Bu eser NIH araştırma tarafından desteklenmektedir (A1R03AI120027 (RN) ve 1R21AI20012 (RN)), kurumsal araştırma hibe (RN), başlangıç (RN) vermek ve MD Anderson CIC tohum vermek (RN).

Tüm yöntem tanımlamak burada kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) University of Texas MD Anderson Kanser Merkezi tarafından onaylanmıştır.
1. aşı için peptid hazırlanması
<ol><li>Fosfat tamponlu tuz (PBS) uygun konsantrasyon ve 30 için girdap ile lyophilized peptid dağıtılması s. Not: hgp10025-33için son konsantrasyonu 1 mg/mL ve OVA257-264için son konsantrasyonu 0.5 mg/mL. Peptid enjeksiyon önce yeniden oluşturma. Sulandırma sonra depolamayın.</li>
</ol>2. Splenocytes transgenik fareden yalıtım
Not: Dalak hücre izolasyon steril bir şekilde gerçekleştirilmesi gerekir.
<ol><li>
Onaylanmış CO2 boğulma yöntemini kullanarak OT-1 transgenik fare ötenazi ve dalak kaldırın. Not: Bu adımda seçim peptid için belirli uygun transgenik fare kullanılmaktadır.<ol>
<li>Fareyi sağ yan yattı. Sprey % 70 etanol (alkol) fareyle sol tarafında. Deri forseps kullanarak çekin ve Cerrahi makas kullanarak deriyi kesme; dalak peritoneal kavite içinde görünür. Yavaşça dalak erişmek için Periton boşluğuna kesmiş. Dalak forseps kullanarak kaldırın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Dalak bir petri kabına (PBS % 1 fetal sığır serum (FBS) ile) 2 mL orta A ile 70 µm filtrede yerleştirerek ve lavabo pompası sonu ile dalak smashing tarafından disaggregate.
	<ol>
<li>Splenocytes yeri bir 50 mL konik tüp ve petri kabına toplamak. Petri kabına orta iki kez tüm hücreleri toplamak için A 5 mL ile yıkayın. Orta bir up için 25 mL ekleyin ve hücreler için 475 x g de oda sıcaklığında 5 dk santrifüj kapasitesi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Hücreleri Aspire edin ve resuspend 1 ml / dalak kırmızı kan hücresi (RBC) lizis arabellek başı. Kuluçkaya 5 dakika süreyle oda sıcaklığında eklemek 10 mL orta A ve santrifüj 475 x g., oda sıcaklığında Pelet orta A 10 ml Resuspend ve hücre süspansiyon 70 µm filtre içine temiz bir 50 mL konik yoluyla filtreleme tarafından enkaz kaldırmak.</li>
	<li>
Trypan mavi ve bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak. PBS hücrelerde son konsantrasyonu 10 resuspend6 - 1006 hücre/mL. OVA257için-264 özel 106 hücre/mL öldürme, resuspend ve hgp100 için25-33 belirli 1006 hücre/mL öldürme, resuspend.
	<ol>
<li>475 x g., 5 min için oda sıcaklığında kalan hücreleri süpernatant Aspire edin ve 15 mL soğuk PBS hücreleri yıkamayı resuspend spin. Yıkama adım bir kez daha yineleyin. Hücreleri 475 x g., 5 min için oda sıcaklığında süpernatant Aspire edin ve 2.4. adımda belirlenen son hacmine göre soğuk PBS resuspend spin.</li>
		<li>Tek hücre süspansiyon 1.5 mL microcentrifuge tüp aktarmak ve alıcı C57/BL6 fare içine enjeksiyon kadar buz üzerinde tutun.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Splenocytes transgenik fareler üzerinden enjeksiyon
<ol><li>Bir restrainer dorsal yüzü alıcı C57/BL6 fare yerleştirin. Enjeksiyon kuyruk taban alanı % 70 izopropil alkol ile sprey. Tek hücre süspansiyon (Bölüm 2), 100 µL intravenöz eğim yüzü yukarı bakacak şekilde 27 G iğne kullanarak kuyruk ven içine yönetmek.</li>
</ol>4. Covax yönetim
Not: Eğer hücreler öğleden sonra enjekte edilir, covax ertesi sabah 18 h hücre enjeksiyon içinde yönetilmesi.
<ol><li>Fare ile % 1-3 isoflurane açık anestezi kutusuna yerleştirin. Fareler tam anestezi sonra manifold anestezi odasında bağlı burun koni için fareler aktarın. Sırt yanında kadar ölçülü fareler tutun. Not: Anesthetization para çekme yanıt değil elde edildi doğrulamak için bir kısa ayak çimdik tarafından onaylanır. Federal yasa isoflurane Kullanım sırasına lisanslı bir veteriner kısıtlar.</li>
	<li>Enjeksiyon kuyruk taban alanı % 70 izopropil alkol ile sprey. Peptid çözümden (Bölüm 1) 100 µL subkutan enjekte içine kuyruk temel bölge, iğne eğim yüzü yukarı bakacak şekilde 4-5 mm nüfuz şırınga ile 27 G iğne kullanarak. Not: Fare kuyruğu10tabanında Subkutan Enjeksiyon ile bir kanat içinde aşı.</li>
	<li>100 µL anti-CD40 antikor (0,5 mg/mL stok) lateral aşı enjeksiyon yeri için enjekte.</li>
	<li>Dikkatle imiquimod krem 50 mg/fare aşı sitelerde geçerlidir. Kadar krem artık görünür ve tamamen emilir yüzeyde imiquimod krem sür.</li>
	<li>İntraperitoneally 100 µL 100.000 IU/mL rhIL-2 protein enjekte (IP), alt karın bölgesi. Onlar tamamen anesteziden iyileştikten sonra fare 5 min için gözlemlemek. Not: Deney 3 gün boyunca bu noktada duraklatıldı.</li>
</ol>5. CFSE ile etiketleme için hedef Splenocytes yalıtım
Not: Dalak hücre izolasyon steril bir şekilde gerçekleştirilmesi gerekir.
<ol><li>C57BL/6 fareler onaylı CO2 boğulma yöntemine göre ötenazi. Spleen(s) olduğu gibi adım 2.1.1 kaldırın. Dalak disaggregate ve splenocytes olduğu gibi adımları 2.2.1 - 2.2.3 yıkayın. Kırmızı kan hücreleri adımları 2.3 - 2.3.2 olduğu gibi koşullar.</li>
	<li>Bir hemasitometre kullanarak sayım için hücre kaldırma ve hücre 106 hücre/mL CFSE-etiketleme çözümü (7. adımda açıklanan), son bir konsantrasyon için hesaplayın. G. aspiratı süpernatant x 475, 5 min için oda sıcaklığında kalan hücreleri spin.</li>
</ol>6. peptid hedef Splenocytes darbe
Not: Peptid darbe steril bir şekilde gerçekleştirilmesi gerekir.
<ol><li>Senaryo Özeti 106 hücre/mL tam medya resuspend (% 10 ile RPMI 1640 medya FBS, % 1'l-glutamin (L-Gln), % 1 penisilin/streptomisin (kalem/Strep)). 2 tüpler (15 mL conicals) içine hücreleri bölün. Her tüpün darbeli veya unpulsed olarak etiketleyin.</li>
	<li>
Peptid etiketli tüp için Geniş puls ekleyin. OVA257-264 darbe için 1 µg/mL ekleyin ve darbe hgp10025-33 için 2 µg/mL ekleyin. Not: Unpulsed hücreleri aynı kuluçka peptid ek olmadan sadece pulsed hücreler olarak tabi.<ol>
<li>Kuluçkaya hücreleri + 37 ° c için 1 h peptid.</li>
	</ol>
</li>
	<li>10 mL tam medya ekleyin (RPMI 1640 medya % 10 ile FBS, % 1'l-glutamin (L-Gln), % 1 penisilin/streptomisin (kalem/Strep)) yıkamak için her tüp için her ikisi de darbe ve unpulsed hedef hücreler. G. aspiratı süpernatant x 475, 5 min için oda sıcaklığında kalan hücreleri spin.</li>
</ol>7. hedef Splenocytes etiketleme için hazırlanması CFSE
<ol><li>
6.3. adımda yıkama hücre sırasında CFSE etiketleme çözüm hazırlamak; Darbeli hücreleri CFSEMerhaba ve unpulsed CFSEloetiketlenir. 1 mL CFSE-etiketleme çözeltisi 106 hücreler için hazırlayın. Not: CFSE ışığa duyarlı ve ışık her zaman korunmalıdır.<ol>
<li>CFSEMerhaba hazırlamak-etiketleme medya RPMI medya %1640 2 ile 1 uL/mL CFSE (5 mM stok çözelti) 5 µM/mL nihai bir konsantrasyon için ekleyerek FBS.</li>
		<li>CFSElo hazırlamak-etiketleme medya 1 uL/mL CFSE (0,5 mM stok çözelti) 0.5 µM/mL RPMI medya %1640 2 ile son bir konsantrasyon için ekleyerek FBS.</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. hedef Splenocytes CFSE ile etiketlerine göre
Not: CFSE etiketleme steril bir şekilde gerçekleştirilmesi gerekir.
<ol><li>Darbeli ve unpulsed Hedef hücrelerden (adım 6.3) 106 hücre/mL medya CFSE etiketleme resuspend. Darbeli hücreleri ile hazırlanmış CFSEMerhabaresuspend-medya ve unpulsed hücreleri etiketleme hazırlanan CFSElo-etiketleme medya.</li>
	<li>Hücreleri ve CFSE etiketleme medya nazik inversiyon veya dönen karıştırın. Vortexing tarafından bir arada kullanmayın. Hücreleri kuluçkaya ve CFSE etiketleme medya 15 dk. 37 ° C'de hücreler her 5 dk Remix.</li>
	<li>Her hücre süspansiyon ve spin hücrelere 475 x g de 5 min için oda sıcaklığında 10 mL tam medya ekleyin.</li>
	<li>Süpernatant Aspire edin ve 10 mL soğuk PBS hücrelerde resuspend. 475 x g de 5 min için 4 ° C'de hücreler spin.</li>
	<li>8.4 arasındaki adımları yineleyin.</li>
	<li>Hücreleri ve mix peptid Geniş puls, CFSEMerhabasaymak-unpulsed, CFSEloile etiketli-hücreleri alıcı fareler içine enjeksiyon için 1:1 oranında etiketli. 1 x 106 temel Akış Sitometresi değerlendirmesi (Bölüm 11) için kullanacağınız hücre karışık bir aliquot tutmak. Not: Son enjeksiyon için fare başına 100 µL birimdir. Son hücre sayısı 10e6 hücreleri olduğunu. Şırınga ve iğne hacim kaybı dikkate alınması gerekir ve 500 µL tahmin edilebilir.</li>
</ol>9. enjeksiyon hedef hücre
Not: CFSE etiketli hücreleri ışık öncesinde ve mümkün olduğu kadar enjeksiyon sırasında korumalı tutun.
<ol><li>Bir restrainer dorsal yüzü alıcı C57BL/6 farelerde yerleştirin. Enjeksiyon kuyruk taban alanı % 70 izopropil alkol ile sprey. Tek hücre süspansiyon, 100 µL kuyruk damar içine eğim yüzü yukarı bakacak şekilde intravenöz yönetmek.</li>
</ol>10. yeniden yalıtım hedef hücre
