Biz bizim teknik görevlileri için borçlu bulunmaktadır: U. Bröder ve H. Shkarlet, deneysel işlemler sırasında bize yardım etti. Bu eser kısmen EU hibe (sözleşme UniVax, Sözleşme No 601738 ve TRANSVAC2, No. 730964) ve bir Helmholtz Derneği hibe (HAI-IDR) tarafından finanse edildi. Finansman kaynakları araştırma etkilemek değil tasarım, makale veya yayın için göndermek için karar nesil.

Bu çalışmada kullanılan tüm fareler C57BL/6 kökenli idi. Bütün hayvanlar patojen-Alerjik koşullar altında tutuldu. Tüm deneyler Alman hayvanları koruma kanunu (TierSchG BGBl. normatif göre gerçekleştirilen BEN S 1105; 25.05.1998) ve izni numarası altında 33.4-42502-04-13/1281 ve 162280 hayvan deneyleri etik ve devlet ofis (tüketicinin korunması, alt Saksonya eyalet Office ve gıda güvenliği), alt Saksonya Komitesi tarafından kabul edildi.
1. CFSE OT boyama-ı T hücreleri ve evlat edinen Transfer
Not: OT-ben fareler T hücre reseptör (TCR) sabit α ve β zincirleri birlikte OVA, IMMUNO-baskın peptid tanımak express transgenically oluşturulan hayvanlar vardır SIINFEKL10,11. Sonuç olarak, bu fareler SIINFEKL özgü CD8 oldukça yüksek bir dizi var+ T hücreleri normal ya da OVA aşı fareler (≤ % 1)13ile karşılaştırıldığında (%97)12 .
<ol><li>İzlenebilir CD8 yalıtım+ T hücreleri OT-ben fareler T lenfosit özgü Thy1bir (Thy1.1) gen ifade:<ol>
<li>6-9 haftalık OT ötenazi-ben fare CO2 Solunduğunda servikal çıkığı14tarafından takip. Cerrahi makas, cerrahi pense ve forseps yardımıyla vücut cilt ayırma ile deri kesim tarafından dalak ve büyük lenf düğümleri (sadece kasık, aksiler ve servikal çiftleri) teşrih ve yer onları Petri yemekler (60 x 15 mm) içeren her bir 100 µm gözenek kafes Kupası doku bileme ve hücre serbest bırakılması için.</li>
		<li>Buzda muhafaza tam RPMI Orta (RPMI 1640, % 10 v/v FCS, 100 U/mL penisilin, 50 µg/mL streptomisin) 3-5 ml Petri yemekler (her bir kafes Kupası) korumak.</li>
		<li>Organları bir şırınga dalgıç veya benzer bir steril aleti yardımıyla püre (önceki kesme gerekli değildir) ve 15 mL santrifüj tüpleri elde edilen tek hücre süspansiyon toplamak.</li>
		<li>Hücre süspansiyon vasıl 300 x g 4 ° C'de 10 dakika santrifüj kapasitesi Süpernatant atmak. 10 mL soğuk PBS hücrelerde Santrifüjü tarafından yıkama ve dalak üzerinden eritrositler pelet 1 mL/dalak amonyum klorür arabelleği (ACK arabellek, piyasada bulunan) yeniden askıya tarafından parçalayıcı. Buz üzerinde 1,5 dk için hücreleri kuluçkaya ve daha sonra (daha önce yapılan gibi) Santrifüjü tarafından 10 mL soğuk PBS hücrelerle yıkayın.</li>
		<li>Pelet PBS (pH 7.2) içeren % 5 fetal Sığır serum Manyetik izolasyon için 1 mL aynı tüpte yeniden askıya.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Manyetik izolasyon gerçekleştirmek için CD8 negatif seçime devam etmek+ T hücreleri üretici yönergelerine uygun bir manyetik izolasyon kit kullanarak veya iletişim kuralları15yayınlandı.</li>
	<li>CFSE boyama gerçekleştirmek için önce CD8 saymak+ T hücreleri elde OT-ben fare bir otomatik hücre sayaç (parçacık counter) kullanarak. 1-5 x 107 hücre/mL 5 mikron PBS CFSE 15 ml şahin tüp ışıkta korunuyorsunuz 37 ° C'de 7 dakika ile 1-5 mL hacminde leke.</li>
	<li>Hücrelere fetal Sığır serum aynı cilt (1:1) ekleyerek CFSE boyama gidermek ve onları ışıktan korunan 37 ° C'de ek 7 min için kuluçkaya. PBS 10 mL hücrelerle iki kez yıkayın.</li>
	<li>Bir otomatik hücre sayaç kullanarak hücreleri saymak. 3-5 x 106 hücreler/fare 100 µL intravenöz enjekte için 3-5 x 107 hücre/mL PBS için cep numarasını ayarla (IV) kuyruk damar yolu ile.</li>
	<li>Kuyruk ven enjeksiyonları gerçekleştirmek için uygun restrainers farelerde hareketsiz. Sıcak arka alan ve kuyruk farelerin 20-25 cm uzakta fare kuyruğu ven vazodilatasyon izin vermek 1-3 dakika arasında bir kırmızı ışık lamba kullanarak enjekte edilir. Not: Bu kolaylığı ven algılama ve hücre süspansiyon yönetimi için yardımcı olur.</li>
