Yazarlar hiçbir katkıda bulunanlar var.

Bu iletişim kuralı Chalmers üniversitenin insan araştırma Etik Komitesi kuralları izler.
Not: Tüm steril Biyogüvenlik kabini içinde gerçekleştirilecek adımlardır.
1. hazırlanması sarf malzemeleri, Bioink ve hücreleri
<ol>
	<li>İki şırınga elde etmek, bir şırınga (şekil 1bir) hücre süspansiyon için diğer şırınga bioink (şekil 1b) için ise.</li>
	<li>Radarı kilit bağlantısı üzerinden ikili şırınga ile birleştiğinde bir steril pasif karıştırma ünitesi (şekil 1c) edinin.</li>
	<li>Kontrollü bir hızda aynı anda iki steril şırınga bir birimden bükün bir dağıtım birimi (şekil 1d) edinin. Not: Bu çalışmada kullanılan karıştırma oranı 10: 1'dir. Bu nedenle, 12 mL şırınga ve 1 mL şırınga 10:1 karıştırma birimi tarafından gerektiği gibi kullanın.</li>
	<li>Steril kartuş (şekil 1e) ve bioink ve hücre süspansiyon içine doğrudan karışık için bir steril kadın-erkek radarı kilit bağlayıcı elde etmek.</li>
	<li>Elde etmek veya bioink ile bir hücre süspansiyon karıştırma için hazırlamak. Not: Bu protokol için bir nanocellulose/aljinat dayalı bioink kullanılmıştır. Bu bioink bir steril 100 mM CaCl2 çözüm sonrası yazdırma ilavesi ile çapraz bağlanmış.</li>
	<li>Hücrelerin % 0.5 tripsin/EDTA çözüm kullanarak bağlantısını kesin ve toplam17trypan mavi dışlama yöntemi kullanarak hücreleri sayar. Not: Bu protokol için insan fibroblast kullanılmıştır.</li>
	<li>Ne hücre yoğunluğu son yazdırılan yapı isteniyorsa belirlemek. Aşağıdaki denklemler bu hedef son hücre yoğunluğu sağlamak için seyreltilmiş gerekir hasat hücreleri konsantrasyon kullanarak hesaplama. Not: Bu protokol için 5 x 106 hücre/mL son hücre yoğunluğu kullanılmıştır.<ol>
		<li>Deneyler için istenen hücre konsantrasyonu seçin: Chücre (hücre/mL).</li>
		<li>Bioink gerekli, Vbioink, istenen yapıları toplam sayısına göre miktarı Hesapla: 
		Vbioink = Vinşa × Nkonutların Not: Örneğin, 100 µL bioink yapı başına bir birimdir. 30 yapıları yazdırıldıysa, sonra gerekli bioink 3 mL birimdir.</li>
		<li>Gerekli hücre sayısını hesaplar: 
		Nhücreleri = Chücre (1.1 × Vbiyolink)</li>
		<li>1/10th bioink hacmi hücreler (Nhücreleri) resuspend: 
		Vhücre süspansiyon = 0.1 × Vbiyolink Not: Örneğin, eğer Vbioink 3 mL, sonra Vhücre süspansiyon = 0,1 × 3 mL = 0.3 mL =</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. hücre süspansiyon ve Bioink karıştırma
<ol>
	<li>Hücre süspansiyon hücre süspansiyon şırınga aktarın.</li>
	<li>Bioink başka bir şırıngaya aktarmak veya bioink içeren bir şırınga elde edilir.</li>
	<li>Bioink şırınga pistonu geri çekilip şırınga dağıtım ünitesine yerleştirin. Birim radarı kilit bağlayıcı yukarı doğru (şekil 1f1) ile dikey olarak yerleştirin.</li>
	<li>Hücre şırınga pistonu geri bioink şırınga olarak benzer bir uzunluk için çekin ve dağıtım birimi (şekil 1f2) yerleştirin.</li>
	<li>Her iki şırınga radarı kilit bağlayıcılar (şekil 1f3) büküm tarafından karıştırma birimine ekleyin.</li>
	<li>Karıştırma sistemi şırınga havada Yükselt için dağıtım biriminde iterek Başbakan. Radarı kilit (şekil 1g4) ulaşan çözüm önce astar durdurmak.</li>
	<li>Priming sonra karıştırma birim yolu ile belgili tanımlık radarı kilit bağlamak (şekil 1g5) sonu dolum kartuş takın. Dolum kartuş pistonu alt eki önce olduğundan emin olun.</li>
	<li>Yavaş yavaş (şekil 1h6) bioink ve hücre süspansiyon birlikte kartuş (şekil 1i7) karıştırmak dağıtım birimi sıkıştırmak.</li>
	<li>Pistonu aşağı doğru bioink hücreli karışımı karıştırma sonra başvurun için steril damlalıklı ipucu ile dolum kartuş itin. Hücre/bioink karışımı karıştırma ünitesine kalıptan çekilmiş değil emin olmak için sıkıştırılmış kadar dağıtımı devam et.</li>
	<li>Kartuş kap ve herhangi bir hava kabarcıkları kartuş (piston son) başına taşımak için çalışma yüzeyinin üzerinde hafifçe dokunun. Not: Bu noktada, hücre/bioink yazdırma için hazır karışımdır. Aşağıdaki bölümlerde belirli uygulamalar ve yazdırma işlemleri açıklayacağım.</li>
</ol>
3. el ile Spatula karıştırma için karşılaştırıldığında bir karıştırma birimini kullanarak hücre canlılığı tespiti
<ol>
	<li>İnsan fibroblast (Bölüm 7), % 80'i izdiham bir % 0.5 tripsin/EDTA Çözümle ayırmak, sayma ve kültür orta bioink ile karıştırma sonra son bir konsantrasyon ulaşmak için yeterli hücre yoğunluğu, resuspend (1:10 cep: bioink oranı) 5 x 10 6 hücre/mL.</li>
	<li>Hücre içine her iki pasif birimi teknik (Adım 2) karıştırma kullanarak bioink veya hücre canlılığı her iki tekniğin de etkisini değerlendirmek için spatula ile karıştırın.</li>
	<li>Hücreleri kullanarak birimi teknik 1, 2 veya 3 kez 100 mM CaCl2kullanarak cross-linking için bir kalıp içine dağıtımı önce karıştırma pasif bioink içine karışımı. Not: ek karışımlar gerçekleştirmek için bir şırınga yerine doğrudan bir kartuş cep/bioink karıştırın. O zaman önceki protokol sonrası karıştırma birimi aracılığıyla ama hücre şırınga bileşen olmadan karışım klibi için.</li>
	<li>Hücreleri içine el ile mekanik bir spatula ile için 30, 60 veya 90 s. Aktarım süreleri (karıştırma her süre) karışımları için 100 mM CaCl2ile ilişkilendirerek bir kalıp içine karıştırma kullanarak ayrı bir bioink karışımı.</li>
	<li>Örnekleri cross-linking ve kültür standart koşullar altında tamamlanmasından sonra iyi bir tabağa aktarın.</li>
	<li>Yapıları kültür 1 gün sonra yıkayın (n = 3-4 grup başına) serum serbest hücre kültür orta 30 dakika süreyle boyama bir çözüm yapıları hücrelerde leke (4 µM Calcein AM, 1 µM arasında etidyum homodimer-1) 30 dk için.<ol>
		<li>İki ek kez yıkayın ve serum serbest hücre kültür orta 37 ° C'de 1 saat olmak üzere toplam örneklerinde kuluçkaya</li></ol></li></ol>Örnekleri canlı hücre yansıma çözümü aktarın.
	
