Agradecemos o Dr. Kristen Verhey (Universidade de Michigan, Ann Arbor) e Dr. Gregory Pazour (Universidade de Massachusetts Medical School) para fornecer alguns plasmídeos. O projeto foi apoiado por concessões do National Institutes of Health (NIH GM097037, GM116204 e GM122552 para W.Y.).

1. preparação da pilha NIH-3T3 para microscopia de velocidade do estoque
<ol><li>1,5 semanas antes do experimento, recuperar uma cultura fresca de células NIH-3T3 de um estoque congelado descongelar a 37 ° C e transferindo as células para um balão de cultura de células de2 25 cm com 3 mL de modificado águia de Dulbecco médio (DMEM) suplementado com 110 mg/mL piruvato de sódio, glutamina 2 mM, 10% de soro fetal bovino e 1% penicilina/estreptomicina.</li>
	<li>Incube a 37 ° C numa incubadora 5% CO2 células.</li>
	<li>Dividi células na confluência de 80%, de dois em dois dias, pelo menos três vezes antes do dia experimental para garantir a homogeneidade do ciclo celular. Trypsinize células com tripsina 0,25% por 2 min a 37 ° C, Aspire tripsina e substituí-lo com 2 mL do meio. Pipeta repetidamente a médio e romper a conjuntos de células, remova o número desejado de células e trazer o volume total dos meios de comunicação de volta até 3 mL. Nota: NIH-3T3 foram anteriormente alterado geneticamente para expressar NPHP-4, uma proteína que localiza o TZ26, fundidos no terminal C para mCherry. mCherry é um fluoróforo que pode ser animado com 561 iluminação nm para localizar quantitativamente a barreira de seletividade TZ e orientar os cílios primários.</li>
	<li>Dois dias antes do experimento, placa as células em um fundo de vidro 35mm prato na confluência de 60-70% com 1,5 mL do mesmo meio de como passo 1.1 e retornam as células para a incubadora.</li>
	<li>Um dia antes do experimento, transfect quimicamente as células com o plasmídeo desejado. Misturar 500-1000 ng do plasmídeo desejado (veja a Nota abaixo) na proporção de 1: 2.5 com reagente de transfeccao em 0,25 mL de mídia reduzida soro sem antibióticos durante 30 min. aspirado de mídia de 35 milímetros de vidro prato fundo e substituí-lo com o plasmídeo de 0,25 mL / mistura de reagente de transfeccao mais um extra 1,25 mL de mídia reduzida soro sem antibióticos. Mídia reduzida soro serve ao propósito de facilitar um bem sucedida do transfection, induzindo o crescimento de cílios primário, bem como manter as células viva tempo suficiente para realizar o experimento. Retorno as células para a incubadora para o experimento no dia seguinte. Nota: Ao executar rastreamento único-molécula de IFT20, um plasmídeo que contém que um IFT20 geneticamente modificados fundidas no seu terminal C a GFP é usado25. Ao executar o único-molécula de rastreamento de SSTR3, um plasmídeo que contém um SSTR3 geneticamente modificados fundidas no seu término de N para um domínio de peptídeo (AP) aceitador e C terminal a GFP é usado22. Além de construção de SSTR3, um plasmídeo contendo o ligase biotina BirA deve ser expressa co e os meios de comunicação de transfeccao devem ser suplementados com 10 biotina µM. BirA, em seguida, anexa biotina ao domínio AP de moléculas de AP-SSTR3-GFP recém sintetizados ao nível do PS. Alexa647 conjugada com três dos quatro sites de ligação de biotina na estreptavidina, em média, então podem ser completadas para a mídia antes da imagem latente para etiqueta fluorescente as moléculas de AP-SSTR3-GFP na superfície exterior do celular22,27 . GFP e AlexaFluor647 são utilizados neste método; no entanto, outras sondas fluorescentes podem ser usadas se eles têm da mesma forma, foto-estabilidade elevada e quântica rendimento.</li>
	<li>Se usando a construção de SSTR3 marcado externamente, remover a mídia da parte inferior de vidro prato 1 h antes do experimento, lave a célula 5 vezes com 1 mL de tampão fosfato salino (PBS) e adiciona 1 mL de mídia reduzida soro suplementado com 1 µM Alexa647 conjugados streptavidin.</li>
	<li>Não mais que 15 min antes do experimento, remova a mídia do prato fundo vidro e lavar as células transfectadas e etiquetadas 5 vezes com 1 mL de PBS.</li>
	<li>Coloque 1 mL de tampão de imagem (20 mM HEPES, 110mm KOAc, 5mm NaOAc, 2mm MgOAc, 1mm EGTA, pH 7,3) no prato fundo vidro. Nota: No buffer de imagem, as células são viáveis para não mais do que 3 h. Portanto, apenas a 2 h de experimentos são executadas em cada prato.</li>
</ol>2. microscopia de velocidade
Nota: A configuração de microscopia de velocidade inclui um microscópio de fluorescência invertido equipado com um objectivo apocromático de 1,4-at 100 × óleo-imersão, 35 mW 633 nm He-Ne laser, 50 mW estado sólido 488 nm e 561-nm lasers, um ganho de multiplicação em-microplaqueta câmera acoplado-dispositivo de carga e um pacote de software do microscópio para aquisição de dados e processamento (Figura 1). Para a imagem latente de canal individual, GFP, mCherry e Alexa647 estão animado por 488 nm, 561 nm ou lasers de 633 nm, respectivamente. Para rastreamento de molécula, único ponto de iluminação é usada para controlar as moléculas individuais fluorescente-etiquetadas. Para a imagem latente de epifluorescência, uma lente côncava é colocado no caminho da iluminação de laser para expandir o feixe em um campo uniforme da iluminação. A emissão de fluorescência é coletado pelo mesmo objectivo, filtrado por um filtro dicroico (405/488/561/635) e um filtro de emissão (405/488/561/635) e fotografado com a câmera do CCD acima operando a 500 Hz para rastreamento de molécula ou 2 Hz para imagem de epifluorescência.
<ol><li>Fixe a placa de fundo de vidro para o palco do microscópio e localize uma célula que corretamente expressa as construções desejadas. Uma vez que foi encontrado um celular adequada, alinhe o ponto de NPHP4-mCherry na base dos cílios primários com a localização no plano de imagem que corresponde à iluminação de único ponto do laser.</li>
