Bu araştırma Doğa Bilimleri ve mühendislik Araştırma Konseyi Kanada (PBS için 05239), Kanada Vakfı tarafından desteklenmiştir yenilik/Ontario Araştırma Fonu (PBS için) prostat kanseri Vakfı - babama (PBS) ve Ontario Telus gezintiye mücadele Yüksek Lisans Burs (Y.J.C. ve NS).

1. Polimeraz zincir tepkimesi (PCR)-site yönettiği mutagenesis Cys birleşme bir bakteriyel evde beslenen hayvan-28a ifade vektör içine aracılı.
<ol><li>260 0,020 (μg/mL) cm -1 ultraviyole (UV) nesli katsayısı kullanarak evde beslenen hayvan-28a vektör (Yani çift iplikçikli DNA) konsantrasyonu belirlemek nm.</li>
	<li>Sentez böyle her Cys mutasyon için tamamlayıcı mutajenik astar bir çift ben) tamamlayıcı ilk Bankası uyuşmazlığı ve 15 nukleotid sonra şablonu için tamamlayıcı önce şablon için en az 15 nükleotit son temel uyumsuzluğu, II) toplam astar uzunluğu 45 nukleotid ve III fazla değil) bir guanin veya sitozin her astar (tablo 1) ilk ve son nükleotit konumunda yer alır. Astar sentez 0.025 μmol ölçek ve kartuş arıtma kullanarak yapılır olun.</li>
	<li>Yüksek sadakat DNA polimeraz, kullanarak iki 20 µL PCR reaksiyon karışımları ayarla: bir ileri astar ve ikinci içeren ters astar içeren. Son 1 x PCR arabellek 1.5 mM MgCl 2, 0.2 mM dNTPs, 0.5 mikron astar, 0.4 μL DMSO, konsantrasyonları içeren her karışım hazırlamak 1,25 ng/μL şablon DNA, 0,02 U/μL yüksek sadakat DNA polimeraz.</li>
	<li>Termal döngüsü bir üç adım iletişim kuralı kullanılarak ayrı karışımları: 30 98 ° C (denaturing) s, 53-56 ° C 30 (TAV), s 30 s kilobase(kb) -1 (uzantısı) şablonunun DNA için 72 ° C. Sıcaklık programı 5 döngüleri için yineleyin ve son 72 ° C uzantısı adım 7.5 dakika süreyle ekleme</li>
	<li>Sonra ilk PCR ile ileriye ve geriye doğru astar ayrı borular içinde ürünler tek tüp (yani 40 μL toplam) içine birleştirmek ve 1.4. adımda açıklandığı gibi aynı Bisiklete binme parametrelerini kullanarak bir ek 20 döngü için PCR reaksiyon devam.</li>
	<li>Electrophorese 15 μL %1 (w/v) özel PCR reaksiyon karışımı jel 0.5 x Tris, Asetik asit, etilen diamin tetra Asetik asit (EDTA) arabellek (TAE) çalıştıran kullanarak. Denetimleri şablon DNA PCR tarafından güçlendirilmiş değil eşit miktarda ve marker bantları hem büyük hem de beklenen PCR ürünü boyutu daha az içeren başvuru DNA merdivenin bir aliquot electrophorese.</li>
	<li>120 V 40 dk Elektroforez sonra suda 0.5 μg/mL arasında etidyum bromür ve sallamak için oda sıcaklığında 30 dk içeren jel daldırın. Tam uzunlukta şablonu güçlendirilmiş mutajenik astar tarafından bir artış güçlendirilmiş grubun denetim şablonu grup UV ışığı altında karşılaştırıldığında göreli etidyum bromür floresan yoğunluğu içinde onaylamak (302 nm).
	<ol><li>Yok amplifikasyon belirgindir, PCR tavlama sıcaklığı arasında 53-56 ° C sıcaklık aralığı 0.5 ° C artışlarla ayarladıktan sonra yineleyin.</li>
	</ol></li> <li>Şablon mutajenik astar tarafından amplifikasyon onayı kalan ~ 25 μL PCR reaksiyon karışımdan metillenmiş şablon DNA sindirmek için DpnI restriksiyon enzimi ile tedavi. DpnI 0.5 µL (10 adet) 1 × DpnI reaksiyon arabellek son bir konsantrasyon başı 25 μL PCR reaksiyon karışımı kullanın. 37 ° C'de 2,5 h için kuluçkaya</li>
	<li>Şablon sindirim, takip Ekle ~ 5-10 μL ısı 100 µL sindirilir karışıma, şok bir 1,75 mL microcentrifuge tüp yetkili DH5α Esherichia coli hücrelerde. Hücre DNA karışımı 60 dakika süreyle buz üzerinde kuluçkaya</li>
	Kuru sıcak blokta <li>ısı şok microcentrifuge tüp 45 için 42 ° C'de hücre DNA karışımı s. 3 dakika buzda karışımı kuluçka sonra oda sıcaklığında Luria-Bertani suyu (LB) 900 μL hücrelere ekleme ve toplam hücre süspansiyon steril 14 mL yuvarlak alt tüp içine transfer.</li>
	<li>Sürekli 190 devir / dakikada sallayarak ile hücre süspansiyon 90 dk 37 ° C'de kuluçkaya.</li>
	<li>Daha sonra geri içine bir 1,75 mL microcentrifuge tüp ve oda sıcaklığında 5 min için 10.000 x g, santrifüj hücre süspansiyon transfer.</li>
	<li>Santrifüjü sonra süpernatant ile 900 μL kaldırmak ve nazik LB. kalan 100 μL içinde pipetting tarafından bakteri hücreleri resuspend</li>
	<li>Sonuç konsantre hücre süspansiyon ifade vektör (Yani 60 μg/mLKanamycin) için seçici olan antibiyotik içeren bir LB-agar plaka üzerine aktarın. Aseptik süspansiyon agar plaka üzerinde eşit olarak yayılmış ve ~ 16 h 37 için kuluçkaya ° C.</li>
	<li>Ertesi gün 5 mL sıvı lb antiobiotic seçim basınç (Yani 60 μg/mL sefaloridin) içeren bir koloni plaka aşılamak. Sıvı kültür gecede 37 ° C'de sabit 37, sallayarak ile büyümek ° C.</li>
	<li>İzole ve yayılan plazmid alkalin lizis yordamı 45 üzerinde dayalı bir ticari olarak mevcut kit kullanarak E. coli hücrelerden arındırmak.</li>
	<li>Faiz mutasyon mevcut ve uygun okuma çerçevesi Sanger DNA sıralama plazmid 46 tarafından onaylayın.</li>
</ol> 2. Üniforma 15 BL21 ΔE3 Escherichia coli ifadede N etiketli protein.
 Not: farklı rekombinant proteinler farklı ifade koşulları gerektirir. Aşağıdaki ifade insan STIM1 EFSAM protein için en iyi duruma getirilmiş bir işlemdir.
<ol><li>BL21 ΔE3 kodon (+) ısı şok yetkili hücrelere Cys mutasyonlar (yani evde beslenen hayvan-28a-EFSAM) barındıran ifade vektör dönüştürmek ve plakası 1.9-1.14 adımlarda açıklandığı gibi antibiyotik seçimi basınç içeren LB-agar plakaları) ile değişiklikleri takip: doğrudan plaka ~ 1000 μL toplam hücre süspansiyon microcentrifuge tüp hücrelerde Santrifüjü tarafından konsantre gerek kalmadan LB-agar tabakta dışında 150 μL aliquot.</li>
	<li>Ertesi gün, aseptik aktarım bir koloni 200 mL Erlenmeyer lb uygun antibiyotik (Yani 60 μg/mL sefaloridin için evde beslenen hayvan-28a-EFSAM) ile takıma 20 mL içeren şişesi içine. Bu sıvı starter kültür gecede (yani ~ 16 h) 37 ° c de sabit sallayarak ile büyümek ~ 190 rpm.</li>
	<li>Adım 2.2 olarak aynı gün, M9 hazırlamak için 15 protein N etiketli ifade ısıyla tarafından orta M9 1 litre arabellek tuzları (42 mM Na 2 HPO 4, 22 mM KH 2 PO 4, 8,6 mM NaCl, pH 7,4) bir 4 L Erlenmeyer şişesi. Serin bir kez, %20 (w/v) D-glikoz, 1 M CaCl 2, 1 M Tiamin, 1 M MgSO 4, 1 mg/mL biotin ve 0.2 g/mL 15 N-NH 4 Cl karışımı içine 1 L steril M9 tuz solüsyonu 0,2 mikron steril enjektör filtre aracılığıyla filtre böylece Bu bileşenler son konsantrasyonları vardır %0,2 (w/v) D-glikoz, 100 mikron CaCl 2, 50 mikron Tiamin, 1 mM MgSO 4, 1 μg/mL biotin ve 1 mg/mL 15 N-NH 4 CL</li>
	<li>Ertesi gün, aseptik 20 mL gecede sıvı starter kültür 50 mL steril konik tüp ve santrifüj 2.400 × g hücreleri cips için 15 dakika için de içine transfer.</li>
	<li>Elde edilen hücre Pelet M9 en az orta 10 ml LB orta decanting sonra resuspend ve resuspended Pelet karışımı içine 1 L M9 en az orta antibiyotik (Yani 60 μg/mL sefaloridin) ile transfer.</li>
	<li>~0.6-0,8 M9 en az orta bakteriyel starter kültür 37 ° C ve 600 nm (OD600) ulaştığı, optik yoğunluk kadar sallayarak ~ 190 rpm sabit içeren 1 litre büyümek.</li>
	<li>Specfified OD600 aralığı ulaşıldığında, izopropil β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) protein ifade ikna etmek için 200 mikron ekleyin.</li>
	<li>~ 16 h (Yani gece) ~ 190 rpm sabit sallayarak ile ortam sıcaklığı protein ifade için hücreleri kuluçka IPTG eklenmesinden sonra devam.</li>
	<li>Ertesi gün aralıklarla ~ 10.000 × g, 4 ° C'de 30 dakika süreyle, bakterilerin hasat</li>
	<li>LB dikkatle boşaltmak ve hücre Pelet 50 mL konik tüp içine aktarın. -80 ° C'de Pelet arıtma kadar mağaza.</li>
</ol> 3. E. coli rekombinant protein saflaştırma.
 Not: farklı rekombinant proteinler ayrı arıtma yordamlar gerektirir. İletişim kuralı için 6 ve #215 aşağıdadır; O'nun öğesini EFSAM arıtma dahil--dan evde beslenen hayvan-28a yapı ifade organları.
<ol><li>El ile 6 M guanidin-HCl, 20 mM Tris-HCl (pH 8) içinde donmuş bakteri hücre Pelet homojenize ve 5 mM β-mercaptoethanol motorlu 10 mL transfer pipet kullanarak. Guanidin-HCl 5 mL ıslak cep Pelet bu adım için de başına yaklaşık 40 mL ekleyin.</li>
	<li>Aşağıdaki bir 90 dk kuluçka hibridizasyon fırında sürekli rotasyon ile ortam sıcaklığı, santrifüj kapasitesi ~ 15.000 × g, çözünür protein çözünmez hücre artıkları (Yani pelet) ayırmak 40 dk 8 ° C karisimin karışımı (yani süpernatant).</li>
	<li>(V/v) Ni 2 + % 50 µL eklemek 750-nitrilotriacetic asit özel boncuk lysate Bulamaç için açıklık ve inversiyon hibridizasyon fırında ile oda sıcaklığında başka bir 90 dakika için kuluçkaya.</li>
	<li>Daha sonra bağlı Ni 2 + için özel boncuk bir yerçekimi akışı protein arıtma sütununda toplayarak 6 × O'nun öğesini protein yakalamak. Lysate üzerinden tamamen 3.5 adıma geçmeden önce sütun akmaya izin.</li>
	<li>10 mL 6 M üre, 20 mM Tris-HCl pH 8 ve 5 mM β-mercaptoethanol ile üç kez toplanan boncuk yıkayın. Tüm 10 mL sütunun sonraki her 10 mL önce geçer emin olmak yıkama</li>