	
	<li>İmge yolu ile 10 X büyütme FITC ve Texas kırmızı filtrelerle ters bir mikroskop kullanarak bir dijital renkli kameraya almak ve görüntü analiz yazılımı kullanarak analiz.</li>
	<li>Rasgele üç görüntüleri her yapı miktar hücre canlılık için seçin.</li>
	<li>Toplam hücre sayısı için canlı hücreler oranını temel alan canlılığı hesaplayın. Bir tek yönlü ANOVA Tukey'nın birden fazla karşılaştırma testi ile takip üzerinden veri analiz.</li>

4. Bioprinting kıkırdak analogları ile bir tek hücre türü
<ol>
	<li>3D model analog istenen doku çizin. Bioprinting için Gcode dosyasına dönüştürmek ve bioprinter1Gcode dosyasını yükleyin. Not: Bu protokol için STL dosya olarak boyutları 4.8 x 4.8 x 0.9 mm3 kare yapısıyla ihraç edildi. Gcode dosya aşağıdaki ayarları kullanarak kafes yapısı oluşturuldu: katman kalınlığı, 0.3 mm; dolgu deseni, dikdörtgen çizgili; dolgu yoğunluğu, % 25; hız, 10 mm/s.</li>
	<li>İzole ve birincil insan burun kondrosit (hNC) hastaların başvurulan protokolü1takip cryopreserve.</li>
	<li>Çözülme ve cryopreserved hNCs genişletin ve bir kez standart kültür orta 37 ° C'de kullanarak monolayer kültür genişletin Senaryo Özeti % 80-90 izdiham %0,5 tripsin/EDTA çözeltisi ile bağlantısını kesin ve bir trypan mavi dışlama protokolü kullanarak saymak. HNCs geçit 2 kullanarak tüm deneyler yapılmıştır.</li>
	<li>100 x 106 hücre/mL 300 µL % 10 fetal sığır serum, % 1 penisilin-streptomisin ve bioink ile karıştırma için hazırlık 50 µg/mL askorbik asit ile takıma kültür ortamının içinde hNCs resuspend.</li>
	<li>Karışım hNC hücre süspansiyon nanocellulose/aljinat içine Birimi Protokolü 9 x 106 hücre/mL son hücre konsantrasyonu elde etmek için 10:1 bioink:cell süspansiyon oranında karıştırma pasif bioink aşağıdaki temel.</li>
	<li>Bioprinter UV Işınlarına maruz kalma ve temizleme işlemi aşağı % 70 etanol ile steril edilmektedir emin olun. Kısırlık bir laminar akışı kabine yerleştirerek korumak.</li>
	<li>Steril yazdırma başlıklarını bioink/hücre süspansiyon karışımlar içeren kartuşları takın ve bioprinter yerleştirin.</li>
	<li>Bioprinter el ile veya iletişim kuralları tarafından yazıcıya özel ayarlama.</li>
	<li>Bioprint kafes yapılı, aşağıdaki yazdırma parametrelerini kullanarak hücre yüklü yapıları: 25G konik Nozul 25 kPa basınçta. Bioprint-boş hücre yapıları (yok hücreleri içeren hücre orta ile karışık) bir denetim olarak.</li>
	<li>100 mm CaCl2 5 dk. durulama için iyonik bir çözüm yapıları ekleyerek yapılarını bölünmelerini ve standart kültür koşullarda (37 ° C, % 5 CO2ve % 95 bağıl nem) kültür ortamında kuluçkaya. Medya her ikinci veya üçüncü gün değiştirin.</li>
	<li>2 ve 4 haftalıkken histolojik analizler için örnekler toplamak. Bir Alcian mavi leke18kullanarak GAG üretim için örnekleri leke.</li>
</ol>
5. cilt analogları iki hücre tipleri ile Bioprinting
<ol>
	<li>İstenen doku analog 3D model çizmek ve bioprinting için Gcode dosyasına dönüştürün. Bioprinter üzerinde Gcode dosya yükleyin. Not: Bu protokol için STL dosya olarak boyutları 4.8 x 4.8 x 0.9 mm3 kare yapısıyla ihraç edildi. O zaman Gcode dosya aşağıdaki ayarları kullanarak kafes yapısı oluşturuldu: katman kalınlığı, 0.3 mm; dolgu deseni, dikdörtgen çizgili; dolgu yoğunluğu, % 25; hız, 10 mm/s.</li>
	<li>Hücreleri bioprinting için bioink içine karıştırma için hazırlayın. Cilt analogları imalatı için iki hücre türleri kullanılmıştır. İki hücre tipleri bioink ve bioprinting içine karıştırılmıştır.<ol>
		<li>Birincil HDF edinin. Bu hücrelerin % 10 fetal sığır serum, % 1 penisilin-streptomisin ve 50 µg/mL askorbik asit ile DMEM büyüme medyada bakımı. Senaryo Özeti % 80-90 izdiham %0,5 tripsin/EDTA çözeltisi ve sayısı ile bağlantısını kesin.</li>
		<li>İzole ve başvurulan protokolü1takip hastaların birincil hNC cryopreserve. Çözülme ve monolayer kültür cryopreserved hNCs genişletin. Senaryo Özeti % 80-90 izdiham %0,5 tripsin/EDTA çözeltisi ve sayısı ile bağlantısını kesin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>100 x 106 hücre/mL büyüme ortam içinde her iki hücre tipleri resuspend. 100 x 106 hücre/mL 300 µL medya bir son toplam konsantrasyon ulaşmak için birlikte bir 1:1 oranında hücre süspansiyonlar karıştırın.</li>
	<li>Karışım 50: 50 hücre süspansiyon HDF ve nanocellulose/aljinat içine hNC Birimi Protokolü 9 x 106 hücre/mL son hücre konsantrasyonu elde etmek için 10:1 bioink:cell süspansiyon oranında karıştırma pasif bioink aşağıdaki temel.</li>
	<li>Bioprinter steril edilmektedir veya laminar akış içinde kısırlık korumak için kabine yerleştirilir emin olun.</li>
	<li>Steril yazdırma başlıklarını bioink/hücre süspansiyon karışımlar içeren kartuşları takın ve bioprinter yerleştirin.</li>
	<li>Bioprinter ya da el ile ayarlamak veya yazıcıya özgü protokoller.</li>
	<li>Bioprint kafes yapılı, aşağıdaki yazdırma parametrelerini kullanarak hücre yüklü yapıları: 25G konik Nozul 25 kPa basınçta. Bioprint-boş hücre yapıları (yok hücreleri içeren hücre orta ile karışık) bir denetim olarak.</li>
	<li>100 mm CaCl2 5 dk. durulama için iyonik bir çözüm yapıları ekleyerek yapılarını bölünmelerini ve standart kültür koşullarda (37 ° C, % 5 CO2ve % 95 bağıl nem) kültür ortamında kuluçkaya. Medya her ikinci veya üçüncü gün değiştirin.</li>
	<li>2 ve 4 haftalıkken histolojik analizler için örnekler toplamak. Örnekleri kollajen için leke ben bir Masson'ın trichrome leke19kullanarak üretim.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Avila, H. M., Schwarz, S., Rotter, N., Gatenholm, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+bioprinting+of+human+chondrocyte-laden+nanocellulose+hydrogels+for+patient-specific+auricular+cartilage+regeneration.">3D bioprinting of human chondrocyte-laden nanocellulose hydrogels for patient-specific auricular cartilage regeneration.</a> Bioprinting. 1, 22-35 (2016).</li><li>Lee, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design+and+fabrication+of+human+skin+by+three-dimensional+bioprinting.">Design and fabrication of human skin by three-dimensional bioprinting.</a> Tissue Eng Part C Methods. 20 (6), 473-484 (2013).</li><li>Costantini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic-enhanced+3D+bioprinting+of+aligned+myoblast-laden+hydrogels+leads+to+functionally+organized+myofibers+in+vitro+and+in+vivo.">Microfluidic-enhanced 3D bioprinting of aligned myoblast-laden hydrogels leads to functionally organized myofibers in vitro and in vivo.</a> Biomaterials. 131, 98-110 (2017).</li><li>Fedorovich, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofabrication+of+Osteochondral+Tissue+Equivalents+by+Printing+Topologically+Defined,+Cell-Laden+Hydrogel+Scaffolds.">Biofabrication of Osteochondral Tissue Equivalents by Printing Topologically Defined, Cell-Laden Hydrogel Scaffolds.</a> Tissue Eng Part C Methods. 18 (1), 33-44 (2011).</li><li>Vijayavenkataraman, S., Lu, W. F., Fuh, J. Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+bioprinting+of+skin:+a+state-of-the-art+review+on+modelling,+materials,+and+processes.">3D bioprinting of skin: a state-of-the-art review on modelling, materials, and processes.</a> Biofabrication. 8 (3), 032001 (2016).</li><li>Peltola, S. M., Melchels, F. P. W., Grijpma, D. W., Kellom&#228;ki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+rapid+prototyping+techniques+for+tissue+engineering+purposes.">A review of rapid prototyping techniques for tissue engineering purposes.</a> Ann Med. 40 (4), 268-280 (2008).</li><li>Xu, T., Jin, J., Gregory, C., Hickman, J. J., Boland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inkjet+printing+of+viable+mammalian+cells.">Inkjet printing of viable mammalian cells.</a> Biomaterials. 26 (1), 93-99 (2005).</li><li>Cui, X., Dean, D., Ruggeri, Z. M., Boland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+damage+evaluation+of+thermal+inkjet+printed+Chinese+hamster+ovary+cells.">Cell damage evaluation of thermal inkjet printed Chinese hamster ovary cells.