Not: Bu adımı zamanlaması kritik ve CTL sitotoksisite ve uyarılması için antijen gücünü bağımlı değil. Bir OVA257-264 pulsed hedef öldürme değerlendirme için hücreleri enjeksiyon sonra hasat 4-6 h olmak istiyorum. CFSE etiketli hücreleri karanlıkta ışık duyarlı, süreç dalağı olduğundan.
<ol><li>Alıcı C57BL/6 fareler onaylı CO2 boğulma yöntemine göre ötenazi.</li>
	<li>Spleen(s) olduğu gibi adım 2.1.1 kaldırın. Dalak disaggregate ve splenocytes olduğu gibi adımları 2.2.1 - 2.2.3 yıkayın. Kırmızı kan hücreleri adımları 2.3 - 2.3.2 olduğu gibi koşullar.</li>
	<li>Hücreleri (FACs) arabellek (%1 BSA + PBS) sıralama 1 mL Floresans aktif hücredeki değerlendirmesi için Akış Sitometresi tarafından resuspend.</li>
</ol>11. gating mantığı tarafından Akış Sitometresi CTL etkinliğini belirlemek için
<ol><li>
Standart Akış Sitometresi protokolü kullanarak CTL etkinliğini değerlendirmesini gerçekleştirin. Hücrelerin uyarma11488 nm lazer ile bir Akış Sitometresi FITC kanal kullanarak elde.
	<ol>
<li>Canlı lenfositler ileri dağılım (FSC) vs yan dağılım (SSC) parametrelerini kullanarak kapıda. Toplam CFSE pozitif nüfus için canlı lenfosit kapısı içinde subgate. Not: Enjekte CFSE etiketli hücreleri dalak içinde mevcut toplam lenfositlerin küçük bir alt kadar yapacaktır. CSFE-pozitif hücreler günlük ölçekte iki ayrı nüfus olarak görünmesi gerekir.</li>
		<li>Unpulsed (sol üst noktası, CFSElo) ve darbeli (sağ üst noktası, CFSEMerhaba) yüzdesini belirlemek için bir çubuk grafik biçimi kullanın nüfus. CFSEMerhaba hücre kaybı antijen spesifik CTL aktiviteyi göstermektedir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+and+quantification+of+T+cell-mediated+cytotoxicity+using+cell-permeable+fluorogenic+caspase+substrates.">Visualization and quantification of T cell-mediated cytotoxicity using cell-permeable fluorogenic caspase substrates.</a> Nat Med. 8 (2), 185-189 (2002).</li><li>Wherry, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+relationship+and+protective+immunity+of+memory+CD8+T+cell+subsets.">Lineage relationship and protective immunity of memory CD8 T cell subsets.</a> Nat Immunol. 4 (3), 225-234 (2003).</li><li>He, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+sensitive+flow+cytometry-based+cytotoxic+T-lymphocyte+assay+through+detection+of+cleaved+caspase+3+in+target+cells.">A sensitive flow cytometry-based cytotoxic T-lymphocyte assay through detection of cleaved caspase 3 in target cells.</a> J Immunol Methods. 304 (1-2), 43-59 (2005).</li><li>Barber, D. L., Wherry, E. J., Ahmed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutting+edge:+rapid+in+vivo+killing+by+memory+CD8+T+cells.">Cutting edge: rapid in vivo killing by memory CD8 T cells.</a> J Immunol. 171 (1), 27-31 (2003).</li><li>Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+fluorescent+target+arrays+for+assessment+of+T+cell+responses+in+vivo.">The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo.</a> J Vis Exp. (88), e51627 (2014).</li><li>Johansson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+killer+cell+education+in+mice+with+single+or+multiple+major+histocompatibility+complex+class+I+molecules.">Natural killer cell education in mice with single or multiple major histocompatibility complex class I molecules.</a> J Exp Med. 201 (7), 1145-1155 (2005).</li><li>Hailemichael, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+antigen+at+vaccination+sites+induces+tumor-specific+CD8(+)+T+cell+sequestration,+dysfunction+and+deletion.">Persistent antigen at vaccination sites induces tumor-specific CD8(+) T cell sequestration, dysfunction and deletion.</a> Nat Med. 19 (4), 465-472 (2013).</li><li>Overwijk, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+regression+and+autoimmunity+after+reversal+of+a+functionally+tolerant+state+of+self-reactive+CD8++T+cells.">Tumor regression and autoimmunity after reversal of a functionally tolerant state of self-reactive CD8+ T cells.</a> J Exp Med. 198 (4), 569-580 (2003).</li><li>Cho, H. I., Celis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+peptide+vaccines+eliciting+extensive+CD8+T-cell+responses+with+therapeutic+antitumor+effects.">Optimized peptide vaccines eliciting extensive CD8 T-cell responses with therapeutic antitumor effects.</a> Cancer Res. 69 (23), 9012-9019 (2009).</li><li>Ya, Z., Hailemichael, Y., Overwijk, W., Restifo, N. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+model+for+pre-clinical+study+of+human+cancer+immunotherapy.">Mouse model for pre-clinical study of human cancer immunotherapy.</a> Curr Protoc Immunol. 108, 21-43 (2015).</li><li>Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+protocols+for+surface+and+intracellular+antigen+analyses+of+neural+cell+types.">Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types.</a> J Vis Exp. (94), (2014).</li><li>Durward, M., Harms, J., Splitter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+specific+killing+assay+using+CFSE+labeled+target+cells.">Antigen specific killing assay using CFSE labeled target cells.</a> J Vis Exp. (45), (2010).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu iletişim kuralı basit olmakla birlikte, dikkatli bir şekilde gerçekleştirilmesi gereken birkaç önemli adımlar vardır. Enjeksiyon antijen spesifik T-hücre test edilen takip covax astar pulsed hedeflerinden herhangi bir öldürme görmek gereklidir. Kısa ömürlü su bazlı formülasyonu yavaş-antijen serbest yağ bazlı bir yaklaşımla yerine su bazlı covax aşı kronik enflamatuar faz için bir akut iltihabi durum oluşturur mümkün olsa daha iyi bir neden olabilir sonucu7,12.
Buna ek olarak, CFSE etiketleme antijen nabız gibi atan bir ideal Akış Sitometresi göstergesi için tek tip olması gereken aşağıdaki hedef hücre. CFSEMerhaba 5 mikron ile ve CFSElo 0.5 µM ile etiketleme ideal bir günlük fark kolayca ayırt edilebilir nüfus sağlamak için bu sistem içinde bulundu.
Test edilen spesifik antijen sistemi değiştirmek basit bir protokoldür. İlk olarak, covax bir parçası olarak yönetilen peptid konsantrasyonu onaylanması. Bu uygun konsantrasyonu belirlemek için basit bir yol aşılamak ve genişleme kan enjekte, antijen spesifik T hücrelerinin takip etmektir. Bu durumda, zayıf antijen (hgp10025-33) güçlü bir antijen (OVA257-264) iki kat daha fazla peptid gerektirir. Bu protokol için kullanılan doğrulanmış konsantrasyonları in dürtme gücüne dayalı diğer antijenleri test etmek için makul bir başlangıç noktası olur. Değişiklik bir nokta sadece vahşi tipi fare peptid tarafından takip ilgi bir antijen ile bağışıklık için CTL-işlev değerlendirmek için hedefler darbe olurdu. Ancak, bu değişiklik üstünde belgili tanımlık harekete geçirmek ve endojen antijen spesifik yanıt-e doğru genişlemesi güvenmek istiyorsunuz ve çok hedef hücre aktarımı zamanlaması büyük olasılıkla 7-14 gün sonra aşılama gerçekleşmesi gerekir. Buna ek olarak, antijen spesifik öldürme düzeyini büyük ölçüde göre için transgenik T hücreleri aktarırken gözlenen azalabilir. Bu değişiklik ile bir ihtar CTL yanıt-e doğru hedef düzeyini tespit edilmesini çok düşük olabilir olduğunu.
T-hücre astar için gerekli antijen miktarına ek olarak, CFSE etiketli hedef hücre yeniden yalıtım zamanlaması belirli bir hipotez için optimize edilmiş olması gerekir. T-hücre olmak için değişiklikleri test sonucunda diferansiyel içinde yetenekleri öldürmek yeniden tecrit zamanlaması ayarlar gerektirebilir. T-hücre ile bir gelişmiş öldürme görev hedefleri çok bağlamamak--dan onun vahşi tipi muadili değerlendirildi olması gerekmektedir. Bu kinetik profil dikkatle test edilmiş hipotez gidermek için en uygun timepoint belirlemek için keşfedilmeyi. Genel olarak, biz bu hedef hücre enjeksiyon sonra 4 ile 24 s arasında değişir bulduk.
Bir tahlil efektör hücrelerin kronik bitkin bir duruma ikna etmek için teşvik değil olduğunu kısıtlamasıdır. Bu nedenle, CTL işlevi son etkinleştirilen efektör hücrelere sınırlıdır. Bu yöntem hangi-cekti var olmak için gelecekteki uygulamalar ilginç bir kronik aktif antijen spesifik T hücre alt bir bellek nüfus veya öldürme yeteneğini geri çağırma işlevini değerlendirmek için değiştirilmiş olabilir mümkündür.
Bu öldürme vivo içinde hızlı algılama bazı sınırlamaları ayarlama bir vitro üstesinden gelir için CTL işlevi vivo içinde test bu yöntem sağlar. Sağlam bir bağışıklık sistemi yer ve peptid sunum ve endojen antijen sunan hücreler tarafından ortak stimülasyon astar covax yöntemi ile aktarılan T hücrelerinin dayanan. Deneyleri öldürmek diğer vivo içinde farklı olarak, bu yöntem bir enfeksiyon veya tümör hedefin varlığını gerektirir. Ancak, bir tümör hedef yanı sıra ek bir karşılaştırıcı sağlayacak ve antijen spesifik T hücreleri ve covax yönetim bu yöntemin gelecekteki uygulamalar için enjeksiyon önce tahlil için eklenebilir.