	<li>Elute 2 mL kesirler 6 M üre, 20 mM Tris-HCl pH 8, kullanarak bir dizi proteinler 300 mM imidazole ve 5 mM β-mercaptoethanol 90 s kuluçka süresi arasında kesirler ile. Tüm 2 mL sütun her sonraki elüsyon adım önce geçtiği olun.</li>
	<li>Bu aşamada faiz protein Laemmli 47 yöntemini kullanarak Coomassie mavi lekeli Sodyum Lauryl Sülfat polyacrylamide Jel Elektroforez (SDS-sayfa) tarafından eluted kesirler mevcut olduğunu onaylayın. Protein boyutu, miktarı ve saflık bir karşılaştırma her ikisi de olan standart molekül ağırlığı marker bantları karşı değerlendirmek daha az ve beklenen molekül ağırlığı daha büyük ilgi proteinin.</li>
	<li>Diyaliz membran 3.500 Da Moleküler ağırlığı kesme içine eluted protein kesirler havuz ve 1 L refolding tampon (20 mM Tris, 300 mM NaCl, 1 mM DTT, 5 mM CaCl 2, pH 8) 4 ° C'de kuluçkaya arabellek magneti tarafından karıştırılır iken bir gecede c karıştırıcı.</li>
	<li>~ 16 h refolding zaman, sonra ~ 1 U Trombin mg protein doğrudan diyaliz çanta için ücret ekleyin ve ek ~ 24 h için 4 ° C'de kuluçkaya</li>
	<li>6 × ölçüde onun etiketi bölünme hangi polyacrylamide kullanarak jelleri (SDS-sayfa) denaturing electrophoresed önce ve sonra kuluçka Trombin ile diyaliz çantasından alınan ~ 15 μL protein aliquots, Coomassie-mavi boyama doğrulayın Laemmli 47 yöntemi. Cleaved 6 × molekül ağırlığı için onun etiketi karşılık gelen göç ~ 2 kDa vardiyada gözlem yapılırsa, 3.11 adıma geçer; Coomassie-mavi boyama tarafından algılanabilir bir kısmını sindirilmemiş protein kalıntıları, ~0.2 U Trombin mg protein başına doğrudan diyaliz çanta ekleyin ve ek ~ 24 h için 4 ° C'de kuluçkaya</li>
	<li>Kullanımı daha fazla protein arındırmak boyutu dışlama veya iyon Kromatografi. İçin anyon Satım Kromatografi, EFSAM protein çözüm diyaliz çanta ve konsantre kaldırmak ~ 10 kat Ultrafiltrasyon santrifüj yoğunlaştırıcı bir 10.000 Da molekül ağırlığı ile kesme kullanarak. Daha sonra çözüm yeniden seyreltik ~ 20-fold NaCl ücretsiz tampon (20 mM Tris, 5 mM CaCl 2, 1 mM DTT, pH 8).</li>
	<li>Prepacked anyon Satım sütun 3.11. adımda anlatılan NaCl ücretsiz tampon 10 sütun hacimleri ile equilibrate. Dropwise bir şekilde ve sürekli çözüm sütun çıkmadan streams neden kaçınmak şırınga baskıların sütun ile çözüme iterek hava hava kabarcığı yok içeren bir radarı-kilit şırınga yüklenen arabellek kullanarak equilibrate. Güçlü anyon değiştirici (örneğin kuaterner amonyum fonksiyonel gruplar ile çapraz özel) kullanın.</li>
	<li>NaCl ücretsiz tampon (Adım 3.11) sütuna içine 3.12 adımda anlatıldığı gibi seyreltilmiş protein çözüm yükleyin.</li>
	<li>Elute proteinler arasında bir degrade [yani 0 - %60 (v/v)] NaCl artan arabellek (20 mM Tris, 1 M NaCl, 5 mM CaCl 2, 1 mM DTT, pH 8) iki pompa hızlı protein sıvı Kromatografi (FPLC) sistemi kullanarak. ~1-1.5 mL kesirleri toplamak ve UV 280 nm Absorbans kullanarak protein elüsyon profili izlemek için FPLC sistemi ve bir akış oranı 0.5 mL/dak</li>
	<li>Elüsyon tepeler ve protein saflık Coomassie mavi lekeli SDS-sayfa tarafından Laemmli 47 yöntemini kullanarak jelleri yanı sıra ilgi protein içeren kesirleri tanımlama.</li>
	<li>Havuzu kesirler gösterilen &#62; % 95'i (yani sadece bir tek protein grup Coomassie-mavi jelleri lekeli gösteren kesirler olarak alınan) bir Diyaliz çanta ve deneysel arabellek 3.8 adımda anlatıldığı gibi diyaliz tarafından ilgi Exchange'e.</li>
</ol> 4. Kimyasal bağlanma diyaliz tarafından protein glikoz-5-MTS.
N-(β-D-glucopyranosyl)-n <ol><li>hazırla 55 mM bir hisse senedi çözüm &#39;-[2-methanethiosulfonyl) etil] 10 mg bileşim % 100 (v/v) DMSO 500 μl içinde eriterek tarafından üre (glikoz-5-MTS). Kullanılmayan glikoz-5-MTS-20 DMSO içinde çözündürüldükten saklamak ° C.</li>
	<li>Hazırlama protein örnek değişiklik 1 L içine ~ 60 mikron protein dialyzing 1,5 mL tarafından değişiklik için arabellek 20 mM BEZLERİ, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl 2 ve 0,1 mM TCEP, pH 8.3 uydurdum. Değiştirilen protein boyutundan daha küçük bir Diyaliz membran molekül ağırlığı kesme kullanın (örneğin 3.500 Da kesme ~ 17.500 Da EFSAM için kullanın).</li>
	<li>Sonra 24 h 4 ° C'de microcentrifuge tüpüne diyaliz çantasından örnek aktarın. 2 mM son bir konsantrasyon DMSO çözündürüldükten glikoz-5-MTS ekleyin.</li>
	<li>Örnek, ortam sıcaklığında 1 h için karanlıkta kuluçkaya. 1 h kuluçka döneminde çözüm tüp nazik dokunarak her 10 dk. mix</li>
	<li>Daha sonra yeniden Döviz protein içine adım 4.2 veya santrifüj Ultrafiltrasyon tarafından açıklandığı gibi diyaliz 4 ° C'de tarafından hiçbir indirgeyici içeren son deneysel arabellek. Ultrafiltrasyon yordamı için ~1.5 mL protein örnek için konsantre &#60; 0.5 mL ve daha sonra deneysel arabelleği ile aynı yoğunlaştırıcı sulandırmak. Toplam döviz 30 × 30 × 30 en az olması bu konsantrasyon-seyreltme iki ek kez tekrarlayın 27,000-fold =. EFSAM için 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 5 mM CaCl 2, pH 7.5 deneysel tampon olarak kullanın.</li>
	<li>Örnek diyaliz veya Ultrafiltrasyon değişimi adım 4.2 ve 4.5, sırasıyla, 25 mM amonyum bikarbonat veya 25 mM amonyum asetat açıklandığı gibi electrospray iyonlaşma kütle spektrometresi için hazırlayın. Diyaliz kullanılıyorsa, herhangi bir kalıntı NaCl ve CaCl 2 tuzları kaldırmak için en az üç kez alışverişi sağlamak.</li>
	<li>Belirlemek doğru kitle (yani ± 1 Da) protein electrospray iyonlaşma kullanarak ilgi kütle spektrometresi 48 , 49. Cys thiol 281.3 Da protein eklemek için methanethiosulfonate kimyasal üzerinden her kovalent glikoz katkısı bekliyoruz kitle (yani glikoz-5-MTS için 360.4 Da eklemek ve 2 bırakarak grup böylece sırasında kovalent 79.1 Da CH 3 için çıkarmak ek).</li>
</ol> 5. Çözüm NMR modif değerlendirilmesiication verimliliği ve yapısal tedirginlikler.
<ol><li>Emin olun değiştirilmiş konsantrasyonu protein &#62; glikoz ek ve son arabellek exchange sonra 100 mikron. EFSAM için protein konsantrasyonu 280 UV yok olma katsayısı kullanarak tahmin 1.54 (mg mL - 1) cm - 1 nm.</li>
	<li>Ek protein çözüm 60 mikron ile titremeden ve nabız kalibrasyon ve % 10 (v/v) D 4,4-dimethyl-4-silapentane-1-sulfonic asitin (DSS) 2 O sinyal kilidi için. Yüksek sinyal gürültü kullanımı 600 μL örnekleri için 5 mm NMR frekans eşlemeli tüpler, takılı içine bir çift rezonans HCN kriyojenik sonda ile donatılmış bir en az 600 MHz Spektrometre.</li>
	<li>Daha önce ayrıntılı 50 , 51, sıcaklık, 1 H ve 15 N süpürme genişlikleri, geçici ve artış olarak standart 1 H - 15 N HSQC spectra toplamak belirli örnek için uygun ayarları. EFSAM spectra, kullanımı 20 ° C, 256 1 H geçişler için 64 15 N boyut artışlarla ve 1 H ve 15 N 8.000 ve 1800 Hz olarak ayarlanmasına genişlikleri süpürme.</li>
	<li>Glikozile protein spektrum edinimi ekleyin dithiothreitol (DTT) NMR örnek 15 mM son bir konsantrasyon için 1 M stoktan. DTT disülfür aracılı eki azaltma tarafından protein glikoz yan kaldırır.</li>
	<li>Bir ikinci 1 H - 15 N HSQC glikoz eki tarafından neden değişiklik verimliliği ve yapısal tedirginlikler değerlendirmek için bir başvuru spektrum sağlayan bu azaltılmış/değiştirilmemiş koşullar altında elde.</li>
	<li>Daha önce 52 detaylı olarak NMRPipe kullanarak NMR verileri işlemek. En az işleme veri dönüştürme, aşamalı, solvent bastırma, Fourier dönüşümü ve spectra ürününün ilk görsel öğe içerdiğinden emin olun.</li>
	<li>Değerlendirin değişiklik verimliliği ölçme Amid en yüksek yoğunluklarda ve CARA 53 tarihinde NEASY eklentisi kullanarak değiştirilmiş ve azaltılmış spectra kimyasal shift değerleri tarafından. Glikoz ikisinde bağlı ve spectra azaltılmış Cys Amid en yüksek yoğunluğu değerlendirmek için emin olun. Cys Amid güvenilir bir şekilde her iki spectra bulunamıyor, bir okuma artıkları Cys için bitişik yoğunluklarda kullanın.</li>
	<li>Verimliliği Cys-modified spektrum üzerinden Amid yoğunluğu olarak bölünmüş (yani DTT tedavi) Cys-azaltılmış spektrum üzerinden Amid yoğunluğunu tarafından Calculate 100 ile çarpılır: 
	<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56302/56302eq1.jpg" />, nerede ben M Cys-modified spektrumda Amid yoğunluğunu ve ben R Cys-azaltılmış spektrumda Amid yoğunluğunu. Alternatif olarak, kaba etkinliği birkaç Amid tepeler üzerinde değerlendirmek: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56302/56302eq2.jpg" />, verimliliği i her biri için hesaplanan ayrı ayrı tespit verimliliği nerede kalıntı, ben ve n sayısıdır toplam hesaplamada kullanılan artıkları.</li>
	<li>Kimyasal shift tedirginlikler (CSP) 15 N ve 1 H boyutu her tepe gözlenen ve daha büyük 15 N kimyasal üst karakter aralığı kullanmak için normalize iki spectra kimyasal shift farklılıkları üzerinden hesaplamak Denklem takip: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56302/56302eq3.jpg" />, nerede ΔH proton boyut ppm değişimdir ve ΔN azot boyut ppm değişimdir.</li></ol>

