Lundbeck Vakfı Hibe numarası R155-2013-14113 ve yazarlar Elisabeth Helena Bruun, Sarah Christine Christensen ve Niels M. Kristiansen için teknik yardım kabul etmek istiyorum.

Yazarlar hiçbir çıkar çatışması rapor.

Arıtma ve hızla çoğalmak-in pBEC
Arıtma işlemi sırasında kritik adımlar meninkslerde hızlı ve etkili kaldırma ve ayırma arıtma verimi ve saflık ve model uygun kurulması için önemlidir beyaz ve gri madde içerir. PBECs kullanarak sunulan vitro BBB modeli için Biz Geliştirilmiş ve mekanik homojenizasyon izole gri madde boyutu-seçici yüzdeki, sindirim collagenase ile yalıtım için filtre uygulama dayalı bir arıtma yordam Basitleştirilmiş , Dnaz ve Tripsin, ilk bir kültür, microvessel parçacıkları ile. Genel olarak, arıtma ve Primer hücre ekimi sırasında büyük zorluklardan biri bulaşıcı hücreleri ortadan kaldırılması olduğunu. Birincil beyin endotel hücrelerinin arıtma ile deneyim ayrıntılı kaldırma meninkslerde ve beyaz madde sonuçlarında saflık ve verim kapiller geliştirilmiş, hem de artan endotel hücre büyümesi ve BBB ifade belirtti özellikleri. Bu nedenle, hangi dikkatli (sulci içinde de dahil olmak üzere) meninkslerde sunulan protokolündeki kaldırma kaldırma (Bu fibroblast benzeri özelliklere sahip) leptomeningeal hücrelerinin yanı sıra Arteryel ve arterioler düz kas hücrelerinin sağlamak için tasarlanmıştır büyümeye daha hızlı kültür endotel hücreleri. Aynı şekilde, beyaz madde malzeme indirilmesi daha saf endotel hücre kültürleri, daha az bulaşıcı hücreleri izole kapiller parçalardan büyüyen ile sonuçlandı. Ancak, bu Basitleştirilmiş ve yalıtım için uygulanan hızlı yöntem izole kılcal verimini düşürür ve gri cevherde yalıtım duruma getirilmesi her beyin verimini önemli ölçüde artırabilirsiniz. Bir alternatif arıtma protokolü69' dahil, bir yoğunluk degrade ücretsiz endotel hücreleri izole ve endotel hücre saflık artırmak için kullanılabilir, ama zaman alıcı ve aynı şekilde verim düşürebilirsiniz. Bu arıtma yöntemlerin her ikisi de edilmiş yoğun kullanılan ve karakterize ve MC ve astrocyte ortak kültür (normalde 500-1500 Ω cm2)7,16', yüksek AYLARININ pBEC modelleri oluşturma özellikleri paylaşan 21,22,49,57,70,71.
Monolayers yüksek paracellular restrictiveness ile oluşturmak için deneyim perisitlerden endotel kültürler16' dan ortadan kaldırılmalıdır göstermiştir. Domuz beyin perisitlerden genellikle pBEC katmanları altında büyümeye ve delik endotel katmanlarda sıçan beyin endotel hücreleri72,73kültürleri için gözlemlediği gibi neden olmaz. Kültürler her nasıl, yapmak pBEC perisitlerden daha geniş görünür endotel hücrelerinin ve düzensiz hücre yatılı16ile morfolojisi etkiler eğilimindedir. Beyin endotel hücreleri sızma Taşıyıcılar (örneğin P-glikoprotein) yüksek düzeyde yüzdeki diğer hücre tiplerinde daha hızlı çünkü bulaşıcı hücre sayısı puromisindir tedavi74tarafından azaltılabilir. Fetal veya neonatal buzağı serum iyilik endotel hücrelerinin büyümesini türetilmiş yerine PDS trombosit-türevi büyüme faktörü ve vasküler endotelyal büyüme gibi büyüme faktörlerinin düşük yoğunluklu olduğu gibi Ayrıca, serum plazma kaynaklı (PDS) kullanın faktör, BBB geçirgenliği artırmak ve anjiogenezi14,75,76,77teşvik için gösterilir. İzole kapiller parçaları ilk kültürünü tanıtmak ve bu puromisindir tedavisi (4 µg/mL) ve PDS kullanımı ile birleştirerek, böylece bundan sonra biz olabilir büyük ölçüde bulaşıcı hücreleri arıtma sonra kalan azaltmada başarılı olduk sıkı endotel monolayers geçirgen membran ekler üzerinde kurmak. Kültür yemekleri ve geçirgen membran Ekle yüzeyler üzerinde endotel hücrelerinin en iyi ek sağlamak için bu kollajen tip IV (dan insan plasenta) ve fibronektin kaplama karışımı büyük yayılması artırır gözlenmiştir verimleri ve kombine karışım bu nedenle tercih yalnızca ben78kollajen türünü geleneksel yöntem kullanarak üzerinden.
Hücreleri ve yüksek AYLARININ Vitro BBB manken kurulması farklılaşma
Böylece ortak kültür astrocytes ile fonksiyonel sıkı kavşak inducing ve yüksek AYLARININ değerleri16,57ulaşmak için gerekli değildir MC pBECs genellikle yalıtım, takip birçok BBB temel özellikleri korur. Koşullar içine BBB fenotip endotel hücrelerinin farklılaşması için en iyi duruma getirmek için çaba serum içeren kullanımı dahil 8-CPT-kamp ile (hücre içi kamp seviyesi13artan) hidrokortizon7 takıma orta ve RO 20-1724 (hücre içi kamp düzeyde muhafaza), hangi uygun olarak önceki bulgular74,79 birlikte başarıyla bariyer gerginlik geliştirilmiş ve AYLARININ arttı ve de bir daha geri yüklemek için yardımcı vivo gen ekspresyonu gibi80profil. Ancak, endotel tabakası sıkılaştırma hidrokortizon kullanımı belirli uyaranlara ve yanıt kemoterapi ve sitokinler soruşturma sırasında inflamasyon, için model kullanma amacıyla yanıtta endotel hücrelerinin değiştirebilir hidrokortizon kullanımı kaçınılması gerekir.
Karşılaştırmalı çalışmalar ile MC MC ACM ve astrocyte ile her iki katılımcı laboratuvarlar ve başka bir yerde ortak kültürlerin, astrositik katkı endotel BBB özellikleri geliştirmek ve bariyer gerginlik artan yeteneği gösterilmiştir 21 , 40 , 42 , 49 , 79 , 81 , 82 , 83. pBECs BBB fenotip yüksek gibi ifadesi elde etmek için bir NCC astrocytes ile kurulan ve her ikisi de domuz bulundu ve sıçan birincil astrocytes faydalı, aynı zamanda diğer laboratuvarlar22görülmektedir. Astrocyte NCCs kurulması sırasında ortaya çıkan gerginlik endotel bariyer, w etkisi saflık ve yaş astrocyte kültürlerin deneyimler göstermiştir2-8 hafta, hangi zaman içinde astrocyte Morfoloji içinde gözlenen bir değişiklikle ilişkili olan varlık astrocytes en uygun yaş ith. NCC kurmadan önce günde orta değiştirmek astrocytes için zararlı metabolitleri kaldırmak ve stimülasyon ve bariyer geliştirme etkileyen sinyal faktörler serbest bırakmak astrocytes için yeterli zaman tanımak için tasarlanmıştır. Endotel hücreleri ve astrocytes geçirgen membran Ekle sisteminde ortak kültür bariyer modeli işleme özel dikkat etmek önemlidir. Orta değiştirmek sırasında aspirasyon ve orta eklenmesi ve ekler hareketlerini dikkatle endotel bariyer kesintileri en aza indirmek için yapmanız gerekir.
Tekrarlanabilirlik ve güvenilirlik
Primer hücre vitro modelleri oluşturmak için kullanırken büyük bir meydan okuma kültürler arası yüksek tekrarlanabilirlik ulaşmaktır. Bu tür standardizasyon seçtiğiniz yöntem, yüksek kalite araçları ve reaktifler ve mikrodiseksiyon durumumda bir araya geldi olabilir. Sunulan yöntem için düşük toplu iş toplu iş çeşitlemesiyle yüksek tekrarlanabilirlik bu nedenle son derece sıkı bağlılık açıklanan yordamlara bağlı.
Yerine esnek çubuk elektrotlar azaltmak kullanılan toplu işlemleri ve şişeleri arasında iyi bir tekrarlanabilirlik AYLARININ ölçümleri, doku direnci ölçüm odası veya katı minyatür elektrotlar ile epitel Voltmetreler sırasında elde etmek için gözlenen AYLARININ değerleri değişkenlik. Yüksek AYLARININ değerleri (şekil 4) elde ek olarak sunulan modeli güvenilirliğini karşılık gelen düşük küçük çözünen geçirgenliği (şekil 4) ve pBECs (şekil 5 immunocytochemical karakterizasyonu tarafından onaylandıktan ).
Uygulanan yöntem ve Model sınırlamalar
Transgenik ve minyatür domuzlar kullanımı son yıllarda artmıştır, ama içinde vivo veri miktarını kemirgen modeller için kullanılabilir verilere göre hala sınırlı olduğunu ve bu nedenle vitro domuz verileri karşılaştırmak için bir sorun teşkil vivo sonuçlar. Ancak, domuz Biyoloji Biyoloji insan birçok kurulan laboratuvar hayvanlarının daha yakından yansıtır ve transgenik domuz için model olarak Alzheimer hastalığı-si olmak şimdi be gibi nörolojik hastalıklar eğitim84, kullanılabilirliğini kurulan vivo veri zamanla daha az sorunlu olması beklenen.
Yüzdeki kan akışında taklit etmek için yetersizlik geçerli geçirgen membran ekle sistem modelleri BBB bir kısıtlamasıdır. Vivo, Yamultma stres endotel hücre fizyolojisi bölümü, farklılaşma, geçiş ve Apoptozis85,86gibi birçok yönlerini etkilemeye ve önemli BBB özellikleri gibi etkilemek için gösterilmiştir bileske proteinler ve indüksiyon ve polarizasyon taşıyıcılar61,85,87ifadesi. Bu koşullar tanıtmak, yeni geliştirilen mikrosıvısal sistemleri88,89,90kabul edilebilir.
Vitro geçirgenliği verilerden unstirred su Katmanı (sulu sınır tabaka) etkisi için düzeltmek için yararlı bir yöntem yazılım tabanlı yaklaşım21kullanarak tahmin edilen 'içsel geçirgenliği' vivo, türetmektir. Bu yazılım aynı zamanda detaylı geçirgenliği veri analizi21için kullanılabilir.
Gelecekteki uygulamalar ve yön yöntemi
Nörovasküler birimi bileşenleri inducing ve BBB özellikleri korumak önemli rol oynarlar gösterilmiştir ve geçerli vitro model henüz vivo içinde koşullar, önemli bileşenlerinin tam olarak taklit etmek mümkün olmuştur ve etkileşimleri hala eksik olabilir. Sunulan modeli gelişmekte olan şimdiki çabalar üçlü-kültür modelleri ile her ikisi astrocytes ve perisitlerden ve farklı türlerin hücreleri birleştirerek deneyler oluşturma içerir. Perisitlerden birleşmesiyle defa değil önemli ölçüde bariyer AYLARININ düzeylerini artırmak için gözlenmiştir. Ancak, syngeneic domuz modelleri domuz beyin endotel hücreleri, fare astrocytes ve sıçan perisitlerden bariyer gerginlik ve hallmark proteinler karakteristik beyin ifade kullanarak kültürleri üç katına karşılaştırılabilir olmak gözlenmiştir endotel22. Bir model geliştirmek için insan pluripotent kök hücreler ve yetişkin kök türetme biçimlendirmenizi gerektiren ilaç bulma ve teslim ve/veya21progenitör hücre için BBB modelleri insan hücreleri, in vitro gelecekteki gelişmeler temel alan.