	<li>(Eliyle fareler ve lamba arasında yer) sağlamak değil de fareler için sıcak ve kuyruk damarları açıkça izlenebiliyor, enjeksiyon için devam olduğunu. Hücreleri bir 1 mL şırınga ile 25'lik iğne16kullanarak yan veya dorsal kuyruk damar içine enjekte.</li>
</ol>2. aşılama (+/-adjuvan OVA Endo-ücretsiz)
<ol><li>OT ile nakledilen fareler koyun-hücreleri (adım 1.7, Şekil 1) bir anestezi odasında ve bir anestezi makinesi14tarafından isoflurane oksijen yönetmek.</li>
	<li>Ne zaman fare anestezi altında tamamen uyuyor, odasından çıkar ve temiz enjeksiyon gerçekleştirmek için bir elektrikli saç kesme makinesi kullanarak gluteus superficialis (yanal alt sırt) alan üzerinde fare kürk tıraş uygulama alanını iyi bir görünüm ile.</li>
	<li>Aşının, SC 25'lik iğne kullanarak traş alanında 50 µL enjekte.</li>
</ol>3. yalıtım lenfositleri ve Akış Sitometresi Analizi için boyama
<ol><li>Yalıtım lenfositleri ve splenocytes<ol>
<li>Aşı fareler tarafından servikal yerinden çıkması takip CO2 Solunduğunda ötenazi.</li>
		<li>Boşaltma ve uzak lenf düğümleri ve dalak ayıklamak ve ayrı Petri yemeklerinde 100 µm gözenek örgü bardak doku bileme ve hücre serbest bırakılması için içeren koyun. 1.1.2 1.1.3 aracılığıyla adımları.</li>
		<li>Süpernatant Santrifüjü sonra dikkatle boşaltmak ve hücre granül (yaklaşık 100 µL) kalan PBS aynı birimdeki yeniden askıya alma.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Akış Sitometresi Analizi için boyama<ol>
<li>Tablo 1' de tasvir konsantrasyonlarda boyama antikorlar içeren bir ana karışımı bir 15 mL santrifüj tüpü hazırlayın, böylece 2 x verimli boyama mix yoğunlaşmıştır. Yeterli hacim örnek başına 100 µL için ana karışımı hazırlayın. Mix hücreleri ve ana mix 1:1 ve 30 dk için 4 ° C'de kuluçkaya. Not: Son boyama hacim örnek başına 200 µL (hücre Pelet + 100 µL antikor ana Mix 100 µL) olmalıdır.</li>
		<li>Hücreleri tarafından iki kez aralıklarla iki kez PBS, 10 mL ekleme 1.1.3 içinde açıklandığı gibi yıkayın.</li>
		<li>0.5-1 lekeli hücreleri yeniden askıya PBS mL toplama ve transferi akış sitometresi tüpler süspansiyon. Her zaman buz üzerinde örnekleri tutmak ve ışıktan korunan.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. akış sitometresi
<ol><li>Her zaman 70-100 µm filtreleri kullanarak hücre örnekleri ön filtre.</li>
	<li>Tek boyama tazminat denetimleri tablo 1 (boncuk veya hücreleri) ayrıntılı fluorophores için hazır olun. Not: Tazminat sitometresi veya analiz yazılımı17,18,19 yılında gerçekleştirilen ve tüm örnekler için uygulanan gerekir.</li>
	<li>Şekil 2' de tasvir gating strateji izleyin. Kısaca, kapı nüfus ileri dağılım yüksekliği ileri dağılım alanı (Şekil 2A) ve tekrar yan yan dağılım alanı (SSA, Şekil 2B) birini dışlamak için geniş dağılım vs.</li>
	<li>Kapı BV 650 (auto-floresan) vs FITC (CFSE) doğru CFSE ayırımcılık için komplo tarafından Şekil 2B popülasyondan yüksek otomatik floresan hücreleri hücrelerden lekeli. Boncuk veya BV 650 için tazminat denetimlere Birleşik antikor ile lekeli hücreler içerir. Bu arsa (Şekil 2C) BV 650 vs FITC OT kapı için kullanılır-ben CFSE hücreleri lekeli.</li>
	<li>Şekil 2 c nüfus için Pe-Cy7 (Thy1.1 - CD90.1-) APC (CD8) vs vs alıcı fareler donörden türetilmiş hücre ayırmak için kapı. Not: Hücreleri OT türetilmiş-ben donör fareler WT (C57BL/6, alıcı) hücrelerin farelerde elde edilen Thy1.2+ (CD90.2) (Şekil 2B) ise Thy1.1+ (CD90.1), değildir. Bazı laboratuvarlar OT var-ben bir Thy1.2 arka plan ve WT (C57BL/6) bir Thy1.1 içinde fareler. Bu durumda Thy1.2 karşı antikor OT için kullanmak zorunda-geçişi hücre.</li>
	<li>CD8 yeniden kapı+ hücreleri Thy1.1+ popülasyondan APC (CD8) BV 450 (CD4) oluşan bir kapıya komplo tarafından (Şekil 2E).</li>
	<li>CD8 çubuk grafik görünümünü kullanarak Şekil 2E içinde geçişli nüfus görüntülemek+ CFSE (FITC, 530/15 Kanal - mavi lazer-), gösterilen hücre kapısı proliferated nüfus yoğunluklarını 10 dahil ederek2 düzeyine kadar nerede bölünmemiş denetim nüfus (yoğunluklarda ~ 105, CFSE boyama ve akış sitometresi voltaj ayarı etkinliğini bağlı olarak) vardır (Şekil 2F).</li>