Protein glikozilasyon nerede şekerler kovalent polipeptitler öncelikle amino asit yan zincirlerine bağlantıları aracılığıyla eklenen post-translational bir değişiklik olduğunu. Memeli proteinler en çok % 50'si olan glikozile 54, glikozile proteinler daha sonra biyomoleküler bağlama benzeşme değiştirme gelen etkileri çeşitli bir yelpazede içebileceğiniz, katlama, kanal etkinlik değiştirerek, hedefleme protein etkileyen molekülleri bozulması ve hücresel, devletlerde (33değerlendirme) birkaç isim için. Glikozilasyon memeli Fizyoloji önemli rolü memeli glycan yapıları 33tam çeşitliliği oluşturmak için gelişmiş proteinler birkaç yüz tarafından belirgindir. N- değişmiş ve ile ilişkili O- glikozilasyon desenleri çok sayıda hastalık devletler () artan ve azalan) prostat (artan ve azalan), meme de dahil olmak üzere, karaciğer (artış), yumurtalık (artış), pankreas (artan) ve mide kanserleri (artan) 55. Ayrıca, Tau, huntingtin, glikozilasyon toksisite Alzheimer, Huntington ve Parkinson hastalıkları 56ile ilişkili bu proteinlerin düzenlemek için α-synuclein bulundu ve glikozilasyon doğuştan bozukluk grubu-si olmak be Glikozilasyon 54aracılık enzimler kalıtsal kusur sonucunda tespit edilmiştir. Böylece, glikozilasyon kesin biyofizik, biyokimyasal ve yapısal etkilerini anlama muazzam etkisi protein Yönetmeliği ve sağlık ve hastalık işlevinde anlayışımızı potansiyeline sahiptir.
Memeli glycome içinde bulunan glycan yapılar çeşitliliği yol on şeker yapı taşları fucose, galaktoz, glikoz, N- acetylgalactosamine, N- peptidoglikan, glucuronic asit, iduronic asit, mannoz dahil, sialik asit ve ksiloz 33. N- glikozilasyon kaçınılmaz bir N- peptidoglikan şeker protein doğrudan bağlantılar., O- glikozilasyon--dan birisi- N- acetylgalacotose, N- peptidoglikan, ksiloz, fucose neden, glikoz veya galaktoz kovalent polipeptid için bağlı. Biz bu şekerler hemen protein yüzeye bitişik biyofiziksel ve yapısal özelliklerini nasıl etkilediğini anlamaya başlamak için burada site seçici Cys artıkları ile protein mühendislik thiols şeker eklemek bir yaklaşımı açıklamak sıra. Burada, endogenously glikozile Cys tarafından değiştirilir ve vitro basit bir kimyasal yaklaşım yoluyla değiştirilebilir vardır kalıntıları. Bu şekilde katlanır ve istikrar yanı sıra genel yapısı için toplu değişiklikler yanı sıra belirli her sitede katkısını ve protein işlevi tease için tekli ve çoklu glikozilasyon siteleri tabi.
Son zamanlarda, bu yaklaşım şekilde ayrı ayrı ve üst üste Asn131 ve Asn171 N- glikozilasyon siteleri 42rolünü değerlendirmek için EFSAM ile kullanıldı. Cys mutasyona ve glikoz kovalent eki Asn131 veya Asn171 sitelerine bir azalma Ca2 + bağlama benzeşme ortaya ve istikrar bastırılır. Ne zaman iki site aynı anda glikoz eki, benzeşim bağlama içinde azalır ile modifiye edildi ve istikrar potentiated önde gelen Oligomerizasyonda eğilimi içinde vitrogelişmiş. Yapısal olarak, burada açıklanan yaklaşım Asn131 veya Asn171 değişiklikler karşılıklı SAM etki alanı, hemen EF-el çiftine bitişik bulunan çekirdek α8 sarmal huzursuz gösterdi. Bu yapısal analizi nasıl EF içinde yakınlaşan ve potentiated yapısal değişim için protein glikoz değişiklikler yüzeyi yol expounds-el: SAM arayüzey hangi sonuçta protein oynattığını ve SOCE 42geliştirir.
Nasıl bir yaşam EFSAM yüzeyine yakın etkileri katlama, istikrar ve yapısı, bu yordamı yardım döken ışık kolayca bu site seçici yaklaşım uygulanması daha uzun karbonhidrat acil servise, belirli eklemek için değiştirilmesi sırasında Golgi ve PM orada verilen yerelleştirme (yani farklı olgunluk glikozilasyon Birleşik) olduğunu güvenilir bir kaynak için bu karbonhidrat thiol değişiklik olduğu için ters çevrilebilir kullanarak MTS MTS tercih edilir gibi thiols için bağlayabilirsiniz fonksiyonel grupları içeren bir indirgeyici ve bir başvuru spektrum kolayca elde edilebilir. Bu yaklaşım ayrıca lipitler gibi protein diğer post-translational moieties bağlamak için adapte edilebilir. Aynı zamanda, dikkate alınması gereken bu yaklaşımın bazı sınırlamaları vardır. İlk olarak, mutasyon glikozilasyon sitelerin yapısını, istikrar ve herhangi bir glikoz değişiklik olmadığında da katlanır etkileyebilecek Cys yöntemi kullanır. Benzer şekilde, protein yerli Cys kalıntılarında da glikoz eki glikozile olmayan sitelerde önlemek için mutasyona gerekir. Ayrıca, ek Cys kalıntılarının kez arıtma daha zor hale bakteri nedeniyle Cys crosslinking ve misfolding, dahil vücut oluşumu teşvik etmektedir. Yine de, burada açıklanan bu site seçici Cys-crosslinking yaklaşım belirli glikozilasyon siteleri yüksek düzeyde gerektiren deneylerde yapısal, biyokimya ve biyofizik etkileri dışarı alay kontrollü sağlar homojen protein. Etkileri yapısı üzerinde yerel olmayan Cys artıkları istikrar ve katlama sadece herhangi bir değişiklik bir karşılaştırma için vahşi tipi yokluğunda protein öznitelikleri 42tespit edilebilir. Hangi değişiklik engelleme protein (örneğin Asn-için-Ala) mutant sürümleri hızlı ökaryotik hücrelerde elde işlevsel veriler ile birlikte ele alındığında, şu anda açıklanan yaklaşım protein yapısal mekanizmalarının yeni görüşler ortaya çıkarır yönetmelik translasyonel modifikasyonlar tarafından.