</a> Biotechnol Bioeng. 106 (6), 963-969 (2010).</li><li>Parsa, S., Gupta, M., Loizeau, F., Cheung, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+surfactant+and+gentle+agitation+on+inkjet+dispensing+of+living+cells.">Effects of surfactant and gentle agitation on inkjet dispensing of living cells.</a> Biofabrication. 2 (2), 025003 (2010).</li><li>Derby, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inkjet+printing+of+functional+and+structural+materials:+fluid+property+requirements,+feature+stability,+and+resolution.">Inkjet printing of functional and structural materials: fluid property requirements, feature stability, and resolution.</a> Annu Rev Mater Res. 40, 395-414 (2010).</li><li>Colosi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Bioprinting+of+Heterogeneous+3D+Tissue+Constructs+Using+Low-Viscosity+Bioink.">Microfluidic Bioprinting of Heterogeneous 3D Tissue Constructs Using Low-Viscosity Bioink.</a> Adv Mater. 28 (4), 677-684 (2016).</li><li>Ober, T. J., Foresti, D., Lewis, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Active+mixing+of+complex+fluids+at+the+microscale.">Active mixing of complex fluids at the microscale.</a> Proc Natl Acad Sci. 112 (40), 12293-12298 (2015).</li><li>Shabnam, P., Madhuja, G., Fr&#233;d&#233;ric, L., Karen, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+surfactant+and+gentle+agitation+on+inkjet+dispensing+of+living+cells.">Effects of surfactant and gentle agitation on inkjet dispensing of living cells.</a> Biofabrication. 2 (2), 025003 (2010).</li><li>Chahal, D., Ahmadi, A., Cheung, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+piezoelectric+cell+printing+accuracy+and+reliability+through+neutral+buoyancy+of+suspensions.">Improving piezoelectric cell printing accuracy and reliability through neutral buoyancy of suspensions.</a> Biotechnol Bioeng. 109 (11), 2932-2940 (2012).</li><li>Niu, X., Lee, Y. -. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+spatial-temporal+chaotic+mixing+in+microchannels.">Efficient spatial-temporal chaotic mixing in microchannels.</a> J Micromech Microeng. 13 (3), 454 (2003).</li><li>Liu, R. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passive+mixing+in+a+three-dimensional+serpentine+microchannel.">Passive mixing in a three-dimensional serpentine microchannel.</a> J Microelectromech Syst. 9 (2), 190-197 (2000).</li><li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability.">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Curr protoc immunol. , (2001).</li><li>Scott, J., Dorling, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+staining+of+acid+glycosaminoglycans+(mucopolysaccharides)+by+alcian+blue+in+salt+solutions.">Differential staining of acid glycosaminoglycans (mucopolysaccharides) by alcian blue in salt solutions.</a> Histochem Cell Biol. 5 (3), 221-233 (1965).</li><li>Garvey, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modified+elastic+tissue-Masson+trichrome+stain.">Modified elastic tissue-Masson trichrome stain.</a> Stain technol. 59 (4), 213-216 (1984).</li><li>Xu, T., Zhao, W., Zhu, J. -. M., Albanna, M. Z., Yoo, J. J., Atala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complex+heterogeneous+tissue+constructs+containing+multiple+cell+types+prepared+by+inkjet+printing+technology.">Complex heterogeneous tissue constructs containing multiple cell types prepared by inkjet printing technology.</a> Biomaterials. 34 (1), 130-139 (2013).</li><li>Kolesky, D. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+bioprinting+of+vascularized,+heterogeneous+cell-laden+tissue+constructs.">3D bioprinting of vascularized, heterogeneous cell-laden tissue constructs.</a> Adv Mater. 26 (19), 3124-3130 (2014).</li><li>Kolesky, D. B., Homan, K. A., Skylar-Scott, M. A., Lewis, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+bioprinting+of+thick+vascularized+tissues.">Three-dimensional bioprinting of thick vascularized tissues.</a> Proc Natl Acad Sci. 113 (12), 3179-3184 (2016).</li><li>Rutz, A. L., Hyland, K. E., Jakus, A. E., Burghardt, W. R., Shah, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multimaterial+bioink+method+for+3D+printing+tunable,+cell-compatible+hydrogels.">A multimaterial bioink method for 3D printing tunable, cell-compatible hydrogels.</a> Adv Mater. 27 (9), 1607-1614 (2015).</li><li>K&#214;pf, M., Campos, D. F. D., Blaeser, A., Sen, K. S., Fischer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tailored+three-dimensionally+printable+agarose-collagen+blend+allows+encapsulation,+spreading,+and+attachment+of+human+umbilical+artery+smooth+muscle+cells.">A tailored three-dimensionally printable agarose-collagen blend allows encapsulation, spreading, and attachment of human umbilical artery smooth muscle cells.</a> Biofabrication. 8 (2), 025011 (2016).</li><li>Gurkan, U. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+anisotropic+biomimetic+fibrocartilage+microenvironment+by+bioprinting+mesenchymal+stem+cells+in+nanoliter+gel+droplets.">Engineering anisotropic biomimetic fibrocartilage microenvironment by bioprinting mesenchymal stem cells in nanoliter gel droplets.</a> Mol Pharm. 11 (7), 2151-2159 (2014).</li><li>Ma, Y., Ji, Y., Huang, G., Ling, K., Zhang, X., Xu, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioprinting+3D+cell-laden+hydrogel+microarray+for+screening+human+periodontal+ligament+stem+cell+response+to+extracellular+matrix.">Bioprinting 3D cell-laden hydrogel microarray for screening human periodontal ligament stem cell response to extracellular matrix.</a> Biofabrication. 7 (4), 044105 (2015).</li><li>Lu, H. H., Thomopoulos, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+attachment+of+soft+tissues+to+bone:+development,+healing,+and+tissue+engineering.">Functional attachment of soft tissues to bone: development, healing, and tissue engineering.</a> Annu Rev Biomed Eng. 15, 201-226 (2013).</li><li>Aguado, B. A., Mulyasasmita, W., Su, J., Lampe, K. J., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+viability+of+stem+cells+during+syringe+needle+flow+through+the+design+of+hydrogel+cell+carriers.">Improving viability of stem cells during syringe needle flow through the design of hydrogel cell carriers.</a> Tissue Eng Part A. 18 (7-8), 806-815 (2011).</li><li>Parisi-Amon, A., Mulyasasmita, W., Chung, C., Heilshorn, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein-Engineered+Injectable+Hydrogel+to+Improve+Retention+of+Transplanted+Adipose-Derived+Stem+Cells.">Protein-Engineered Injectable Hydrogel to Improve Retention of Transplanted Adipose-Derived Stem Cells.</a> Adv Healthc Mater. 2 (3), 428-432 (2013).</li><li>Qiu, X., De Jesus, J., Pennell, M., Troiani, M., Haun, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+device+for+mechanical+dissociation+of+cancer+cell+aggregates+into+single+cells.">Microfluidic device for mechanical dissociation of cancer cell aggregates into single cells.</a> Lab Chip. 15 (1), 339-350 (2015).</li><li>Cukierman, E., Pankov, R., Yamada, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+interactions+with+three-dimensional+matrices.">Cell interactions with three-dimensional matrices.</a> Curr Opin Cell Biol. 14 (5), 633-640 (2002).</li><li>Loessner, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioengineered+3D+platform+to+explore+cell-ECM+interactions+and+drug+resistance+of+epithelial+ovarian+cancer+cells.">Bioengineered 3D platform to explore cell-ECM interactions and drug resistance of epithelial ovarian cancer cells.</a> Biomaterials. 31 (32), 8494-8506 (2010).</li><li>Lin, R. Z., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+three-dimensional+multicellular+spheroid+culture+for+biomedical+research.">Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research.</a> Biotechnol J. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).</li></ol>

Bu makale yazarları CELLINK LLC, çalışanlardır.

