Klonlama, Gemma Harris sn-alışveriş merkezleri ve beamlines I03 ve I04 elmas ışık kaynağında bilim adamları için'yardım OPPF-İngiltere anıyoruz.

Not: sinyal peptid silindi kodlama dizisi standart bir füzyon protokol sonrası pOPINF vektörde klonlanmış; yerli protein Escherichia coli BL21 Rosetta hücrelerdeki bir etiket onun füzyon olarak ifade 28 , 29. değişken etiketli selenomethionine üretici 30 göre standart yöntemleri aşağıdaki ifade edilir. SBP daha önce saflaştırılmış rekombinant 31 , 32 açıklanan.
 1. biyokimyasal karakterizasyonu <ol><li>termal kayması tahlil <ol><li>hazırlamak 48 tampon çözeltiler 4.0 arasında değişen pH 9,5 ve NaCl konsantrasyon için 0-0, 5 M ve açıklandığı gibi bir 96-şey plaka 40 µL dağıtmak Tablo 1 33.</li> <li>eklemek için 1-2 mg/mL konsantrasyonu SBP çözümün de 5 her µL.</li>
		<li>Eklemek için 20 x için (bkz: Malzemeler tablo) protein flüoresan leke de 5 her µL.</li>
		<li>Pipetting tarafından çözümleri karıştırmak, şeffaf yapışkan film kullanarak plaka mühür ve spin 112 x g oda sıcaklığında 2 min için.</li>
		<li>Deney gerçek zamanlı bir makinede çalıştırın: 99 ° C ile 10 s ayrı tutma zamanı için 4'ten 3 ° C/dak bir sıcaklık rampa ayarlayın ve floresan her 0,5 ° C uyarma, 483 nm ve emisyon 568, okumak nm.</li>
		<li>Analiz için erime sıcaklık (T m) türevi en az tanımlayan her arabellek durumuna Floresans emisyon eğrileri. 
		Not: Bu yordam protein istikrar düzelme yardım için en iyi arabellek çözüm iyi bir göstergesi verir. PH aralığı ve tuz konsantrasyonu yüksek T m ile arabellek durumuna göre seçim ve gliserol ve 0,5 mM, %2.5 (v/v) eklemek tris(2-carboxyethyl) aşağıdaki adımları (sn-tampon) için arabellek çözüm tanımlamak için fosfamin (TCEP).</li>
	</ol></li> <li>MALS ve analitik sn <ol><li>degassed filtrelenmiş su (kullanım geniş moleküler ağırlık 24 mL sütun) ile ambalajlı jel filtrasyon sütunun iki sütunlu cilt yıkama gerçekleştirmek.</li>
		<li>Sütun ışık saçılma bulmak-e doğru bağlamak ve termal üst karakter tahlil kararlı sn arabelleğinden sütunla equilibrate.</li>
		<li>5 mg/mL dengelenmiş sn sütun ve akış bir sütun hacmi sn-tampon içine, saflaştırılmış SBP enjekte 100 µL.</li>
		<li>Elüsyon Kromatografik tek veya birden çok tepeler için kontrol ve molar kütle ve tüm türler için polydispersity dizin edinme analiz yazılımı kullanarak saçılma verileri incelemek. 
		Not: bir oligomeric türlere karşılık gelen her zirve için polydispersity kontrol etmek yararlı olduğunu dizin hesaplanan molar kitle ağırlıklı molekülleri (Mw/Mn) sayısına kütle/azı kitle üzerinde ağırlıklı olarak. Polydispersity değeri 1 yakın bir monodispersed pik gösterir. 
		Not: Bütün Oligomerizasyonda türlerin tanımladıktan sonra daha yüksek konsantrasyonlarda daha büyük oligomer oluşumu lehine protein konsantrasyonu, bağımlılığını eğitim yararlı gibi.</li>
		<li>Yürütmek birden çok analitik sn çalıştırma; artan konsantrasyonları (0.1 - 10 mg/mL) dengelenmiş jel filtrasyon sütuna (kullanım geniş molekül ağırlığı 5 mL sütun), saflaştırılmış SBP 100 µL enjekte ve her zaman bir sütun birim sn-arabelleği akış.</li>
		<li>Elüsyon Kromatografik tek veya birden çok tepeler için kontrol ve 280 Absorbans Koyulukları çözümlemek için farklı başlangıç protein konsantrasyonları karşılık gelen eğrilerinin nm. Farklı doruklarına göreli yoğunluklarda sabit kalırsa, oligomeric türler arasında arası dönüştürme mevcut değildir. Farklı konsantrasyonlarda göreli Koyulukları içinde çeşididir şekilde protein konsantrasyonu bağlıdır farklı oligomeric türler arasında bir göstergesi. 
		Not: Bu karakterizasyonu hangi tür kristalizasyon için daha uygundur tanımlamak için temel adımdır. Gerçekten de, farklı monodispersed tür tanımlanmış bir konsantrasyon bir sabit oligomeric durumda olmaları durumunda kristalize daha yatkındır.</li>
	</ol></li></ol> 2. Protein hazırlık ve kristalizasyon <ol><li>partiye hazırlık sn <ol><li>bir tek sütunluk birimi sonra yıkama degassed süzülmüş suyla equilibrate sn-tampon ile (geniş bir Moleküler ağırlığı 120 mL partiye hazırlık ambalajlı jel filtrasyon sütun sütun).</li>
		<li>1-5 mL, 5-50 mg/mL saf SBP dengelenmiş jel filtrasyon sütun ve akış bir sütun hacmi sn-tampon içine enjekte.</li>
		<li>Sütun akışı aracılığıyla 1 mL kesirler toplamak.</li>
		<li>Bir tek monodisperse zirveye karşılık gelen kesirler havuz; 15 mL aralıklarla filtreleri 1.500 g de örnekte spin ve istenen konsantrasyonu elde kadar konsantrasyonu ölçmek (genellikle SP0092 için 50-100 mg/mL).</li>
	</ol></li> <li>Kristalizasyon <ol><li>kristalizasyon deney öncesi kristalizasyon Test üretici tarafından açıklandığı gibi kullanarak en iyi toplama aralığını belirlemek: <ol><li>besleme 0.5 - 1.0 mL her dört kristalizasyon testi 24-iyi oturan farklı bir rezervuar çözümlerinde kristalizasyon plaka bırakın.</li>
			<li>Protein çözüm 1 µL rezervuar çözüm 1 µL ile karıştırılarak kristalizasyon damla hazırlamak, plaka mühür ve oda sıcaklığında en az 1 (bir gecede kuluçka sonra daha güvenilir sonuçlar elde edilen) s için kuluçkaya.</li>
			<li>Kontrol damla kalite 10 x büyütme mikroskop kullanarak her yoğunlaşması. 
			Not: Test en az üç farklı protein konsantrasyonu: (I) açık kalan damla çoğunu belirtmek protein çok seyreltik kristalizasyon için; (II) damla çoğu ağır çökelti varlığı bir aşırı yüksek konsantrasyon anlamına gelir; ve (III) dengeli bir oluşum açık düþer ve çökelti (Eğer ışık daha iyi) test konsantrasyon kristalizasyon için olumlu olduğunu iyi bir göstergesidir.</li>
		</ol></li> <li>96-şey oturma inis kristalizasyon tabak hazir; her rezervuar iyi 34 , 35 , farklı ticari kristalizasyon çözeltinin 100 µL dağıtmak 36 , 37.</li> <li>dağıtmak 100 nL kristalizasyon Robotik sistem kullanarak tüm kristalizasyon damla Wells önceden tanımlanmış konsantrasyonu (Adım 1.1.6) adlı protein örneği.</li>