İşletilen kalsiyum (Ca2 +) depolamak girişidir (SOCE) hangi tarafından bağışıklık hücreleri almak Ca2 + sitozol ekstraselüler uzaya üzerinden büyük yol. T lenfositler, plazma zarı (PM) yer alan T hücre reseptör protein tirozin kinaz ( 1,2,3' te gözden) etkinleştirmek antijenleri bağlayın. Bir fosforilasyon çağlayan fosfolifaz-γ (PLCγ) hangi daha sonra diacylglycerol ve inositol 1,4,5-trisphosphate (IP3 membran phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP2) hidroliz aracılık eder aktivasyonu yol açar ). IP3 konsantrasyon degrade acil servis üzerinden aşağı akmaya böylece bu reseptör kanal açma ve Ca2 + izin IP3 için (IP3R) üzerinde reseptörleri endoplazmik retikulum (ER) bağlayan bir küçük diffusible elçisidir Lümen ( 4' te gözden) sitozol için. Reseptör birleştiğinde gr protein ve tirozin kinaz reseptörleri başka bir heyecanlı ve telaşlı hücre türleri sorumlu çeşitli IP3 aynı üretim ve IP3Rs aktivasyonu için sinyal.
Sonlu Ca2 + depolama kapasitesini ER, IP3nedeniyle-aracılı yayın ve sonuç artış sitozolik Ca2 + sadece geçici; Bununla birlikte, bu tükenmesi ER luminal Ca2 + derinden stromal etkileşim molekülü-1 (STIM1), bir tür etkiler-ben transmembran (TM) protein çoğunlukla üzerinde ER membran 5,6,7bulundu. STIM1 bir EF-el çift ve steril α-motifi (EFSAM) oluşan bir Lümen odaklı Ca2 + algılama etki alanı içerir. Üç sitozolik odaklı dolandı-coil etki alanı EFSAM ( 8' gözden) tek TM etki alanı tarafından ayrılır. ER luminal Ca2 + tükenmesi, yapısal düzenlemeler TM ve kıvrılmış-coil etki alanları 10neden bir istikrarsızlık birleştiğinde Oligomerizasyonda 7,9 EFSAM uğrar. Bu yapısal değişiklikler yayınlanmasından sonuçlanan bir bindirme STIM1 ER-PM kavşak 11,12,13,14 PM phosphoinositides 15, ile etkileşimleri aracılığıyla 16 ve Orai1 alt birimleri 17,18. Orai1 forma Ca2 + kanal 19,20,21,22araya PM alt birimleri proteinlerdir. STIM1-Orai1 etkileşimleri ER-PM kavşaklar, Ca2 + yüksek konsantrasyonda üzerinden sitozol içine hareketini sağlayan bir açık Ca2 + aktif yayın Ca2 + (CRAC) kanal uyum kolaylaştırmak Ekstrasellüler boşluk. Bağışıklık hücreleri içinde sürekli sitozolik Ca2 + yükselmeler CRAC kanalları üzerinden Ca2 +- calmodulin/kalsinörin bağımlı dephosphorylation daha sonra çekirdek girer nükleer faktör aktive T-hücrelerinin neden ve T-hücre harekete geçirmek 1,3teşvik genlerin transkripsiyon yönetmelik başlar. Agonist kaynaklı luminal Ca tükenmesi2 + ER via STIM1 23,24 ve elde edilen sürekli sitozolik Ca2 + yükseklik tarafından CRAC kanal etkinleştirme işlemi toplu olarak SOCE 25olarak adlandırılır. SOCE T-hücreleri hayati rol tarafından ağır kombine immün yetmezlik sendromları 3,19,26, STIM1 ve Orai1 kalıtsal mutasyonların neden olabilir gösteren çalışmalar belirgindir 27. EFSAM başlatır SOCE ER luminal Ca2 + tükenmesi kaybı ile Ca2 + koordinasyon kurallı EF-el, sonuçta kendi kendine Derneği istikrarsızlık birleştiğinde 7, önde gelen algılama sonra 28,29.
Glikozilasyon kovalent eki ve işleme oligosakkarit yapıları, olarak da bilinen glukanlardir, ER ve Golgi ( 30,32,33gözden) çeşitli biyosentetik adımlarda var. Glikozilasyon Ökaryotlar iki baskın tür vardır: N-bağlantılı ve O-bağlı, belirli amino asit ve bağlantı köprüleme atom bağlı olarak. N- glikozilasyon, glukanlardir Asn yan zinciri Amid için eklenir ve çoğu durumda, inisiyasyon adım serviste oluşur polipeptid zinciri Lümen 34taşır. Glikoz (Glc), mannoz (adam) ve N- peptidoglikan (GlcNAc) (yani Glc3Man9GlcNAc2) acil servise oluşur On dört-şeker çekirdek yapısı transferini N- glikozilasyon, ilk adımdır membran lipid oligosaccharyltransferase 35,36tarafından. Daha fazla adımlar, bölünme veya glikoz artıkları, transfer gibi acil serviste belirli glycosidases ve glycosyltransferases tarafından katalize. Acil servis bırakın ve Golgi hareket bazı proteinler daha fazla işlenmiş 37olabilir. Glukanlardir, genellikle Ser veya Thr artıkları, yan zinciri hidroksil grubu için ek O- glikozilasyon başvurduğu ve bu değişiklik tamamen Golgi kompleksi 33,34oluşur. Kadar yapılabilir N- peptidoglikan, fucose, galaktoz birkaç O- glycan yapıları ve sialik asit her yaşam ile sırayla 33ekledi.
Hiçbir belirli sıra adl tip-in O- glikozilasyon, için önkoşul olarak tanımlanan süre ortak bir fikir birliği sırası Nile ilişkili olduğu düşünülmektedir-bağlantılı değişiklik: Asn-X-Ser/Thr/nerede X-ebilmek var olmak herhangi bir amino asit Cys, Pro 33. STIM1 EFSAM iki bu fikir birliği N- glikozilasyon sitelerin içerir: Asn131-Trp132-Thr133 ve Asn171-Thr172-Thr173. Gerçekten de, önceki çalışmalar EFSAM N- glikozile 38,39,40,41Asn131 ve Asn171 memeli hücrelerinde olabilir göstermiştir. Ancak, N- glikozilasyon SOCE üzerinde sonuçları önceki çalışmalarda uyumsuz olmuştur, düşündüren bastırılmış, potentiated veya hiçbir etkisi bu translasyonel modifikasyon tarihinde SOCE harekete geçirmek 38, tarafından"xref" = > 39,40,41. Böylece, EFSAM N- glikozilasyon temel biyofiziksel, biyokimyasal ve yapısal sonuçları üzerinde araştırma bu değişiklik düzenleyici etkileri kavrama için hayati önem taşımaktadır. Bu vitro deneyler homojen proteinler yüksek düzeyde gereksinimini nedeniyle kovalent glikoz moieties için EFSAM eklemek için site seçici bir yaklaşım uygulandı. İlginçtir, Asn131 ve Asn171 glikozilasyon içinde EFSAM çekirdek yakınsama ve SOCE STIM1-aracılı 42teşvik biyofiziksel özellikleri geliştirmek yapısal değişiklikler nedeniyle.
Cys thiols kimyasal bağlanma glikosil gruplarının köklü tarafından ilk protein işlevi 43 siteye özgü glikozilasyon etkilerini anlamak için bu enzim-Alerjik yaklaşımın gösterdi seminal bir çalışma oldu , 44. son zamanlarda ve saygı ile STIM1, Asn131 ve Asn171 artıkları için Cys mutasyona uğramış ve glucose-5-(methanethiosulfonate) [glucose-5-(MTS)] kovalent glikoz için ücretsiz thiols 42bağlamak için kullanıldı. Burada, biz sadece mutagenesis site belirli Cys artıkları değişiklik için birleştirmek için kullanır ama çözüm Nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopisi hızla değişiklik verimliliği ve yapısal değerlendirmek için de geçerlidir bu yaklaşım tarif tedirginlikler glikozilasyon bir sonucu olarak. Özellikle, bu genel metodoloji ya O- etkileri çalışmaya kolayca uyarlanabilir veya N- glikozilasyon herhangi recombinantly protein üretilen.

