;-ketoglutarate-dependent dioxygenases2, 3. 5-hmC is proposed to be involved in the maintenance of embryonic stem (mES) cell, normal hematopoiesis and malignancies, and zygote development2, 5-10. To better understand the function of 5-hmC, a reliable and straightforward sequencing system is essential. Traditional bisulfite sequencing cannot distinguish 5-hmC from 5-mC11. To unravel the biology of 5-hmC, we have developed a highly efficient and selective chemical approach to label and capture 5-hmC, taking advantage of a bacteriophage enzyme that adds a glucose moiety to 5-hmC specifically12.
Here we describe a straightforward two-step procedure for selective chemical labeling of 5-hmC. In the first labeling step, 5-hmC in genomic DNA is labeled with a 6-azide-glucose catalyzed by &beta;-GT, a glucosyltransferase from T4 bacteriophage, in a way that transfers the 6-azide-glucose to 5-hmC from the modified cofactor, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). In the second step, biotinylation, a disulfide biotin linker is attached to the azide group by click chemistry. Both steps are highly specific and efficient, leading to complete labeling regardless of the abundance of 5-hmC in genomic regions and giving extremely low background. Following biotinylation of 5-hmC, the 5-hmC-containing DNA fragments are then selectively captured using streptavidin beads in a density-independent manner. The resulting 5-hmC-enriched DNA fragments could be used for downstream analyses, including next-generation sequencing.
Our selective labeling and capture protocol confers high sensitivity, applicable to any source of genomic DNA with variable/diverse 5-hmC abundances. Although the main purpose of this protocol is its downstream application (i.e., next-generation sequencing to map out the 5-hmC distribution in genome), it is compatible with single-molecule, real-time SMRT (DNA) sequencing, which is capable of delivering single-base resolution sequencing of 5-hmC.

Described is a two-step labeling process using &beta;-glucosyltransferase (&beta;-GT) to transfer an azide-glucose to 5-hmC, followed by click chemistry to transfer a biotin linker for easy and density-independent enrichment. This efficient and specific labeling method enables enrichment of 5-hmC with extremely low background and high-throughput epigenomic mapping via next-generation sequencing.

Genomik DNA 5-hydroxymethylcytosine seçici Yakalama

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

The study of electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ handling abnormalities requires isolated cardiomyocytes. In addition, the possibility to investigate myocytes from patients using these techniques is an invaluable requirement to elucidate the molecular basis of cardiac diseases such as atrial fibrillation (AF).1 Here we describe a method for isolation of human atrial myocytes which are suitable for both patch-clamp studies and simultaneous measurements of intracellular Ca2+ concentrations. First, right atrial appendages obtained from patients undergoing open heart surgery are chopped into small tissue chunks ("chunk method") and washed in Ca2+-free solution. Then the tissue chunks are digested in collagenase and protease containing solutions with 20 &mu;M Ca2+. Thereafter, the isolated myocytes are harvested by filtration and centrifugation of the tissue suspension. Finally, the Ca2+ concentration in the cell storage solution is adjusted stepwise to 0.2 mM. We briefly discuss the meaning of Ca2+ and Ca2+ buffering during the isolation process and also provide representative recordings of action potentials and membrane currents, both together with simultaneous Ca2+ transient measurements, performed in these isolated myocytes.

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

We describe the isolation of human atrial myocytes which can be used for intracellular Ca2+ measurements in combination with electrophysiological patch-clamp studies.

Ca aynı anda Ölçümler İnsan Atriyal miyositlerin izolasyonu<sup&gt; 2 +</sup&gt; Geçici ve Membran Akımlar

The study of  electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp  technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the development of diverse techniques to visualize individual RNA transcripts in single living cells. One promising technique that has recently been described utilizes an oligonucleotide-based optical probe, ratiometric bimolecular beacon (RBMB), to detect RNA transcripts that were engineered to contain at least four tandem repeats of the RBMB target sequence in the 3&#8217;-untranslated region. RBMBs are specifically designed to emit a bright fluorescent signal upon hybridization to complementary RNA, but otherwise remain quenched. The use of a synthetic probe in this approach allows photostable, red-shifted, and highly emissive organic dyes to be used for imaging. Binding of multiple RBMBs to the engineered RNA transcripts results in discrete fluorescence spots when viewed under a wide-field fluorescent microscope. Consequently, the movement of individual RNA transcripts can be readily visualized in real-time by taking a time series of fluorescent images. Here we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery into cells by microporation and live-cell imaging of single RNA transcripts.

Ratiometric bimolecular beacons (RBMBs) can be used to image single engineered RNA transcripts in living cells. Here, we describe the preparation and purification of RBMBs, delivery of RBMBs into cells by microporation and fluorescent imaging of single RNA transcripts in real-time.

Oranlı metrik Bimoleküler Fenerleri kullanma Yaşam Hücrelerde Tek Engineered RNA Transkriptlerinin Gerçek zamanlı Görüntüleme

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This occurs when endothelial cells, which line blood vessels, become adhesive to circulating immune cells such as monocytes. In vitro measurement of this adhesiveness has until now been done by quantifying the total number of monocytes that adhere to an endothelial layer either as a direct count or by indirect measurement of the fluorescence of adherent monocytes. While such measurements do indicate the average adhesiveness of the endothelial cell population, they are confounded by a number of factors, such as cell number, and do not reveal the proportion of endothelial cells that are actually adhesive. Here we describe and demonstrate a method which allows the enumeration of adhesive cells within a tested population of endothelial monolayer. Endothelial cells are grown on glass coverslips and following desired treatment are challenged with monocytes (that may be fluorescently labeled). After incubation, a rinsing procedure, involving multiple rounds of immersion and draining, the cells are fixed. Adhesive endothelial cells, which are surrounded by monocytes are readily identified and enumerated, giving an adhesion index that reveals the actual proportion of endothelial cells within the population that are adhesive.