		Karşılık gelen kristalizasyon <li>dağıtmak 100 nL farklı baraj gölünün çözümler adım 2.2.3 reçete protein ile karıştırmak için kuyu bırak. Buharlaşma önlemek ve kristalizasyon damla ile havzanın denge etkinleştirmek için kristalizasyon plaka mühür.</li>
		<li>Kontrol damla düzenli olarak (başlangıçta her 1-2 günde, daha sonra her hafta) 10 x (en az) kullanarak kristal oluşumu ve büyüme değerlendirmek için büyütme mikroskobu. 
		Not: protein kristalizasyon için kullanılan için otomatik görüntüleme sistemi görselleştirme ve yakalama düşüyor.</li>
	</ol></li></ol> 3. Kristal karakterizasyonu ve x-ışını veri toplama <ol><li>kristal montaj <ol><li>hazırlamak cryoprotectant çözüm % 25'i (v/v) gliserol (son konsantrasyonu) ekleyerek (böylece ilk suda % 25'i yerine kristalizasyon durumuna karışımı) 38.</li>
		<li>Doldurmak bir köpük dewar sıvı azot ve yer dewar içine uni-Pak örnek muhafaza parçası ile. Sıvı azot sıcaklık için soğumasını bekleyin.</li>
		<li>Kes ve mühürleme teyp kristalizasyon plaka nerede kristalleri oluşan açılan kaldır.</li>
		<li>Bir damla hedef damla yakın konumlandırılmış bir coverslide üzerine cryoprotectant çözüm 1 µL yerleştirin.</li>
		<li>Seçili kristal bir manyetik değnek 39 , 40 üzerinde monte edilmiş bir omurga standart üsteki bir naylon cryo-döngü kullanarak cryoprotectant çözüm damla özgün damla--dan transfer.</li>
		<li>Hızlı bir şekilde kristal cryoprotectant damla--dan sıvı azot döngüsü uni-Pak örnek sahibi ilk boş pozisyon yerleştirerek, transfer.</li>
		<li>İstenen kristalleri hasat ve uni-Pak örnek tutucu içinde depolanan kadar (sızdırmazlık bandı kesme) tekrarlayın.</li>
		<li>Yer uni-Pak temel uni-Pak puck değnek kullanarak ve beamline (sıvı azot koşullarda) Pak almak. 
		Dikkat: Son derece düşük derece!</li>
		<li>Kullanmak cryo-maşa ve Pak dewar yükleme aracı uni yüklemek için-puck(s) beamline örnek değiştirici robot içine dewar. Uni-Pak örnek sahibi örnek döngü sahipleri örnek robotun içine dik bırakarak temel kapak üzerinden ayırmak dewar ve böylece sıvı nitrojeni maruz ve örnek değiştirici robot tarafından erişilmesini.</li>
	</ol></li> <li>Kristal karakterizasyonu Not: hasat kristaller daha sonra bir laboratuvar x-ışını kaynağı'nı kırınım kalitesi için veya bir sinkrotron radyasyon (SR) x-ışını kaynağı ekranlı. Makromoleküllerin kristalografisi (MX) beamlines yapı çözüm için anormal kırınım yararlanmak için ayarlanabilir enerji kaynağı sağlamak. Aşağıdaki bölümde, deneysel yetenekleri doğrultusunda çalışma talimatların elmas ışık kaynağı MX beamlines bir dizi teklif edilir ancak bu yönergeleri de MX beamlines, diğer synchrotrons dünya çapında adapte edilebilir.
	<ol><li>İlk adım olarak, onaylamak veya anormal scatterers kristal tanımlamak yararlıdır. Bu uygun bir x-ışını Floresans spektrum kristal üzerinden ölçerek elde edilebilir. İlk beamline x-ışını enerji tüm öğeler genellikle makromoleküllerin kristalleri için beklenen heyecanlandırmak için yüksek ayarlanır emin olun (14 keV veya daha yüksek).</li>
		<li>Örnek değiştirici robot tarafından monte edilebilir örnek seçmek için beamline kontrol yazılımı kullanın; döngü otomatik olarak x-ışını ışının içinde ortalanır ve kristal merkezleme beamline kontrol yazılımı kullanarak el ile onaylanabilir.</li>
		<li>Kayıt beamline kontrol yazılımı kullanarak bir x-ışını Floresans spektrum: kullanıcı bir çekim hızı seçer ve ölçüm başlatır (floresan/floresan spektrum ayarı, &#8594; koş, şekil 2A). Beamline kontrol yazılımı otomatik olarak Floresans dedektörü yerleştirin ve en az olay Floresans dedektörü okunabilir bir sinyal almak için x-ışını akı belirler X-ray konumlandırır. Edinsel spektrum sonra doğal olarak meydana gelen için donatılmış emisyon zirveleri ile otomatik bir biçimde analiz biyolojik öğeler. Bu yordamlar beamline kontrol yazılım grafik kullanıcı arabirimi (GUI) - GDA (www.opengda.org) Firmamız ve synchrotrons Europe 41 , 42 boyunca içinde kullanılabilir.</li>
		Eğer uygun öğeleri tespit <li>bu anormal kırınım deney için yararlanılabilir, kristal anormal kırınım veri toplama için en uygun dalga boyu belirlemek için bir x-ışını soğurma kenar enerji taraması gerçekleştirin: beamline tarihinde kontrol yazılımı, öğeyi seçin ve tarama başlatmak (floresan/floresan ayarı, inceden inceye gözden geçirmek &#8594; Atom adı, &#8594; koş, şekil 2B). 
		Not: bir tek anormal kırınım deneme için emme kenar zirvesine anormal saçılma en üst düzeye çıkarmak için kullanılır. Deneysel dikkat edilmesi gereken noktalar bir çok dalga boyu anormal kırınım deneyi gerçekleştirmek için daha önce ayrıntılı 43 olmuştur.</li>
		Kristal birim hücre parametreleri, simetri ve kırınım sınırı belirlemek için <li>salınım yöntemini kullanarak 45 ° aralıklarla üç x-ışını kırınım desen ölçmek (veri toplama/tarama &#8594; geçerli, koşmak Şekil 2C). Beamline kontrol yazılımı, salınım açısı ve çekim hızı ve röntgen ışını yüzdesi ayarlamak için yeteneği ile kullanıcıya sunar. Standart kristal tarama için 0.5°, bir çekim hızı 0.5 s ve % 5 x-ışını demeti iletim salınım açısı önerilir. Ölçülen kırınım görüntüleri EDNA boru hattı tarafından otomatik olarak analiz edilir ve stratejileri tam veri kümesi 22 topluluğu için bir dizi dönmek.</li>