Hücresel yapısı ve fonksiyonu kan - beyin bariyerini
Dolaşım ve merkezi sinir sistemi (MSS) arayüzü BBB CNS microenvironment kontrolünü homoeostatic için anahtar bir düzenleyici site düzgün ve sinir sisteminin korunması için gerekli olan görevi görür. BBB kan damarı Lümen astar endotel hücreleri sitedir. Beyin kılcal, endotel hücreleri karmaşık hücreler arası sıkı kavşaklar oluşturmak ve belirli akını ve sızma taşıyıcılar güçlü polarize ifade şekillerinin çok özel moleküler taşıma kan ve beyin 1arasında olun. Sıkı bağlantı kompleksleri yapısal bileşenlerini aile occludin ve claudin, zonula occludens (ZO) proteinler, cingulin protein içerir ve bileske adezyon molekülleri (sıkışmaları) ilişkili. Claudin 5 paracellular bileske sınırlama içinde özellikle önemlidir. İndüksiyon ve bu karakteristik BBB endotel fenotip Bakımı dahil ile çevredeki hücreleri, perisitlerden, astrocytes, sinir hücreleri ve Bodrum membranlar, hangi beyin endotel ile birlikte form hücreleri de dahil olmak üzere dinamik etkileşimler nörovasküler birim (NVU)2,3. Bu etkileşimler dahil mekanizmaları henüz tam olarak anlaşılmış değil, ancak exchange BBB geçirgenliği modülasyon kısa vadede sağlar ve uzun vadeli BBB özellikleri4indükler hücreleri arasındaki kimyasal sinyallerin içerir. Astrocytes özellikle beyin endotel hücre fenotip için katkıda bulunmak için bilinen ve düzenleyici faktörler gliyal kaynaklı Nörotrofik faktör (hücre içi kampı etkileyen)5, temel fibroblast büyüme faktörü6gibi bir kaynaktır, hidrokortizon7ve dönüştürme büyüme faktörü β (TGF-β)8. TGF-β, etkisini ancak, tartışılan9olmuştur.
Vivo Vitro BBB
İn vivo çalışmalar BBB Biyoloji değerli bilgiler vermeye devam ediyor. Ancak, hücre kültür modelleri ek anlayışlar sağlamak ve sağlık ve hastalığında BBB detaylı moleküler ve fonksiyonel yönlerini anlamak için yararlı araçlar oluşturur. Hücre tipleri ve BBB bileşenlerinin arasındaki karmaşık etkileşimler vitro modellerinde tam olarak ulaşmak zor olsa da, ortada, beyin endotel hücrelerinin ilk arıtma ve uygulama mono-kültür içinde bu yana 10 , 11 , 12, arıtma işlemleri ve BBB koşullarının büyüme kapsamlı geliştirme kültür modelleri, in vivo bariyer büyük benzerlik sonuçlanan cep. Yaygın olarak kullanılan vitro BBB modelleri kemirgen, domuz ve sığır kökenli Primer hücre ve ölümsüzleştirdi hücre satırlarını temel alır. Her model farklı avantajları ve dezavantajları vardır. Karşılaştırma ve model seçimi için doğrulama işaretleri ifade BBB enzimler, ışınlayıcılar, reseptörleri ve yapısal proteinler gibi geçerli kurulan modelleri1, genel bakış, oluşturmak için kullanılır.
Amaç iletişim kuralı
Önemli özelliklerinden biri: BBB bariyer gerginlik ve yüksek AYLARININ henüz çok sayıda mevcut modelleri de vivo içinde düzeylerini yansıtmak değil. Birkaç laboratuar geliştirme ve en iyi duruma getirme katkılarıyla bir araya getiren, bu iletişim kuralının amacı İlköğretim ile birincil pBECs MC ile ya da ezelî ACM veya NCC temel yüksek AYLARININ vitro BBB modeli oluşturmak için bir yöntem sunmaktır astrocytes fare veya domuz kökenli. Modelinin kurulması ve uygulanan yordamlar çabaları bulaşıcı hücreleri ortadan kaldırmak için ve pBECs farklılaşma BBB fenotip içine geliştirmek için içerir. Bu eser güvenilir, yüksek AYLARININ modelleri işyerinde düşük paracellular geçirgenliği ve anahtar sıkı bileske proteinler, taşıyıcılar ve reseptörleri iyi işlev ifadesi ile sonuçlandı. Ancak, üç farklı koşul kültürünün astrocytes beyin endotel hücre fenotip bir faktör olarak, üç farklı fenotipleri beyin endotel hücrelerinin temsil eder. NCC modeli nerede BBB özellikleri maksimal ifade, özellikle bazı özel mekanizmalar ilaç bulma, taşıma çalışmaları ve hücre içi kaçakçılığı, ilgili çalışmaların yanı sıra hücre-hücre etkileşimlerin incelenmesi için yararlıdır avantajlı.
Kökeni ve geçmişi iletişim kuralı
Burada açıklanan pBEC modeli Dr. Louise Morgan ve meslektaşları, hangisinin bir başarılı önceki sığır beyin endotel hücre modeli13tarihinde dayalı tarafından büyük ölçüde (Londra) Eisai laboratuarlarında geliştirilen domuz modeli dayanır. Hücre hazırlık özgün yöntem saflık geliştirmek için subculturing bir adım gelir yüzdeki yakalamak için bir iki aşamalı filtreleme naylon kullanarak kafesleri oldu. Yöntemi önceki gelişiminde en uygun BBB fenotip ve bariyer gerginlik desteklenmiştir orta ACM dahil olmak üzere, büyüme elde edildi. Yöntemine yapılan diğer değişiklikler R. Skinner tarafından Prof N. Rothwell'ın Manchester UK14,15laboratuarında yapılmış. Yöntem Abbott laboratuarı, KCL Londra, nerede Patabendige önemli ölçüde astrocytes veya ACM kullanımı kaçınarak ve puromisindir ile perisitlerden gibi bulaşıcı hücreleri ortadan kaldırarak hazırlamak basit yapılmış tarafından kabul edilmiştir. MC model birkaç önemli şekil-in vivo BBB, etkili sıkı kavşaklar, membran taşıma sistemleri ve reseptör aracılı transcytosis16,17 gibi korunmuş ilk kağıtları doğruladı , 18 , 19 , 20. daha sonra S. Yusof tekrar test astrocyte ortak kültür ve bu belirgin bir biçimde iyileştirilmiş AYLARININ, yani bu şu anda Abbott laboratuarı21' kullanılan tercih edilen varyant bulundu. Model başarıyla oldu M. Nielsen transfer başka değişiklikler nerelerdeydin Aarhus, laboratuarda (Bu iletişim kuralı) tanıttı, ayıklama, tek bir kafes filtrasyon adım ve bir tek filtre kaplama adım kullanarak kolaylaştırmaya gri de dahil olmak üzere önemli kollajen ve fibronektin birleştirerek. Domuz astrocytes (Bu iletişim kuralı) yalıtım için uygulanan prosedür Thomsen ve ark22tarafından açıklanan Aalborg, T. Moos laboratuvarda tarafından geliştirilen iletişim kuralları dayanıyordu. AYLARININ ve Londra ve Aarhus içinde oluşturulan modeli diğer özelliklerini hangi model labs arasında kolayca aktarılır ve iyi dikkatli gözlem ve rasyonalizasyon yöntemi adımlardan yanıt kavramına güven ödünç benzerdir. Nitekim, S. Yusof şimdi yerel koşullara ve doku kaynakları için daha fazla ayarlama dahil bir tropik ülke (Malezya) yılında23, MC model kurmuştur.
Avantajları alternatif yöntemler üzerinde ve şu anda modelleri kurulan
Sığır ve kemirgen kökenli beyin endotel hücrelerine kıyasla, pBECs yalıtım24takip vivo BBB fenotip kaybı daha düşük bir oranı sahip olmanın avantajı sağlar. Ayrıca, pBECs MC (800 Ω cm2)16 monolayers bEND.5 ve bEND.3 (50 Ω cm2) gibi hücre hatları için yaygın olarak bildirilen düzeyleri ile karşılaştırıldığında bile yetiştirilen nispeten sıkı endotel engelleri, şekillendirme yeteneğine 25 , 26 , 27, cEND (300-800 Ω cm2)28,29,30ve cerebEND (500 Ω cm2)29,31,32ve birincil beyin fare (100-300 Ω cm2) endotel hücreleriSS = "xref" > 33,34,35,36 ve fare (100-300 Ω cm2)37,38. Bununla birlikte, AYLARININ bağımlılık üzerinde arıtma ve kültür yordamlar göstermektedir. Çoğu durumda, ACM eklenmesi veya astrocytes ile ortak kültür endotel Katmanlar1gerginlik endotel hücreleri ve artış ayırt edici etkileri gösterir. Yine de, çabaları ile kodlamayla koşulları en iyi duruma getirmek için sadece sığır tabanlı modeller AYLARININ değerleri domuz tabanlı modeller (800 Ω cm2 ' MC, en çok astrocyte ortak kültür 2500 Ω cm2 Ortalamalar) karşılaştırılabilir göstermiştir13 ,39,40,41,42,43,44,45. Birincil sığır beyin üzerine alan modelleri olarak endotel hücreleri büyük varyasyon, laboratuvarlar14,45,46,47,48içinde ve arasında göstermiştir, tekrarlanabilirlik bir sorun olabilir. Rapor burada pBEC modelinde katkıda bulunan laboratuvarlar çok benzer AYLARININ ve paracellular geçirgenlik değerleri düşük değişkenliği hem de laboratuvarlar arasında ile elde ettik. Bu nedenle, burada sunulan yöntemiyle düşük değişkenliği ile güçlü bir modeli kurmak diğer laboratuarlar için mümkün olmalıdır. Sıkı endotel Katmanlar oluşturan ek olarak, pBECs modelleriyle daha önce ifade ve sıkı kavşak proteinler, fonksiyonel BBB taşıyıcılar, reseptörleri ve enzimler, gösterdiği için uygunluğunu test bir dizi çalışmalar15 tarafından doğrulanmış , 16 , 17 , 19 , 20 , 22 , 49 , 50 , 51 , 52 , 53 , 54 , 55 , 56 , 57 , 58 , 59. Ayrıca, yayınlanmamış transcriptome veri pBECs ortak kültürü üzerinde BBB taşıyıcılar ve reseptörleri (yayınlanmamış sonuçları, Nielsen vd.) beklenen bir profili gösterir.