Birden çok iletişim kuralı bir CD8 cytolytic (CTL) potansiyelini değerlendirmek için mevcut+ veya CD4+ T hücre. Bu değerlendirme vitro kontrollü şartlar1,2,3altında kolayca yapılabilir. Buna ek olarak, bulaşıcı hastalık modelleri, LCMV gibi klasik CTL işlev hedef hücreleri etiketli differentially CFSE (5-(and 6)-Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester) aracılığıyla inceledik nerede CFSEMerhaba-etiketli hücreleri bir peptid ve CFSEloile geniş puls-etiketli hedef hücre are sol unpulsed. Hücreleri sonra bir 1:1 oranında enjekte ve kaybı CFSEMerhabaiçin değerlendirildi-darbeli hedefleri Akış Sitometresi4tarafından etiketli. Aşı ve ret modelleri de benzer stratejileri için kullanmış her iki CD8 tarafından öldürmek vivo içinde değerlendirilmesi+ ve CD4+ T hücreleri de5,6NK hücreleri. Bu güçlü bir tahlil ancak bağışıklık sistemi hedef enjeksiyon önce Başbakan enfeksiyöz ajanlar kullanımını gerektirir.
Bu iletişim kuralı, öte yandan, ana bilgisayarın önceki enfeksiyon gerektirir ve bunun yerine hedef enjeksiyon önce bağışıklık sistemi hazırlamak için bir aşı strateji kullanır. Bu aşı bir su bazlı bir immunostimulatory kokteyl covax7bir Toll benzeri reseptör 7 (TLR7) oluşan, adı verilen hükmü gerektiren peptid aşı formülasyon oluşur agonist (imiquimod krem), agonistik bir anti-CD40 antikor ve immunostimulatory maddeleri, yaşla peptid özgü astar ve güçlü bağışıklık yanıtı için sinerjik birleşime önde gelen interleukin-2 (IL-2). Bu nedenle, aşı sadece üç gün önce hedef hücrelerin enjeksiyon ile birlikte işlev değerlendirmesi için hücreleri işletilmektedir gibi bu tahlil CTL işlevinin bir hızlı okuma sağlar. Buna ek olarak, covax astar yeterince güçlü astarlanmalıdır antijen spesifik T hücre öldürme kapasitesi 4 ile 24 h sonra enjeksiyon arasında görülebilir.
Bu protokol büyük sınırlama antijen ve test edilen hipotez için uygundur hedef öldürme tespiti için zaman çizelgesi vivo tanımlayan iş. Dikkatli değerlendirme gerçekleştirilmelidir, varyasyonları antijen gücü hem de genetik değişiklikler olarak T-hücreleri test edilen hedef öldürme farklı zamanlama algılamaya gerektirecektir fark CTL işlevinde neden olabilir. Ayrıca, süre peptid uygun konsantrasyonu için aşı insan Melanom antijen glycopeptide 100 (hgp10025-33) için optimize edilmiş ve ovalbumin257-264 (OVA257-264)8,9 , belirli bir çalışma için daha uygun olabilir başka bir antijen model kullanımı daha fazla doğrulama gerektirir. CTL efektör fonksiyonu covax ile birlikte bir adjuvan olarak uyarmak için bir hedef antijenleri kapasite beklenen farklılıklar nedeniyle IL-2 doz konsantrasyon ve doz sıklığı duruma getirilmesi istenen hedefe ulaşmak için gerekli olabilir. Genel olarak, bu iletişim kuralı işlevi vivo içinde öldürme hızlı bir değerlendirme sağlar ve herhangi bir verilen antijen için adapte edilebilir.