	<li>Ölü hücreleri paralel yayılması değerlendirme olarak değerlendirmek amacıyla bir ek Kapısı (Şekil 2 değil görüntülenen) çizim FITC vs L/D işaretleyici (450/20 kanal, UV Lazer) olun.</li>
	<li>Tazminat denetimleri için en az 5000 olaylar ve 10.000 olayları (gate E, Şekil 2) bir akış sitometresi adlı örneklerinden elde etmek. Düşük veya orta akış sitometresi çalıştırmak (20.000 olaylar/s akış hızı fazla olamaz).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Krishna, S., Anderson, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-Cell+Epitope+Discovery+for+Therapeutic+Cancer+Vaccines.">T-Cell Epitope Discovery for Therapeutic Cancer Vaccines.</a> Methods Mol Biol. 1403, 779-796 (2016).</li><li>Pinchuk, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CD8++T+cell+heptaepitope+minigene+vaccine+induces+protective+immunity+against+Chlamydia+pneumoniae.">A CD8+ T cell heptaepitope minigene vaccine induces protective immunity against Chlamydia pneumoniae.</a> Journal of immunology. 174, 5729-5739 (2005).</li><li>Zhang, J., Silvestri, N., Whitton, J. L., Hassett, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonates+mount+robust+and+protective+adult-like+CD8(+)-T-cell+responses+to+DNA+vaccines.">Neonates mount robust and protective adult-like CD8(+)-T-cell responses to DNA vaccines.</a> Journal of virology. 76, 11911-11919 (2002).</li><li>Marchant, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mature+CD8(+)+T+lymphocyte+response+to+viral+infection+during+fetal+life.">Mature CD8(+) T lymphocyte response to viral infection during fetal life.</a> J Clin Invest. 111, 1747-1755 (2003).</li><li>Simmons, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucosal+delivery+of+a+respiratory+syncytial+virus+CTL+peptide+with+enterotoxin-based+adjuvants+elicits+protective,+immunopathogenic,+and+immunoregulatory+antiviral+CD8++T+cell+responses.">Mucosal delivery of a respiratory syncytial virus CTL peptide with enterotoxin-based adjuvants elicits protective, immunopathogenic, and immunoregulatory antiviral CD8+ T cell responses.</a> Journal of immunology. 166, 1106-1113 (2001).</li><li>Fulginiti, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Respiratory+Virus+Immunizationa+Field+Trial+Of+Two+Inactivated+Respiratory+Virus+Vaccines;+An+Aqueous+Trivalent+Paratnfluenza+Virus+Vaccine+And+An+Alum-Precipitated+Respiratory+Syncytial+Virus+Vaccine1.">Respiratory Virus Immunizationa Field Trial Of Two Inactivated Respiratory Virus Vaccines; An Aqueous Trivalent Paratnfluenza Virus Vaccine And An Alum-Precipitated Respiratory Syncytial Virus Vaccine1.</a> American journal of epidemiology. 89, 435-448 (1969).</li><li>Olson, M. R., Varga, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD8+T+cells+inhibit+respiratory+syncytial+virus+(RSV)+vaccine-enhanced+disease.">CD8 T cells inhibit respiratory syncytial virus (RSV) vaccine-enhanced disease.</a> Journal of immunology. 179, 5415-5424 (2007).</li><li>Lirussi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+I+IFN+and+not+TNF,+is+Essential+for+Cyclic+Di-nucleotide-elicited+CTL+by+a+Cytosolic+Cross-presentation+Pathway.">Type I IFN and not TNF, is Essential for Cyclic Di-nucleotide-elicited CTL by a Cytosolic Cross-presentation Pathway.</a> EBioMedicine. 22, 100-111 (2017).</li><li>Ebensen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bis-(3',5')-cyclic+dimeric+adenosine+monophosphate:+strong+Th1/Th2/Th17+promoting+mucosal+adjuvant.">Bis-(3',5')-cyclic dimeric adenosine monophosphate: strong Th1/Th2/Th17 promoting mucosal adjuvant.</a> Vaccine. 29, 5210-5220 (2011).</li><li>Hogquist, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+receptor+antagonist+peptides+induce+positive+selection.">T cell receptor antagonist peptides induce positive selection.</a> Cell. 76, 17-27 (1994).