	<li>Capturar uma imagem de epifluorescência de NPHP4-mCherry e IFT20-GFP ou AP-SSTR3-GFP usando a função de "Snap" na aba "Câmera" da janela "Controles de foco", se usando o pacote de software de microscopia digital (ver Tabela de materiais). Nota: Estas imagens atuará como uma referência para os locais da molécula subsequentes.</li>
	<li>Uma vez que as imagens de referência são obtidas, localmente reduza a concentração de moléculas simples rotuladas. Foto-descora o TZ com 1 iluminação de laser mW por 20 s ou até que a intensidade da fluorescência é próximo de fluorescência de fundo. Nota: Quando a concentração exacta pode ser controlada, 0,1-1 nM rotulado moléculas simples são usados.</li>
	<li>Para preparar para rastreamento de molécula, reduza a potência de iluminação do laser de ~0.15 mW para moléculas simples rotulado com GFP ou ~0.5 mW para moléculas rotulado com Alexa647.</li>
	<li>Assim que a potência do laser e parâmetros de imagem são conjunto, ganho máximo e intensificação e taxa de quadros de 2 ms, para a imagem latente de molécula, envolver-se o laser de iluminação adequada e registrar não-foto, rotulado de moléculas simples como eles são transportados através da região de foto do TZ clicando no botão de "Stream" na aba "Câmera" da janela "Controles de foco". Nota: Não mais de 2 min de vídeo deve ser capturada para minimizar os efeitos da deriva ciliar para um nível insignificante.</li>
	<li>Depois de capturar o vídeo única molécula, processe os vídeos usando um algoritmo de ajuste Gaussian 2D, tais como vislumbre pelo laboratório Gelles, que localiza precisamente do centroide de excitação do cada molécula PSF em uma abrangente área de interesse (AOI).</li>
	<li>Selecione todos os locais da molécula com precisão < 10 nm e corrigir o centro de cílios com base na distribuição da molécula locais equipados com uma função gaussiana 2D. Nota: Usando 2D para o algoritmo de transformação 3D, as rotas de transporte 3D de rotas IFT20-GFP e AP-SSTR3 são claramente mostradas na membrana ciliar ou axonemal ciliar, respectivamente.</li>
</ol>3. 2D para 3D transformação
<ol><li>Uma vez que várias mil localizações para o trânsito de moléculas (sinal-ruído ratio > 11) no cílio são coletadas, selecione eixo longo do cílio como a X-dimensão. Faça um histograma de dimensão Y dos locais e obter as somas bin em incrementos de 10 nm. Nota: A 2D para 3D transformação pode ser avaliada pela mão ou qualquer software ou linguagem de programação. Os autores têm implementado com sucesso a transformação em Matlab e Python 2.7.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Huang, B., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+fluorescence+microscopy.">Super-resolution fluorescence microscopy.</a> Annu Rev Biochem. 78, 993-1016 (2009).</li><li>Leung, B. O., Chou, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+super-resolution+fluorescence+microscopy+for+biology.">Review of super-resolution fluorescence microscopy for biology.</a> Appl Spectrosc. 65, 967-980 (2011).</li><li>Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. 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J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat Meth. 3, 793-796 (2006).</li><li>Ma, J., Yang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+distribution+of+transient+interactions+in+the+nuclear+pore+complex+obtained+from+single-molecule+snapshots.">Three-dimensional distribution of transient interactions in the nuclear pore complex obtained from single-molecule snapshots.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 107, 7305-7310 (2010).</li><li>Ma, J., Goryaynov, A., Sarma, A., Yang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-regulated+viscous+channel+in+the+nuclear+pore+complex.">Self-regulated viscous channel in the nuclear pore complex.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109, 7326-7331 (2012).</li><li>Ma, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+three-dimensional+mapping+of+mRNA+export+through+the+nuclear+pore.">High-resolution three-dimensional mapping of mRNA export through the nuclear pore.</a> Nat Comm. 4, (2013).</li><li>Akey, C. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+Bardet-Biedl+syndrome+ciliary+proteins+perturbs+planar+cell+polarity+in+vertebrates.">Disruption of Bardet-Biedl syndrome ciliary proteins perturbs planar cell polarity in vertebrates.</a> Nat Genetics. 37, 1135-1140 (2005).</li><li>Handel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+targeting+of+somatostatin+receptor+3+to+neuronal+cilia.">Selective targeting of somatostatin receptor 3 to neuronal cilia.</a> Neuroscience. 89, 909-926 (1999).</li><li>Follit, J. A., Tuft, R. A., Fogarty, K. E., Pazour, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+intraflagellar+transport+protein+IFT20+is+associated+with+the+Golgi+complex+and+is+required+for+cilia+assembly.">The intraflagellar transport protein IFT20 is associated with the Golgi complex and is required for cilia assembly.</a> Mol Biol Cell. 17, 3781-3792 (2006).</li><li>Awata, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NPHP4+controls+ciliary+trafficking+of+membrane+proteins+and+large+soluble+proteins+at+the+transition+zone.">NPHP4 controls ciliary trafficking of membrane proteins and large soluble proteins at the transition zone.</a> J Cell Sci. 127, 4714-4727 (2014).</li><li>Howarth, M., Ting, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+proteins+in+live+mammalian+cells+with+biotin+ligase+and+monovalent+streptavidin.">Imaging proteins in live mammalian cells with biotin ligase and monovalent streptavidin.</a> Nat Protoc. 3, 534-545 (2008).</li><li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+super-resolution+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy.">Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy.</a> Science. 319, 810-813 (2008).</li></ol>