Domuz tabanlı BBB modeli daha fazla avantajı vardır genom, anatomi, Fizyoloji ve hastalık ilerleme domuz yansıtmak olumlu olan60, özellikleri için kurulan diğer modellere kıyasla daha yüksek bir dereceye insan biyolojisi ilaç endüstrisi. Domuz beyin et endüstrisi ortak bir yan ürün olduğu için onlar deneyler için gerekli ve bir domuz beyin üzerinden yüksek arıtma verimi sağlayan hayvanlar sayısını en aza indirme endotel hücreleri, beyin kolayca erişilebilir bir kaynak oluşturmaktadır. Arıtma ve Primer hücre tarımı biraz zaman alıcı ve model kurma standardizasyon uzmanlık gerektirir rağmen Primer hücre en güvenilir BBB modelleri oluşturma. Bariyer gerginlik, ışınlama ifade profilleri ve microenvironment yönetmelik deneysel bulgular vivo içinde61, yansıtmıyor gibi ölümsüzleştirdi hücre hatları yerine, önemli özellikler olarak olamaz 62. vitro modeller canlı hücre daha yüksek çözünürlükte görüntüleme, görselleştirme hücre içi süreçlerin bir yakın yaklaşım kullanarak hedefleri örneklenen veya gözlenen hücrelere izin vererek mümkün hale avantajı sağlamak yüksek büyütme ile daha iyi optik kalitesi63. İki fotonlu mikroskobu yaşayan hayvanlarda kullanımı böyle değildir. Ayrıca, vitro modelleri hücreleri, görselleştirme tagged proteinlerin ve onların ticareti soruşturma izin transfect olanağı sağlar.
Uygulama modeli
BBB işlevi sabit değildir ve dinamik olarak fizyolojisi ve patoloji modülasyonlu. Nörodejeneratif, dahil olmak üzere birçok nörolojik hastalıklarda enflamatuar ve bulaşıcı hastalıklar, bozulma ve BBB geçirgenliği artmıştır gözlenen64,65,66,67 . Azaltmak ve hastalık ilerleme ve sonraki zarar önlemek için kimlik ve BBB modülasyon temel moleküler mekanizmaları karakterizasyonu büyük önemi vardır. Bu bağlamda güvenilir vitro modelleri ilaç endüstrisi tarafından yüksek talep ve ayrıca MSS ilaçlara geçirgenliği BBB öngörmede önemli rol oynarlar. Geçirgenliği ekran hizmet veren herhangi bir vitro model bir kısıtlayıcı paracellular yol, bir fizyolojik gerçekçi hücre mimarisi ve ışınlama mekanizmaları68fonksiyonel ifade görüntülenmelidir. Önceki çalışmalar16,17,57ve paracellular geçirgenliği ve ifade burada TJ ve AJ proteinlerin gösterdi, sunulan model bu kriterleri karşılayan ve BBB bir aralığı için uygundur çalışmalar her iki normal Fizyoloji ve patoloji. Sunulan arıtma ve ekimi yönteminin güçlü basitlik birleşimini içerir ve tekrarlanabilirlik ve yetenek astrositik dahil bir elde edilen sağlam ve güvenilir yüksek AYLARININ vitro BBB modeli ile etkiler. Bunun amacı, astrocytes, domuz ve sıçan kökenli pBECs benzer bir şekilde22BBB fenotip artırmak için gösterilmiştir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F1141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen IV</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C5533</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F-12</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE12-719F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/Low Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D6046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco Invitrogen</td>
			<td>15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma derived serum (PDS)</td>
			<td>First Link UK Ltd.</td>
			<td>60-00-89</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Gibco Invitrogen</td>
			<td>10-270-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin/EDTA</td>
			<td>Gibco Invitrogen</td>
			<td>15090-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3393</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8833</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8-CPT-cAMP</td>
			<td>Biolog</td>
			<td>C010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RO 20-1724</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B8279</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin Sulfate</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-518Z</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>34896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EtOH</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20,824,296</td>
			<td>Mix the 70 % solution from the 96 % EtOH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNAse 1</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D4513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase CLS2</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6885</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddH2O</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Made with Elga System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T75 flasks</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>156499</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar Transwell inserts (Cell permeable membrane inserts)</td>
			<td>Costar</td>
			<td>CLS3401</td>
			<td>12-well plate, 12 mm diameter, 0.4 &#956;m polycarbonate membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml centrifuge tubes</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>188271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml centrifuge tubes</td>
			<td>Cellstar</td>
			<td>227261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cryo vials</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>377224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 ml bottle</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>159910/159920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpels</td>
			<td>Swann-Morten</td>
			<td>REF0211</td>
			<td>Type 24</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue homogenizer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D9188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>140 &#956;m filters</td>
			<td>MERCK</td>
			<td>NY4H04700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#956;m filters</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndOhm chamber system</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>ENDOHM-12</td>
			<td>EndOhm chamber for 12mm Culture Cups</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOM2 electrode system</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>300523+STX100C</td>
			<td>TEER measurement system with rigid STX-100C electrode pair</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Long needle</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td>Attach to a syringe</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-tip curved forceps</td>
			<td>KLS Martin</td>
			<td>12-409-12-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Broad tip forceps</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82027-390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filter holder</td>
			<td>MERCK Milipore</td>
			<td>Swinnex-47</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml syringe</td>
			<td>Braun</td>
			<td>4617509F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml syringe</td>
			<td>Terumo</td>
			<td>SSt20ESI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Occludin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab31721</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-p120 Catenin antibody</td>
			<td>BD Transduction laboratories</td>
			<td>610133</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-ZO-1 antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>61-7300</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Claudin 5 antibody</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SAB4502981</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti rabbit IgG conjugated with Alexa Flour 568</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A10042</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey anti mouse IgG conjugated with Alexa Flour 488</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>A21202</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEC100X250UC</td>
			<td>0.15&#181;l/ml final working conc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lucifer Yellow</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L0144</td>
			<td>10 &#181;g/ml final working conc</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