<table><tbody><tr><td>Phusion DNA Polymerase</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F530S</td><td>Use in step 1.3.</td></tr><tr><td>Generuler 1kb DNA Ladder</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>FERSM1163</td><td>Use in step 1.6.</td></tr><tr><td>DpnI Restriction Enzyme</td><td>New England Biolabs, Inc.</td><td>R0176</td><td>Use in step 1.8.</td></tr><tr><td>Presto Mini Plasmid Kit</td><td>GeneAid, Inc.</td><td>PDH300</td><td>Use in step 1.16.</td></tr><tr><td>BL21 DE3 codon (+) E. coli</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td>230280</td><td>Use in step 2.1.</td></tr><tr><td>DH5a E. coli</td><td>Invitrogen, Inc.</td><td>18265017</td><td>Use in step 1.9.</td></tr><tr><td>0.22 mm Syringe Filter</td><td>Millipore, Inc.</td><td>SLGV033RS</td><td>Use in step 2.3.</td></tr><tr><td>HisPur Ni&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;-NTA Agarose Resin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88221</td><td>Use in step 3.3.</td></tr><tr><td>3,500 Da MWCO Dialysis Tubing</td><td>BioDesign, Inc.</td><td>D306</td><td>Use in step 3.8, 3.16, 4.2, 4.5 and 4.6.</td></tr><tr><td>Bovine Thrombin</td><td>BioPharm Laboratories, Inc.</td><td>SKU91-055</td><td>Use in step 3.9.</td></tr><tr><td>5 mL HiTrap Q FF Anion Exchange Column</td><td>GE Healthcare, Inc.</td><td>17-5156-01</td><td>Use in step 3.11.</td></tr><tr><td>Glucose-5-MTS</td><td>Toronto Research Chemicals, Inc.</td><td>G441000</td><td>Use in step 4.1.</td></tr><tr><td>Vivaspin 20 Ultrafiltration Centrifugal Concentrators</td><td>Sartorius, Inc.</td><td>VS2001</td><td>Use in step 3.11, 4.2, 4.5 and 4.6.</td></tr><tr><td>PageRuler Unstained Broad Protein Ladder</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26630</td><td>Use in step 3.7, 3.10 and 3.15</td></tr><tr><td>HiTrap Q FF Anion Exchange Column</td><td>GE Healthcare, Inc.</td><td>17-5053-01</td><td>Use in step 3.12.</td></tr><tr><td>AKTA Pure Fast Protein Liquid Chromatrography System</td><td>GE Healthcare, Inc.</td><td>29018224</td><td>Use in step 3.14.</td></tr><tr><td>600 MHz Varian Inova NMR Spectrometer</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td></td><td>Use in step 5.2 and 5.5.</td></tr></tbody></table>

targeting cysteine thiols for in vitro site-specific glycosylation of recombinant proteins

Stromal etkileşim molekülü-1 (STIM1) bir türüdür-ben transmembran protein bulunan endoplazmik retikulum (ER) ve plazma membran (AM). ER-resident STIM1 am Orai1 kanalları bağışıklık yanıtı sürücüler asıl Ca2 + sinyal gönderme işlemi olan işletilen kalsiyum (Ca2 +) girişi saklamak olarak bilinen bir süreç içinde etkinlik düzenlemektedir. STIM1 Ca2 + algılama etki molekülün içinde iki luminal Asn sitelerdeki post-translational N- glikozilasyon uğrar. Ancak, biyokimya, biyofizik, ve N- glikozile STIM1 yapısı biyolojik etkileri kötü kolaylıkla homojen N- glikozile protein yüksek seviyede elde etmek için son zamanlarda bir yetersizlik nedeniyle kadar anladım. Burada, hangi temel N- glikozilasyon protein yapısı ve etkileri mekanizmasını anlamak için ilgili belirli protein sitelere glikoz moieties verdiği bir vitro kimyasal yaklaşım uygulanması açıklanmaktadır. Çözüm Nükleer manyetik rezonans spektroskopisi kullanılarak değişiklik her iki verimliliğini yanı sıra tek bir örnek glikoz ekli yapısal sonuçlarını değerlendirmek. Bu yaklaşım kolayca doğada bulunan sayısız glikozile proteinler çalışmaya adapte edilebilir.