	</ol></li> <li>X-ışını veri toplama Not: Kullanıcı standart salınım modu veya Friedel arkadaşları yakın zaman ve x-ışını doz ve yaklaşık aynı emme davranışı ile kayıt altına sağlar ters ışın modu verilerini toplamak üzere seçebilirsiniz anormal farklılıklar daha doğru bir ölçüm sağlar. İkincisi özellikle küçük anormal farklılıklar bekleniyor ve/veya örnekleri radyasyon hassas anormal kırınım deney gerçekleştirirken kullanışlıdır. En iyi veri toplama stratejileri kullanmak için önemli noktalara kapsamlı bir şekilde gözden geçirilmiş 22 , 23 , 44 , 45 olmuştur , 46 , 47. <ol><li>beamline kontrol yazılımı kullanarak içe aktarma veri koleksiyon parametrelerini sağlayacak strateji program tarafından önerilen: ı. ω-dönme ekseninin başlangıç konumunu II. Salınım genişliği ω-eksen dönme açısı için her kırınım görüntü III. Pozlama süresi her kırınım resim için IV. Sayı-in imge (dolaylı olarak toplam ω-eksen döndürme açısını tüm veri toplama için tanımlama) tam veri kümesi için aşırı pozlama ve radyasyon zarar görmemesi için x-ışını demetinin zayıflama yüzdesi v. Not: bizim kurumu için veri toplama çalışan, toplanan verilerin otomatik işleme için yazılım boru hatları iyi kurulmuş: (i) kırınım veri (dizin oluşturulmuş, tümleşik ve ölçekli) azalır xia2 boru hattı tarafından hangi kullanıcı için yansıma mtz dosyaları üretir aşamalı ve yapı çözüm/arıtma 48 için giriş olarak. (ii) ne zaman önemli bir anormal sinyal algılandığında veri çözümlemesi sırasında SHELX kullanarak bir ilk hızlı otomatik yapı çözüm boru hattı (fast_ep) ağır atom altyapı deneysel çözmeye çalışır phasing, aşamalı elektron yoğunluğu harita sağlayan nerede mümkün. Bir ikinci daha kapsamlı yapı çözüm boru hattı otomatik olarak çözmek ve structu inşa girişimleri taahhüt ederkullanarak bağımsız yazılım suites 49 , 50 , 51 , 52; Nerede bu başarılı olmadığı durumlarda, kullanıcı bir ilk model ve elektron yoğunluğu harita ile sağlanacaktır. Bu arıtma tamamlayıp modeli seçim crystallographic yazılım paketleri ile doğrulamak kullanıcı için temel sağlar.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu kağıt, açıklama ve karbonhidrat SBPs proteinler S. pneumoniaesayfasından belirli bir vurgu ile biyokimyasal ve yapısal karakterizasyonu için entegre bir iletişim kuralı doğrulama. Yine de, bu diğer SBPs farklı organizmalar üzerinden ve hatta diğer ilgisiz çözünür proteinler analizi için standart bir prosedür olarak kullanılabilir.
Protokol ilk bölümünü protein istikrar ve protein örnekleri hazırlanırken kristalizasyon yararlanan dördüncül yapı biyokimyasal bilgilerini sağlamaya odaklanmıştır. Termal kayması deneyleri bölümünde, biz sadece pH ve bu yordamı genel hükümlerini korumak için NaCl toplama varyasyon tanımlamak. Buna rağmen birçok diğer arabellek şartlar benzer bir şekilde, örneğin, herhangi bir kimyasal bileşik teskin katkı maddesi kullanılan da dahil olmak üzere test edilebilir: özellikle belirli bir SBP bağlamak gerçek ligand(s) Tartırmada son derece etkili m bir kaç santigrat derece31tarafından. Bazı durumlarda, denaturing eğriler kötü düşük sinyal veya protein toplama veya kısmi elinde tutmasına neden bir yüksek floresan arka plan nedeniyle tanımlanabilir. Bunu önlemek için bir protein: boya titrasyon belirsiz denaturing eğrileri en iyi duruma getirmek için gerçekleştirilebilir. Hiçbir gelişme edindiyseniz, protein kararlılığını iyileştirmek çeşitli katkı maddeleri eleme tavsiye edilir ve uygun ekranları yukarıda açıklanan54olmuştur.
Genellikle, çoğu SBPs doğal ortamlarında monomeric, ama burada gösterildiği multimerization kristalizasyon deneylerde kullanılan daha yüksek konsantrasyonlarda oluşabilir, böylece MALS ve SEC tarafından sağlanan Oligomerizasyonda davranış karakterizasyonu kristalizasyon için en uygun istikrarlı monodisperse Oligomerizasyonda durumunu değerlendirmek için gerekli. Bununla birlikte, farklı kimyasallar proteinler Oligomerizasyonda davranışı üzerinde kristalizasyon koşul dahil etkisini tahmin etmek zordur. SN ve MALS muayene protein örneği kapsamlı toplama gösteriyorsa, bu oluşma olasılığını azaltmak için aşağıdaki tavsiye ederiz: taze protein örneği (değil donma çözdürülen) kullanmak ve termal ile gerçekleştirilen sabitleme analiz genişletin shift deneyleri, olası katkı maddeleri ve hafif deterjanlar son bir kaynak olarak toplama en aza indirmek için test. Bu yazıda, bu protokol genel hükümlerini korumak için yüksek üretilen iş seyrek matris ticari kristalizasyon tarama kullanarak kristalizasyon için temel kuralları tanıtacağız. Ancak, yüksek çözünürlüklü x-ışını kırınım protein kristalleri elde etme kristalizasyon koşulları precipitant konsantrasyonu, pH, kimyasal katkı maddeleri, farklı sıcaklıklarda, ilavesi ile ilgili olarak en iyi duruma getirmek için yinelemeli ince ayar gerekir ve diğer kristal damla ve rezervuar16,17arasında değişen denge dynamics faktörler.
Protokolünün ikinci parçası üzerinde üzgün phasing için anormal veri edinimi x-ışını kırınım veri koleksiyonu belirli bir odak için en iyi strateji tanımlamak için protein kristalleri karakterizasyonu açıklar. SBPs benzer bir genel yapısı korumak (ve potansiyel olarak kullanılabilir modeller başlangıç olarak yatırılan 3D modellerinden olsa bile), bu Proteinlerin moleküler değiştirme yöntemi tarafından aşamalı her zaman değişkenlik nedeniyle basit değil İkincil yapı elemanları ve bu proteinlerin iç esneklik. Bu nedenle, biz üzgün yöntemi teklif ve bu proteinler zaten özünde metaller veya gerçekten özel bağlama metallerin anormal diffracting öğeleri bir dizi sağlayabilir kristalizasyon arabellek koşullar bağlı olduğunu vurgulamak bir bizim genel iletişim kuralı standart adımda.
Sonuç olarak, bu iletişim kuralı bir standart güdümlü iş akışı yanı sıra yapı belirlenmesi başarı oranını artırmak hızlandırmak için istismar SBPs biyokimyasal ve yapısal özellikleri ayrıntılı açıklamasını sağlayan yordamlar tanımlar SBPs yapısal karakterizasyon genel olarak.