improved method for the establishment of an in vitro blood-brain barrier model based on porcine brain endothelial cells

Bu iletişim kuralının amacı ve ekimi pBECs ve vitro kan - beyin bariyerini (BBB) modelleri pBECs mono-kültür (MC), MC astrocyte şartına orta (ACM), ile temel kurmak için en iyi duruma getirilmiş bir yordam sunar ve ortak kültür (NCC) astrocytes, domuz ile temas ya da sıçan kökenli. pBECs izole ve parçaları kapiller beyin cortices aile içi domuz 5-6 aylık üzerinden kültürlü. Bu parçaları dikkatli çıkarılması meninkslerde, yalıtım ve gri madde, filtrasyon, Enzimatik sindirim ve Santrifüjü homojenizasyon tarafından saf. Daha fazla bulaşıcı hücreleri ortadan kaldırmak için kapiller parçaları ile puromisindir içeren kültürlü orta. % 60-95 birleşmesi, kapiller parçalardan büyüyen pBECs için pasajlı zaman geçirgen membran filtre ekler ve modellerinde kurdu. Bariyer gerginlik ve pBECs BBB karakteristik fenotip artırmak için hücreleri aşağıdaki farklılaşma faktörler ile tedavi edildi: membran permeant 8-CPT-kampı (burada kısaltılmış kampı), hidrokortizon ve bir fosfodiesteraz inhibitörü, RO-20-1724 (RO). Yordamı bir 9-11 gün boyunca yürütülen ve NCC modeli oluşturulurken, astrocytes 2-8 hafta önceden kültürlü. Bağlılık protokolündeki açıklanan yordamlara endotel katmanları kurulması son derece kısıtlı paracellular geçirgenliği ile izin verdi, bir ortalama transendothelial elektriksel direnç (AYLARININ) 1249 ± 80 Ω cm gösterilen NCC ile model 2ve paracellular geçirgenliği (Papp) için Lucifer sarı, 0.90 10-6 ± 0,13 10-6 cm sn-1 (± SEM, yani n = 55). Daha fazla bu pBEC fenotip değerlendirilmesi gösterdi sıkı bileske proteinler claudin 5, iyi ifade ZO-1, occludin ve adherens junction protein p120 catenin. Sunulan model bir dizi sağlık ve hastalığında BBB çalışmaları için kullanılabilir ve çok kısıtlayıcı paracellular geçirgenliği ile bu model taşıma ve hücre içi kaçakçılığı çalışmalar için uygundur.