Os autores declaram não há conflitos de interesse.

Este protocolo descreve a aplicação da microscopia de velocidade para o cílio primário, uma organela celular de sinalização que é altamente dependente do transporte eficiente de proteínas. Microscopia de velocidade pode fornecer alta resolução locais (< 10 nm) para moléculas fluorescente-etiquetadas como passam através da iluminação de ponto único centralizada sobre o TZ. Anteriormente tiver sido aplicado para estudar a proteína tráfico através do NPC6,<sup class="xref...

Como afirmado por Ernst Abbe em 1873, a resolução da microscopia de luz convencional foi crida para ser limitada a aproximadamente 200 nm devido à difração de luz do objectivo1,2. Atualmente, as técnicas de microscopia de luz de super-resolução quebrar essa limitação e permitam a captura de imagens dinâmicas, com resolução de difração sub (< 200 nm). As técnicas geralmente caem em duas categorias amplas: estimulada abordagens de microscopia com base de depleção (STED) emissão, que geram o volume de iluminação sub difração devido à resposta óptica não-linear de fluorophores em amostras3; e (palma), microscopia de luz fotoativo e microscopia de reconstrução óptica estocástico (Tempestade)-com base em técnicas de super-resolução, que utilizam funções matemáticas para localizar os centroides de fluorophores e então reconstituir essas centroides para formar imagens de super-resolução4,5. Atualmente, devido a configuração óptica relativamente uncomplicated, PALM e tempestade são extensivamente empregados ativando apenas um pequeno subconjunto de fluorophores em cada quadro de um vídeo longo de uma preparação biológica. Isto permite a localização mais exata por 2D montagem Gaussian da mancha fluorescente, denominado a função de ponto de espalhar (PSF), das proteínas fluorescente-etiquetadas em cada quadro do vídeo. A localização 2D de cada molécula fluorescente-etiquetadas então pode ser sobreposta a um único avião de imagens para produzir uma imagem de super-resolução da preparação biológica1,2. Enquanto estes localização único-molécula, abordagens de super-resolução para microscopia certamente revolucionaram como imagem latente de amostras biológicas foi executada, ainda existem desafios a serem vencidos. Por exemplo, tempestade e PALM podem alcançar seus melhores resoluções espaciais após a fixação de amostras biológicas e, portanto, apresentar uma representação estática das proteínas fluorescente-etiquetadas, que é uma limitação similar de microscopia eletrônica. Além disso, para atingir a alta resolução espacial para cada proteína fluorescente-etiquetadas em células vivas, amostras devem ser fotografadas no framerates há muito tempo que são incapazes de capturar a dinâmica da proteína. Portanto, é necessário superar estes obstáculos técnicos principais.
Para obter uma alta resolução spatiotemporal que é adequada para a detecção de proteínas ou RNAs de movimento rápido em células vivas, nós desenvolvemos microscopia de super-resolução velocidade em nosso laboratório (Figura 1)6,7, 8. vários grandes avanços técnicos na microscopia de velocidade anteriormente permitiram-nos controlar com sucesso nucleocytoplasmic transporte de pequenas moléculas, proteínas, mRNA e vírus através de nativo nuclear pore complexos (NPCs)6, 7 , 8. resumidamente, os seguintes recursos da microscopia de velocidade serão usados para rastrear velozes macromoléculas através das estruturas simétrica e rotacionalmente sub-micrônicas em células vivas, tais como NPCs e cílios primários: (1) um inclinado ou uma iluminação vertical PSF permite a excitação de moléculas simples dentro de um volume pequeno de difração-limite no plano focal (Figura 1); (2), o PSF inclinado pode evitar muito fora de foco da fluorescência e, assim, melhorar a relação sinal-ruído. (3), a densidade óptica de 100-500 kW / cm2 no PSF iluminação permite que milhares de fótons para ser coletado de único fluorophores com velocidades de deteção rápida (> 500 Hz). Velocidade de deteção (4), o jejum também reduz o erro de localização espacial único-molécula (< 10 nm) ao determinar as trajetórias espaciais de mover moléculas fluorescentes em células vivas, porque a difusão molecular é um dos principais fatores fazendo com que as imperfeições da único-molécula de localização para a movimentação de moléculas. Algoritmos de transformação (5) bem estabelecidas 2D para 3D permitem-nos fornecer a densidade de probabilidade espacial 3D mapas de rotas de transporte para moléculas no NPC ou o cílio primário. Vale ressaltar que nosso processo de conversão entre o cartesiano e o sistema de coordenação cilíndrico é usado para gerar uma densidade de probabilidade espacial 3D mapa ao invés de 3D único-molécula rastreamento (Figura 2). Anteriormente, os dados de microscopia eletrônica revelaram que o NPC9,10 e o cílio primário11 ambos têm uma estrutura simétrica e rotacionalmente. Em princípio, aleatoriamente, difundir moléculas movendo-se através do NPC ou cílio primário também deve ter distribuições simétricas e rotacionalmente. Como mostrado na Figura 2, um número elevado de difusão aleatoriamente as moléculas no interior do cilindro geraria distribuições simétricas e rotacionalmente com a vista de seção transversal como que em NPC, ainda mais, resultando em um aproximadamente uniforme espacial distribuição dentro de cada sub-região muito pequena entre dois anéis vizinhos(Figura 2). Esta distribuição uniforme leva a que a distribuição espacial ao longo da dimensão θ no sistema cilíndrico é constante. Então as coordenadas 3D (X, R, θ) podem ser simplificadas para ser as coordenadas 2D (R, X, constante). Na verdade, nosso processo de conversão entre os cartesianos e os sistemas cilíndricos é de 2D (X, Y) a 2D (R, X, constante). A constante θ, refere-se a densidade espacial p na Figura 2,E, é calculada utilizando a equação A<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56475/56475eq1.jpg">.