S. pneumoniae (pnömokok) olduğunu asymptomatically neden otitis, septisemi, pnömoni, sepsis normalde steril nişler geçirmek için yeteneği ile insan solunum yolu üst solunum yolları içinde bulunan gram-pozitif bir bakteri ve Menenjit1,2. Ayrıca, pnömokok enfeksiyonu bir klinik ve ekonomik yük dünya çapında3,4' e katkıda bulunan topluluk edinilen pnömoni önde gelen nedenidir. Antibiyotik dirençli S. pneumoniae suşları dünya genelinde yayılmış ve yedi valent ve on üç-valent pnömokok protein eşlenik aşı yardımcı oldu rağmen antibiyotik direnci, yedek suşları oranını azaltmak aşı kullanımı ortaya çıkmıştır ve araştırma için artan talepleri pnömokok hastalığı5,6,7,8için yeni tedavilerin geliştirilmesi içine açmıştır.
Pnömokok ev sahibi bir karbon kaynağı9,10olarak alınan şeker bağlıdır; Gerçekten de onun alma makine taşıma 32 farklı karbonhidrat11,12,%1330'u ayırıyor. Bu ithalatçılar en az sekiz ABC-taşıyıcı13içerir. ABC Taşıyıcılar hücre dışı SBPs ligand için özgüllük belirleme ve hücre alımı için integral membran taşıyıcı için sunma temel bir rol oynar. Çünkü onlar yüzey proteinleri ve hücresel onların önemli rol SBPs yeni aşılar ve antimicrobials tasarımı için geçerli hedefler temsil eder.
Hedef protein karakterizasyonu ve ligand cepler ve etki alanları arasında esneklik gibi yapısal özellikleri ayrıntılı bir açıklama yararlı bir araç için uyuşturucu yapısı tabanlı tasarım14,15sağlar. X-ışını kristalografisi atomik çözünürlük yakın proteinlerin yapısal karakterizasyon için seçim yöntemi, ama kristalizasyon işleminin öngörülemeyen, zaman alıcı ve her zaman başarılı değil. Gelişmiş sistematik yöntemlerle başarı oranı ve örnek kalite ve istikrar önemli faktörlerdir. Kristalizasyon başarı oranını içindeki protein kimyasal özellikleri ve örnek hazırlama yöntemleri tarafından etkilenir. Bunlar etkisini değerlendirildi ve biyokimyasal karakterizasyonu16,17tarafından haberdar.
Bir başka komplikasyon yapısı tabanlı tasarımı için ele alınması gereken crystallographic faz sorun. Gibi daha fazla protein yapıları kullanılabilir, birçok yapılar homolog yapısı18gerektirir moleküler değiştirme yöntemi tarafından çözülebilir. SBPs esnek etki alanı yapısı sunmak, moleküler değiştirme de zorlu19olabilir. Hedef protein için yeterince benzer bir yapısal model kullanılabilir değilse, bir takım teknikler deneysel aşamalı20almak için kullanılabilir. Bunlar arasında tek dalga boyu anormal dağılımı (SAD) yöntemi birincil tekniği ortaya çıkmıştır ve yoğun faz sorun21çözmek için kullanılan. ÜZGÜN yönteminin kullanımı daha fazla donanım ve yazılım gibi algılama ve22,23, phasing için zayıf anormal sinyallerin kullanım izin vermek için veri toplama stratejileri geliştirmeleri ile gelişmiş 24. yapıları oluştururlar, hangi kırınım veri atomik çözünürlükte gerekli, geçmişte şimdi programda uygulanan olarak stereochemical bilgi Örneğin, birleştirerek yararlı olabilir için Ayrıca, doğrudan yöntemlerdeki gelişmeler ARCIMOLDO25. Kristalografi faz problem çözme yöntemleri yararlı bir daha gözden geçirme Taylor26tarafından verilir.
Burada karbonhidrat taşıma SBP, SP0092 S. pneumoniae, karakterizasyonu için ayrıştıran bir protokol biyokimyasal ve yapısal teknikleri (şekil 1) entegre mevcut. Bu adım adım iletişim kuralı hayat tüm Krallık içinde bulunan genel olarak, SBPs üzerinde yapısal çalışmaların başarı oranını artırmak için stratejiler yararlı örnek test olgusu sağlar. Özellikle, protokol hızlı ve etkili bir yöntem çözümde protein en istikrarlı oligomeric durumunu karakterize önemini vurgular ve kristalizasyon deneyler için takip etmek için en iyi tür tanımlamasını sağlar. 500'den fazla SBP yapıları içinde Protein veri Bankası27rapor olsa da, moleküler yedek bir menteşe bölgesi19tarafından bağlı iki α/β etki alanı doğal esnek yapısı nedeniyle zor olabilir. Böylece, iletişim kuralının ikinci bölümü, üzgün phasing üzgün yöntemiyle ilişkili metal iyonları SBPs ortak yanı sıra selenomethionine birleşme ve selenyum (Se) kullanımı olan phasing için açıklar.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>SelenoMethionine Medium Complete</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD12-500</td>
			<td>Based on a synthetic M9 minimal media supplemented with glucose, vitamins and amino acids with the exception of L-methionine. Other equivalent products are commercially available by other companies.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical 96-Well plate</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4306737</td>
			<td>The Applied Biosystems MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate with Barcode is optimized to provide unmatched temperature accuracy and uniformity for fast, efficient PCR amplification. This plate, constructed from a single rigid piece of polypropylene in a 96-well format, is compatible with Applied Biosystems&#174; 96-Well Real-Time PCR systems and thermal cyclers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SYPRO Orange</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>S6651</td>
			<td>SYPRO Orange Protein Gel Stain is a sensitive, ready-to-use fluorescent stain for proteins in 1D gels. Quite universal and well-established protein dye for hydrophobic regions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical Adhesive film</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4311971</td>
			<td>The Applied Biosystems MicroAmp Optical Adhesive Film reduces the chance of well-to-well contamination and sample evaporation when applied to a microplate. It is ideal for optical measurement, because it gives low background.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7500 Fast Real-time PCR System</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4362143</td>
			<td>The Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System enables standard 96-well format high speed thermal cycling, significantly reducing your run time for quantitative real-time PCR applications, delivering results in about 30 minutes. The Upgrade Kit is available to upgrade a standard 7500 Real-Time PCR System to the Fast Configuration via a field service installation. Other RT-PCR machine can be used. Data export not easy for the old data analysis software.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 increase 10/300 GL column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28990944</td>
			<td>Superdex 200 Increase 10/300 GL is a versatile, prepacked column for size exclusion chromatography in small-scale (mg) preparative purification as well as for characterization and analysis of proteins with molecular weights between 10 000 and 600 000, such as antibodies. Optimal separation ideal for high resolution biophysical techniques.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAWN HELEOS II</td>
			<td>Wyatt</td>
			<td></td>
			<td>DAWN HELEOS II is the premier Multi-Angle static Light Scattering (MALS) detector for absolute characterization of the molar mass and size of macromolecules and nanoparticles in solution. The DAWN offers the highest sensitivity, the widest range of molecular weight, size and concentration, and the largest selection of configurations and optional modules for enhanced capabiliites. Other MALS detecting systems from other companies apart from Wyatt have not been tested, so no additional feedback can be provided.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 5/150 GL</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28906561</td>
			<td>Superdex 200 are prepacked size exclusion chromatography columns for high-resolution small-scale preparative and analytical separations of biomolecules. Superdex 200 has a separation range for molecules with molecular weights between 10 000 and 600 000. The peak separation is not as optimal as for the &#34;increase&#34; version but this model is ideal for the standard day by day use.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiLoad 16/600 Superdex 200 pg</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28989335</td>
			<td>HiLoad 16/600 Superdex 200 prep grade are prepacked XK columns designed for high-resolution preparative gel filtration chromatography.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 Well &#34;Big&#34; Sitting Drop Crystallization Plate</td>
			<td>MiTeGen</td>
			<td>XQ-P-24S-A</td>
			<td>The 24 well &#34;big&#34; crystallization plate is used mainly for protein crystal screening by sitting drop vapor diffusion techniques, and for crystallization condition optimization. It has quite large reservoir well and sample container, which favor manual handling and big sized protein crystal growth. In addition, its flat surfaces are easily to be sealed by transparent tape or cover slips.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCT Pre-Crystallization Test</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR2-140</td>
			<td>The PCT Pre-Crystallization Test is used to determine the appropriate protein concentration for crystallization screening.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 Well CrystalQuick</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>6098xx</td>
			<td>Square-well plates have three crystallization wells per reservoir, making it possible to test 288 samples per plate. Generally used only for the inital screening because their squared edge make crystals fishing difficult.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uni-Puck</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD7-601</td>
			<td>The Universal V1-Puck (Uni-puck) is a sample pin storage and shipping container for use with the majority of automated sample mounting systems worldwide - includes the ACTOR, SAM and CATS systems amongst others (Diamond, Soleil, SPring-8, Photon Factory, CLSI and across the USA)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Foam Dewar</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD7-35</td>
			<td>5.7&#34; diameter by 2.8&#34; deep. 800mL capacity.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounted CryoLoop - 20 micron</td>
			<td>Hampton</td>
			<td>HR4-955</td>
			<td>Mounted CryoLoops with 20 micron diameter nylon. These nylon loops are bonded to hollow, stainless steel MicroTubes&#8482; that are used to mount, freeze, and secure the crystal during cryocrystallographic procedures and X-ray data collection. Different sizes exist and they can be adapted in lenght. They are quite versatile tools.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CryoWand</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD7-411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puck dewar loading tool</td>
			<td>Molecular Dimensions</td>
			<td>MD7-607</td>
			<td>This tool is used to separate uni-pucks to load them into the robot dewar. It consists of two pieces: a Teflon tube part and a metal rod part.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