<table><tbody><tr><td>6 to 12 week old female C57BL/6 mice&amp;nbsp;</td><td>Charles River</td><td>027</td><td>C57 Black 6 mice</td></tr><tr><td>OT-1 6-12 week old female mice&amp;nbsp;</td><td>Jackson Labs</td><td>003831</td><td></td></tr><tr><td>hgp100&lt;sub&gt;25&amp;ndash;33&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;</td><td>CPCScientific</td><td>834139</td><td>KVPRNQDWL</td></tr><tr><td>OVA &lt;sub&gt;257&amp;ndash;264&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;</td><td>CPCScientific</td><td>MISC-012</td><td>SIINFEKL</td></tr><tr><td>Imiquimod cream 5%&amp;nbsp;</td><td>Fougera</td><td>51672-4145-6</td><td>Aldara Cream</td></tr><tr><td>CD40-specific mAb&amp;nbsp;</td><td>BioXcell</td><td>BE0016-2</td><td>clone FGK4.5</td></tr><tr><td>rhIL-2 protein&amp;nbsp;</td><td>Hoffman LaRoche Inc</td><td>136</td><td>Recombinant human IL-2 protein</td></tr><tr><td>70% isopropyl alcohol Prep&amp;nbsp;</td><td>Kendall</td><td>S-17474</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td>Phosphate Buffered Saline</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Life Technologies</td><td>26140-079</td><td>fetal bovine serum</td></tr><tr><td>RBC lysis buffer&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>A10492-01</td><td>red blood cell lysis buffer</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Media</td><td>Life Technologies</td><td>11875119</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td>penicillin/streptomycin</td></tr><tr><td>CFSE</td><td>Life Technologies</td><td>C34554</td><td>5-(and 6)-Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>Sigma&amp;nbsp;</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL MCT graduated natural&amp;nbsp;</td><td>Fisher</td><td>05-408-129</td><td>microcentrifuge tube</td></tr><tr><td>70% ethanol</td><td>Fisher</td><td>BP8201500</td><td>EtOH</td></tr><tr><td>Trypan blue solution, 0.4%&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Hemocytometer</td><td>Fisher</td><td>267110</td><td></td></tr><tr><td>27 gauge needle</td><td>BD</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>1 mL syringe</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo assay for detection of antigen-specific t-cell cytolytic function using a vaccination model