Em última análise, rastreamento único-molécula tem ampla aplicação em pesquisa biológica, portanto, é natural que uma infinidade de técnicas será desenvolvida para preencher nichos biológicos específicos12,13,14. Tal é o caso com microscopia de velocidade. Anteriormente, quando combinada com um algoritmo de transformação 3D, esta técnica foi desenvolvida para resolver as rotas de transporte 3D de trânsito moléculas através os NPCs, uma estrutura biológica rotacionalmente simétrica e diffraction subtamanho6. Neste trabalho, cílios primários são mostrados para ser organelas excelente modelo também. Cílios primários são organelas cilíndricas, como antena (raio de ~ 125 nm) que o projeto da superfície dos mamíferos mais células15,16,17. Eles são responsáveis por receber os sinais externos e transmitir uma resposta intracelular, geralmente associada com crescimento e metabolismo de15,16. Portanto, fluxo de proteínas estruturais, reciclagem de receptores transmembranares e transmissão dos mensageiros intracelulares são responsabilidades vitais dos cílios primários. Na junção entre os cílios primários e o corpo da célula é uma barreira de seletividade crítica, chamada de zona de transição ou TZ, através do qual todo o transporte desta proteína deve ocorrer11,18,19, 20. Além da função associada do TZ, pelo menos, dois processos de transporte, do transporte e difusão passiva, são pensados para ser responsável pelo movimento da proteína através desta região16,21, 22. do ponto de vista da saúde humana, a perda de cílios primários e desregulamentação subsequente de sinalização a jusante são característica de muitos cancros. Além disso, muitas doenças genéticas, como síndrome de Bardet-Biedl e doença renal policística, estão associadas a proteína defeituosa transporte23. Tanto o tamanho do limite de difração sub e o complexo processo de transporte seletivo de proteína através do TZ fazem os cílios primários um alvo principal para esta técnica. Neste trabalho de métodos, demonstraremos o rastreamento de uma proteína transmembrana ciliar, receptor de somatostatina 3 (SSTR3)24, rotulado externamente com Alexa Fluor 647 e um componente do IFT, IFT2025, rotulado com uma molécula GFP fundida.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:619px;" width="618">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:47px;width:123px;">25 cm2 tissue culture dish</td>
			<td style="width:204px;">Corning</td>
			<td style="width:101px;">VV-01936-00</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:123px;">Penicillin/streptomycin</td>
			<td style="width:204px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:101px;">15140122</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:123px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:204px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:101px;">10438018</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:123px;">DMEM</td>
			<td style="width:204px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:101px;">10566-016</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:123px;">OPTIMEM</td>
			<td style="width:204px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:101px;">31985062</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:123px;">Trypsin</td>
			<td style="width:204px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:101px;">25300054</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:123px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:204px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">P3813-1PAK</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:123px;">Transit LT1</td>
			<td style="width:204px;">Mirus</td>
			<td style="width:101px;">MIR 2300</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:123px;">35 mm glass bottom dish</td>
			<td style="width:204px;">MatTek</td>
			<td style="width:101px;">P35GCOL-0-14-C</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:123px;">AlexaFluor 647-conjugated streptavidin</td>
			<td style="width:204px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:101px;">S21374</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:123px;">Biotin</td>
			<td style="width:204px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">B4501-100MG</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:123px;">633 nm He-Ne laser</td>
			<td style="width:204px;">Melles Griot</td>
			<td style="width:101px;">25-LHP-928-249</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:123px;">561 nm solid state laser</td>
			<td style="width:204px;">Coherent</td>
			<td style="width:101px;">OBIS 561-50 LS</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:123px;">488 nm solid state laser</td>
			<td style="width:204px;">Coherent</td>
			<td style="width:101px;">1185053</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:123px;">Inverted fluorescence microscope</td>
			<td style="width:204px;">Olympus</td>
			<td style="width:101px;">IX81</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:123px;">1.4-NA 100&#215; oil-immersion apochromatic objective</td>
			<td style="width:204px;">Olympus</td>
			<td style="width:101px;">UPLSAPO 100&#215;</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:123px;">On-chip multiplication gain charge-coupled-device camera</td>
			<td style="width:204px;">Roper Scientific</td>
			<td style="width:101px;">Cascade 128+</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:123px;">Dichroic filter</td>
			<td style="width:204px;">Semrock</td>
			<td style="width:101px;">Di01- R405/488/561/635-25x36</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:123px;">Emission filter</td>
			<td style="width:204px;">Semrock</td>
			<td style="width:101px;">NF01-405/488/561/635-25X5.0</td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:123px;">Slidebook 6.0</td>
			<td>Intelligent Imaging Innovations</td>
			<td></td>
			<td style="width:191px;">digital microscopy software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