BBB Vitro modelleri kurulması
Sunulmuştur, en iyi duruma getirilmiş yönteminde pBECs tarımı ve geçirgen membran Ekle sisteminin kurulması MC veya ACM veya NCC olmadan astrocytes (şekil 1) ile 9-11 gün (Şekil 2) bir süre için gerçekleştirilmiştir. Endotel hücre seçimi için saflaştırılmış kapiller parçalarının ilk bir kültür puromisindir tedavi için en fazla 5 gün, hangi en bulaşıcı hücreleri ortadan ve seklinde endotel hücrelerinden büyüme terfi ile kombine edildi kılcal damar parçaları (şekil 3A-C). Gün 4-6, pBECs gibi üst üste, büyüyen % 60-95'confluency için iletişim inhibe, boyuna hizalanmış hücreleri hızla. Hücreleri istediğiniz confluency ulaşmıştı zaman pBECs kollajen IV ve fibronektin kaplı kaplı geçirgen membran Ekle filtresi membranlar (1.12 cm2 yüzey alanı, 0.4 µm gözenekleri) 1.1 x 105 hücreleri/INSERT, yoğunluğu, hangi onlar Normalde Konfluent monolayers 4 gün sonra (8-10 yalıtım sonrası) kurdu. Ne zaman pBECs ortak kültür, fare veya domuz kökenli astrocytes Poli-L-lizin kaplı alt kuyular için en az 2 hafta NCC (şekil 3D) başlamadan önce üzerinde kaplama. NCC kurarken, 2-8 hafta boyunca kültürlü astrocytes pBECs BBB fenotip teşvik için en iyi desteği sağlamak deneyimler göstermiştir; Bu süre içinde astrocytes bir petek benzeri yapı (şekil 3E-F) düzenlenmiş hücrelerle Konfluent kültürler kurdu. Gün 4 geçirgen membran ekle sistem modeli (gün 8-10 mesaj izolasyon), hücre kampı, hidrokortizon ve RO bariyer gerginlik ve BBB karakteristik ifade deseninin taşıyıcılar, sıkı bileske proteinlerin artırmak için teşvik ve reseptörleri.
PBEC fenotip karakterizasyonu ve Paracellular geçirgenliği
AYLARININ ölçüm ile kombine görsel hücre muayene rutin confluency ve darlık deneyler önce geçirgen membran ekler üzerinde büyüyen endotel hücre tabakasının değerlendirmek için en güvenilir yolu vardır. Şekil 4 küçük molekül uyuşturucu geçirgenliği BBB yoluyla değerlendirmek için belirgin geçirgenliği21 ile (Papp, kombine (iyonik geçirgenliği yansıtan) AYLARININ denetim parametrelerini deneylerin sonuçlarını iki serisi gösterir cm s-1) radiolabeled Sükroz veya tipik küçük ilaç molekülleri paracellular geçirgenliği yansıtan boya izleyici Lucifer sarı (LY), (~ 200-600 Da). Bir bileşik ile a Papp Papp Sükroz veya LY (bağlı olarak ilaç molekül ağırlığı) daha büyük ilgi transcellular geçirgenliği ve/veya taşıma hücreler boyunca hatırlatıyoruz. Fare astrocytes, pBEC iyi toplu halde kültürlü pBECs ile eklediği geçirgen membran içinde şekil 4 gösterir (örneğin burada LY ayarla) TEERs Aralık 500-2000 Ω cm2, birkaç tane daha yüksek veya düşük oluşturacaktır. Bazı parçalar, protokol, öğrenme özellikle erken evrelerinde çevresinde alt TEERs olabilir 100-900 Ω cm2 (örneğin burada Sükroz ayarla). AYLARININ ölçüm sağlar örneğin AYLARININ başlayan filtreler, seçim &#62; 500 Ω cm2, ve aralığı, gösterilen AYLARININ üzerinde Papp nispeten AYLARININ, bu deneyler için yeterince sıkı bariyer katman göstergesidir bağımsızdır. Geçirgenliği ölçüm için protokol çözünen/yapı türüne göre değişir. NCC küçük moleküllerin geçirgenliği ölçüm yordamı açıklaması için bir protokol Yusof, SR, et açıklanmıştır. Al21. Değerlendirme ifade NCC içinde pBECs sıçan astrocytes ile sıkı kavşak proteinlerin hücre-hücre kavşak boyunca claudin 5, occludin ve ZO-1 yerelleştirme ayirt (şekil 5A-C) tarafından gösterildiği gibi gösterdi. Ayrıca, adherens junction protein p120 catenin hücre-hücre kavşak (şekil 5 d) iyi tanımlanmış dağıtım gösterdi.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56277/56277fig1.jpg"> 
Şekil 1: uygulanan tüp bebek BBB modellerin şematik gösterim. Geçirgen membran şematik gösterimi MC (A), MC ile ACM (B)ve astrocytes (C)ile NCC pBECs sistem modelleri ekleyin. MC pBEC büyüme orta veya ACM uygulanmıştır alt wells ise NCC ekler pBECs ile wells 2-8-hafta-yaşlı astrocytes ile yerleştirildi. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56277/56277fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56277/56277fig2.jpg"> 
Şekil 2: akış şeması pBEC yetiştirme ve sunulan modeller kurulması sırasında ana adımlardan. Bir bakış ve zaman çizelgesi yöntemi için bu şematik sunu pBECs kodlamayla prosedürü ve kuruluş sunulan modellerin Yani MC ile ya da ezelî ACM ve NCC astrocytes ile ana adımları özetlemektedir. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56277/56277fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56277/56277fig3.jpg"> 
Şekil 3: ilk pBECs ve sıçan astrocytes kültürleri temsilcisi saat ders. Faz kontrast mikroskobu görüntüler kültürler pBECs (A-C) ve astrocytes (D-F) izlendi 5 gün içinde. Kılcal damar parçaları kılcal damarlar ve bulaşıcı hücrelerin varlığı gösterdi ilk kültür ilk gününde saf (A, gün 1), hangi sonra orta değiştirmek 2 gün ve büyüme, seçim için pBECs, gösterdi, ek bir gün onların büyüme kapiller parçalardan başlayarak (B, gün 3). PBECs Konfluent monolayers genellikle gün 4-ne zaman pBECs seklinde Morfoloji gösterdi ve boyuna hizalanmış 6'da, elde edildi (C). Alt numaralı seribaşı sıçan astrocytes normalde Konfluent katmanlara 5 gün (D-F)içinde hızla kuyuları ve NCC modelleri için 2 hafta sonra büyüme kullanılmıştır. Ölçek çubuğu tüm resimler için: 200 µm. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56277/56277fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56277/56277fig4.jpg"> 
Şekil 4: sıkı kavşak bütünlüğünü pBECs. Belirgin geçirgenliği (Papp) pBECs için paracellular işaretleri sukroz (MW 342.5 14C-etiketli, 14,8-25,9 GBq/mmol) ve Lucifer sarı (MW 521.57, 10 µg mL-1), çizilen AYLARININ karşı. pBECs 1.12 cm2 geçirgen membran ekleme filtreleri sıçan astrocytes iyi ve apikal odasına eklendi işaretleri tabanındaki yukarıda yetiştirilmiştir. Sonra 1 saatte 37 ve #730; C, Bazal odası işaretleyicisinde görünümünü hesaplanan ölçülü ve apikal-için-Bazal Papp (x 10-6 cm sn-1) yapıldı. AYLARININ ölçülen &#62; 3 PappSTX100C EVOM elektrotlar, kullanarak, boş geçirgen membran Ekle filtresi ile direnç 150 Ω. için ortalama AYLARININ Lucifer sarı veri kümesinin düzeltilmiş önce h oldu 1249 ± 80 Ω cm2 (± SEM, yani n = 55). <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56277/56277fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56277/56277fig5.jpg"> 
Şekil 5: pBECs karakterizasyonu Immunocytochemical. 1.12 cm2 geçirgen membran INSERT üzerinde yetiştirilen pBECs için filtre sıçan astrocytes 5 (B) Occludin (C) ZO-1 temel şey, sıkı bağlantı bileşenleri (A) Claudin ayirt mikroskobu analizi ekler, ve adherens junction protein (D) p120 catenin hücre-hücre kavşaklar iyi tanımlanmış yerelleştirme gösterdi ve Konfluent beyin endotel hücre katmanları seklinde, üst üste hücreleri ile ortaya çıkar. Ölçek çubuğu tüm resimler için: 10 µm. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56277/56277fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells at JoVE.com