biochemical and structural characterization of the carbohydrate transport substrate-binding-protein sp0092

Yeni antimicrobials ve aşı geliştirilmesi Streptococcus pneumoniae (pnömokok) için çoklu dirençli suşların hızlı artış durdurmak gerekli. Karbonhidrat substrat proteinler (SBPs) protein bazlı aşılar ve yeni antimicrobials geliştirilmesi için uygun hedefler nedeniyle ekstrasellüler onların Yerelleştirme ve pnömokok metabolizması için karbonhidrat alma merkezi temsil etmek, anılan sıraya göre. Burada açıklanan SP0092, pnömokok ve diğer bakteriler diğer karbonhidrat SBPs uzatılabilir kapsamlı bir karakterizasyonu gerçekleştirmek için entegre bir ayrıştıran protokoldür. Bu yordamı inhibitörleri bu sınıfın proteinlerin yapısı tabanlı tasarımı yardımcı olabilir. Sunulan bu yazının ilk bölümünde termal üst karakter tahlil göre biyokimyasal analiz için kurallarıdır, çok ışık saçılma (MALS) açı ve dışlama Kromatografi (sn), hangi istikrar optimize boyutu ve örnek polimerlerin yönelik kristalizasyon denemeler ve bu yüzden başarı geliştirin. Bu yordamı ikinci bölümü kristalize protein çözümlemek için kullanılan ölçüm verileri için ayarlanabilir dalga boyu anormal kırınım sinkrotron beamline ve veri koleksiyon iletişim kurallarını kullanma SBP kristalleri karakterizasyonu açıklar yapısı.