Bu el yazması gösterildiği gibi pre-cellularized bioinks bioprinted ya da kıkırdak imal veya 4 haftaya kadar kültürlü analogları cilt için vardı. Birimi teknik karıştırma pasif kullanarak karıştırma sonra hücre canlılığı geleneksel karıştırma yöntemleri yüksekti. Ayrıca, karıştırma birimini kullanarak karıştırma işlemi basitleştirilmesi adımlar işleme sayısını en aza indirir ve karıştırma ölçüde daha iyi tutarlılık sağlar. Sonuçta, her iki hücre dağıtım ve yapıları ve deneysel grupları arasında bioink içinde daha iyi tekrarlanabilirlik sonuçlanır. ECM bileşenleri GAGs ve kollajen gibi belirli doku birikimi kıkırdak ve cilt analogları için kültür sırasıyla 4 hafta sonra gözlendi. Bu karıştırma tekniği ve farklı doku hedefleri imal etmek seçilmiş yapı geometri esnekliğini gösterir. Kıkırdak ve cilt analogları imalatı her iki nanocellulose-aljinat bioink ve kullanımı bioprinting tekniği farklı mühendislik doku hedefleri için esneklik sergiledi. Çalışmanın sonuçları aşağıdaki iki bileşeni ele alınacak: (1 pasif birimi teknik ve kıkırdak ve cilt analogları içindeki hücreleri (2 davranışını karıştırma.
Geliştirilmesi ve optimizasyonu için bir bioink bir hücre süspansiyon karıştırma bir teknik bu yapıları imalatı için fevkalade. Geleneksel düşük viskozite hidrojel malzemesi, tehdit yazdırmadan önce bir bioink pre-cellularization altında bioinks yüksek viskozite sonuçlandı. Bir bioink içine hücre şirketleşme geleneksel yöntemine alternatif olarak, tek adımlı bir hücre süspansiyon viskoz bir bioink karıştırma için bir protokol geliştirilen ve tartışıldı. Ayrıca, doku yapıları imalatı karıştırma Bu teknikte pratik uygulama değerlendirilmiştir. Bu tek adımlı karıştırma yaklaşımı geleneksel karıştırma teknikleri dahil kontrollü karıştırma oranı, yüksek ve düzensiz kesme vurguluyor, indirilmesi birçok avantajı vardır ve örnek ortadan kaldırmak için kapalı bir sistem kapatın damarları karıştırma. Ancak, bu teknik avantajları cep/bioink karıştırma için geleneksel yöntemler üzerinde emin olmak için birkaç önemli adımlar bulunmaktadır. Hücre şırınga hücrelerde askıya ve iyi karıştırma önce karışık sağlamak için önemlidir. Çok büyük, kaldırma ve transfer hücrelerin arasında bir zaman aralığı içinde belgili tanımlık tenkıye ve başlangıç karıştırma işlemi düzensiz karıştırma ve dağıtım yazdırılan bir filament içine neden olur tortu hücrelere neden olabilir. Sedimantasyon izlenebiliyor, basit inversiyon (2 - 3 kez), Eğer hemen önce karıştırma pasif karıştırma ünitesi montaj hücreleri resuspend ve karıştırma önce tekdüze dağılım sağlamak için yeterli olduğunu. Bu da şırıngaları hava kabarcıkları ortadan kalkar veya önceden karıştırma oranı sabit kalmasını sağlamak için simge durumuna küçültülmüş önemlidir. Büyük hava kabarcıkları karıştırma önce bioink kartuş kalırsanız, çözüm ayrıntılı karıştırma sağlamak için ek bir süre karıştırma birimi üzerinden çalıştırılması önerilir. Hava kabarcığı kalırsa, baskı kartuşu/şırınga nazik dokunarak kalan hava kabarcıkları yerinden. Birden çok malzeme (birkaç karıştırma birimleri veya malzeme) karıştırma daha karmaşık yapıları için gerekli ise, buna ek olarak, karışık olması bioinks/hücre süspansiyonlar konsantrasyonları karıştırmak yoluyla, uygun sulandrarak sonra emin olmak için ayarlanması gerekir son konsantrasyonu hala elde edilir.
Diğer karıştırma teknikleri ile karşılaştırıldığında, pasif karıştırma ünitesi bioinks cellularize için yeni bir yaklaşımdır. Karıştırma veya bir spatula veya başka bir araç ile karıştırarak çift şırınga gibi diğer karıştırma teknikleri pasif karıştırma birim toplu işlemleri ve kullanıcılar arasında karıştırma daha fazla tutarlılık sağlar. Bir spatula karıştırma gibi el ile karıştırma teknikleri doğası kapsamını ve karıştırma oranı büyük kullanıcıdan kullanıcıya varyasyon sonuçlanır. Ayrıca, birim ve çift şırınga karıştırma karıştırma pasif gibi kapalı sistemler bir Petri kabına veya tüp içinde karıştırma el ile karşılaştırıldığında küçük hiçbir örnek kaybı olması.
Bu el yazması fabrikasyon her iki doku analogları bioink tek bir türü ve bir veya iki hücre tipleri oluşuyordu. Ancak, farklı hücre tipleri ile farklı bioinks bölgelerinde içeren mimarileri oluşan doku analogları bioprinting daha fazla fizyolojik doku yapıları20,21imalatı için gerekli olabilir, 22. Daha bioinks benzersiz besteleri ile özel veya işlevleri birlikte farklı kompozisyonlar veya işlevleri23var multimaterial bioinks oluşturmak için varolan bioinks çeşitli karıştırma aracılığıyla oluşturulabilir, 24. Bu gibi cilt için cilt altı katman veya nerede bioink kompozisyon25,26 bir degrade gelişimini sağlamak gerekli olabilir bölge bir doku kemik kıkırdak doku geçiş bölgeleri, özellikle önemli olabilir Bu kritik bölgelerde yerel doku27' bulundu. Ayrıca, bir karıştırma birim büyüme faktörleri ve morfojenlerdeki bioprinting önce bioinks içine karıştırmak için yararlanılabilir. Örnek kaybı kapalı karıştırma sistemi ile ortadan kaldırılması nerede örnek kaybı son onların konsantrasyon bioprinted yapý içinde bir değişiklik neden olabilir, pahalı ve düşük konsantrasyon biyoaktif faktörler, kullanım için çekici olduğunu özellikle degradeler katılmaktadırlar.
Mekanik olarak duyarlı hücre tipleri hasar riski bu çalışmada kullanılan birim karıştırma pasif dahil olmak üzere herhangi bir karıştırma tekniği ile bir kısıtlamadır. Örneğin, kök hücre böyle izole kemik iliği veya embriyo veya İndüklenmiş pluripotent kök hücreler Bunlar mekanik hasar28,29için daha duyarlı. Karıştırma işlemi karıştırma sürecine dahil kesme Kuvvetleri nedeniyle hücrelerinde anormal mekanik gerilmeler kazandırır ve canlılığı30korumak için dengelenmelidir. İyi canlılık (Şekil 2) birincil fibroblastlar ve bu çalışmanın kondrosit kullanımıyla sonuçlanan iken, daha fazla çalışmaları güvenli karışım ve oranlarının daha duyarlı hücre tipleri için belirlemek gereklidir. O zamana kadar bu karıştırma canlılığı en üst düzeye çıkarmak için sürekli bir yavaş sıklığı altında yapılması tavsiye edilir. Buna ek olarak, bu çalışmada seçilen hücre yoğunluğu önceki çalışmalar1üzerinde dayalı tespit edilmiştir. Bu hücre yoğunluğu tüm hücre türleri için ideal olmayabilir.Özellikle, daha yüksek bir konsantrasyon hücreleri karıştırma hücre canlılığı ve doku oluşumu31,32artırabilir artan hücre-hücre kişiler'neden olabilir. Benzer şekilde, pasif karıştırma birim hücre pulcuklarının veya diğer hücre toplamları33 bioinks karıştırma için uygun olabilir.
Olarak önerilen ve gösterdi bu çalışmada, bir pasif karıştırma birim sistemi hızla viskoz bir bioink bir hücre süspansiyon karışımı olabilir. Hücrelere mekanik hasar için risk hala kalırken, yaklaşım ve kullanıcılar arasında tek bir çalışma içinde karıştırma daha fazla tutarlılık sağlar. Pre-cellularized bioinks bu yaklaşımı kullanan her iki kıkırdak imal ve 4 haftaya kadar kültürlü ve doku belirli ECM işaretlerini birikimi gösterdi analogları deri kullanılmıştır. Gelecekteki çalışmaları birimi sistem üzerinden standart bioinks daha karmaşık doku analogları imalatı için özel bioinks karışım karıştırma pasif kullanımı ele alınacak.