Bu yaklaşımın ilk adım mutagenesis glikoz-5-MTS EFSAM kullanılarak değiştirilebilir olabilir Cys artıkları için aday glikozilasyon kalıntılarının yok endojen Cys artıkları, hiçbir özel hususlar öncesinde yapılması gereken bu yüzden gerektirir mutagenesis. Ancak, yerel Cys artıkları açıklanan kimya gerçekleştirmeden önce değiştirilebilir sigara artıkları mutasyona gerekir. En az yerli yapı etkisi için protein ilgi bir küresel dizi hizalaması yapmak öneririz ve diğer kalıntıları olan belirleme en sık endojen Cys pozisyon(lar) bulundu. Cys mutasyon doğal olarak diğer canlılar arasında ortaya çıkan bu artıkları için protein yapısı üzerinde en az etkisi olabilir. Endojen Cys kalıntı kesinlikle korunmuş en yapısal Cys benzer Ser mutasyona öneririz. Şekil 1 unamplified şablon evde beslenen hayvan-28a DNA PCR için kullanılan bir denetim miktardan several-fold daha yüksek yoğunluğu gösteren güçlendirilmiş DNA örneği ile PCR reaksiyon başarısını değerlendirmek tipik bir PCR mutagenesis jel gösterir. Şablon DNA sindirim ve E. coli dönüşmenin plazmid onarım için sonraki adımlar içerir. Plazmid yayılmasında sıralama tarafından mutation(s) ile sıvı kültür, plazmid yalıtım ve sonra mutasyona uğramış vektör protein ifade için kullanılabilecek. Şekil 2A EFSAM NaCl konsantrasyonları artan göre anyon Satım sütundan bir tipik elüsyon profilini gösterir. Şekil 2B EFSAM saflığı Coomassie mavi lekeli SDS-sayfa jeller üzerinde gösterir.
Saf protein aldıktan sonra diyaliz adımlar bir dizi ücretsiz thiol ile MTS reaksiyonu ile glikoz yan eklemek için kullanılır. Şekil 3A normal kurulum bir küçük protein biriminin görüntüsünü diyaliz membran membran klipleri mühürlü ve faiz arabellek içeren büyük bir 1 L kabı içinde bulunan gösterir. Değişiklik başarısını ilk denetimini kütle spektrometresi tarafından gerçekleştirilebilir. Şekil 3B tek bir Cys thiol modifiye EFSAM temsilcisi electrospray kütle spektrumu gösterir. Belirli bir protein için protokol kurulması, değişiklik verimliliği ve yapısal tedirginlikler değerlendirildi tek bir düzgün 15N etiketli örnek. 1H -15N-HSQC spektrum öncesi ve sonrası indirgeyici DTT (şekil 4A) eklenmesiyle elde edilir. Değişiklik verimlilik hesaplamaları Protokolü adım 5.8 (şekil 4B) ayrıntılı olarak değiştirilmiş ve azaltılmış spectra Amid en yüksek yoğunluklarda karşılaştırılması yoluyla yapılabilir. Son olarak, ne zaman kimyasal shift atamaları bir protein, yapısal değişiklikler ile hangi ilişkili detaylı içinde adım 5.9 (şekil 4 c) olarak hesaplanabilir CSP'ler için bilinir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56302/56302fig1.jpg"> 
Resim 1: DNA özel jel amplifikasyon onay şablonu vektörünün mutajenik astar ile gösterilen. Görüntü %1.0 (w/v) özel jel (M), DNA işaretçisiyle gösterir vektör kontrolü (VC) ve PCR güçlendirilmiş şablonu (PCR). DNA Elektroforez 120 V 0.5 x TAE tampon 45 dk için ayrılmış. Toplam 0,5 ng VC yüklendi, eşdeğer şablonu miktarında PCR şeride yüklü. Jel 20 dk önce UV ışık altında görselleştirme için etidyum bromür (~0.5 μg/mL) kullanarak lekeli (302 nm). Jel vektör (siyah ok ucu) beklenen boyutunu yakın güçlendirilmiş DNA yüksek düzeyde gösterir. 1000 ve 1500 bp marker bantları arasında büyük olasılıkla çalışan PCR lane ikinci grupta özellikle güçlendirilmiş bir PCR ürünü temsil eder. Güçlendirilmiş DNA yoğunluk düzeyini başarılı kabul edilebilir için VC Yoğunluk düzeyi daha yüksek olması gerekir. Birkaç diğer DNA boyalar etidyum bromür (örneğin bkz: 57) boyama için daha az mutajenik, daha güvenli alternatifler olarak kullanılabilir. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56302/56302fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56302/56302fig2.jpg"> 
Resim 2: Tipik Kromatografik arıtma ve saflık STIM1 EF-SAM için kontrol edin. 
(A) anyon exchange Kromatografi elüsyon profil STIM1 EF-SAM. Sonra el ile bağlama EF-SAM temel pH ve düşük NaCl konsantrasyon bir şırınga ile anyon Satım sütuna (Q FF) ve AKTA FPLC (GE Healthcare) protein NaCl gradyan ile elute için kullanılır. Elüsyon UV 280 nm sinyal 1 M NaCl 0-%60 (v/v) degrade üzerinde kullanarak AKTA tarafından izlenir. (B) Coomassie mavi lekeli SDS-sayfa jöleyi elüsyon kesirler (a). Denaturing protein jel EF-SAM iki büyük tepeler ~ 250 mM ve ~ 450 mM NaCl elutes ortaya koymaktadır. Arıtma Protokolü verimleri &#62; % 95 saf EF-SAM olarak herhangi bir kirletici eksikliği kanıtladığı band Coomassie mavi lekeli jel içinde göstermek yukarıya. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56302/56302fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56302/56302fig3.jpg"> 
Şekil 3: Diyaliz Kur ve doğrulayıcı-in vitro protein glikozilasyon. 
(A) Cys thiol yolu ile MTS reaktivite glikoz vitro eki için kullanılan tipik diyaliz Kur. Görüntü ~1.5 mL karşı arabelleğe alınmış diyaliz boru içinde bulunan protein gösterir ~ 1 L deneysel arabelleği. Arabellek tam exchange emin olmak için sürekli karıştırılır önemlidir. Görüntü dönen heyecan çubukla zarar ve diyaliz torba batan önlemek için aşırı diyaliz boru için kırpılmış bir microcentrifuge tüp gösterir. (B) Electrospray iyonlaşma kütle spektrumu değiştirilmiş Asn171Cys EF-SAM protein. Kütle spektrometresi değiştirme yordamı başarılı olup olmadığını değerlendirmek için uygun ve doğru bir yaklaşımdır. Tipik bir kitle Kromatografik teorik ve ölçülen kitleler, unmodified ve değiştirilmiş Asn171Cys EF-belirtilen SAM ile gösterilir. Çoğunluk örnek kütle ~1.3 Da beklenen teorik kitle glikoz Birleşik Asn171Cys EF-SAM, içinde olan bir makromolekül karşılık gelir. Veri (B) replotted ve 42değiştirilebilir. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56302/56302fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56302/56302fig4.jpg"> 
Şekil 4: Çözüm NMR değişiklik verimliliği ve yapısal tedirginlikler tek bir NMR örnek üzerinden değerlendirilmesi. 
(A) 1 H -15N-HSQC spektral ilişkin bir bindirme glikoz Birleşik Asn131Cys EFSAM (kırmızı crosspeaks) önce ve sonra (siyah crosspeaks) 15 mM DTT eklenmesi. Bindirmeyi açıkça birkaç kalıntı özgü Amid kimyasal shift değişiklikleri her iki protein ve yapısal tedirginlikler modifikasyonu gösterge gösterir. Kırmızı bir kutu Asn131Cys Amid konumunu gösterir. (B) vınlamak görünümü Asn131Cys Amid içeren 1H -15N-HSQC bölgesi. Asn131Cys Amid tepe değiştirilmiş spektrumda (benM) yoğunluğu azaltılmış (değiştirilmemiş) spektrum (benR) yoğunluğu (gösterilen) verimlilik hesaplanması için bölünür. Bir hesaplama ortalama verimlilik birkaç etkilenen kalıntılarının verimlilik hata tahmini dahil olmak üzere, daha iyi bir tahmin sağlar. Ortalama verimlilik Asn131Cys 5 artıkları (yani 129-133) tabanlı EFSAM için gösterilir. (C) NORMALIZED kimyasal shift tedirginlikler Asn131Cys EFSAM protein glikoz konjugasyon neden. Sonra indirgeyici ile ilave sadece en yüksek yoğunluk analizi [ (B)gösterilen] tarafından uygun tahmini değişiklik verimlilik sağlar, ama aynı zamanda veri için sağlar HSQC deneyler kümesi daha önce tek bir örnek ve toplanan değişiklik ile ilişkili yapısal değişiklikler değerlendirilmesi. Glikoz konjugasyon konumu 131 lokalize en büyük tedirginlikler neden olur; Ancak, bu analiz sıra yakınlık gösteren bu analiz değeri, yalnızca dayalı beklenmedik olan tedirginlikler ortaya koymaktadır. (C) veri replotted ve 42değiştirilebilir. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56302/56302fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>STIM1 mutasyonbir</td>
			<td>Yönb</td>
			<td colspan="2">DNA dizisic</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Asn131Cys</td>
			<td>İleri</td>
			<td colspan="2">5'-GTCATCAGAAGTATACTGTTGGACCGTGGATGAGG-3'</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Asn131Cys</td>
			<td>geriye doğru</td>
			<td colspan="2">5'-CCTCATCCACGGTCCAACAGTATACTTCTGATGAC-3'</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Asn171Cys</td>
			<td>İleri</td>
			<td colspan="2">5'-CCAAGGCTGGCTGTCACCTGCACCACCATGACAGGG-3'</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Asn171Cys</td>
			<td>geriye doğru</td>
			<td colspan="2">5'-CCCTGTCATGGTGGTGCAGGTGACAGCCAGCCTTGG-3'</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">bir STIM1 amino asit numaralandırma NCBI katılım AFZ76986.1 dayalı.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">b 'Ters' astar 'İleri' astar geriye doğru tamamlayıcı dizisine karşılık gelir.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">c Altı çizili kodon üçlüsü Cys mutasyon karşılık gelir.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tablo 1. Cys mutagenesis içinde evde beslenen hayvan-28a STIM1 EFSAM Asn için örnek Oligonükleotid (astar) serileri oluşturmak.

Watch this Scientific Journal Video about Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins at JoVE.com

Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins

Sistein Thiols rekombinant proteinler Vitro siteye özgü Glikozilasyon için hedefleme

Biyokimyasal ve yapısal analizleri glikozile proteinlerin homojen örnekleri nispeten büyük miktarda gerektirir. Burada, reaktif Cys thiols hedefleyerek bakterilerden saflaştırılmış rekombinant proteinlerin siteye özgü Glikozilasyon için verimli bir kimyasal yöntem mevcut.

Stromal interaction molecule-1 (STIM1) is a type-I transmembrane protein located on the endoplasmic reticulum (ER) and plasma membranes (PM). ER-resident ...

targeting-cysteine-thiols-for-vitro-site-specific-glycosylation

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins

6.5K Görüntüleme.  University of Western Ontario. Biyokimyasal ve yapısal analizleri glikozile proteinlerin homojen örnekleri nispeten büyük miktarda gerektirir. Burada, reaktif Cys thiols hedefleyerek bakterilerden saflaştırılmış rekombinant proteinlerin siteye özgü Glikozilasyon için verimli bir kimyasal yöntem mevcut.

Video: Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the development of antibody drug conjugates (ADCs) and nanomedicine, fluorescent microscopy and systems chemistry. For many of these applications, specificity of the bioconjugation method used is of prime concern. The Michael addition of maleimides with cysteine(s) on the target proteins is highly selective and proceeds rapidly under mild conditions, making it one of the most popular methods for protein bioconjugation.
We demonstrate here the modification of the only surface-accessible cysteine residue on yeast cytochrome c with a ruthenium(II) bisterpyridine maleimide. The protein bioconjugation is verified by gel electrophoresis and purified by aqueous-based fast protein liquid chromatography in 27% yield of isolated protein material. Structural characterization with MALDI-TOF MS and UV-Vis is then used to verify that the bioconjugation is successful. The protocol shown here is easily applicable to other cysteine - maleimide coupling of proteins to other proteins, dyes, drugs or polymers.

Synthesis of Protein Bioconjugates via Cysteine-maleimide Chemistry

This protocol details the important steps required for the bioconjugation of a cysteine containing protein to a maleimide, including reagent purification, reaction conditions, bioconjugate purification and bioconjugate characterization.

Protein Bioconjugatlar sentezi<em&gt; yoluyla</em&gt; Sistein-maleimid Kimya

The chemical linking or bioconjugation of proteins to fluorescent dyes, drugs, polymers and other proteins has a broad range of applications, such as the ...