</li><li>Clarke, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+ovalbumin-specific+TCR+transgenic+line+OT-I:+MHC+elements+for+positive+and+negative+selection.">Characterization of the ovalbumin-specific TCR transgenic line OT-I: MHC elements for positive and negative selection.</a> Immunology and cell biology. 78, 110-117 (2000).</li><li>Topham, D. J., Castrucci, M. R., Wingo, F. S., Belz, G. T., Doherty, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+antigen+in+the+localization+of+naive,+acutely+activated,+and+memory+CD8(+)+T+cells+to+the+lung+during+influenza+pneumonia.">The role of antigen in the localization of naive, acutely activated, and memory CD8(+) T cells to the lung during influenza pneumonia.</a> Journal of immunology. 167, 6983-6990 (2001).</li><li>Le Bon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-priming+of+CD8++T+cells+stimulated+by+virus-induced+type+I+interferon.">Cross-priming of CD8+ T cells stimulated by virus-induced type I interferon.</a> Nature immunology. 4, 1009-1015 (2003).</li><li>Otto, K., Bullock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Laboratory Mouse. , 555-569 (2004).</li><li>Lim, J. F., Berger, H., Su, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Activation+of+Murine+Lymphocytes.">Isolation and Activation of Murine Lymphocytes.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. , (2016).</li><li>Shimizu, S., Bullock, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Laboratory Mouse. , 527-542 (2004).</li><li>Breton, G., Lee, J., Liu, K., Nussenzweig, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+human+dendritic+cell+progenitors+by+multiparametric+flow+cytometry.">Defining human dendritic cell progenitors by multiparametric flow cytometry.</a> Nature protocols. 10, 1407-1422 (2015).</li><li>Kaminski, D. A., Wei, C., Rosenberg, A. F., Lee, F. E. -. H., Sanz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparameter+Flow+Cytometry+and+Bioanalytics+for+B+Cell+Profiling+in+Systemic+Lupus+Erythematosus.">Multiparameter Flow Cytometry and Bioanalytics for B Cell Profiling in Systemic Lupus Erythematosus.</a> Methods in molecular biology. 900, 109-134 (2012).</li><li>Bayer, J., Grunwald, D., Lambert, C., Mayol, J. F., Maynadie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thematic+workshop+on+fluorescence+compensation+settings+in+multicolor+flow+cytometry.">Thematic workshop on fluorescence compensation settings in multicolor flow cytometry.</a> Cytometry. Part B, Clinical cytometry. 72, 8-13 (2007).</li><li>Newrzela, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T-cell+receptor+diversity+prevents+T-cell+lymphoma+development.">T-cell receptor diversity prevents T-cell lymphoma development.</a> Leukemia. 26, 2499-2507 (2012).</li><li>Iwasaki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allergen+endotoxins+induce+T-cell-dependent+and+non-IgE-mediated+nasal+hypersensitivity+in+mice.">Allergen endotoxins induce T-cell-dependent and non-IgE-mediated nasal hypersensitivity in mice.</a> J Allergy Clin Immunol. 139, 258-268 (2017).</li><li>Tsuchiya, K., Siddiqui, S., Risse, P. A., Hirota, N., Martin, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+presence+of+LPS+in+OVA+inhalations+affects+airway+inflammation+and+AHR+but+not+remodeling+in+a+rodent+model+of+asthma.+American+journal+of+physiology.">The presence of LPS in OVA inhalations affects airway inflammation and AHR but not remodeling in a rodent model of asthma. American journal of physiology.</a> Lung cellular and molecular physiology. , L54-L63 (2012).</li><li>Burgdorf, S., Scholz, C., Kautz, A., Tampe, R., Kurts, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+and+mechanistic+separation+of+cross-presentation+and+endogenous+antigen+presentation.">Spatial and mechanistic separation of cross-presentation and endogenous antigen presentation.</a> Nature. 9, 558-566 (2008).</li><li>Last'ovicka, J., Budinsky, V., Spisek, R., Bartunkova, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+lymphocyte+proliferation:+CFSE+kills+dividing+cells+and+modulates+expression+of+activation+markers.">Assessment of lymphocyte proliferation: CFSE kills dividing cells and modulates expression of activation markers.