Bu tümleşik iletişim kuralı dört ile başarılı olmak için kanıtlanmıştır (iki yayınlandı ve iki yapıları yayımlanmamış) pnömokok bağlayıcı protein hedefler altı karbonhidrat analiz32,53bugüne kadar. Bu bölümde, biz SP0092 biyokimyasal ve yapısal karakterizasyon SBPs yapısal çalışmaların genel rehberlik için temsil edici bir sonucu olarak mevcut.
Sonra SBP SP0092 ifade edilen ve daha önce32tanımlandığı gibi saf saf protein termal üst karakter tahlil kullanarak arabellek istikrar için analiz edildi: SP0092 sergileyen bir artan Tm pH 6,5 NaCl varlığında 0 - 0.2 M konsantrasyon aralığı (şekil 3A). Bunun ışığında, aşağıdaki adımları için arabellek çözüm olarak tanımlanmıştır: 0,02 M MES pH 6.5, 0.2 M NaCl, %2.5 (v/v) gliserol, 0,5 mM TCEP. SP0092 farklı Oligomerizasyonda durumları mutlak molar kütlesi tetrameric, trimeric, dimerik ve monomeric türleri için karşılık gelen 187.2, 140.8, 97.0 ve 49,4 kDa, moleküler ağırlık ölçme sn birleştiğinde MALS tarafından ölçüldü () sırasıyla Şekil 3B). Farklı protein dilutions sn profilde analizini artan protein konsantrasyonu, daha büyük reaksiyonlar genellikle kullanılan daha yüksek konsantrasyonlarda daha kararlı olduğunu düşündüren Oligomerizasyonda tetiklediği saptandı kristalizasyon. Nitekim, saflaştırılmış büyük oligomeric türler kristalizasyon denemeler için yönetmen başarıyla üretilen protein kristalleri tür did değil monomer tamamlayın.
En iyi duruma getirilmiş kristalleri yerli elde edilen ve Se-metiyonin SP0092 türlü etiketli x-ışını kırınım tarafından karakterize. Bu kristaller gelen x-ışını Floresans ölçümü Se beklendiği gibi sadece Se-metiyonin kristalleri için algılandı ise protein, bağlanan Zn için emisyon tepeler her iki durumda da ortaya koydu. Hangi olay x-ışını dalga boyu ilgili x-ışını soğurma kenarlarına Zn veya Se ayarlamak için doğrudan deneysel veri kristallerin anormal sinyal en üst düzeye çıkarmak için mevcut sağlanan x-ışını soğurma taramaları Se ve Zn kenarlarında sonra gerçekleştirilen Sonuç veri (şekil 4A-B) üzerinden elde edilebilir.
Düşük iletim adlı üç kırınım şablonlarını ölçmek sonra tam bir anormal veri kümesi EDNA (şekil 4 c) tarafından önerilen veri toplama stratejisini kullanarak elde edildi. Anormal sinyal mevcut otomatik aşamalı boru hattında alt yapısını belirlemek için beamline tetikler ve elde edilen ilk deneysel aşamalarında dayanan, üreten ilk haritalar ve sonra rafine ve doğrulanmış modelleri (şekil 4 d ).
Özet olarak, olası tehlikelere tekniği öncelikle kristal mevcudiyeti ve kalitesinden ortalanır. Optimizasyon protein kararlılığınızı geliştirmek için arabellek koşulların yanı sıra protein çözümde, birden fazla oligomer tanımlandığında kullanılacak en uygun oligomeric durumunu tanımlaması kristalizasyon başarısızlık riskini azaltabilir sahne. Erken bir aşamada teşhis ilişkili metal iyonları kullanımı istismar yapı çözüm kadar hız ve moleküler değiştirme yöntemleri başarısız olduğunda protein etiketli selenomethionine gereksiz üretimini önlemek.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56294/56294fig1.jpg"> 
Şekil 1. Karbonhidrat SBPs biyokimyasal ve yapısal karakterizasyonu için iş akışı diyagramı. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56294/56294fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56294/56294fig2.jpg"> 
Şekil 2. Kristal karakterizasyonu GDA içinde. (A)GDA beamline kontrol yazılımı x-ışını Floresans denetimi sekmesindeki ekran görüntüsü. (B) GDA x-ışını enerji kenar-tarama denetimi sekmesinde ekran görüntüsü. (C) GDA veri toplama kristal tarama sekmesinde ekran görüntüsü. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56294/56294fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56294/56294fig3.jpg"> 
Şekil 3. SP009239-491biyokimyasal karakterizasyonu. (A)3D-Yüzey grafiği pH bir fonksiyonu ve arabellek çözüm NaCl konsantrasyonu SP009239-491 erime sıcaklığı komplo. (B) sn ve MALS sonuçları için SP009239-491. Emme 280 nm mavi renkle gösterilir. Farklı Oligomerizasyonda Birleşik molar kitlelerin kırmızıyla gösterilir. Paneli (B)32değiştirildi. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56294/56294fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56294/56294fig4.jpg"> 
Şekil 4. SP009239-491yapısal karakterizasyonu. (A)ve (B) x-ışını soğurma enerji Zn ve Se kenarına SP009239-491 kristalleri için tarama. Zn ve kristalleri içeren Se ölçülen Floresans gösterilen mavi ve mavi, hesaplanan f' ve f "anormal saçılma kesirler are yeşil ve kırmızı, anılan sıraya göre. X-ışını kırınım şablon örnekleri (C) SP009239-491 kristalleri toplanan. (D) Cartoon SP009239-491 dimer yapısı gösterimi. Bir protomer renkli beyaz ve diğer macenta (artıkları 39-366) ve violet (artıkları 367-491), ve anormal saçılma atomları mavi ve mavi topları Zn ve Se, sırasıyla gösterilir. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56294/56294fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>0,1 M sitrik asit pH 4.0</td>
			<td>0,1 M sitrik asit pH 4.5</td>
			<td>0,1 M fosfat pH 5,0</td>
			<td>0,1 M sitrat pH 5.5</td>
			<td>0,1 M Bis-tris pH 6</td>
			<td>0,1 M ADA pH 6,5</td>
			<td>0,1 M BEZLERİ pH 7</td>
			<td>0,1 M HEPES pH 7.5</td>
			<td>0,1 M Imidazole pH 8.0</td>
			<td>0,1 M Tris pH 8,5</td>
			<td>0,1 M CHES pH 9</td>
			<td>0,1 M CHES pH 9,5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 0 M</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
</tr></tbody></table>			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
		
		<tr>
			<td>NaCl 0.1 M</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 0.2 M</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 0,5 M</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
			<td>40 μL</td>
		</tr>
	

Tablo 1. Termal üst karakter tahlil için arabellek oluşturma.

Watch this Scientific Journal Video about Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092 at JoVE.com

Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Karbonhidrat substrat bağlayıcı protein geniş bir biyokimyasal ve yapısal karakterizasyon Streptococcus pneumoniae gerçekleştirmek için akıcı bir protokol sunulmuştur.

Karbonhidrat taşıma substrat-bağlayıcı-protein SP0092 biyokimyasal ve yapısal karakterizasyonu

Development of new antimicrobials and vaccines for Streptococcus pneumoniae (pneumococcus) are necessary to halt the rapid rise in multiple resistant ...

biochemical-structural-characterization-carbohydrate-transport

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

29.7K Görüntüleme.  Harwell Science & Innovation Campus. Karbonhidrat substrat bağlayıcı protein geniş bir biyokimyasal ve yapısal karakterizasyon Streptococcus pneumoniae gerçekleştirmek için akıcı bir protokol sunulmuştur.

Video: Biochemical and Structural Characterization of the Carbohydrate Transport Substrate-binding-protein SP0092

Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography

Membrane proteins (MPs) are essential components of cellular membranes and primary drug targets. Rational drug design relies on precise structural information, typically obtained by crystallography; however MPs are difficult to crystallize. Recent progress in MP structural determination has benefited greatly from the development of lipidic cubic phase (LCP) crystallization methods, which typically yield well-diffracting, but often small crystals that suffer from radiation damage during traditional crystallographic data collection at synchrotron sources. The development of new-generation X-ray free-electron laser (XFEL) sources that produce extremely bright femtosecond pulses has enabled room temperature data collection from microcrystals with no or negligible radiation damage. Our recent efforts in combining LCP technology with serial femtosecond crystallography (LCP-SFX) have resulted in high-resolution structures of several human G protein-coupled receptors, which represent a notoriously difficult target for structure determination. In the LCP-SFX technique, LCP is recruited as a matrix for both growth and delivery of MP microcrystals to the intersection of the injector stream with an XFEL beam for crystallographic data collection. It has been demonstrated that LCP-SFX can substantially improve the diffraction resolution when only sub-10 &#181;m crystals are available, or when the use of smaller crystals at room temperature can overcome various problems associated with larger cryocooled crystals, such as accumulation of defects, high mosaicity and cryocooling artifacts. Future advancements in X-ray sources and detector technologies should make serial crystallography highly attractive and practicable for implementation not only at XFELs, but also at more accessible synchrotron beamlines. Here we present detailed visual protocols for the preparation, characterization and delivery of microcrystals in LCP for serial crystallography experiments. These protocols include methods for conducting crystallization experiments in syringes, detecting and characterizing the crystal samples, optimizing crystal density, loading microcrystal laden LCP into the injector device and delivering the sample to the beam for data collection.

We describe procedures for the preparation and delivery of membrane protein microcrystals in lipidic cubic phase for serial crystallography at X-ray free-electron lasers and synchrotron sources. These protocols can also be applied for incorporation and delivery of soluble protein microcrystals, leading to substantially reduced sample consumption compared to liquid injection.