Kimya

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of these glycoproteins possess immunoglobulin (Ig) folds and are central to immune recognition and regulation. Here, we present a platform for the design, expression and biophysical characterization of the extracellular domain of human B cell receptor CD22. We propose that these approaches are broadly applicable to the characterization of mammalian glycoprotein ectodomains containing Ig domains. Two suspension human embryonic kidney (HEK) cell lines, HEK293F and HEK293S, are used to express glycoproteins harbouring complex and high-mannose glycans, respectively. These recombinant glycoproteins with different glycoforms allow investigating the effect of glycan size and composition on ligand binding. We discuss protocols for studying the kinetics and thermodynamics of glycoprotein binding to biologically relevant ligands and therapeutic antibody candidates. Recombinant glycoproteins produced in HEK293S cells are amenable to crystallization due to glycan homogeneity, reduced flexibility and susceptibility to endoglycosidase H treatment. We present methods for soaking glycoprotein crystals with heavy atoms and small molecules for phase determination and analysis of ligand binding, respectively. The experimental protocols discussed here hold promise for the characterization of mammalian glycoproteins to give insight into their function and investigate the mechanism of action of therapeutics.

We present approaches for the biophysical and structural characterization of glycoproteins with the immunoglobulin fold by biolayer interferometry, isothermal titration calorimetry, and X-ray crystallography.

X-ışını kristalografisi ve biyofiziksel teknikleri immünglobulin katlanmış glikoproteinlerin karakterizasyonu

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Biyokimya

Analysis of the Solvent Accessibility of Cysteine Residues on Maize rayado fino virus Virus-like Particles Produced in Nicotiana benthamiana Plants and Cross-linking of Peptides to VLPs

Mimicking and exploiting virus properties and physicochemical and physical characteristics holds promise to provide solutions to some of the world's most pressing challenges. The sheer range and types of viruses coupled with their intriguing properties potentially give endless opportunities for applications in virus-based technologies. Viruses have the ability to self- assemble into particles with discrete shape and size, specificity of symmetry, polyvalence, and stable properties under a wide range of temperature and pH conditions. Not surprisingly, with such a remarkable range of properties, viruses are proposed for use in biomaterials 9, vaccines 14, 15, electronic materials, chemical tools, and molecular electronic containers4, 5, 10, 11, 16, 18, 12.
In order to utilize viruses in nanotechnology, they must be modified from their natural forms to impart new functions. This challenging process can be performed through several mechanisms including genetic modification of the viral genome and chemically attaching foreign or desired molecules to the virus particle reactive groups 8. The ability to modify a virus primarily depends upon the physiochemical and physical properties of the virus. In addition, the genetic or physiochemical modifications need to be performed without adversely affecting the virus native structure and virus function. Maize rayado fino virus (MRFV) coat proteins self-assemble in Escherichia coli producing stable and empty VLPs that are stabilized by protein-protein interactions and that can be used in virus-based technologies applications 8. VLPs produced in tobacco plants were examined as a scaffold on which a variety of peptides can be covalently displayed 13. Here, we describe the steps to 1) determine which of the solvent-accessible cysteines in a virus capsid are available for modification, and 2) bioconjugate peptides to the modified capsids. By using native or mutationally-inserted amino acid residues and standard coupling technologies, a wide variety of materials have been displayed on the surface of plant viruses such as, Brome mosaic virus 3, Carnation mottle virus 12, Cowpea chlorotic mottle virus 6, Tobacco mosaic virus 17, Turnip yellow mosaic virus 1, and MRFV 13.

Analysis of the Solvent Accessibility of Cysteine Residues on Maize rayado fino virus Virus-like Particles Produced in Nicotiana benthamiana Plants and Cross-linking of Peptides to VLPs

A method to analyze the solvent accessibility of the thiol group of cysteine residues of Maize rayado fino virus (MRFV)-virus-like particles (VLPs) followed by a peptide cross-linking reaction is described. The method takes advantage of the availability of several chemical groups on the surface of the VLPs that can be targets for specific reactions.

Sistein Kalıntılarının Solvent Erişilebilirlik Analizi<em&gt; Mısır rayado fino virüsü</emÜretilen&gt; Virüs gibi parçacıklar<em&gt; Nicotiana benthamiana</emVLP&#39;ler için Peptidlerin&gt; Bitkiler ve Çapraz bağlama

Mimicking  and exploiting virus properties and physicochemical and physical  characteristics holds promise to provide solutions to some of  the world's ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Synthesis and Bioconjugation of Thiol-Reactive Reagents for the Creation of Site-Selectively Modified Immunoconjugates

Maleimide-bearing bifunctional probes have been employed for decades for the site-selective modification of thiols in biomolecules, especially antibodies. Yet maleimide-based conjugates display limited stability in vivo because the succinimidyl thioether linkage can undergo a retro-Michael reaction. This, of course, can lead to the release of the radioactive payload or its exchange with thiol-bearing biomolecules in circulation. Both of these processes can produce elevated activity concentrations in healthy organs as well as decreased activity concentrations in target tissues, resulting in reduced imaging contrast and lower therapeutic ratios. In 2018, we reported the creation of a modular, stable, and easily accessible phenyloxadiazolyl methyl sulfone reagent &#8212; dubbed &#8216;PODS&#8217; &#8212; as a platform for thiol-based bioconjugations. We have clearly demonstrated that PODS-based site-selective bioconjugations reproducibly and robustly create homogenous, well-defined, highly immunoreactive, and highly stable radioimmunoconjugates. Furthermore, preclinical experiments in murine models of colorectal cancer have shown that these site-selectively labeled radioimmunoconjugates exhibit far superior in vivo performance compared to radiolabeled antibodies synthesized via maleimide-based conjugations. In this protocol, we will describe the four-step synthesis of PODS, the creation of a bifunctional PODS-bearing variant of the ubiquitous chelator DOTA (PODS-DOTA), and the conjugation of PODS-DOTA to the HER2-targeting antibody trastuzumab.

In this protocol, we will describe the synthesis of PODS, a phenyoxadiazolyl methyl sulfone-based reagent for the site-selective attachment of cargos to the thiols of biomolecules, particularly antibodies. In addition, we will describe the synthesis and characterization of a PODS-bearing bifunctional chelator and its conjugation to a model antibody.

Sentez ve Site seçici olarak oluşturulması için Thiol reaktif reaktif Bioconjugation Immunoconjugates modifiye

Maleimide-bearing bifunctional probes have been employed for decades for the site-selective modification of thiols in biomolecules, especially antibodies. ...

Preparation of Site-Specific Cytotoxic Protein Conjugates via Maleimide-thiol Chemistry and Sortase A-Mediated Ligation

Cancer is currently the second most common cause of death worldwide. The hallmark of cancer cells is the presence of specific marker proteins such as growth factor receptors on their surface. This feature enables development of highly selective therapeutics, the protein bioconjugates, composed of targeting proteins (antibodies or receptor ligands) connected to highly cytotoxic drugs by a specific linker. Due to very high affinity and selectivity of targeting proteins the bioconjugates recognize marker proteins on the cancer cells surface and utilize receptor-mediated endocytosis to reach the cell interior. Intracellular vesicular transport system ultimately delivers the bioconjugates to the lysosomes, where proteolysis separates free cytotoxic drugs from the proteinaceous core of the bioconjugates, triggering drug-dependent cancer cell death. Currently, there are several protein bioconjugates approved for cancer treatment and large number is under development or clinical trials.
One of the main challenges in the generation of the bioconjugates is a site-specific attachment of the cytotoxic drug to the targeting protein. Recent years have brought a tremendous progress in the development of chemical and enzymatic strategies for protein modification with cytotoxic drugs. Here we present the detailed protocols for the site-specific incorporation of cytotoxic warheads into targeting proteins using a chemical method employing maleimide-thiol chemistry and an enzymatic approach that relies on sortase A-mediated ligation. We use engineered variant of fibroblast growth factor 2 and fragment crystallizable region of human immunoglobulin G as an exemplary targeting proteins and monomethyl auristatin E and methotrexate as model cytotoxic drugs. All the described strategies allow for highly efficient generation of biologically active cytotoxic conjugates of defined molecular architecture with potential for selective treatment of diverse cancers.

Here we provide detailed protocols for a site-specific labeling of proteins with cytotoxic drugs using maleimide-thiol reaction and sortase A-mediated ligation.

Cancer is currently the second most common cause of death worldwide. The hallmark of cancer cells is the presence of specific marker proteins such as ...

Resin-Assisted Capture Coupled with Isobaric Tandem Mass Tag Labeling for Multiplexed Quantification of Protein Thiol Oxidation

Reversible oxidative modifications on protein thiols have recently emerged as important mediators of cellular function. Herein we describe the detailed procedure of a quantitative redox proteomics method that utilizes resin-assisted capture (RAC) in combination with tandem mass tag (TMT) isobaric labeling and liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) to allow multiplexed stochiometric quantification of oxidized protein thiols at the proteome level. The site-specific quantitative information on oxidized cysteine residues provides additional insight into the functional impacts of such modifications. 
The workflow is adaptable across many sample types, including cultured cells (e.g., mammalian, prokaryotic) and whole tissues (e.g., heart, lung, muscle), which are initially lysed/homogenized and with free thiols being alkylated to prevent artificial oxidation. The oxidized protein thiols are then reduced and captured by a thiol-affinity resin, which streamlines and simplifies the workflow steps by allowing the proceeding digestion, labeling, and washing procedures to be performed without additional transfer of proteins/peptides. Finally, the labeled peptides are eluted and analyzed by LC-MS/MS to reveal comprehensive stoichiometric changes related to thiol oxidation across the entire proteome. This method greatly improves the understanding of the role of redox-dependent regulation under physiological and pathophysiological states related to protein thiol oxidation.