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

Yöntem bir Vitro kan - beyin bariyerini modeli domuz beyin endotel hücreleri temel alan kurulması için geliştirilmiş

Protokol amacı birincil domuz beyin endotel hücreleri (pBECs) temel alan bir vitro kan - beyin bariyerini (BBB) modeli kurulması için en iyi duruma getirilmiş bir yordam sunmaktır. Modeli gösterir yüksek tekrarlanabilirlik, yüksek gerginlik ve taşıma ve hücre içi ilaç bulma gelen kaçakçılığı için uygundur.

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) ...

improved-method-for-establishment-an-vitro-blood-brain-barrier-model

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Medicine

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

14.7K Görüntüleme.  Aarhus University. Protokol amacı birincil domuz beyin endotel hücreleri (pBECs) temel alan bir vitro kan - beyin bariyerini (BBB) modeli kurulması için en iyi duruma getirilmiş bir yordam sunmaktır. Modeli gösterir yüksek tekrarlanabilirlik, yüksek gerginlik ve taşıma ve hücre içi ilaç bulma gelen kaçakçılığı için uygundur.

Video: Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

MRI-guided Disruption of the Blood-brain Barrier using Transcranial Focused Ultrasound in a Rat Model

Focused ultrasound (FUS) disruption of the blood-brain barrier (BBB) is an increasingly investigated technique for circumventing the BBB1-5. The BBB is a significant obstacle to pharmaceutical treatments of brain disorders as it limits the passage of molecules from the vasculature into the brain tissue to molecules less than approximately 500 Da in size6. FUS induced BBB disruption (BBBD) is temporary and reversible4 and has an advantage over chemical means of inducing BBBD by being highly localized. FUS induced BBBD provides a means for investigating the effects of a wide range of therapeutic agents on the brain, which would not otherwise be deliverable to the tissue in sufficient concentration. While a wide range of ultrasound parameters have proven successful at disrupting the BBB2,5,7, there are several critical steps in the experimental procedure to ensure successful disruption with accurate targeting. This protocol outlines how to achieve MRI-guided FUS induced BBBD in a rat model, with a focus on the critical animal preparation and microbubble handling steps of the experiment.

Microbubble-mediated focused ultrasound disruption of the blood-brain barrier (BBB) is a promising technique for non-invasive targeted drug delivery in the brain1-3. This protocol outlines the experimental procedure for MRI-guided transcranial BBB disruption in a rat model.

Sıçan Modelinde Transkraniyal Odaklanmış Ultrason kullanarak Kan-beyin bariyeri MRG eşliğinde bozulması

Focused ultrasound (FUS) disruption of the blood-brain barrier (BBB) is an increasingly investigated technique for circumventing the BBB1-5. The BBB is a ...

Tıp

Rat Model of Blood-brain Barrier Disruption to Allow Targeted Neurovascular Therapeutics

Endothelial cells with tight junctions along with the basement membrane and astrocyte end feet surround cerebral blood vessels to form the blood-brain barrier1. The barrier selectively excludes molecules from crossing between the blood and the brain based upon their size and charge. This function can impede the delivery of therapeutics for neurological disorders. A number of chemotherapeutic drugs, for example, will not effectively cross the blood-brain barrier to reach tumor cells2. Thus, improving the delivery of drugs across the blood-brain barrier is an area of interest.
The most prevalent methods for enhancing the delivery of drugs to the brain are direct cerebral infusion and blood-brain barrier disruption3. Direct intracerebral infusion guarantees that therapies reach the brain; however, this method has a limited ability to disperse the drug4. Blood-brain barrier disruption (BBBD) allows drugs to flow directly from the circulatory system into the brain and thus more effectively reach dispersed tumor cells. Three methods of barrier disruption include osmotic barrier disruption, pharmacological barrier disruption, and focused ultrasound with microbubbles. Osmotic disruption, pioneered by Neuwelt, uses a hypertonic solution of 25% mannitol that dehydrates the cells of the blood-brain barrier causing them to shrink and disrupt their tight junctions. Barrier disruption can also be accomplished pharmacologically with vasoactive compounds such as histamine5 and bradykinin6. This method, however, is selective primarily for the brain-tumor barrier7. Additionally, RMP-7, an analog of the peptide bradykinin, was found to be inferior when compared head-to-head with osmotic BBBD with 25% mannitol8. Another method, focused ultrasound (FUS) in conjunction with microbubble ultrasound contrast agents, has also been shown to reversibly open the blood-brain barrier9. In comparison to FUS, though, 25% mannitol has a longer history of safety in human patients that makes it a proven tool for translational research10-12.
In order to accomplish BBBD, mannitol must be delivered at a high rate directly into the brain's arterial circulation. In humans, an endovascular catheter is guided to the brain where rapid, direct flow can be accomplished. This protocol models human BBBD as closely as possible. Following a cut-down to the bifurcation of the common carotid artery, a catheter is inserted retrograde into the ECA and used to deliver mannitol directly into the internal carotid artery (ICA) circulation. Propofol and N2O anesthesia are used for their ability to maximize the effectiveness of barrier disruption13. If executed properly, this procedure has the ability to safely, effectively, and reversibly open the blood-brain barrier and improve the delivery of drugs that do not ordinarily reach the brain 8,13,14.