application of high-speed super-resolution speed microscopy in live primary cilium

O cílio primário é uma protrusão do microtubule-baseado na superfície de muitas células eucarióticas e contém um único complemento de proteínas que funcionam criticamente em motilidade celular e sinalização. Desde que cílios são incapazes de sintetizar suas próprias proteínas, cerca de 200 proteínas ciliares originais precisam ser traficadas entre o citosol e cílios primários. No entanto, ainda é um desafio técnico para mapear tridimensional (3D) locais, das vias de transporte para estas proteínas em cílios primários ao vivo devido às limitações do atualmente existente técnicas. Para conquistar o desafio, recentemente desenvolvemos e empregou uma microscopia 3D de alta velocidade virtual Super-resolução, denominada microscopia difração sub (velocidade) de single-point da borda-excitação, para determinar a localização espacial 3D das vias de transporte para ambos citosólico e proteínas de membrana em cílios primários de células vivas. Neste artigo, vamos demonstrar a configuração detalhada da microscopia de velocidade, a preparação de celulas que expressam proteínas ciliares fluorescência-proteína-labeled, o acompanhamento em tempo real do único-molécula de proteínas individuais no cílio ao vivo e a realização de densidade de probabilidade espacial 3D mapas de rotas de transporte para proteínas ciliares.

Esta seção demonstra os dados obtidos da realização de microscopia de velocidade para o TZ de cílios primários para estudar a rota de transporte de SSTR3 ligado por um vinculador externo de nm ~ 15 de Alexa647(Figura 3). Serve o duplo objectivo de verificar o algoritmo de transformação 3D. Alexa647 deve apenas rótulo a superfície externa do cílio primário e, portanto, a rota de transporte 3D deve revelar uma rota de transporte de ...

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Application of High-speed Super-resolution SPEED Microscopy in Live Primary Cilium

Recentemente nós mapeamos locais espaciais tridimensionais (3D) de rotas de transporte para várias proteínas se dentro cílios primários em células vivas. Aqui este detalhes de papel a instalação experimental, o processo de amostras biológicas e as análises de dados para a fluorescência de super-resolução 3D imagem abordagem recém aplicadas em viver cílios primários.