Hazırlık ve Seri Femtosecond Kristalografi için lipidik Cubic Faz Protein mikro kristallerinin teslimi

Membrane proteins (MPs) are essential components of cellular membranes and primary drug targets. Rational drug design relies on precise structural ...

Biyokimya

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating these studies, reincorporation of detergent-solubilized membrane proteins into liposomes is a stochastic process where protein topology is impossible to enforce. This paper offers an alternative method to these challenging techniques that utilizes a liposome-based scaffold. Protein solubility is enhanced by deletion of the transmembrane domain, and these amino acids are replaced with a tethering moiety, such as a His-tag. This tether interacts with an anchoring group (Ni2+ coordinated by nitrilotriacetic acid (NTA(Ni2+)) for His-tagged proteins), which enforces a uniform protein topology at the surface of the liposome. An example is presented wherein the interaction between Dynamin-related protein 1 (Drp1) with an integral membrane protein, Mitochondrial Fission Factor (Mff), was investigated using this scaffold liposome method. In this work, we have demonstrated the ability of Mff to efficiently recruit soluble Drp1 to the surface of liposomes, which stimulated its GTPase activity. Moreover, Drp1 was able to tubulate the Mff-decorated lipid template in the presence of specific lipids. This example demonstrates the effectiveness of scaffold liposomes using structural and functional assays and highlights the role of Mff in regulating Drp1 activity.

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

This paper describes a method for assessing the interactions and assemblies of integral membrane proteins in vitro with various partner factors in a lipid-proximal environment.

İskele Lipozomlar kullanarak Lipid-proksimal protein-protein etkileşimleri Sulandırın için<em&gt; İn Vitro</em

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

LERLIC-MS/MS for In-depth Characterization and Quantification of Glutamine and Asparagine Deamidation in Shotgun Proteomics

Characterization of protein deamidation is imperative to decipher the role(s) and potentialities of this protein posttranslational modification (PTM) in human pathology and other biochemical contexts. In order to perform characterization of protein deamidation, we have recently developed a novel long-length electrostatic repulsion-hydrophilic interaction chromatography-tandem mass spectrometry (LERLIC-MS/MS) method which can separate the glutamine (Gln) and asparagine (Asn) isoform products of deamidation from model compounds to highly complex biological samples. LERLIC-MS/MS is, therefore, the first shotgun proteomics strategy for the separation and quantification of Gln deamidation isoforms. We also demonstrate, as a novelty, that the sample processing protocol outlined here stabilizes the succinimide intermediate allowing its characterization by LERLIC-MS/MS. Application of LERLIC-MS/MS as shown in this video article can help to elucidate the currently unknown molecular arrays of protein deamidation. Additionally, LERLIC-MS/MS provides further understanding of the enzymatic reactions that encompass deamidation in distinct biological backgrounds.

Here we present a step-by-step protocol of the long-length electrostatic repulsion-hydrophilic interaction chromatography-tandem mass spectrometry (LERLIC-MS/MS) method. This is a novel methodology that enables for the first time quantification and characterization of the glutamine and asparagine deamidation isoforms by shotgun proteomics.

Av tüfeği Proteomics derinlemesine Karakterizasyonu için LERLIC-MS / MS ve Glutamin ölçümü ve Asparajin deamidasyonu

Characterization of protein deamidation is imperative to decipher the role(s) and potentialities of this protein posttranslational modification (PTM) in ...

Structural Characterization of Mannan Cell Wall Polysaccharides in Plants Using PACE

Plant cell wall polysaccharides are notoriously difficult to analyze, and most methods require expensive equipment, skilled operators, and large amounts of purified material. Here, we describe a simple method for gaining detailed polysaccharide structural information, including resolution of structural isomers. For polysaccharide analysis by gel electrophoresis (PACE), plant cell wall material is hydrolyzed with glycosyl hydrolases specific to the polysaccharide of interest (e.g., mannanases for mannan). Large format polyacrylamide gels are then used to separate the released oligosaccharides, which have been fluorescently labeled. Gels can be visualized with a modified gel imaging system (see Table of Materials). The resulting oligosaccharide fingerprint can either be compared qualitatively or, with replication, quantitatively. Linkage and branching information can be established using additional glycosyl hydrolases (e.g., mannosidases and galactosidases). Whilst this protocol describes a method for analyzing glucomannan structure, it can be applied to any polysaccharide for which characterized glycosyl hydrolases exist. Alternatively, it can be used to characterize novel glycosyl hydrolases using defined polysaccharide substrates.

A protocol for the structural analysis of polysaccharides by gel electrophoresis (PACE), using mannan as an example, is described.

Yapısal Mannan hücre duvarı polisakkaritler hızı kullanarak tesislerinde karakterizasyonu

Plant cell wall polysaccharides are notoriously difficult to analyze, and most methods require expensive equipment, skilled operators, and large amounts ...

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used for ATP production. The amphiphilic nature of membrane proteins requires particular attention to their handling, and reconstitution into the natural lipid environment is indispensable when studying membrane transport processes like proton translocation. Here, we detail a method that has been used for the investigation of the proton-pumping mechanism of membrane redox enzymes, taking cytochrome bo3 from Escherichia coli as an example. A combination of electrochemistry and fluorescence microscopy is used to control the redox state of the quinone pool and monitor pH changes in the lumen. Due to the spatial resolution of fluorescent microscopy, hundreds of liposomes can be measured simultaneously while the enzyme content can be scaled down to a single enzyme or transporter per liposome. The respective single enzyme analysis can reveal patterns in the enzyme functional dynamics that might be otherwise hidden by the behavior of the whole population. We include a description of a script for automated image analysis.

Here, we present a protocol to study the molecular mechanism of proton translocation across lipid membranes of single liposomes, using cytochrome bo3 as an example. Combining electrochemistry and fluorescence microscopy, pH changes in the lumen of single vesicles, containing single or multiple enzyme, can be detected and analyzed individually.

Proton pompalama membran enzimler elektrokimya ve floresan mikroskopisi kullanılarak incelenmesi için tek lipozom ölçümleri

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Fully Autonomous Characterization and Data Collection from Crystals of Biological Macromolecules

High-brilliance X-ray beams coupled with automation have&#160;led to the use of synchrotron-based macromolecular X-ray crystallography (MX) beamlines for even the most challenging projects in structural biology. However, most facilities still require the presence of a scientist on site to perform the experiments. A new generation of automated beamlines dedicated to the fully automatic characterization of, and data collection from, crystals of biological macromolecules has recently been developed. These beamlines represent a new tool for structural biologists to screen the results of initial crystallization trials and/or the collection of large numbers of diffraction data sets, without users having to control the beamline themselves. Here we show how to set up an experiment for automatic screening and data collection, how an experiment is performed at the beamline, how the resulting data sets are processed, and how, when possible, the crystal structure of the biological macromolecule is solved.

Here, we describe how to use the automated screening and data collection options available at some synchrotron beamlines. Scientists send cryocooled samples to the synchrotron, and the diffraction properties are screened, the data sets are collected and processed and, where possible, a structure solution is carried out&#8212;all without human intervention.