Son yıllarda, üç boyutlu (3D) bioprinting teknoloji araştırmacılar, daha yaygın olarak doku analogları imalatı için kullanılan olmak için teknik izin için daha erişilebilir hale geldi. Bioprinting Biyomedikal Araştırma çok yönlü doku yapıları, hızlı ve yinelenebilir imalat kolaylaştırarak devrim vaat ediyor. Bioprinting teknoloji dönüm noktası tam olarak (bioinks da bilinir) Biyomalzeme birikimi kontrol yeteneği üç boyutlu olarak bırakır. Bu karmaşık iskele üretimi ile matris besteleri, biyoaktif faktörleri ve daha doğru bir şekilde yerel doku yapısı özetlemek hücreleri farklı bölgelerinde sağlar.
Bioprinting yapıları kıkırdak1, Cilt2, kas3ve kemik4dahil olmak üzere birçok doku uygulamaların imalatı için kullanılmıştır. Bu doku bioprinting nedeniyle kendi içsel çizgili mikro-tekrarlama yoluyla katman katman ifade için uygun olan mimarileri için caziptir. Özellikle, deri imalat bioprinting gibi katman katman ifade teknikleri için uygun olan bir iyi tanımlanmış çok katmanlı yapısı5, sahip olur. Ayrıca, bioprinting gerekli anatomik boyutları sahip yapıları oluşturmak için kullanılması gereken ve doku onarımı için şekiller defekt. Biyomalzeme hasta özel boyut ve şekil6 ile oluşturma yeteneği de dahil olmak üzere birçok dokuların kısmi onarım için talep adrese başlayabilirsiniz ancak bunlarla sınırlı olmamak kemik defektleri, kıkırdak hasarı ve deri lezyonları olan ölçüde değişir hasta hasta.
Bu çalışmada, iki doku analogları (eklem kıkırdak ve cilt) pre-cellularized bioinks bioprinting ile fabrikasyon. Bir bioink süre hücre canlılığı koruyarak bir meydan okuma olabilir tek tip hücre dağıtım emin olabilirsiniz hücre süspansiyon ile yeterli karıştırma sağlanması. Bioinks bioprinting yolu ile ekstrüzyon için uygun çoğu kez çok viskoz ve bu nedenle homojen bir karışım sağlamak için kapsamlı karıştırma gerektirir. Hücrelere mekanik hasar sert karıştırma koşullar altında ortaya ve canlılığı olumsuz etkiler. Çalışmalar çoğu hücre ölümü mürekkep püskürtmeli baskı işlemi sırasında7,8karıştırma gibi hazırlık sırasında oluşur göstermiştir. Geleneksel ajitasyon9 ile karıştırma düşük viskozite bioinks mürekkep püskürtmeli baskı10için uygun için yeterli olsa da, hücrelerin yüksek viskozite bioink karıştırma ekstrüzyon bioprinting için daha uygun daha zordur. Bu ihtiyaç adresleme, püskürtme uçlarını karıştırma kullanımı bioinks sırasında yazdırma işlemi11karıştırma için daha popüler hale geldi. Bu mikserler da yaygın olarak önemli12nerede sıvıları düşük Reynolds sayısı ile karıştırma havacilik araştırmada kullanılmıştır. Bir hücre süspansiyon bir bioink karıştırmak için sürekli bir karıştırma işlemi kullanımı bütünlüğü için yazdırma işlemi sırasında izin vermez. Ancak, hücre süspansiyonlar Düşük viskoziteli bir bioink için karşılaştırıldığında sahip beri zorluklar yazdırma işlemi9,13,14sırasında sedimantasyon hücrelerin önlemede ortaya çıkacak. Alternatif olarak, hücrelerin yazdırmadan önce bir bioink içine karıştırma bu sorunu ele.
Hücre ölümü bir bioink karıştırma sırasında en aza indirmek için hücreleri adım en az sayısında bir bioink içine karıştırmak için pasif bir karıştırma birim dayalı bir teknik geliştirmiştir. Malzemeleri karıştırma birimi aracılığıyla akış ile oluşturulan kaotik karıştırma tekrarlanarak karışım iki bileşen birlikte15,16için yeterlidir. Bu yöntem öncelikle ekstrüzyon bioprinting için uygun herhangi bir bioink ile herhangi bir hücre süspansiyon karıştırma basitleştirmek için geliştirilmiştir. Karıştırma işlemi adım sayısını karıştırma kullanıcıdan kullanıcıya varyasyon ortadan kaldırmak için simge durumuna küçültülmüş. Özellikle hücreleri söz konusu olduğunda aşırı karıştırma adımları zaman alıcı ve tüm bioinks için geçerli değildir olabilir. İkincil, kısırlık korumak hem de örnek kaybı en aza indirmek için kendi kendine yeten bir karıştırma işlemi geliştirmek amaçlanmıştır.
Bu makale, bir hücre süspansiyon işleme en aza indirir ve yüksek hücre canlılığı ve üniforma dağıtım sonuçları birimi teknik karıştırma bir pasif kullanarak bir bioink ile karıştırma göstermektedir. Bu pre-cellularized bioinks sonra bir kıkırdak veya cilt oluşturmak sırasıyla 6 haftaya kadar kültürlü bir ya da iki hücre türleri, bioprint için kullanılmaktadır. Kullanılan bioink daha önce bioprinting1için uygunluk göstermiştir bir aljinat-nanocellulose karışımıdır.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>STARTINK Kit</td>
			<td>CELLINK</td>
			<td>SK0001</td>
			<td>Kit that contained all the elements for the CELLMIXER procedure</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead Kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L3224</td>
			<td>Kit for the analysis of cell viability after mixing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masson&#39;s Trichrome</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>HT15-1KT</td>
			<td>Kit for the analysis of collagen I deposition in the skin constructs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcian Blue</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>B8438-250ML</td>
			<td>Kit for the analysis of glycosaminoglycan deposition in the skin constructs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>INKREDIBLE+ bioprinter</td>
			<td>CELLINK</td>
			<td>Gen1+</td>
			<td>Printer utilized in the study</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM with Glutamax</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>10566016</td>
			<td>Media for culture of the cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% fetal bovine serum</td>
			<td>Thermofisher</td>
			<td>A3160402</td>
			<td>Media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15070063</td>
			<td>Media supplement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>live cell imaging solution</td>
			<td>thermofisher</td>
			<td>A14291DJ</td>
			<td>component utilized using live/dead imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inverted microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>IX73</td>
			<td>microscope utilized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>a digital color camera</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>XC10</td>
			<td>microscope camera utilized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cellSens imaging software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>n/a</td>
			<td>stock software with the microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td>n/a</td>
			<td>open source image analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism 7</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>n/a</td>
			<td>software for statistical analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slic3r software (v1.2.9)</td>
			<td>Slic3r</td>
			<td>n/a</td>
			<td>open-source software to convert .stl file to gcode</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>primary adult human dermal fibroblasts</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>PCS-201-012</td>
			<td>cell source for fibroblasts</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bioprinting of cartilage and skin tissue analogs utilizing a novel passive mixing unit technique for bioink precellularization