Antijen spesifik öldürmek için mevcut metodolojiler vitro kullanmak için sınırlı veya bulaşıcı hastalık modellerinde kullanılmaktadır. Ancak, değil özellikle enfeksiyon öldürmeden antijen spesifik ölçmek amacıyla bir protokol vardır. Bu iletişim kuralı tasarlanmıştır ve antijen spesifik tespiti için izin vererek bu sınırlamaları aşmak için yöntemler açıklanır hedef hücrenin CD8 tarafından öldürmek+ T hücreleri vivo içinde. Bu bir aşı modeli tahlil öldürmek bir geleneksel CFSE etiketli hedef ile birleştirerek gerçekleştirilir. Bu kombinasyon tahlil tümör büyüme veya enfeksiyon bağımlı olmadığı gibi antijen spesifik CTL potansiyel doğrudan ve hızlı bir şekilde değerlendirmek araştırmacı sağlar. Ayrıca, okuma Akış Sitometresi üzerinde temel alır ve bu yüzden çoğu araştırmacı için kolayca erişilebilir olması gerekir. Çalışmanın büyük sınırlama test edilen hipotez için uygun zaman çizelgesi vivo tanımlayan iş. Antijen gücü değişimler ve fark cytolytic işlevinde neden olabilir T hücreleri mutasyonların hücre hasat ve değerlendirme için en uygun zamanı belirlemek için dikkatli bir şekilde değerlendirilmesi gerekir. Peptid aşılama için uygun konsantrasyonu hgp10025-33 ve OVA257-264için optimize edilmiştir, ama daha fazla doğrulama için belirli bir çalışma daha uygun olabilir diğer peptidler için gerekli olacaktır. Genel olarak, bu iletişim kuralı işlevi vivo içinde öldürme hızlı bir değerlendirme sağlar ve herhangi bir verilen antijen için adapte edilebilir.

Önce enjeksiyon CFSE etiketli hedef hücre 1:1 cep karışımı CFSEMerhaba hem CFSElo hedef hücreleri temel frekansları belirlemek için bir Akış Sitometresi çalıştırılır. Resim 1 A gösterir gating strateji CFSE nüfus değişiklikleri algılamak için bir ilk kapısı FSC ve SSC parametreleri kullanılarak yapılır. Bu nüfus için etiketlenmemiş endojen splenocytes göre nispeten küçük olduğu gibi toplam CFSE pozitif hücreler sonra frekans değişiklikleri değerlendiriliyor önce subgated. CFSEMerhaba ve CFSElo nüfus göreli sıklığı hesaplanan toplam CFSE pozitif nüfusunun % 100 ayarlanmasıdır. Bu analizi yapılabilir bir çubuk grafik veya nokta çizim biçimini kullanarak. Enjeksiyon öncesi CFSE nüfusun göreli sıklığı örneği şekil 1' deBgösterilir. Bu oran nadiren tam olarak 1:1 olacak ama oldukça yakın olmalıdır. Covax astar gerekliliğini CFSEMerhaba hedef hücreleri 24 saat mesaj enjeksiyon gözlenen şekil 1' de nerede antijen öldürmek yok darbe,C gösterilir. Resim 1 D gösterir antijen etkili öldürülmesi darbe, CFSEMerhaba-hedef hücreler olarak enjeksiyon önce gözlendi zirve neredeyse fark edilmeden ve % 1 algılama oranı dramatik % 50 den başlayarak kaymıştır etiketli. Şekil Ayrıca antijen Kinetik darbe, CFSEMerhabagösterir-bu nüfus 6 h ve 24 h mesaj enjeksiyon kaybı değerlendirme tarafından hedef hücre öldürme etiketli.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56255/56255fig1.jpg"> Şekil 1: Temel ve enjeksiyon CFSE etiketli hedef hücre takip etiketli hücreleri karşılaştırılması. (A)CTL işlev değerlendirmesi gating strateji gösterilir. Kısaca, canlı lenfositler ileri dağılım (FSC) vs yan dağılım (SSC) parametrelerini kullanarak kapı. Toplam CSFE pozitif hücreler içinde canlı hücre kapısı subgated. CFSEMerhaba ve CFSElo oranı toplam CFSE pozitif nüfus içindeki ilgili onların sıklığını dayanır. (B) aşağıdaki etiketleme CFSE hedef hücreleri 1:1 karışık ve CFSEMerhaba ve CFSElo hücre oranı için Akış Sitometresi tarafından değerlendirildi. Sayıları (solda) bir çubuk grafik ve CFSE vs SSC nokta Arsa (sağda) biçimleri ilgili doruklarına frekans gösterir. (C) bu hedef hücreleri covax rejimi ile önceden aşı olmadan öldürmek eksikliği gösterir. Splenocytes hasat 24 saat sonra enjeksiyon vardı. (D) bu antijen Geniş puls CFSEMerhaba hedef hücreleri 6 h (üstte bulunan grafik) öldürülmesi gösterir ve 24 s (altta bulunan grafik) enjeksiyon sonrası. Sayıları bir çubuk grafik (solda) ve CFSE vs SSC nokta Arsa (sağda) biçimi CFSE etiketli doruklarına sıklığını gösterir. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56255/56255fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model at JoVE.com

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

Bu iletişim kuralının amacı antijen spesifik bir fare modelinde bir hedef hücrenin öldürmek için hafiye-in vivo sağlamaktır.

Vivo Tahlil antijen spesifik T-hücre Cytolytic işlevi bir aşı modeli kullanılarak tespiti için

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

in-vivo-assay-for-detection-antigen-specific-t-cell-cytolytic

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

9.8K Görüntüleme.  University of Texas MD Anderson Cancer Center. Bu iletişim kuralının amacı antijen spesifik bir fare modelinde bir hedef hücrenin öldürmek için hafiye-in vivo sağlamaktır.