Blood-brain barrier disruption aids the delivery of certain drugs to the brain. Mannitol delivered intra-arterially shrinks cells surrounding blood vessels in order to physically disrupt the barrier.

Kan-beyin bariyer bozulması arasında Rat Modeli Nörovasküler Therapeutics Hedefli izin ver için

Endothelial cells with tight junctions along with the basement membrane and astrocyte end feet surround cerebral blood vessels to form the blood-brain ...

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells (cEND) as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

Due to the high mortality incident brought about by traumatic brain injury (TBI), methods that would enable one to better understand the underlying mechanisms involved in it are useful for treatment. There are both in vivo and in vitro methods available for this purpose. In vivo models can mimic actual head injury as it occurs during TBI. However, in vivo techniques may not be exploited for studies at the cell physiology level. Hence, in vitro methods are more advantageous for this purpose since they provide easier access to the cells and the extracellular environment for manipulation.
Our protocol presents an in vitro model of TBI using stretch injury in brain microvascular endothelial cells. It utilizes pressure applied to the cells cultured in flexible-bottomed wells. The pressure applied may easily be controlled and can produce injury that ranges from low to severe. The murine brain microvascular endothelial cells (cEND) generated in our laboratory is a well-suited model for the blood brain barrier (BBB) thus providing an advantage to other systems that employ a similar technique. In addition, due to the simplicity of the method, experimental set-ups are easily duplicated. Thus, this model can be used in studying the cellular and molecular mechanisms involved in TBI at the BBB.

Stretch in Brain Microvascular Endothelial Cells cEND as an In Vitro Traumatic Brain Injury Model of the Blood Brain Barrier

In vitro traumatic brain injury models are being developed to reproduce in vivo brain deformation. Stretch-induced injury has been employed for astrocytes, neurons, glial cells, aortic, and brain endothelial cells. However, our system uses a blood brain barrier (BBB) model that possesses properties constituting a legitimate model of the BBB to establish an in vitro&#160;TBI model.

Bir olarak beyin mikrovasküler endotel hücreleri (cend) olarak gerin<em&gt; In Vitro</emKan Beyin Bariyer&gt; Travmatik Beyin Hasarı Modeli

Due to the high mortality incident brought about by traumatic brain injury (TBI), methods that would enable one to better understand the underlying ...

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and characterize a highly reproducible rat syngeneic in vitro model of the BBB using co-cultures of primary rat brain endothelial cells (RBEC) and astrocytes to study receptors involved in transcytosis across the endothelial cell monolayer. Astrocytes were isolated by mechanical dissection following trypsin digestion and were frozen for later co-culture. RBEC were isolated from 5-week-old rat cortices. The brains were cleaned of meninges and white matter, and mechanically dissociated following enzymatic digestion. Thereafter, the tissue homogenate was centrifuged in bovine serum albumin to separate vessel fragments from nervous tissue. The vessel fragments underwent a second enzymatic digestion to free endothelial cells from their extracellular matrix. The remaining contaminating cells such as pericytes were further eliminated by plating the microvessel fragments in puromycin-containing medium. They were then passaged onto filters for co-culture with astrocytes grown on the bottom of the wells. RBEC expressed high levels of tight junction (TJ) proteins such as occludin, claudin-5 and ZO-1 with a typical localization at the cell borders. The transendothelial electrical resistance (TEER) of brain endothelial monolayers, indicating the tightness of TJs reached 300 ohm&#183;cm2 on average. The endothelial permeability coefficients (Pe) for lucifer yellow (LY) was highly reproducible with an average of 0.26 &#177;&#160;0.11 x 10-3 cm/min. Brain endothelial cells organized in monolayers expressed the efflux transporter P-glycoprotein (P-gp), showed a polarized transport of rhodamine 123, a ligand for P-gp, and showed specific transport of transferrin-Cy3 and DiILDL across the endothelial cell monolayer. In conclusion, we provide a protocol for setting up an in vitro BBB model that is highly reproducible due to the quality assurance methods, and that is suitable for research on BBB transporters and receptors.

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier BBB: A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The aim of the present study was to validate the reproducibility of an in vitro BBB model involving a rat syngeneic co-culture of endothelial cells and astrocytes. The endothelial cell monolayer presented high TEER and low LY permeability. Expression of specific TJ proteins, functional responses to inflammation and functionality of transporters and receptors were assessed.

Ayarlama-up bir<em&gt; In Vitro</emSıçan Kan-beyin bariyerinin&gt; Model (BBB): BBB geçirimsizliği ve Reseptör aracılı Ulaştırması Bir Odak

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and ...

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As such, primary or &#39;neuronal-like&#39; cell culture systems are commonly utilized. While&#160;these systems are relatively easy to work with, and are useful model systems in which various functional outcomes (such as cell death) can be readily quantified, the examined outcomes and pathways in cultured immature neurons (such as excitotoxicity-mediated cell death pathways) are not necessarily the same as those observed in mature brain, or in intact tissue. Therefore, there is the need to develop models in which cellular mechanisms in mature neural tissue can be examined. We have developed an in vitro technique that can be used to investigate a variety of molecular pathways in intact nervous tissue. The technique described herein utilizes rat cortical tissue, but this technique can be adapted to use tissue from a variety of species (such as mouse, rabbit, guinea pig, and chicken) or brain regions (for example, hippocampus, striatum, etc.). Additionally, a variety of stimulations/treatments can be used (for example, excitotoxic, administration of inhibitors, etc.). In conclusion, the brain slice model described herein can be used to examine a variety of molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.

Excitotoxic Stimulation of Brain Microslices as an In vitro Model of Stroke

We have developed a brain slice model which can be used to examine molecular mechanisms involved in excitotoxicity-mediated brain injury.&#160;This technique generates viable mature brain tissue and reduces animal numbers required for experimentation, whilst keeping the neuronal circuitry, cellular interactions, and postsynaptic compartments partly intact.

Bir olarak Beyin Microslices arasında excitotoxic uyarılması<em&gt; In vitro</em&gt; İnme Model

Examining molecular mechanisms involved in neuropathological conditions, such as ischemic stroke, can be difficult when using whole animal systems. As ...