Aplicação da microscopia de velocidade de alta velocidade super-resolução no cílio primário ao vivo

The primary cilium is a microtubule-based protrusion on the surface of many eukaryotic cells and contains a unique complement of proteins that function ...

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8.2K visualizações.  Temple University. Recentemente nós mapeamos locais espaciais tridimensionais (3D) de rotas de transporte para várias proteínas se dentro cílios primários em células vivas. Aqui este detalhes de papel a instalação experimental, o processo de amostras biológicas e as análises de dados para a fluorescência de super-resolução 3D imagem abordagem recém aplicadas em viver cílios primários.

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High Speed Droplet-based Delivery System for Passive Pumping in Microfluidic Devices

A novel microfluidic system has been developed that uses the phenomenon of passive pumping along with a user controlled droplet based fluid delivery system. Passive pumping is the phenomenon by which surface tension induced pressure differences drive fluid movement in closed channels. The automated fluid delivery system consists of a set of voltage controlled valves with micro-nozzles connected to a fluid reservoir and a control system. These voltage controlled valves offer a volumetrically precise way to deliver fluid droplets to the inlet of a microfluidic device in a high frequency manner. Based on the  dimensions demonstrated in the current study example, the system is capable of flowing 4 milliliters per minute (through a 2.2mm by 260um cross-sectional channel). Based on these same channel dimensions, fluid exchange of a point inside the channel can be achieved in as little as eight milliseconds. It is observed that there is interplay between momentum of the system (imparted by a combination of the droplets created by the valves and the fluid velocity in the channel), and the surface tension of the liquid. Where momentum provides velocity to the fluid flow (or vice-versa), equilibration of surface tension at the inlet provides a sudden stop to any flow. This sudden stop allows the user to control the flow characteristics of the channel and opens the door for a variety of biological applications, ranging anywhere from reagent delivery to drug-cell studies. It is also observed that when nozzles are aimed at the inlet at shallow angles, the droplet momentum can cause additional interesting fluid phenomena, such as mixing of multiple droplets in the inlet.

A novel microfluidic system has been developed using the phenomenon of passive pumping and a user controlled fluid delivery system. This microfluidic system has the potential to be used in a wide variety of biological applications given its low cost, ease of use, volumetric precision, high speed, repeatability and automation.

High Speed ​​Delivery System Droplet-based para Passive Bombeamento em dispositivos microfluídicos

A novel microfluidic system has been developed that uses the phenomenon of passive pumping along with a user controlled droplet based fluid delivery ...

Biologia

Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

Bacterial cell division requires the coordinated assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central to this process is the formation of a ring-like suprastructure (Z-ring) by the FtsZ protein at the division plan3,4. The Z-ring consists of multiple single-stranded FtsZ protofilaments, and understanding the arrangement of the protofilaments inside the Z-ring will provide insight into the mechanism of Z-ring assembly and its function as a force generator5,6. This information has remained elusive due to current limitations in conventional fluorescence microscopy and electron microscopy. Conventional fluorescence microscopy is unable to provide a high-resolution image of the Z-ring due to the diffraction limit of light (~200 nm). Electron cryotomographic imaging has detected scattered FtsZ protofilaments in small C. crescentus cells7, but is difficult to apply to larger cells such as E. coli or B. subtilis. Here we describe the application of a super-resolution fluorescence microscopy method, Photoactivated Localization Microscopy (PALM), to quantitatively characterize the structural organization of the E. coli Z-ring8.
	PALM imaging offers both high spatial resolution (~35 nm) and specific labeling to enable unambiguous identification of target proteins. We labeled FtsZ with the photoactivatable fluorescent protein mEos2, which switches from green fluorescence (excitation = 488 nm) to red fluorescence (excitation = 561 nm) upon activation at 405 nm9. During a PALM experiment, single FtsZ-mEos2 molecules are stochastically activated and the corresponding centroid positions of the single molecules are determined with &lt;20 nm precision. A super-resolution image of the Z-ring is then reconstructed by superimposing the centroid positions of all detected FtsZ-mEos2 molecules.
	Using this method, we found that the Z-ring has a fixed width of ~100 nm and is composed of a loose bundle of FtsZ protofilaments that overlap with each other in three dimensions. These data provide a springboard for further investigations of the cell cycle dependent changes of the Z-ring10 and can be applied to other proteins of interest.

We describe a super-resolution imaging method to probe the structural organization of the bacterial FtsZ-ring, an essential apparatus for cell division. This method is based on quantitative analyses of photoactivated localization microscopy (PALM) images and can be applied to other bacterial cytoskeletal proteins.

Super-Resolution Imaging da Divisão de Máquinas bacteriana

Bacterial cell division requires the coordinated  assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central  to this process is the formation of ...