Bioprinting yapıları doku mühendisliği uygulamaları için hızlı ve tekrarlanabilir imalatı için güçlü bir tekniktir. Bu çalışmada, kıkırdak ve cilt analogları birimi teknik karıştırma bir roman pasif kullanan bioink pre-cellularization sonra fabrikasyon. Bu teknik bir hücre süspansiyon çok viskoz bir bioink karıştırma adımları kolaylaştırmak amacı ile geliştirilmiştir. Bioprinting yatırılır filamentler çözünürlüğe tekdüzelik hücre dağıtım bölgeleri hücre olmadan birikimi veya iğne yapışmasına neden olabilir büyük hücre kümeleri saklama önlemek için yazdırmadan önce güvence gerektirir. Biz hızla bir hücre süspansiyon kıkırdak ve cilt analogları bioprinting önce bir bioink ile karıştırmak için yeteneğini göstermek. Her iki doku analogları 4 haftaya kadar kültürlü. Hücre canlılığı ve doku belirli hücre dışı Matriks (ECM) işaretlerini glikozaminoglikan (gag) ve kollajen gibi birikimi histolojik analiz gösterdi ben sırasıyla.

Bu el yazması sonuçlarında iki bölüme ayrılır. İlk olarak, hücre canlılığı sonrası karıştırma mekanik yöntemi veya pasif karıştırma ünitesi ile analiz edildi. Ardından, kıkırdak ve cilt yapıları kültürlü ve ilgili histolojik işaretler için analiz.
Hücre dağıtım her iki durumda da homojen ortaya çıktı. Ancak, bir spatula (Şekil 2b) kullanarak el ile karıştırma eylem bir pasif karıştırma ünitesi ile (Şekil 2bir) karıştırma daha daha fazla farkı vardır. Ölçüde, hız ve karıştırma tekniği bir spatula ile kullanıcı üzerinde son derece bağımlı. Ancak, hücre içine bir bioink pasif bir karıştırma ünitesi ile karıştırma karıştırma programların yönetimini standartlaştıran ve toplu işlemleri arasında varyasyon en aza indirir. Ayrıca, Mayıs 30, 60 ve 90 s karıştırma zaman hücre büyük miktarda bioink büyük bir miktar karıştırma için yeterli olmayabilir. Daha titiz bir spatula ile karıştırma ile karıştırma gerekli olabilir. İçinde karşılaştırma, pasif bir karıştırma birim kullanmak daha iyi karıştırma sırasında bioink hücrelere karıştırma oranını korur ve homojen bir karıştırma gerçekleştirilir sağlar. Ayrıca, örnek bir endişe geleneksel karıştırma teknikleri ile nereye bioink Petri yemekler, tüpler ve onların yüksek viskozite nedeniyle karıştırma araçları bırakılabilir kayıptır. Hücre canlılığı karıştırma birimi ile karıştırma için yüksek (&#62; % 90) 1, 2 veya 3 kez. Pasif karıştırma ünitesi kullanılmıştır karıştırma yaklaşık 1 dakika yavaş sabit karıştırma hızda götürdü. Bir spatula ile karıştırma yüksek canlılık 30 ve 60 s, 90'daha büyük için karıştırma sonra sergilenen iken s karıştırma diğer gruplara göre canlılığı önemli bir azalma sonuçlandı (77,9 ± % 14, p &#60; 0,05) (Şekil 2c). Bu aşırı karıştırılması nedeniyle bu hücreleri hasara neden olabilir. Uzun vadeli canlı/ölü 14 gün ve kültürünün 28 gün sonra boyama ek şekil 1' de gösterilen. Hücreleri 14, gün geçtikçe yayılıyor başlar ve son derece gün 28 tarafından yayılır ve iyi canlılık gösteriyor.
Sonra kültür, kıkırdak ve cilt doku analogları Histoloji ile analiz edildi. Analiz kıkırdak yapıları itibariyle 0, 14 ve 28 gün, bir miktar ve bir Alcian mavi leke (şekil 3a-3_c) gösterildiği şekilde GAGs kapsamını gösterir. Gün 14 boyama konumlara hücrelere proksimal sınırlı iken leke yokluğunda gün 0, fark edilir. Ancak, gün kültür tarafından 28, Alcian mavi bir chondrocytic ECM oluşumu gösteren yapı bulunur. Bioprinted deri yapılarını histolojik boyama kollajen ile ben bir Masson'ın Trichrome leke (Resim 3d-3f) kullanarak analiz edildi. Benzer şekilde kıkırdak yapılarını, gün 0 örnekleri yok kollajen birikimi sergiledi. Tarafından gün 14 Kültür, kollajen önemli mevduat hücrelerin etrafındaki ve yapı yüzey boyunca kaydedildi. Yoğun kollajen katmanları yapı yüzeyi ve toplu içinde bulunamadı gibi bu daha fazla gün 28, tarafından geliştirilmiş oldu.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56372/56372fig1.jpg"> 
Resim 1 : Pasif karıştırma birim sistemi. (bir) 1 mL şırınga hücre süspansiyon, bioink, (c) dağıtım birimi, (d) pasif karıştırma ünitesi, (e) ile (b) 12 mL şırınga dolum kartuş, (f) Meclisi bioink şırınga (1) ve hücre için süspansiyon şırınga (2) dağıtım birimi, pasif karıştırma birimi ek şırınga (3), (g) eki, kadın-erkek radarı kilit Bağlayıcısı (4) ve ek dolum kartuş (5) sonuna tamamlar derleme, (h ) karıştırma ünitesi (6), (ı) hazırlamak için dağıtım birimi sıkıştırmak hücre süspansiyon ile bioink mix ve dolum kartuş (7) dağıtmak için dağıtım birimi üzerinde itmeye devam edin. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56372/56372fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56372/56372fig2.jpg"> 
Resim 2 : Hücre canlılığı görüntüleri ve analiz. Temsilcisi görüntüleri canlı (yeşil) ve ölü (kırmızı) insan fibroblast birim 1, 2 veya 3 kez karıştırma pasif ile karıştırdıktan sonra gösterilen (bir) veya spatula 30, 60 veya 90 saniye (b) ve 1 gün için 3D kültür. 4 X büyütme görüntülere gösterilir. Ölçek çubuklar gösterir 200 µm. (c) yüzde ortalama canlılık insan fibroblast, birim veya spatula ve 3D kültür için 1 gün karıştırma pasif ile karıştırdıktan sonra. Hata çubukları, ortalama, standart sapma gösterir * 0,005. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56372/56372fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56372/56372fig3.jpg"> 
Şekil 3: doku belirli hücre dışı matriks ifade. Bioprinted kıkırdak yapılarını 14 ve (c) 28 gün 0, (b) Alcian (bir) mavi kullanan glikozaminoglikan lekeli. 5 X büyütme oranında yakalanan görüntüleri. Bioprinted cilt yapıları lekeli kollajen için ben gün 0, (e) 14, Masson'ın Trichrome (d) kullanan ve (f) 28. 5 X büyütme oranında yakalanan görüntüleri. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56372/56372fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Supplementary Figure 1" src="/files/ftp_upload/56372/56372supfig1.jpg"> 
Takıma giren şekil 1: hücre canlılığı gün 14 (bir) ve gün 28 (b). Ölçek çubuğu 200 µm, yeşil hücreleri canlı başvurduğu, kırmızı ölü hücrelere başvurur. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56372/56372supfig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization at JoVE.com

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting kıkırdak ve cilt doku analogları bir roman pasif birimi teknik Bioink Precellularization için karıştırma kullanmak

Kıkırdak ve cilt analogları nanocellulose-aljinat dayalı bioink kullanarak bioprinted vardı. Bioinks bir tek adım pasif karıştırma ünitesi üzerinden yazdırmadan önce cellularized. Yapıları düzgün cellularized, yüksek canlılık var ve farklılaşma olumlu işaretleri sergilemek için gösterdi.