</a> Cellular immunology. , 79-85 (2009).</li><li>Oelke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+of+CD8(+)+antigen-specific+cytotoxic+T+lymphocytes+after+enrichment+based+on+cytokine+secretion:+comparison+with+the+MHC-tetramer+technology.">Functional characterization of CD8(+) antigen-specific cytotoxic T lymphocytes after enrichment based on cytokine secretion: comparison with the MHC-tetramer technology.</a> Scand J Immunol. 52, 544-549 (2000).</li><li>Wang, W., Golding, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cytotoxic+T+lymphocyte+response+against+a+protein+antigen+does+not+decrease+the+antibody+response+to+that+antigen+although+antigen-pulsed+B+cells+can+be+targets.">The cytotoxic T lymphocyte response against a protein antigen does not decrease the antibody response to that antigen although antigen-pulsed B cells can be targets.</a> Immunology letters. 100, 195-201 (2005).</li><li>O'Sullivan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Memory+CD8(+)+T+cells+use+cell-intrinsic+lipolysis+to+support+the+metabolic+programming+necessary+for+development.">Memory CD8(+) T cells use cell-intrinsic lipolysis to support the metabolic programming necessary for development.</a> Immunity. 41, 75-88 (2014).</li><li>Xu, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+I+interferon+protects+antiviral+CD8++T+cells+from+NK+cell+cytotoxicity.">Type I interferon protects antiviral CD8+ T cells from NK cell cytotoxicity.</a> Immunity. 40, 949-960 (2014).</li><li>Volk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+three+humanized+mouse+models+for+adoptive+T+cell+transfer.">Comparison of three humanized mouse models for adoptive T cell transfer.</a> The journal of gene medicine. 14, 540-548 (2012).</li><li>Safinia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanized+Mice+as+Preclinical+Models+in+Transplantation.">Humanized Mice as Preclinical Models in Transplantation.</a> Methods Mol Biol. 1371, 177-196 (2016).</li><li>Grover, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Humanized+NOG+mice+as+a+model+for+tuberculosis+vaccine-induced+immunity:+a+comparative+analysis+with+the+mouse+and+guinea+pig+models+of+tuberculosis.">Humanized NOG mice as a model for tuberculosis vaccine-induced immunity: a comparative analysis with the mouse and guinea pig models of tuberculosis.</a> Immunology. 152, 150-162 (2017).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Modern aşılar ideal Avusturyalıanti arıtılmış antijen ve adjuvan lipozomlar, virüs gibi parçacıklar, nano tanecikleri veya canlı vektörel çizimler gibi bir iletim sistemi mümkün ilavesi ile vardır. Bir aşı tasarlarken önemli bir yönü klinik gereksinimlerinize uygun bir doğru adjuvan seçmektir. Kapsamı parçası humoral ve hücresel immün yanıt (veya her ikisi), sistemik bir immün yanıt (veya her ikisi) vs yerel seçim ve aşı hedef popülasyon oluşturmak için gereken bellek tür lehine içerebilir. Bir önemli yönü adjuvan değerlendirilmesi hızla CTL oluşturmak için kapasitesini tespit etmektir. Biz burada hızla OT ölçerek CTL yanıt vivo içinde bir fare modeli özelliklerini belirlemek için zaten bilinen teknikleri dayalı bir yöntem sundu-ı CD8 T hücre çoğalması. Bu yöntem için tahmin adjuvan tarafından elde edildi bağışıklık yanıtının potens sağlar (OT yayılması-ı T hücreleri) sadece 4 iş günü içinde. Bu yöntem daha fazla etkili eylem ve eylemler adjuvan immün yanıt (yerel sistemik vs) açısından karşılaştırılması kolaylaştırır. Burada, bir örnek farklı adjuvan tedavi (ADJ1 vs. ADJ2) aşı bağışıklık yanıtı nasıl etkileyeceğini göstermiştir. ADJ2 eylem nerede bağışıklık yanıtı drenaj lenf nodlarında etkinleştirir yerel yönetim ile sınırlı iken ADJ1 eylemiyle aynı doz daha yaygın bir CTL yanıt hem yerel ve sistemik düzey ama üretme drenaj lenf nodlarında ADJ2 daha az güç ile.