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy techniques. However, as the image is acquired in a very different way than normal, by building up an image molecule-by-molecule, there are some significant challenges for users in trying to optimize their image acquisition. In order to aid this process and gain more insight into how STORM works we present the preparation of 3 test samples and the methodology of acquiring and processing STORM super-resolution images with typical resolutions of between 30-50 nm. By combining the test samples with the use of the freely available rainSTORM processing software it is possible to obtain a great deal of information about image quality and resolution. Using these metrics it is then possible to optimize the imaging procedure from the optics, to sample preparation, dye choice, buffer conditions, and image acquisition settings. We also show examples of some common problems that result in poor image quality, such as lateral drift, where the sample moves during image acquisition and density related problems resulting in the 'mislocalization' phenomenon.

We describe the preparation of three test samples and how they can be used to optimize and assess the performance of STORM microscopes. Using these examples we show how to acquire raw data and then process it to acquire super-resolution images in cells of approximately 30-50 nm resolution.

As amostras de teste para otimizar STORM Super-Resolution Microscopy

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

Visualization of G3BP Stress Granules Dynamics in Live Primary Cells

SGs can be visualized in cells by immunostaining of specific protein components or polyA+ mRNAs. SGs are highly dynamic and the study of their assembly and fate is important to understand the cellular response to stress. The deficiency in key factors of SGs like G3BP (RasGAP SH3 domain Binding Protein) leads to developmental defects in mice&#160;and alterations of the Central Nervous System. To study the dynamics of SGs in cells from an organism, one can culture primary cells and follow the localization of a transfected tagged component of SGs. We describe time-lapse experiment to observe G3BP1-containing SGs in Mouse Embryonic Fibroblasts (MEFs). This technique can also be used to study G3BP-containing SGs in live neurons, which is crucial as it was recently shown that these SGs are formed at the onset of neurodegenerative diseases like Alzheimer&#39;s disease. This approach can be adapted to any other cellular body and granule protein component, and performed with transgenic animals, allowing the live study of granules dynamics for example in the absence of a specific factor of these granules.

Stress granules (SGs) are cytoplasmic RNA granules containing stalled ribonucleoprotein particles (RNPs), and important in cellular response to various stresses. Dynamics of SGs can be followed in live cells by visualizing the localization of a tagged component of SGs in transfected primary cells after stress.

Visualização de G3BP Estresse grânulos Dynamics em pilhas ao vivo

SGs can be visualized in cells by immunostaining of specific protein components or polyA+ mRNAs. SGs are highly dynamic and the study of their assembly ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule imaging assays which allows adhesion of single virions to glass surfaces with specificity. This preparation is based on grafting the surface of the glass with a mixture of PLL-g-PEG and PLL-g-PEG-Biotin, adding a layer of avidin, and finally creating virion anchors through attachment of biotinylated virus specific antibodies. We have applied this technique across a range of experiments including atomic force microscopy (AFM) and super-resolution fluorescence imaging. This sample preparation method results in a control adhesion of the virions to the surface.

The attachment of virions to a surface is a requirement for single virion imaging by Super-resolution fluorescence imaging or atomic force microscopy (AFM). Here we demonstrate a sample preparation method for controlled adhesion of virions to glass surfaces suitable for use in AFM and super-resolution fluorescence imaging.

Preparação da amostra para microscopia da força atômica de virion único e imagem de fluorescência de super-resolução

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy (f3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the diffraction of light allowing super-resolution of live samples. There are currently three main types of super-resolution techniques &#8211; stimulated emission depletion (STED), single-molecule localization microscopy (including techniques such as PALM, STORM, and GDSIM), and structured illumination microscopy (SIM). While STED and single-molecule localization techniques show the largest increases in resolution, they have been slower to offer increased speeds of image acquisition. Three-dimensional SIM (3D-SIM) is a wide-field fluorescence microscopy technique that offers a number of advantages over both single-molecule localization and STED. Resolution is improved, with typical lateral and axial resolutions of 110 and 280 nm, respectively and depth of sampling of up to 30 &#181;m from the coverslip, allowing for imaging of whole cells. Recent advancements (fast 3D-SIM) in the technology increasing the capture rate of raw images allows for fast capture of biological processes occurring in seconds, while significantly reducing photo-toxicity and photobleaching. Here we describe the use of one such method to image bacterial cells harboring the fluorescently-labelled cytokinetic FtsZ protein to show how cells are analyzed and the type of unique information that this technique can provide.

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy f3D-SIM

Spatiotemporal information about dynamic proteins inside live cells is crucial for understanding biology. A type of super-resolution microscopy called fast 3D-structured illumination microscopy (f3D-SIM) reveals unique information about the cytokinetic Z ring in bacteria: both its bead-like appearance and the rapid dynamics of FtsZ within the ring.

Super-resolution Imaging do Z Anel Cytokinetic em bactérias vivas Usando o Fast-estruturados 3D Iluminação Microscopy (F3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the ...