Video: In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells

Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) can be used to easily and quickly label a cell population of interest for in vivo investigation. This labeling has classically been used to study proliferation and migration. In the method presented here, we have shortened the timeline after adoptive transfer to look at survival and killing of epitope specific CFSE labeled target cells4-6. The level of specific killing of a CD8 + T cell clone can indicate the quality of the response, as their quantity may be misleading. Specific CD8+ T cells can become functionally exhausted over time with a decline in cytokine production and killing7,8. Also, certain CD8 + T cell clones may not kill as well as others with differing TCR specificities9. For effective Cell Mediated Immunity (CMI), antigens must be identified that produce not only adequate numbers of responding T cells, but also functionally robust responding T cells. Here we assess the percent cell specific killing of two peptide specific T cell clones in BALB/c mice.

Antigen Specific In Vivo Killing Assay using CFSE Labeled Target Cells

Many infections elicit a strong CTL response, but occasionally, the quantity of responding cells does not correlate to control of the pathogen1. One measure of CTL quality is their ability to kill specifically2. CFSE labeling of target cells can be used to investigate this CTL response quality in vivo3,4.

Antijen Özgül In Vivo</emKAKE Etiketli Hedef Hücreler> Killing Testi

Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) can be used to easily and quickly label a cell population of interest for in vivo investigation.  ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The orthotopic murine model can be performed on large cohorts of immunocompetent mice simultaneously, is relatively inexpensive and preserves the cognate tissue microenvironment. The quantification of T cell infiltration and cytotoxic activity within orthotopic tumors provides a useful indicator of an antitumoral response.
This protocol describes the methodology for surgical generation of orthotopic pancreatic tumors by injection of a low number of syngeneic tumor cells resuspended in 5 &#181;L basement membrane directly into the pancreas. Mice bearing orthotopic tumors take approximately 30 days to reach endpoint, at which point tumors can be harvested and processed for characterization of tumor-infiltrating T cell activity. Rapid enzymatic digestion using collagenase and DNase allows a single-cell suspension to be extracted from tumors. The viability and cell surface markers of immune cells extracted from the tumor are preserved; therefore, it is appropriate for multiple downstream applications, including flow-assisted cell sorting of immune cells for culture or RNA extraction, flow cytometry analysis of immune cell populations. Here, we describe the ex vivo stimulation of T cell populations for intracellular cytokine quantification (IFN&#947; and TNF&#945;) and degranulation activity (CD107a) as a measure of overall cytotoxicity. Whole-tumor digests were stimulated with phorbol myristate acetate and ionomycin for 5 h, in the presence of anti-CD107a antibody in order to upregulate cytokine production and degranulation. The addition of brefeldin A and monensin for the final 4 h was performed to block extracellular transport and maximize cytokine detection. Extra- and intra-cellular staining of cells was then performed for flow cytometry analysis, where the proportion of IFN&#947;+, TNF&#945;+ and CD107a+ CD4+ and CD8+ T cells was quantified.
This method provides a starting base to perform comprehensive analysis of the tumor microenvironment.

Generation of Orthotopic Pancreatic Tumors and Ex vivo Characterization of Tumor-Infiltrating T Cell Cytotoxicity

This protocol describes the surgical generation of orthotopic pancreatic tumors and the rapid digestion of freshly isolated murine pancreatic tumors. Following digestion, viable immune cell populations can be used for further downstream analysis, including ex vivo stimulation of T cells for intracellular cytokine detection by flow cytometry.

Ortotopik Pankreas Tümörlerinin Üretimi ve Tümör Efiltrasyonu T Hücre Sitotoksisitesinin Ex vivo Karakterizasyonu

In vivo models of pancreatic cancer provide invaluable tools for studying disease dynamics, immune infiltration and new therapeutic strategies. The ...

Kanser Araştırmaları

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

Immunogenic cell death of tumors, caused by chemotherapy or irradiation, can trigger tumor-specific T cell responses by releasing danger-associated molecular patterns and inducing the production of type I interferon. Immunotherapies, including checkpoint inhibition, primarily rely on preexisting tumor-specific T cells to unfold a therapeutic effect. Thus, synergistic therapeutic approaches that exploit immunogenic cell death as an intrinsic anti-cancer vaccine may improve their responsiveness. However, the spectrum of immunogenic factors released by cells under therapy-induced stress remains incompletely characterized, especially regarding extracellular vesicles (EVs). EVs, nano-scale membranous particles emitted from virtually all cells, are considered to facilitate intercellular communication and, in cancer, have been shown to mediate cross-priming against tumor antigens. To assess the immunogenic effect of EVs derived from tumors under various conditions, adaptable, scalable, and valid methods are sought-for. Therefore, herein a relatively easy and robust approach is presented to assess EVs' in vivo immunogenicity. The protocol is based on flow cytometry analysis of splenic T cells after in vivo immunization of mice with EVs, isolated by precipitation-based assays from tumor cell cultures under therapy or steady-state conditions. For example, this work shows that oxaliplatin exposure of B16-OVA murine melanoma cells resulted in the release of immunogenic EVs that can mediate the activation of tumor-reactive cytotoxic T cells. Hence, screening of EVs via in vivo immunization and flow cytometry identifies conditions under which immunogenic EVs can emerge. Identifying conditions of immunogenic EV release provides an essential prerequisite to testing EVs' therapeutic efficacy against cancer and exploring the underlying molecular mechanisms to ultimately unveil new insights into EVs' role in cancer immunology.

In Vivo Immunogenicity Screening of Tumor-Derived Extracellular Vesicles by Flow Cytometry of Splenic T Cells

This manuscript describes how to assess in vivo immunogenicity of tumor cell-derived extracellular vesicles (EVs) using flow cytometry. EVs derived from tumors undergoing treatment-induced immunogenic cell death seem particularly relevant in tumor immunosurveillance. This protocol exemplifies the assessment of oxaliplatin-induced immunostimulatory tumor EVs but can be adapted to various settings.

İn Vivo Dalak T Hücrelerinin Akım Sitometrisi ile Tümör Kaynaklı Hücre Dışı Veziküllerin İmmünojenite Taraması

Immunogenic cell death of tumors, caused by chemotherapy or irradiation, can trigger tumor-specific T cell responses by releasing danger-associated ...

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of immunotherapies. Here we describe the use of fluorescent target array (FTA) technology, which utilizes vital dyes such as carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE), violet laser excitable dyes (CellTrace Violet: CTV) and red laser excitable dyes (Cell Proliferation Dye eFluor 670: CPD) to combinatorially label mouse lymphocytes into &#62;250 discernable fluorescent cell clusters. Cell clusters within these FTAs can be pulsed with major histocompatibility (MHC) class-I and MHC class-II binding peptides and thereby act as target cells for CD8+ and CD4+ T cells, respectively. These FTA cells remain viable and fully functional, and can therefore be administered into mice to allow assessment of CD8+ T cell-mediated killing of FTA target cells and CD4+ T cell-meditated help of FTA B cell target cells in real time in vivo by flow cytometry. Since &#62;250 target cells can be assessed at once, the technique allows the monitoring of T cell responses against several antigen epitopes at several concentrations and in multiple replicates. As such, the technique can measure T cell responses at both a quantitative (e.g.&#160;the cumulative magnitude of the response) and a qualitative (e.g.&#160;functional avidity and epitope-cross reactivity of the response) level. Herein, we describe how these FTAs are constructed and give an example of how they can be applied to assess T cell responses induced by a recombinant pox virus vaccine.