Bir adjuvan'ın CTL kapasite başarılı değerlendirilmesi için kritik adımlar genç OT seçenek var-Ben hayvanlar (olarak bir kaynak CD8 T hücreleri) ve OVA endotoksin ücretsiz kullanım bağışıklama için. OT beri-ben fareler transjenik hayvanlar OVA peptid SIINFEKL bir MHC içinde tanımak CD8 T hücreleri üretmek için oluşturulan değildir-Ben bağlam, onun yapay seçilim fare TCR artırır hiper proliferatif CD8 görünüşü+ T hücreleri20 yaş ile. Bir aksiler lenf düğümleri iltihabı böylece yaşlı OT, daha yaygın bir özelliğidir-ben fare. Bu dikkate alarak, bu genç OT kullanmak için tavsiye edilir-Ben hayvanlar mümkün olduğunda (6-9-hafta-yaşlı hayvanlar) hücrelerden herhangi yalıtma önlemek için organları (lenf nodlarının ya dalak) genişlemiş. Büyük olasılıkla nükleer silahların yayılmasına karşı kontrol eder ve tedaviler arasındaki farkları elde değil bu yana Proliferasyona CD8 T hücreleri ile genişlemiş organları kullanımı tüm tahlil etkiler. Adjuvan CTL üretimi kapasitesi ayrımcılık için benzer bir hatadır endotoksin-Alerjik OVA21,22 (bkz: kıyasla daha güçlü bir bağışıklık yanıtı temin endotoksin izleri ile OVA protein kullanarak oluşturulabilir Malzemeler ve kimyasalları), endotoxins güçlü IMMUNO-modülatörler başına 23olduğundan. Bu nedenle, bağışıklama için kullanılan OVA protein endotoksin-Alerjik olması gerekir. Endotoksin-Alerjik OVA, 20 veya 50 µg kullanımı bağışıklama yolun 50 µg subkutan adjuvan test etmek için uygun bir doz varlık bağlıdır. Ayrıca, CFSE yüksek konsantrasyonda kullanımı literatürde24 lekeli hücreleri öldürmek için bildirilen ve ayrıca tahlil sonucu başarısızlık olabilir.
Bazı değişiklikler veya ilerleme-e doğru farklı teknikleri iletişim kuralında kullanılan deney tekrarlanabilirlik artırmak için hayvanlar, stresi azaltmak için uygulamaya edildi. Örneğin, sadece arka ve kuyruk fareler ve tüm hayvan değil Isıtma tarafından Isıtma hayvanların en aza indirmek için veya subkutan enjeksiyon önlemek için stres aşılama önce hayvanlar anesthetizing tarafından ilgili. Anestezi gerekli değildir tarafından hayvan refahı düzenlemeleri Subkutan Enjeksiyon için ama bizim deneyim, tekrarlanabilirlik stres tepkisi tarafından tanıtılan varyasyonları azaltarak artırır.
Bir büyük bu yöntem CFSE hücre membran lekeleri beri onun yüksek parlaklık genellikle sitozol gelen sinyalleri tespiti bozar kısıtlamasıdır. Bu nedenle, CTL kapasite onayı gerekiyorsa, IFN γ salgılanmasını belirli salgı tahlil 25tarafından ve hücre içi sitokin boyama tarafından değerlendirilmelidir.
CTL üretimi kapasitesi adjuvan tarafından sadece 4 gün içinde tahmin etmek için nükleer silahların yayılmasına karşı ölçümü kullanımı daha kısa sürede avantajı geleneksel CTL26 deneyleri ve daha iyi bir aday durumda nerede daha fazla deneme vardır diğer yöntemler ile onay gereklidir.
OVA için bir antijen sınırlı olmasına rağmen ve bu nedenle OT kullanımı-ı T hücreleri, sunulan yöntem burada belgili tanımlık harekete geçirmek proliferated hücrelerinin sıraladıktan sonra farklı adjuvan tarafından indüklenen özelliklerini sağlar. Olası uygulamaları biridir proliferated OT içinde farklı adjuvan tarafından indüklenen metabolik imzalar incelenmesi-ı T hücreleri ve bellek27gelişimi ile ilişkileri. Ek ikincil gösterimleri uyarılmış hücreler sitokinler veya akış sitometresi tarafından degranulation işaretleri veya sitotoksik kapasitelerini içinde vivo CTL testleri8, yaparak ifade gibi biyolojik özelliklerini değerlendirmek olabilir 26 , 28. Bu uygulama farelerde kullanımı sınırlama olduğundan, insanlar için tahminlerim kötüye gösterimleri insanlaşmış fareler29,30,31tarihinde dayalı tarafından gerçekleştirilebilir.