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

bioprinting-cartilage-skin-tissue-analogs-utilizing-novel-passive

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.5K Görüntüleme.  CELLINK LLC. Kıkırdak ve cilt analogları nanocellulose-aljinat dayalı bioink kullanarak bioprinted vardı. Bioinks bir tek adım pasif karıştırma ünitesi üzerinden yazdırmadan önce cellularized. Yapıları düzgün cellularized, yüksek canlılık var ve farklılaşma olumlu işaretleri sergilemek için gösterdi.

Video: Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Density Gradient Multilayered Polymerization (DGMP): A Novel Technique for Creating Multi-compartment, Customizable Scaffolds for Tissue Engineering

Complex tissue culture matrices, in which types and concentrations of biological stimuli (e.g. growth factors, inhibitors, or small molecules) or matrix structure (e.g. composition, concentration, or stiffness of the matrix) vary over space, would enable a wide range of investigations concerning how these variables affect cell differentiation, migration, and other phenomena. The major challenge in creating layered matrices is maintaining the structural integrity of layer interfaces without diffusion of individual components from each layer1. Current methodologies to achieve this include photopatterning2-3, lithography4, sequential functionalization5, freeze drying6, microfluidics7, or centrifugation8, many of which require sophisticated instrumentation and technical skills. Others rely on sequential attachment of individual layers, which may lead to delamination of layers9. 
DGMP overcomes these issues by using an inert density modifier such as iodixanol to create layers of varying densities10. Since the density modifier can be mixed with any prepolymer or bioactive molecule, DGMP allows each scaffold layer to be customized. Simply varying the concentration of the density modifier prevents mixing of adjacent layers while they remain aqueous. Subsequent single step polymerization gives rise to a structurally continuous multilayered scaffold, in which each layer has distinct chemical and mechanical properties. The density modifier can be easily removed with sufficient rinsing without perturbation of the individual layers or their components. This technique is therefore well suited for creating hydrogels of various sizes, shapes, and materials.
A protocol for fabricating a 2D-polyethylene glycol (PEG) gel, in which alternating layers incorporate RGDS-350, is outlined below. We use PEG because it is biocompatible and inert. RGDS, a cell adhesion peptide11, is used to demonstrate spatial restriction of a biological cue, and the conjugation of a fluorophore (Alexa Fluor 350) enables us to visually distinguish various layers. This procedure can be adapted for other materials (e.g. collagen, hyaluronan, etc.) and can be extended to fabricate 3D gels with some modifications10.

Density Gradient Multilayered Polymerization DGMP: A Novel Technique for Creating Multi-compartment, Customizable Scaffolds for Tissue Engineering

Here we describe a unique strategy for creating biocompatible, layered matrices with continuous interfaces between distinct layers for tissue engineering. Such a scaffold could provide an ideal customizable environment to modulate cell behavior by various biological, chemical or mechanical cues

Yoğunluk Gradient Katmanlı Polimerizasyonu (DGMP): Multi-bölmesi oluşturma için A Novel Tekniği, Doku Mühendisliği için Özelleştirilebilir İskelesi

Complex tissue culture matrices, in which types and concentrations of biological stimuli (e.g. growth factors, inhibitors, or small molecules) or matrix ...

Biyomühendislik

Skin Tattooing As A Novel Approach For DNA Vaccine Delivery

Nucleic acid-based vaccination is a topic of growing interest, especially plasmid DNA (pDNA) encoding immunologically important antigens. After the engineered pDNA is administered to the vaccines, it is transcribed and translated into immunogen proteins that can elicit responses from the immune system. Many ways of delivering DNA vaccines have been investigated; however each delivery route has its own advantages and pitfalls. Skin tattooing is a novel technique that is safe, cost-effective, and convenient. In addition, the punctures inflicted by the needle could also serve as a potent adjuvant. Here, we a) demonstrate the intradermal delivery of plasmid DNA encoding enhanced green fluorescent protein (pCX-EGFP) in a mouse model using a tattooing device and b) confirm the effective expression of EGFP in the skin cells using confocal microscopy.

Skin tattooing is a potent and safe way to delivery DNA vaccine intradermally. Here, a DNA plasmid encoding EGFP is delivered by tattooing to the skin of a laboratory mouse, and the expression of EGFP in the skin cells is then inspected by confocal microscopy.

Cilt DNA Aşı Teslim İçin Yeni Bir Yaklaşım olarak Dövme

Nucleic acid-based vaccination is a topic of growing interest, especially plasmid DNA (pDNA) encoding immunologically important antigens. After the ...

A Novel Stretching Platform for Applications in Cell and Tissue Mechanobiology

Tools that allow the application of mechanical forces to cells and tissues or that can quantify the mechanical properties of biological tissues have contributed dramatically to the understanding of basic mechanobiology. These techniques have been extensively used to demonstrate how the onset and progression of various diseases are heavily influenced by mechanical cues. This article presents a multi-functional biaxial stretching (BAXS) platform that can either mechanically stimulate single cells or quantify the mechanical stiffness of tissues. The BAXS platform consists of four voice coil motors that can be controlled independently. Single cells can be cultured on a flexible substrate that can be attached to the motors allowing one to expose the cells to complex, dynamic, and spatially varying strain fields. Conversely, by incorporating a force load cell, one can also quantify the mechanical properties of primary tissues as they are exposed to deformation cycles. In both cases, a proper set of clamps must be designed and mounted to the BAXS platform motors in order to firmly hold the flexible substrate or the tissue of interest. The BAXS platform can be mounted on an inverted microscope to perform simultaneous transmitted light and/or fluorescence imaging to examine the structural or biochemical response of the sample during stretching experiments. This article provides experimental details of the design and usage of the BAXS platform and presents results for single cell and whole tissue studies. The BAXS platform was used to measure the deformation of nuclei in single mouse myoblast cells in response to substrate strain and to measure the stiffness of isolated mouse aortas. The BAXS platform is a versatile tool that can be combined with various optical microscopies in order to provide novel mechanobiological insights at the sub-cellular, cellular and whole tissue levels.

We present in this article a novel stretching platform that can be used to investigate single cell responses to complex anisotropic biaxial mechanical deformation and quantify the mechanical properties of biological tissues.

Hücre ve Doku mechanobiology Applications A Novel Germe Platformu

Tools that allow the application of mechanical forces to cells and tissues or that can quantify the mechanical properties of biological tissues have ...

Generation of a Three-dimensional Full Thickness Skin Equivalent and Automated Wounding

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models reflect the human wound situation better than animal models. Although two-dimensional models are widely used to investigate processes such as cellular migration and proliferation, models that are more complex are required to gain a deeper knowledge about wound healing. Besides a suitable model system, the generation of precise and reproducible wounds is crucial to ensure comparable results between different test runs. In this study, the generation of a three-dimensional full thickness skin equivalent to study wound healing is shown. The dermal part of the models is comprised of human dermal fibroblast embedded in a rat-tail collagen type I hydrogel. Following the inoculation with human epidermal keratinocytes and consequent culture at the air-liquid interface, a multilayered epidermis is formed on top of the models. To study the wound healing process, we additionally developed an automated wounding device, which generates standardized wounds in a sterile atmosphere.

The goal of this protocol is to build up a three-dimensional full thickness skin equivalent, which resembles natural skin. With a specifically constructed automated wounding device, precise and reproducible wounds can be generated under maintenance of sterility.

Üç-boyutlu Tam Kalınlığı Deri Üretimi Eşdeğer ve Otomatik Yaralama

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models ...