Protein thiol oxidation has significant implications under normal physiological and pathophysiological conditions. We describe the details of a quantitative redox proteomics method, which utilizes resin-assisted capture, isobaric labeling, and mass spectrometry, enabling site-specific identification and quantification of reversibly oxidized cysteine residues of proteins.

Reçine Destekli Yakalama, Protein Thiol Oksidasyonunun Çoklanmış Niceliği için İzobarik Tandem Kütle Etiketi Etiketleme ile Birleştirildiğinde

Reversible oxidative modifications on protein thiols have recently emerged as important mediators of cellular function. Herein we describe the detailed ...

Nonspecific Proteolysis-Based Glycomics Strategy for Bacterial Glycoproteins

Protein glycosylation is one of the most common and complex post-translational modifications. Many techniques have been developed to characterize the specific roles of glycans, the relationship between their structures and their impact on the functions of proteins. A common method for glycan analysis is to employ exoglycosidase cleavage to release N-linked glycans from glycoproteins or glycopeptides using Peptide-N-Glycosidase F (PNGase F). However, the glycan-protein linkages in bacteria are different and there is no enzyme available to release glycans from bacterial glycoproteins. In addition, free glycans have also been described in mammalian cells, bacteria, yeast, plants, and fish. In this article, we present a method that can characterize the N-linked glycosylation system in Campylobacter jejuni by detecting asparagine (Asn)-linked and free glycans that are not attached to their target proteins. In this method, total proteins from C. jejuni were digested by Pronase E with a higher enzyme to protein ratio (2:1&#8722;3:1) and a longer incubation time (48&#8722;72 h). The resulted Asn-glycans and free glycans were then purified using porous graphitic carbon cartridges, permethylated, and analyzed by mass spectrometry.

This study presents a method for glycomics analysis of glycoproteins by a combination of pronase E digestion, permethylation, and mass spectrometry analysis. This method is capable of analyzing all types of N-linked glycans, including bacterial N-glycans.

Protein glycosylation is one of the most common and complex post-translational modifications. Many techniques have been developed to characterize the ...

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane proteins including ion channels2, ion pumps3, and transporters4. Recent developments have combined site-specific fluorophore labeling alongside TEVC to 
concurrently examine the conformational dynamics at specific residues and function of these proteins on the surface of single cells.
We will describe a method to study the conformational dynamics of membrane proteins by simultaneously monitoring fluorescence and current changes using voltage-clamp fluorometry. This approach can be used to examine the molecular motion of membrane proteins site-specifically following cysteine replacement and site-directed fluorophore labeling5,6. Furthermore, this method provides an approach to determine distance constraints between specific residues7,8. 
This is achieved by selectively attaching donor and acceptor fluorophores to two mutated cysteine residues of interest.
In brief, these experiments are performed following functional expression of the desired protein on the surface of Xenopus leavis oocytes. The large surface area of these oocytes enables facile functional measurements and a robust fluorescence signal5. It is also possible to readily change the extracellular conditions such as pH, ligand or cations/anions, which can provide further information on the mechanism of membrane proteins4. Finally, recent developments 
have also enabled the manipulation of select internal ions following co-expression with a second protein9.
Our protocol is described in multiple parts. First, cysteine scanning mutagenesis proceeded by fluorophore labeling is completed at residues located at the interface of the transmembrane and extracellular domains. Subsequent experiments are designed to identify residues which demonstrate large changes in fluorescence intensity (&lt;5%)3 upon a conformational change of the protein. Second, these changes in fluorescence intensity are compared to the kinetic parameters of 
the membrane protein in order to correlate the conformational dynamics to the function of the protein10. This enables a rigorous biophysical analysis of the molecular motion of the target protein. Lastly, two residues of the holoenzyme can be labeled with a donor and acceptor fluorophore in order to determine distance constraints using donor photodestruction methods. It is also possible to monitor the relative movement of protein subunits following labeling with a donor and acceptor fluorophore.

Examining the Conformational Dynamics of Membrane Proteins in situ with Site-directed Fluorescence Labeling

We will describe a method which measures the kinetics of ion transport of membrane proteins alongside site-specific analysis of conformational changes using fluorescence on single cells. This technique is adaptable to ion channels, transporters and ion pumps and can be utilized to determine distance constraints between protein subunits.

Membran Proteinleri Konformasyonel Dynamics incelenmesi In situ Site Floresan Etiketleme

Two electrode voltage clamp electrophysiology (TEVC) is a powerful tool to investigate the mechanism of ion transport1 for a wide variety of membrane ...

Biyoloji

Homogeneous Glycoconjugate Produced by Combined Unnatural Amino Acid Incorporation and Click-Chemistry for Vaccine Purposes

Genetic code expansion is a powerful tool to introduce unnatural amino acids (UAAs) into proteins to modify their characteristics, to study or create new protein functions or to have access to protein conjugates. Stop codon suppression, in particular amber codon suppression, has emerged as the most popular method to genetically introduce UAAs at defined positions. This methodology is herein applied to the preparation of a carrier protein containing an UAA harboring a bioorthogonal functional group. This reactive handle can next be used to specifically and efficiently graft a synthetic oligosaccharide hapten to provide a homogeneous glycoconjugate vaccine. The protocol is limited to the synthesis of glycoconjugates in a 1:1 carbohydrate hapten/carrier protein ratio but amenable to numerous pairs of biorthogonal functional groups. Glycococonjugate vaccine homogeneity is an important criterion to ensure complete physico-chemical characterization, thereby, satisfying more and more demanding drug regulatory agency recommendations, a criterion which is unmet by classical conjugation strategies. Moreover, this protocol makes it possible to finely tune the structure of the actual conjugate vaccine, giving rise to tools to address structure-immunogenicity relationships.

Genetic code expansion is applied for the introduction of an unnatural amino acid bearing a biorthogonal functional group on a carrier protein at a defined site. The biorthogonal function is further used for the site-selective coupling of a carbohydrate antigen to provide a homogeneous glycoconjugate vaccine.

Homojen Glikokonkonjuggate Kombine Doğal Olmayan Amino Asit Birleşme ve Tıklama-Kimya Aşı Amaçlı Tarafından Üretilen

Genetic code expansion is a powerful tool to introduce unnatural amino acids (UAAs) into proteins to modify their characteristics, to study or create new ...

Biyomühendislik

Rapid Antibody Glycoengineering in Chinese Hamster Ovary Cells

Recombinant monoclonal antibodies bind specific molecular targets and, subsequently, induce an immune response or inhibit the binding of other ligands. However, monoclonal antibody functionality and half-life may be reduced by the type and distribution of host-specific glycosylation. Attempts to produce superior antibodies have inspired the development of genetically modified producer cells that synthesize glyco-optimized antibodies. Glycoengineering typically requires the generation of a stable knockout or knockin cell line using methods such as clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-associated protein 9. Monoclonal antibodies produced by engineered cells are then characterized using mass spectrometric methods to determine if the desired glycoprofile has been obtained. This strategy is time-consuming, technically challenging, and requires specialists. Therefore, an alternative strategy that utilizes streamlined protocols for genetic glycoengineering and glycan detection may assist endeavors toward optimal antibodies. In this proof-of-concept study, an IgG-producing Chinese hamster ovary cell served as an ideal host to optimize glycoengineering. Short interfering RNA targeting the Fut8 gene was delivered to Chinese hamster ovary cells, and the resulting changes in FUT8 protein expression were quantified. The results indicate that knockdown by this method was efficient, leading to a ~60% reduction in FUT8. Complementary analysis of the antibody glycoprofile was performed using a rapid yet highly sensitive technique: capillary gel electrophoresis and laser-induced fluorescence detection. All knockdown experiments showed an increase in afucosylated glycans; however, the greatest shift achieved in this study was ~20%. This protocol simplifies glycoengineering efforts by harnessing in silico design tools, commercially synthesized gene targeting reagents, and rapid quantification assays that do not require extensive prior experience. As such, the time efficiencies offered by this protocol may assist investigations into new gene targets.

The glycosylation pattern of an antibody determines its clinical performance, thus industrial and academic efforts to control glycosylation persist. Since typical glycoengineering campaigns are time- and labor-intensive, the generation of a rapid protocol to characterize the impact of glycosylation genes using transient silencing would prove useful.

Çin Hamster Yumurtalık Hücrelerinde Hızlı Antikor Glikomühendisliği

Recombinant monoclonal antibodies bind specific molecular targets and, subsequently, induce an immune response or inhibit the binding of other ligands. ...

Sistein Thiols rekombinant proteinler Vitro siteye özgü Glikozilasyon için hedefleme

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Protein Bioconjugatlar sentezi