Bu yöntem ilk tarama olarak hücresel yanıt aktivatörleri seçimi için kullanılmak üzere sağlam ve değiştirilebilir veya proliferated T hücrelerinin daha fazla çözümleme için birleştiğinde için yeterince esnek Ayrıca biz burada sundu gibidir. Özet olarak, bu hızlı içinde vivo değerlendirme adjuvan CTL oluşturma kapasitesinin eylem onların adjuvan aday moleküllerin modu hızlı bir karakterizasyonu ilgilenen aşı laboratuvarlarda Akademi ve sanayi için ideal bir araçtır.

Aşılar inducing sitotoksik T lenfositler (CTL) belirli türde kanser1mücadele için geliştirilmiş anahtar tedavi müdahaleler vardır. CTL de intrasellüler patojenlerin2karşı koruyucu aşıları için önemli. Ayrıca, CTL bir kaç bağışıklık savunma mekanizmaları da erken hayat enfeksiyonlar5mücadele için CTL üzerinde bağlıdır kime risk nüfus yenidoğan bebeklerin3,4 gibi işlevsel olarak etkin bulunmaktadır. Bu bağlamda, CTL yanıt (şap) temin etmez bir adjuvan ile geliştirilen aşılar karşı solunum sinsityal virüs (RSV) aşı bebeklerde6adet enfeksiyondan üzerine ciddi komplikasyonlara yol tam bir başarısızlık sonuçlandı. Aşı bu olumsuz etkileri bir CD8 tarafından ters+ T hücre yanıt7. Biz daha önce interferon genler (STING) agonistler bazı uyarıcı tarafından elde edildi (tip ı interferonlar) ana sitokinler bu adjuvan8tarafından kısmen yayılması ölçerek oluşturulan CTL yanıt için gerekli olduğunu göstermiştir OT-ı T hücreleri sonra aşı ve yetenekleri inducing CTL ölçüsü gözlenen bu sonuçları kullanarak aşılama programları9erişmek. OT yayılması ölçümü-ben CD8+ T hücreleri bir vahşi türü (WT) C57BL/6 alıcı fare carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) boya tarafından seyreltme bir aşı adjuvan yeteneği oluşturmak için sağlam bir tahmin olduğunu. SIINFEKL, (ovalbumin, OVA IMMUNO-baskın peptid), çapraz-astar. Bu tekniğin varyasyonları yaygın OT yayılması değerlendirilmesi için kullanılan-ben CD8+ ve OT-II CD4+ T hücreleri. Örneğin, seçili sitokinler (KO fareler) ya da antijen hatırlama WT hayvanlarda sonra aşı etkinliği ölçmek için yokluğunda kullanılmıştır. Hangi OT CFSE lekeli pasif transfer sonra kısa protokol (4 gün deneme) geliştirmiştir-ben CD8+ T hücreleri, 50 bir doz oluşan bir cilt altı (SC) bağışıklama endotoksin-Alerjik OVA test adjuvan ile desteklenmiş µg yönetilen (Şekil 1). 48 h sonrasi hipererjik sonuçları takip adjuvan kapasitesi CTL yanıt-e doğru oluşturmak için güvenilir bir kanıtı sağlar. Bu strateji, dalak (veya uzak lenf düğümleri) CTL etkinliğini ölçerek ölçüde yanıt yanı sıra bağışıklama sonra drenaj lenf nodu yerel Bağışıklık yanıtında potens değerlendirmek mümkündür.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BD LSR Fortessa Cell Analyzer</td>
			<td>BD</td>
			<td>Special Order</td>
			<td>Flow Cytometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFSE</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>C34554</td>
			<td>Proliferation Dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MojoSort Mouse CD8 T Cell Isolation Kit</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>480007</td>
			<td>Magnetic Isolation Beads and antibodies for negative selection of untouched CD8 T cells.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>L23105</td>
			<td>Dead Cell Marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD90.1 (Thy-1.1) Monoclonal Antibody (HIS51), PE-Cyanine7</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>25-0900-82</td>
			<td>antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD8a Antibody</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100712</td>
			<td>antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BV421 Rat Anti-Mouse CD4</td>
			<td>BD</td>
			<td>740007</td>
			<td>antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Z2 coulter Particle count and Size Analyzer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>9914591DA</td>
			<td>Cell counter. Z2 Automated particle/cell counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EndoGrade Ovalbumin (10 mg)</td>
			<td>Hyglos(Germany)</td>
			<td>321000</td>
			<td>Ovalbumin endotoxin free tested.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer 100&#181;m nylon</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352360</td>
			<td>Cell strainer (100 &#181;m pore mesh cups).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample Vials</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>899366014</td>
			<td>Sample vials for Z2 automated counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mice (CD90.2)</td>