Tamamen Özerk karakterizasyonu ve biyolojik oluştururlar kristalleri üzerinden veri toplama

High-brilliance X-ray beams coupled with automation have&#160;led to the use of synchrotron-based macromolecular X-ray crystallography (MX) beamlines for ...

Identification of Novel CK2 Kinase Substrates Using a Versatile Biochemical Approach

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets in both physiological and pathological states. CK2 is an evolutionarily conserved serine/threonine kinase with a growing list of hundreds of substrates involved in multiple cellular processes. Due to its pleiotropic properties, identifying and characterizing a comprehensive set of CK2 substrates has been particularly challenging and remains a hurdle in the study of this important enzyme. To address this challenge, we have devised a versatile experimental strategy that enables the targeted enrichment and identification of putative CK2 substrates. This protocol takes advantage of the unique dual co-substrate specificity of CK2 allowing for specific thiophosphorylation of its substrates in a cell or tissue lysate. These substrate proteins are subsequently alkylated, immunoprecipitated, and identified by liquid chromatography/tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). We have previously used this approach to successfully identify CK2 substrates from Drosophila ovaries and here we extend the application of this protocol to human glioblastoma cells, illustrating the adaptability of this method to investigate the biological roles of this kinase in various model organisms and experimental systems.

The objective of this protocol is to label, enrich, and identify substrates of protein kinase CK2 from a complex biological sample such as a cell lysate or tissue homogenate. This method leverages unique aspects of CK2 biology for this purpose.

Kimliği roman CK2 kinaz yüzeylerde çok yönlü bir biyokimyasal yaklaşım kullanarak

The study of kinase-substrate relationships is essential to gain a complete understanding of the functions of these enzymes and their downstream targets ...

Ion Exchange Chromatography (IEX) Coupled to Multi-angle Light Scattering (MALS) for Protein Separation and Characterization

Ion-exchange chromatography with multi-angle light scattering (IEX-MALS) is a powerful method for protein separation and characterization. The combination of the high-specificity separation technique IEX with the accurate molar mass analysis achieved by MALS allows the characterization of heterogeneous protein samples, including mixtures of oligomeric forms or protein populations, even with very similar molar masses. Therefore, IEX-MALS provides an additional level of protein characterization and is complementary to the standard size-exclusion chromatography with multi-angle light scattering (SEC-MALS) technique.
Here we describe a protocol for a basic IEX-MALS experiment and demonstrate this method on bovine serum albumin (BSA). IEX separates BSA to its oligomeric forms allowing a molar mass analysis by MALS of each individual form. Optimization of an IEX-MALS experiment is also presented and demonstrated on BSA, achieving excellent separation between BSA monomers and larger oligomers. IEX-MALS is a valuable technique for protein quality assessment since it provides both fine separation and molar mass determination of multiple protein species that exist in a sample.

Ion Exchange Chromatography IEX Coupled to Multi-angle Light Scattering MALS for Protein Separation and Characterization

This protocol describes the use of high-specificity ion-exchange chromatography with multi-angle light scattering for an accurate molar mass determination of proteins, protein complexes, and peptides in a heterogeneous sample. This method is valuable for quality assessment, as well as for the characterization of native oligomers, charge variants, and mixed-protein samples.

Protein ayrımı ve karakterizasyonu için birden fazla açıyla ışık saçılma (MALS) birleştiğinde iyon Kromatografi (IEX)

Ion-exchange chromatography with multi-angle light scattering (IEX-MALS) is a powerful method for protein separation and characterization. The combination ...

Looking Outwards: Isolation of Cyanobacterial Released Carbohydrate Polymers and Proteins

Cyanobacteria can actively secrete a wide range of biomolecules into the extracellular environment, such as heteropolysaccharides and proteins. The identification and characterization of these biomolecules can improve knowledge about their secretion pathways and help to manipulate them. Furthermore, some of these biomolecules are also interesting in terms of biotechnological applications. Described here are two protocols for easy and rapid isolation of cyanobacterial released carbohydrate polymers and proteins. The method for isolation of released carbohydrate polymers is based on conventional precipitation techniques of polysaccharides in aqueous solutions using organic solvents. This method preserves the characteristics of the polymer and simultaneously avoids the presence of contaminants from cell debris and culture medium. At the end of the process, the lyophilized polymer is ready to be used or characterized or can be subjected to further rounds of purification, depending on the final intended use. Regarding the isolation of the cyanobacterial exoproteome, the technique is based on the concentration of the cell-free medium after removal of the major contaminants by centrifugation and filtration. This strategy allows for reliable isolation of proteins that reach the extracellular milieu via membrane transporters or outer membrane vesicles. These proteins can be subsequently identified using standard mass spectrometry techniques. The protocols presented here can be applied not only to a wide range of cyanobacteria, but also to other bacterial strains. Furthermore, these procedures can be easily tailored according to the final use of the products, purity degree required, and bacterial strain.

Here, protocols for the isolation of cyanobacterial released carbohydrate polymers and isolation of their exoproteomes are described. Both procedures embody key steps to obtain polymers or proteins with high purity degrees that can be used for further analysis or applications. They can also be easily adapted according to specific user needs.

Dışa bakıyor: Siyanobacterial serbest karbonhidrat polimerleri ve proteinleri Izolasyonu

Cyanobacteria can actively secrete a wide range of biomolecules into the extracellular environment, such as heteropolysaccharides and proteins. The ...

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in solution, is a relative technique that relies on the elution volume of the analyte to estimate molecular weight. When the protein is not globular or undergoes non-ideal column interactions, the calibration curve based on protein standards is invalid, and the molecular weight determined from elution volume is incorrect. Multi-angle light scattering (MALS) is an absolute technique that determines the molecular weight of an analyte in solution from basic physical equations. The combination of SEC for separation with MALS for analysis constitutes a versatile, reliable means for characterizing solutions of one or more protein species including monomers, native oligomers or aggregates, and heterocomplexes. Since the measurement is performed at each elution volume, SEC-MALS can determine if an eluting peak is homogeneous or heterogeneous and distinguish between a fixed molecular weight distribution versus dynamic equilibrium. Analysis of modified proteins such as glycoproteins or lipoproteins, or conjugates such as detergent-solubilized membrane proteins, is also possible. Hence, SEC-MALS is a critical tool for the protein chemist who must confirm the biophysical properties and solution behavior of molecules produced for biological or biotechnological research. This protocol for SEC-MALS analyzes the molecular weight and size of pure protein monomers and aggregates. The data acquired serve as a foundation for further SEC-MALS analyses including those of complexes, glycoproteins and surfactant-bound membrane proteins.

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering SEC-MALS

This protocol describes the combination of size exclusion chromatography with multi-angle light scattering (SEC-MALS) for absolute characterization of proteins and complexes in solution. SEC-MALS determines the molecular weight and size of pure proteins, native oligomers, heterocomplexes and modified proteins such as glycoproteins.

Boyutlar-dışlama kromatografi ile çok açılı ışık saçılmasına bağlı proteinlerin karakterizasyonu (SEC-,)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in ...