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial resolution is restricted by diffraction to ~ 200 nm within the image plane and &#62; 500 nm along the optical axis. As a result, fluorescence microscopy has long been severely limited in the observation of ultrastructural features within cells. The recent development of super resolution microscopy methods has overcome this limitation. In particular, the advent of photoswitchable fluorophores enables localization-based super resolution microscopy, which provides resolving power approaching the molecular-length scale. Here, we describe the application of a three-dimensional super resolution microscopy method based on single-molecule localization microscopy and multiphase interferometry, called interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM). This method provides nearly isotropic resolution on the order of 20 nm in all three dimensions. Protocols for visualizing the filamentous actin cytoskeleton, including specimen preparation and operation of the iPALM instrument, are described here. These protocols are also readily adaptable and instructive for the study of other ultrastructural features in cells.

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy iPALM

We present a protocol for the application of interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM), a 3-dimensional single-molecule localization super resolution microscopy method, to the imaging of the actin cytoskeleton in adherent mammalian cells. This approach allows light-based visualization of nanoscale structural features that would otherwise remain unresolved by conventional diffraction-limited optical microscopy.

Tridimensional Super Resolution Microscopia de filamentos de actina F por Interferometric fotoativado Localization Microscopy (iPALM)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm allows for the routine imaging of nanoscale biological complexes and processes. This increase in resolution also means that methods popular in electron microscopy, such as single-particle analysis, can readily be applied to super-resolution fluorescence microscopy. By combining this analytical approach with super-resolution optical imaging, it becomes possible to take advantage of the molecule-specific labeling capacity of fluorescence microscopy to generate structural maps of molecular elements within a metastable structure. To this end, we have developed a novel algorithm &#8212; VirusMapper &#8212; packaged as an easy-to-use, high-performance, and high-throughput ImageJ plugin. This article presents an in-depth guide to this software, showcasing its ability to uncover novel structural features in biological molecular complexes. Here, we present how to assemble compatible data and provide a step-by-step protocol on how to use this algorithm to apply single-particle analysis to super-resolution images.

This manuscript uses the Fiji-based open-source software package VirusMapper to apply single-particle analysis to super-resolution microscopy images in order to generate precise models of nanoscale structure.

Análise de partícula única open-source para Microscopia Super-resolução com VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to dramatic leaps in our understanding of how cells function. The development and availability of super-resolution microscopy has considerably extended the limits of optical resolution from ~250-20 nm. Biologists are no longer limited to describing molecular interactions in terms of colocalization within a diffraction limited area, rather it is now possible to visualize the dynamic interactions of individual molecules. Here, we outline a protocol for the visualization and quantification of cellular proteins by ground-state depletion microscopy&#160;for fixed cell imaging. We provide examples from two different membrane proteins, an element of the endoplasmic reticulum translocon, sec61&#946;, and a plasma membrane-localized voltage-gated L-type Ca2+ channel (CaV1.2). Discussed are the specific microscope parameters, fixation methods, photo-switching buffer formulation, and pitfalls and challenges of image processing.

This article outlines a protocol for the detection of one or more plasma and/or intracellular membrane proteins using Ground State Depletion (GSD) super-resolution microscopy in mammalian cells. Here, we discuss the benefits and considerations of using such approaches for the visualization and quantification of cellular proteins.

Estado fundamental depleção Super-resolução Imaging em células de mamíferos

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...

Examination of Mitotic and Meiotic Fission Yeast Nuclear Dynamics by Fluorescence Live-cell Microscopy

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does not interfere with cell physiology, and requires minimal experimental handling. The low levels of technical interference enable researchers to study cells across multiple cycles of mitosis and to observe meiosis from beginning to end. Using fluorescent tags such as Green Fluorescent Protein (GFP) and Red Fluorescent Protein (RFP), researchers can analyze different factors whose functions are important for processes like transcription, DNA replication, cohesion, and segregation. Coupled with data analysis using Fiji (a free, optimized ImageJ version), live-cell imaging offers various ways of assessing protein movement, localization, stability, and timing, as well as nuclear dynamics and chromosome segregation. However, as is the case with other microscopy methods, live-cell imaging is limited by the intrinsic properties of light, which put a limit to the resolution power at high magnifications, and is also sensitive to photobleaching or phototoxicity at high wavelength frequencies. However, with some care, investigators can bypass these physical limitations by carefully choosing the right conditions, strains, and fluorescent markers to allow for the appropriate visualization of mitotic and meiotic events.

Here, we present live-cell imaging which is a non-toxic microscopy method that allows researchers to study protein behavior and nuclear dynamics in living fission yeast cells during mitosis and meiosis.

Examinação da dinâmica nuclear do fermento mitotic e Meiotic da fissão pela microscopia viva-pilha da fluorescência

Live-cell imaging is a microscopy technique used to examine cell and protein dynamics in living cells. This imaging method is not toxic, generally does ...