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The ability to monitor T cell responses in detail in vivo is important for the development of our understanding of the immune response. Here we describe the use of fluorescent target arrays (FTAs) in an in vivo T cell assay that assesses &#62;250 parameters simultaneously by flow cytometry.

T hücre yanıtlarının Değerlendirme Floresan hedef Dizilerin Kullanımı<em&gt; In vivo</em

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of ...

Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various nanoparticle systems have been engineered to mimic features of pathogens to improve antigen delivery to draining lymph nodes and increase antigen uptake by antigen-presenting cells, leading to new vaccine formulations optimized for induction of antigen-specific CD8+ T cell responses. In this article, we describe the synthesis of a &#8220;pathogen-mimicking&#8221; nanoparticle system, termed interbilayer-crosslinked multilamellar vesicles (ICMVs) that can serve as an effective vaccine carrier for co-delivery of subunit antigens and immunostimulatory agents and elicitation of potent cytotoxic CD8+ T lymphocyte (CTL) responses. We describe methods for characterizing hydrodynamic size and surface charge of vaccine nanoparticles with dynamic light scattering and zeta potential analyzer and present a confocal microscopy-based procedure to analyze nanoparticle-mediated antigen delivery to draining lymph nodes. Furthermore, we show a new bioluminescence whole-animal imaging technique utilizing adoptive transfer of luciferase-expressing, antigen-specific CD8+ T cells into recipient mice, followed by nanoparticle vaccination, which permits non-invasive interrogation of expansion and trafficking patterns of CTLs in real time. We also describe tetramer staining and flow cytometric analysis of peripheral blood mononuclear cells for longitudinal quantification of endogenous T cell responses in mice vaccinated with nanoparticles.

We describe whole-animal imaging and flow cytometry-based techniques for monitoring expansion of antigen-specific CD8+ T cells in response to immunization with nanoparticles in a murine model of vaccination.

Nanopartikül Aşılama sonrası analizi antijene özgü CD8 + T hücresi tepkileri için tüm hayvan Görüntüleme ve Akış Sitometrisi Teknikleri

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various ...

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model offers accessibility to rare populations of antigen-specific T-cells representative of the cellular memory response as well as the cytokine microenvironment in situ.
This report describes the practical procedure of a cutaneous recall, an SB induction, and a harvest of antigen-specific T-cells. To exemplify the method, the tuberculin skin test is used for antigenic recall in individuals who, prior to this study, underwent a Bacillus Calmette-Gu&#233;rin vaccination against an infection with Mycobacterium tuberculosis. Finally, examples of multiplex and flow cytometric analyses of SB specimens are provided, illustrating high fractions of antigen-specific polyfunctional CD4+ T-cells available by this sampling method compared with cells isolated from the blood.
The method described here is safe and minimally invasive, provides a unique opportunity to study both innate and adaptive immune responses in vivo, and may be beneficial to a broad community of researchers working with cell-mediated immunity and human memory responses, in the context of vaccine development.

A Suction Blister Protocol to Study Human T-cell Recall Responses In Vivo

Here, we provide a demonstration of the suction blister cutaneous recall model. The model allows a simple access to study human in vivo adaptive immune responses, for instance in the context of vaccine development.

İnsan T-hücre hatırlama yanıt Vivo içinde çalışmaya emme Blister iletişim kuralı

Cutaneous antigen-recall models allow for studies of human memory responses in vivo. When combined with skin suction blister (SB) induction, this model ...

Simultaneous Quantification of Anti-vector and Anti-transgene-Specific CD8+ T Cells Via MHC I Tetramer Staining After Vaccination with a Viral Vector

Upon viral infection, antigen-specific CD8+ cytotoxic T cells (CTLs) arise and contribute to the elimination of infected cells to prevent the spread of pathogens. Therefore, the frequency of antigen-specific CTLs is indicative of the strength of the T cell response against a specific antigen. Such analysis is important in basic immunology, vaccine development, cancer immunobiology and the adaptive immunology. In the vaccine field, the CTL response directed against components of a viral vector co-determines how effective the generation of antigen-specific cells against the antigen of interest (i.e., transgene) is. Antigen-specific CTLs can either be detected by stimulation with specific peptides followed by intracellular cytokine staining or by the direct staining of antigen-specific T cell receptors (TCRs) and analysis by flow cytometry. The first method is rather time-consuming since it requires sacrificing of animals to isolate cells from organs. Also, it requires isolation of blood from small animals which is difficult to perform. The latter method is rather fast, can be easily done with small amounts of blood and is not dependent on specific effector functions, such as cytolytic activity. MHC tetramers are an ideal tool to detect antigen-specific TCRs.
Here, we describe a protocol to simultaneously detect antigen-specific CTLs for the immunodominant peptides of the viral vector VSV-GP (LCMV-GP, VSV-NP) and transgenes (OVA, HPV 16 E7, eGFP) by MHC I tetramer staining and flow cytometry. Staining is possible either directly from blood or from single cell suspensions of organs, such as spleen. Blood or single cell suspensions of organs are incubated with tetramers. After staining with antibodies against CD3 and CD8, antigen-specific CTLs are quantified by flow cytometry. Optionally, antibodies against CD43, CD44, CD62L or others can be included to determine the activation status of antigen-specific CD8+T cells and to discriminate between na&#239;ve and effector cells.

Simultaneous Quantification of Anti-vector and Anti-transgene-Specific CD8+ T Cells Via MHC I Tetramer Staining After Vaccination with a Viral Vector

Here, we present a protocol for the ex vivo qualitative detection of antigen-specific CD8+ T cells. Analysis is possible with single cell suspensions from organs or from small amounts of blood. A broad range of studies require the analysis of cytotoxic T cell responses (vaccination and cancer immunotherapy studies).

Anti-vektör ve Anti transgene özel CD8 eşzamanlı miktar+ T hücreleri MHC ile ben Tetramer sonrasi hipererjik bir Viral vektör ile boyama

Upon viral infection, antigen-specific CD8+ cytotoxic T cells (CTLs) arise and contribute to the elimination of infected cells to prevent the spread of ...