Bioprinting Cellularized Constructs Using a Tissue-specific Hydrogel Bioink

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as organ replacements for implantation in patients, and also, when created on a smaller size scale as model "organoids" that can be used in in vitro systems for drug and toxicology screening.
Despite development of a wide variety of bioprinting devices, application of bioprinting technology can be limited by the availability of materials that both expedite bioprinting procedures and support cell viability and function by providing tissue-specific cues. Here we describe a versatile hyaluronic acid (HA) and gelatin-based hydrogel system comprised of a multi-crosslinker, 2-stage crosslinking protocol, which can provide tissue specific biochemical signals and mimic the mechanical properties of in vivo tissues. 
Biochemical factors are provided by incorporating tissue-derived extracellular matrix materials, which include potent growth factors. Tissue mechanical properties are controlled combinations of PEG-based crosslinkers with varying molecular weights, geometries (linear or multi-arm), and functional groups to yield extrudable bioinks and final construct shear stiffness values over a wide range (100 Pa to 20 kPa). Using these parameters, hydrogel bioinks were used to bioprint primary liver spheroids in a liver-specific bioink to create in vitro liver constructs with high cell viability and measurable functional albumin and urea output. This methodology provides a general framework that can be adapted for future customization of hydrogels for biofabrication of a wide range of tissue construct types.

We describe a set of protocols that together provide a tissue-mimicking hydrogel bioink with which functional and viable 3-D tissue constructs can be bioprinted for use in in vitro screening applications.

Bioprinting cellularized dokuya özel Hidrojel Bioink kullanılarak dahil edilmesi

Bioprinting has emerged as a versatile biofabrication approach for creating tissue engineered organ constructs. These constructs have potential use as ...

Automated Robotic Dispensing Technique for Surface Guidance and Bioprinting of Cells

This manuscript describes the introduction of cell guidance features followed by the direct delivery of cells to these features in a hydrogel bioink using an automated robotic dispensing system. The particular bioink was selected as it allows cells to sediment towards and sense the features. The dispensing system bioprints viable cells in hydrogel bioinks using a backpressure assisted print head. However, by replacing the print head with a sharpened stylus or scalpel, the dispensing system can also be employed to create topographical cues through surface etching. The stylus movement can be programmed in steps of 10 &#181;m in the X, Y and Z directions. The patterned grooves were able to orientate mesenchymal stem cells, influencing them to adopt an elongated morphology in alignment with the grooves&#39; direction. The patterning could be designed using plotting software in straight lines, concentric circles, and sinusoidal waves. In a subsequent procedure, fibroblasts and mesenchymal stem cells were suspended in a 2% gelatin bioink, for bioprinting in a backpressure driven extrusion printhead. The cell bearing bioink was then printed using the same programmed coordinates used for the etching. The bioprinted cells were able to sense and react to the etched features as demonstrated by their elongated orientation along the direction of the etched grooves.

This protocol describes a bioprinting methodology using an automated robotic depositing system that incorporates etched topographical guidance cues with the precision deposition of a cell bearing hydrogel bioink. The printed cells are directly delivered to the etched features and are able to sense and orientate with them.

Hücre Yüzey Rehberlik ve Bioprinting için Otomatik Robotik Dağıtım Tekniği

This manuscript describes the introduction of cell guidance features followed by the direct delivery of cells to these features in a hydrogel bioink using ...

A Novel Technique for Generating and Observing Chemiluminescence in a Biological Setting

Intraoperative imaging techniques have the potential to make surgical interventions safer and more effective; for these reasons, such techniques are quickly moving into the operating room. Here, we present a new approach that utilizes a technique not yet explored for intraoperative imaging: chemiluminescent imaging. This method employs a ruthenium-based chemiluminescent reporter along with a custom-built nebulizing system to produce ex vivo or in vivo images with high signal-to-noise ratios. The ruthenium-based reporter produces light following exposure to an aqueous oxidizing solution and re-reduction within the surrounding tissue. This method has allowed us to detect reporter concentrations as low as 6.9 pmol/cm2. In this work, we present a visual guide to our proof-of-concept in vivo studies involving subdermal and intravenous injections in mice. The results suggest that this technology is a promising candidate for further preclinical research and might ultimately become a useful tool in the operating room.

This protocol describes a new intraoperative imaging technique that uses a ruthenium complex as a source of chemiluminescent light emission, thereby producing high signal-to-noise ratios during in vivo imaging. Intraoperative imaging is an expanding field that could revolutionize the way that surgical procedures are performed.

Biyolojik ortamda oluşturuluyor ve Gözlem Kemilüminesans için Yeni Bir Teknik

Intraoperative imaging techniques have the potential to make surgical interventions safer and more effective; for these reasons, such techniques are ...

A Novel Tenorrhaphy Suture Technique with Tissue Engineered Collagen Graft to Repair Large Tendon Defects

Surgical management of large tendon defects with tendon grafts is challenging, as there are a finite number of sites where donors can be readily identified and used. Currently, this gap is filled with tendon auto-, allo-, xeno-, or artificial grafts, but clinical methods to secure them are not necessarily translatable to animals because of the scale. In order to evaluate new biomaterials or study a tendon graft made up of collagen type 1, we have developed a modified suture technique to help maintain the engineered tendon in alignment with the tendon ends. Mechanical properties of these grafts are inferior to the native tendon. To incorporate engineered tendon into clinically relevant models of loaded repair, a strategy was adopted to offload the tissue engineered tendon graft and allow for the maturation and integration of the engineered tendon in vivo until a mechanically sound neo-tendon was formed. We describe this technique using incorporation of the collagen type 1 tissue engineered tendon construct.

In this paper, we present an in vitro and in situ protocol to repair a tendon gap of up to 1.5 cm by filling it with engineered collagen graft. This was performed by developing a modified suture technique to take the mechanical load until the graft matures into the host tissue.

Büyük Tendon Kusurlarını Onarmak İçin Doku Mühendisliği Kollajen Greftli Yeni Bir Tenorhaphy Dikiş Tekniği

Surgical management of large tendon defects with tendon grafts is challenging, as there are a finite number of sites where donors can be readily ...

Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary complications. However, islet transplantation still has several limitations such as the low viability of transplanted islets due to poor islet engraftment and hostile environments. In addition, the insulin-producing cells differentiated from human pluripotent stem cells have limited ability to secrete sufficient hormones that can regulate the blood glucose level; therefore, improving the maturation by culturing cells with proper microenvironmental cues is strongly required. In this article, we elucidate protocols for preparing a pancreatic tissue-derived decellularized extracellular matrix (pdECM) bioink to provide a beneficial microenvironment that can increase glucose sensitivity of pancreatic islets, followed by describing the processes for generating 3D pancreatic tissue constructs using a microextrusion-based bioprinting technique.

Decellularized extracellular matrix (dECM) can provide suitable microenvironmental cues to recapitulate the inherent functions of target tissues in an engineered construct. This article elucidates the protocols for the decellularization of pancreatic tissue, evaluation of pancreatic tissue-derived dECM bioink, and generation of 3D pancreatic tissue constructs using a bioprinting technique.

3D Hücre Yüklü Pankreas Dokusu Yapıları Baskı için Pankreas Doku Türetilmiş Ekstrasellüler Matrix Bioink

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...

Using Multilayered Hydrogel Bioink in Three-Dimensional Bioprinting for Homogeneous Cell Distribution

During the extrusion-based three-dimensional bioprinting process, liquid-like bioinks with low viscosity can protect cells from membrane damage induced by shear stress and improve the survival of the encapsulated cells. However, rapid gravity-driven cell sedimentation in the reservoir could lead to an inhomogeneous cell distribution in bioprinted structures and therefore hinder the application of liquid-like bioinks. Here, we developed a novel multilayered modified strategy for liquid-like bioinks (e.g., gelatin methacryloyl with low viscosity) to prevent the sedimentation of encapsulated cells. Multiple liquid interfaces were manipulated in the multilayered bioink to provide interfacial retention. Consequently, the cell sedimentation action going across adjacent layers in the multilayered system was retarded in the bioink reservoir. It was found that the interfacial retention was much higher than the sedimental pull of cells, demonstrating a critical role of the interfacial retention in preventing cell sedimentation and promoting a more homogeneous dispersion of cells in the multilayered bioink.

Here, we developed a novel multilayered modified strategy for liquid-like bioinks (gelatin methacryloyl with low viscosity) to prevent the sedimentation of encapsulated cells.

Homojen Hücre Dağılımı için Üç Boyutlu Biyobaskıda Çok Katmanlı Hidrojel Bioink'in Kullanılması

During the extrusion-based three-dimensional bioprinting process, liquid-like bioinks with low viscosity can protect cells from membrane damage induced by ...