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

We report an in vitro method that allows the quantitation of the actual number of adhesive cells within an endothelial cell monolayer.

Endotel Hücre yapışma miktarının belirlenmesi<em&gt; In Vitro</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to dose-limiting toxicity and many adverse side effects. Targeting the genome with sequence-specific small molecules may enable molecules with increased therapeutic index and fewer off-target effects. N-methylpyrrole/N-methylimidazole polyamides are molecules that can be rationally designed to target specific DNA sequences with exquisite precision. And unlike most natural transcription factors, polyamides can bind to methylated and chromatinized DNA without a loss in affinity. The sequence specificity of polyamides has been extensively studied in vitro with cognate site identification (CSI) and with traditional biochemical and biophysical approaches, but the study of polyamide binding to genomic targets in cells remains elusive. Here we report a method, the crosslinking of small molecules to isolate chromatin (COSMIC), that identifies polyamide binding sites across the genome. COSMIC is similar to chromatin immunoprecipitation (ChIP), but differs in two important ways: (1) a photocrosslinker is employed to enable selective, temporally-controlled capture of polyamide binding events, and (2) the biotin affinity handle is used to purify polyamide&#8211;DNA conjugates under semi-denaturing conditions to decrease DNA that is non-covalently bound. COSMIC is a general strategy that can be used to reveal the genome-wide binding events of polyamides and other genome-targeting chemotherapeutic agents.

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

Identifying the direct targets of genome-targeting molecules remains a major challenge. To understand how DNA-binding molecules engage the genome, we developed a method that relies on crosslinking of small molecules to isolate chromatin (COSMIC).

COSMIC ile Hücrelerde İlaç-DNA Etkileşimlerinin genom Haritalama (Küçük moleküllerinin çapraz bağlanmasını Kromatin yalıtmak için)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...

DamID-seq: Genome-wide Mapping of Protein-DNA Interactions by High Throughput Sequencing of Adenine-methylated DNA Fragments

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is an alternative approach to chromatin immunoprecipitation (ChIP). An expressed fusion protein consisting of the protein of interest and the E. coli DNA adenine methyltransferase can methylate the adenine base in GATC motifs near the sites of protein-DNA interactions. Adenine-methylated DNA fragments can then be specifically amplified and detected. The original DamID assay detects the genomic locations of methylated DNA fragments by hybridization to DNA microarrays, which is limited by the availability of microarrays and the density of predetermined probes. In this paper, we report the detailed protocol of integrating high throughput DNA sequencing into DamID (DamID-seq). The large number of short reads generated from DamID-seq enables detecting and localizing protein-DNA interactions genome-wide with high precision and sensitivity. We have used the DamID-seq assay to study genome-nuclear lamina (NL) interactions in mammalian cells, and have noticed that DamID-seq provides a high resolution and a wide dynamic range in detecting genome-NL interactions. The DamID-seq approach enables probing NL associations within gene structures and allows comparing genome-NL interaction maps with other functional genomic data, such as ChIP-seq and RNA-seq.

We describe herein an assay by coupling DNA adenine methyltransferase identification (DamID) to high throughput sequencing (DamID-seq). This improved method provides a higher resolution and a wider dynamic range, and allows analyzing DamID-seq data in conjunction with other high throughput sequencing data such as ChIP-seq, RNA-seq, etc.

DamID seq: Adenin-metillenmiş DNA Fragments Yüksek Verimli Dizileme tarafından Protein-DNA Etkileşimleri genom Haritalama

The DNA adenine methyltransferase identification (DamID) assay is a powerful method to detect protein-DNA interactions both locally and genome-wide. It is ...

Quantitation of Protein Expression and Co-localization Using Multiplexed Immuno-histochemical Staining and Multispectral Imaging

Immunohistochemistry is a commonly used clinical and research lab detection technique for investigating protein expression and localization within tissues. Many semi-quantitative systems have been developed for scoring expression using immunohistochemistry, but inherent subjectivity limits reproducibility and accuracy of results. Furthermore, the investigation of spatially overlapping biomarkers such as nuclear transcription factors is difficult with current immunohistochemistry techniques. We have developed and optimized a system for simultaneous investigation of multiple proteins using high throughput methods of multiplexed immunohistochemistry and multispectral imaging. Multiplexed immunohistochemistry is performed by sequential application of primary antibodies with secondary antibodies conjugated to horseradish peroxidase or alkaline phosphatase. Different chromogens are used to detect each protein of interest. Stained slides are loaded into an automated slide scanner and a protocol is created for automated image acquisition. A spectral library is created by staining a set of slides with a single chromogen on each. A subset of representative stained images are imported into multispectral imaging software and an algorithm for distinguishing tissue type is created by defining tissue compartments on images. Subcellular compartments are segmented by using hematoxylin counterstain and adjusting the intrinsic algorithm. Thresholding is applied to determine positivity and protein co-localization. The final algorithm is then applied to the entire set of tissues. Resulting data allows the user to evaluate protein expression based on tissue type (ex. epithelia vs. stroma) and subcellular compartment (nucleus vs. cytoplasm vs. plasma membrane). Co-localization analysis allows for investigation of double-positive, double-negative, and single-positive cell types. Combining multispectral imaging with multiplexed immunohistochemistry and automated image acquisition is an objective, high-throughput method for investigation of biomarkers within tissues.

Immunohistochemistry is a powerful lab technique for evaluating protein localization and expression within tissues. Current semi-automated methods for quantitation introduce subjectivity and often create irreproducible results. Herein, we describe methods for multiplexed immunohistochemistry and objective quantitation of protein expression and co-localization using multispectral imaging.