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is known to contribute significantly to the morbidity and mortality associated with ischemic strokes. Ischemic cerebrovascular accidents account for 80% of all strokes. A common cause of IR injury is the rapid inflow of fluids following an acute/chronic occlusion of blood, nutrients, oxygen to the tissue triggering the formation of free radicals.
Ischemic stroke is followed by blood-brain barrier (BBB) dysfunction and vasogenic brain edema. Structurally, tight junctions (TJs) between the endothelial cells play an important role in maintaining the integrity of the blood-brain barrier (BBB). IR injury is an early secondary injury leading to a non-specific, inflammatory response. Oxidative and metabolic stress following inflammation triggers secondary brain damage including BBB permeability and disruption of tight junction (TJ) integrity.
Our protocol presents an in vitro example of oxygen-glucose deprivation and reoxygenation (OGD-R) on rat brain endothelial cell TJ integrity and stress fiber formation. Currently, several experimental in vivo models are used to study the effects of IR injury; however they have several limitations, such as the technical challenges in performing surgeries, gene dependent molecular influences and difficulty in studying mechanistic relationships. However, in vitro models may aid in overcoming many of those limitations. The presented protocol can be used to study the various molecular mechanisms and mechanistic relationships to provide potential therapeutic strategies. However, the results of in vitro studies may differ from standard in vivo studies and should be interpreted with caution.

Oxygen-Glucose Deprivation and Reoxygenation as an In Vitro Ischemia-Reperfusion Injury Model for Studying Blood-Brain Barrier Dysfunction

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is associated with a high rate of morbidity and mortality. The goal of the in vitro model of oxygen-glucose deprivation and reoxygenation (OGD-R) described here is to assess the effects of ischemia reperfusion injury on a variety of cells, particularly in blood-brain barrier (BBB) endothelial cells.

Bir oksijen-Glukoz Yoksunluk ve reoksijenizasyonun<em&gt; In Vitro</em&gt; İskemi-Reperfüzyon Modeli incelenmesi Kan-Beyin Bariyeri Disfonksiyon için

Ischemia-Reperfusion (IR) injury is known to contribute significantly to the morbidity and mortality associated with ischemic strokes. Ischemic ...

An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice

Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity is a commonly used model to study both acute lung injury and fibrosis, and multiple methods have been developed for administering bleomycin (and other toxic agents) into the lungs. However, many of these approaches, such as transtracheal instillation, have inherent drawbacks, including the need for strong anesthetics and survival surgery. This paper reports a quick, reproducible method of intratracheal intubation that involves mild inhaled anesthesia, visualization of the trachea, and the use of a surrogate spirometer to confirm exposure. As a proof of concept, 8-12 week old C57BL/6 mice were administered either 2.0 U/kg of bleomycin or an equivalent volume of PBS, and both damage and fibrotic endpoints were measured post-exposure. This procedure allows researchers to treat a large cohort of mice in a relatively short period with little expense and minimal post-procedure care.

This article presents a rapid and simple method for administering bleomycin directly into the mouse trachea via intubation. Key advantages of this method are that it is highly reproducible, easy to master, and does not require specialized equipment or lengthy recovery times.

Farelerde Trakea hızlı intübasyon için geliştirilmiş bir yöntem

Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity ...

An Anesthesia, Surgery, and Harvest Method for the Evaluation of Transpedicular Screws Using an In Vivo Porcine Lumbar Spine Model

Pedicle screw fixation is the gold standard for the treatment of spinal diseases. However, many studies have reported the issue of loosening pedicle screws after spinal surgery, which is a serious concern. To address this problem, diverse types of pedicle screws have been examined to identify those with good fixation strength and osseointegration in spine bone. The porcine spine is a good alternative for the human spine in the evaluation of pedicle screws due to the anatomical size, mechanical characteristics, and cost. Although several studies have reported that pedicle screws are efficient in the porcine model, no study has described detailed protocols for the evaluation of a pedicle screw using the porcine model. Here, we describe a detailed method for evaluating transpedicular screws using an in vivo porcine lumbar spine model. The technical details for anesthesia, spine surgery, and harvest provided here will facilitate with the evaluation of the transpedicular screw fixation model.

An Anesthesia, Surgery, and Harvest Method for the Evaluation of Transpedicular Screws Using an In Vivo Porcine Lumbar Spine Model

Here, we introduce a method to evaluate transpedicular screws by using an in vivo porcine lumbar spine model.

Transpediküler Vidaların Değerlendirilmesinde Anestezi, Cerrahi ve Hasat Yöntemi<emIn vivo</em&gt; Domuz Kemik Omurgası Modeli

Pedicle screw fixation is the gold standard for the treatment of spinal diseases. However, many studies have reported the issue of loosening pedicle ...

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by astrocytes, pericytes and brain endothelial cells (BECs). Here, we detail methods to assess BBB coverage using single cultures of immortalized human BECs, single cultures of primary mouse BECs, and a humanized triple culture model (BECs, astrocytes and pericytes) of the BBB. To highlight the applicability of the assays to disease states, we describe the effect of oligomeric amyloid-&#946; (oA&#946;), which is an important contributor to Alzheimer&#39;s disease (AD) progression, on BBB coverage. Further, we utilize the epidermal growth factor (EGF) to illuminate the drug screening potential of the techniques. Our results show that single and triple cultured BECs form meshwork-like structures under basal conditions, and that oA&#946; disrupts this cell meshwork formation and degenerates the preformed mesh structures, but EGF blocks this disruption. Thus, the techniques described are important for dissecting fundamental and disease-relevant processes that modulate BBB coverage.

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Maintaining blood-brain barrier coverage is key for the homeostasis of the central nervous system. This protocol describes in vitro techniques to delineate the fundamental and pathological processes that modulate blood-brain barrier coverage.

Kan-beyin Bariyeri Mesh Benzeri Gemi Oluşumu ve Kesintisini Değerlendiren İn Vitro Tahliller

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by ...

Establishment and Evaluation of a Porcine Vein Graft Disease Model

Venous graft disease (VGD) is the leading cause of coronary artery bypass graft (CABG) failure. Large animal models of CABG-VGD are needed for the investigation of disease mechanisms and the development of therapeutic strategies. 
To perform the surgery, we enter the cardiac chamber through the third intercostal space and carefully dissect the internal mammary vein and immerse it in normal saline. The right main coronary artery is then treated for ischemia. The target vessel is incised, a shunt plug is placed, and the distal end of the graft vein is anastomosed. The ascending aorta is partially blocked, and the proximal end of the graft vein is anastomosed after perforation. The graft vein is checked for patency, and the proximal right coronary artery is ligated. 
CABG surgery is performed in minipigs to harvest the left internal mammary vein for its use as a vascular graft. Serum biochemical tests are used to evaluate the physiological status of the animals after surgery. Ultrasound examination shows that the proximal, middle, and distal end of the graft vessel are unobstructed. In the surgical model, turbulent blood flow in the graft is observed upon histological examination after the CABG surgery, and venous graft stenosis associated with intimal hyperplasia is observed in the graft. The study here provides detailed surgical procedures for the establishment of a repeatable CABG-induced VGD model.

In this protocol, novel pig vein bypass grafting was performed through a small incision in the left chest wall without cardiopulmonary bypass. A postoperative pathology study was done, which showed intimal thickening.