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-based in vivo cytotoxicity assays enable sensitive and accurate quantitation of CD8+ cytolytic T lymphocyte (CTL) responses elicited against tumor- and pathogen-derived peptides. They offer several advantages over traditional killing assays. First, they permit the monitoring of CTL-mediated cytotoxicity within architecturally intact secondary lymphoid organs, typically in the spleen. Second, they allow for mechanistic studies during the priming, effector and recall phases of CTL responses. Third, they provide useful platforms for vaccine/drug efficacy testing in a truly in vivo setting. Here, we provide an optimized protocol for the examination of concomitant CTL responses against more than one peptide epitope of a model tumor antigen (Ag), namely, simian virus 40 (SV40)-encoded large T Ag (T Ag). Like most other clinically relevant tumor proteins, T Ag harbors many potentially immunogenic peptides. However, only four such peptides induce detectable CTL responses in C57BL/6 mice. These responses are consistently arranged in a hierarchical order based on their magnitude, which forms the basis for TCD8 &#8220;immunodominance&#8221; in this powerful system. Accordingly, the bulk of the T Ag-specific TCD8 response is focused against a single immunodominant epitope while the other three epitopes are recognized and responded to only weakly. Immunodominance compromises the breadth of antitumor TCD8 responses and is, as such, considered by many as an impediment to successful vaccination against cancer. Therefore, it is important to understand the cellular and molecular factors and mechanisms that dictate or shape TCD8 immunodominance. The protocol we describe here is tailored to the investigation of this phenomenon in the T Ag immunization model, but can be readily modified and extended to similar studies in other tumor models. We provide examples of how the impact of experimental immunotherapeutic interventions can be measured using in vivo cytotoxicity assays.

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

We describe here a flow cytometry-based in vivo killing assay that enables examination of immunodominance in cytotoxic T lymphocyte (CTL) responses to a model tumor antigen. We provide examples of how this elegant assay may be employed for mechanistic studies and for drug efficacy testing.

Tümör-spesifik CD8+ T hücre tepkiler Immunodominance çalışması Için In vivo sitotoksisite assays terzilik

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-based in vivo cytotoxicity assays enable sensitive and accurate quantitation of CD8+ cytolytic T lymphocyte ...

Rapid In Vivo Assessment of Adjuvant's Cytotoxic T Lymphocytes Generation Capabilities for Vaccine Development

The assessment of modern sub-unit vaccines reveals that the generation of neutralizing antibodies is important but not sufficient for adjuvant selection. Therefore, adjuvants with both humoral and cellular immuno-stimulatory capabilities that are able to promote cytotoxic T lymphocytes (CTL) responses are urgently needed. Thus, faithful monitoring of adjuvant candidates that induce cross-priming and subsequently enhance CTL generation represents a crucial step in vaccine development. In here we present an application for a method that uses SIINFEKL-specific (OT-I) T cells to monitor the cross-presentation of the model antigen ovalbumin (OVA) in vivo in the presence of different adjuvant candidates. This method represents a rapid test to select adjuvants with the best cross-priming capabilities. The proliferation of CD8+ T cells is the most valuable indication of cross-priming and it is also regarded as a correlate of adjuvant-induced cross-presentation. This feature can be evaluated in different immune organs like lymph nodes and spleen. The extent of the CTL generation can also be monitored, thereby giving insights on the nature of a local (draining lymph node mainly) or a systemic response (distant lymph nodes and/or spleen). This technique further allows multiple modifications for testing drugs that can inhibit specific cross-presentation pathways and also offers the possibility to be used in different strains of conventional and genetically modified mice. In summary, the application that we present here will be useful for vaccine laboratories in industry or academia that develop or modify chemical adjuvants for vaccine research and development.

Rapid In Vivo Assessment of Adjuvant's Cytotoxic T Lymphocytes Generation Capabilities for Vaccine Development

We present here an application for a standard immunological technique (CFSE stained OT-I proliferation) intended to rapidly monitor adjuvant-mediated cytotoxic T lymphocyte (CTL) generation in vivo. This fast estimation of CTL capacities is useful for the development of prophylactic vaccines against intracellular pathogens as well as therapeutic cancer vaccines.

Adjuvan'ın sitotoksik T lenfositler nesil yeteneklerini hızlı Vivo içinde değerlendirilmesi için aşı geliştirme

The assessment of modern sub-unit vaccines reveals that the generation of neutralizing antibodies is important but not sufficient for adjuvant selection. ...

Tıp

An Immunological Technique to Monitor Adjuvant-Mediated Cytotoxic T Lymphocyte Generation

Source: Lirussi, D. et al., <a href="https://app-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/v/57401">Rapid In Vivo&#160;Assessment of Adjuvant&#39;s Cytotoxic T Lymphocytes Generation Capabilities for Vaccine Development.</a> J. Vis. Exp. (2018)
The video demonstrates an immunological method to monitor in vivo adjuvant-induced cytotoxic T lymphocyte or CTL production. A mouse is pre-injected with genetically engineered, proliferative dye-stained donor CD8+ T lymphocytes. Subcutaneous injection of ovalbumin with adjuvants generates cytotoxic CD8+ T lymphocytes that are identified post-harvesting through immunostaining and flow cytometry.

Adjuvan Aracılı Sitotoksik T Lenfosit Oluşumunu İzlemek İçin İmmünolojik Bir Teknik

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
All mice ...

Vivo Tahlil antijen spesifik T-hücre Cytolytic işlevi bir aşı modeli kullanılarak tespiti için

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

Antijen Özgül In Vivo Killing Testi

Ortotopik Pankreas Tümörlerinin Üretimi ve Tümör Efiltrasyonu T Hücre Sitotoksisitesinin Ex vivo Karakterizasyonu

İn Vivo Dalak T Hücrelerinin Akım Sitometrisi ile Tümör Kaynaklı Hücre Dışı Veziküllerin İmmünojenite Taraması

T hücre yanıtlarının Değerlendirme Floresan hedef Dizilerin Kullanımı

Nanopartikül Aşılama sonrası analizi antijene özgü CD8 + T hücresi tepkileri için tüm hayvan Görüntüleme ve Akış Sitometrisi Teknikleri

İnsan T-hücre hatırlama yanıt Vivo içinde çalışmaya emme Blister iletişim kuralı

Anti-vektör ve Anti transgene özel CD8 eşzamanlı miktar⁺ T hücreleri MHC ile ben Tetramer sonrasi hipererjik bir Viral vektör ile boyama

Tümör-spesifik CD8⁺ T hücre tepkiler Immunodominance çalışması Için In vivo sitotoksisite assays terzilik

Adjuvan'ın sitotoksik T lenfositler nesil yeteneklerini hızlı Vivo içinde değerlendirilmesi için aşı geliştirme

Adjuvan Aracılı Sitotoksik T Lenfosit Oluşumunu İzlemek İçin İmmünolojik Bir Teknik