			<td>Harlan (Rossdorf, Germany)</td>
			<td></td>
			<td>Company is now Envigo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OT-I (C57BL/6 background, CD90.1)</td>
			<td>Harlan (Rossdorf, Germany)</td>
			<td></td>
			<td>Inbreed at our animal facility. Company from where adquired is now Envigo</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tubes</td>
			<td>Fischer (Corning)</td>
			<td>14-959-5</td>
			<td>Corning Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 15 mL tubes</td>
			<td>Fischer (Corning)</td>
			<td>05-527-90</td>
			<td>Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (500 mL)</td>
			<td>Fischer (Gibco)</td>
			<td>20-012-027</td>
			<td>Gibco PBS (Phosphate Buffered Saline), pH 7.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red lamp (heating lamp)</td>
			<td>Dirk Rossmann GmbH (Germany)</td>
			<td>405096</td>
			<td>Heating infrred lamp (100 wats)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IsoFlo (Isoflurane)</td>
			<td>Abbott Laboratories (USA)</td>
			<td>5260.04-05.</td>
			<td>Isoflurane anesthesic (250 mL flask).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tabletop Anesthesia Machine/Mobile Anesthesia Machine with CO2 Absorber</td>
			<td>Parkland Scientific</td>
			<td>V3000PK</td>
			<td>Isoflurane anesthesia machine.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640 medium</td>
			<td>Gibco (distributed by ThermoFischer)</td>
			<td>11-875-093</td>
			<td>Base medium with Glutamine (500 mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strept antibiotic solution (Gibco)</td>
			<td>Gibco (distributed by ThermoFischer)</td>
			<td>15-140-148</td>
			<td>Gibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bobine Serum (Gibco)</td>
			<td>Gibco (distributed by ThermoFischer)</td>
			<td>10082147</td>
			<td>Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACK Lysing Buffer (100 ml)</td>
			<td>Gibco (distributed by ThermoFischer)</td>
			<td>A1049201</td>
			<td>Amonium Chloride Potasium (ACK) Whole Blood Lysis Buffer, suitable for erytrocyte lysis in spleen suspensions also</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Petri Dishes</td>
			<td>Nunc (distributed by ThermoFischer)</td>
			<td>150340</td>
			<td>60 x 15mm Plastic Petri Dish, Non-treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Clump Filter</td>
			<td>CellTrics (Sysmex)</td>
			<td>04-004-2317</td>
			<td>CellTrics&#174; 50 &#956;m, sterile</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid in vivo assessment of adjuvant's cytotoxic t lymphocytes generation capabilities for vaccine development

Modern alt birim aşılar değerlendirilmesi antikorları nötralize üretimi önemli ancak adjuvan seçim için yeterli olduğunu ortaya koymaktadır. Bu nedenle, adjuvan sitotoksik T lenfositler (CTL) yanıt teşvik edebiliyoruz humoral ve hücresel immün uyarıcı yetenekleri ile acilen ihtiyaç vardır. Böylece, çapraz-astar ikna etmek ve daha sonra CTL üretimi geliştirmek adjuvan adayları sadık izleme aşı geliştirmede önemli bir adımı temsil eder. Burada biz SIINFEKL özgü kullanan bir yöntem için bir uygulama mevcut (OT-ben) T hücreleri farklı adjuvan adayların huzurunda modeli antijen ovalbumin (OVA) vivo içinde çapraz sunumunu izlemek için. Bu yöntem en iyi çapraz-astar yetenekleri ile adjuvan seçmek için hızlı bir test temsil eder. CD8 yayılması+ T hücreleri çapraz-astar en değerli belirtisi olduğunu ve aynı zamanda adjuvan kaynaklı çapraz-sunum ilişkili kabul edilir. Bu özellik, lenf düğümleri ve dalak gibi farklı bağışıklık organlarında değerlendirilebilir. CTL oluşturma kapsamını da izlenebilir, böylece bir yerel doğa üzerinde anlayışlar veren (lenf nodu esas olarak boşaltılmasına) ya da sistemik yanıtın (uzak lenf düğümleri ve/veya dalak). Bu tekniği daha da belirli çapraz-sunum yolları inhibe olabilir ve ayrıca geleneksel ve genetiği değiştirilmiş fare farklı suşları kullanılmak üzere imkanı sunuyor ilacını test için birden fazla değişiklik sağlar. Özetle, burada mevcut uygulama geliştirmek veya aşı araştırma ve geliştirme için kimyasal adjuvan değiştirme aşı laboratuarlar sanayi veya Akademi için faydalı olacaktır.

Adjuvan (ADJ1 ve ADJ2) farklı bir birleşimini kullanarak uygulamaları test etmek için biz CTL üretimi kapasitesi adoptively transfer edilen OT yayılması ölçerek değerlendirildi var-ben CD8+ T hücreleri tarafından akış sitometresi (Şekil 2). Bunun için biz daha önce drenaj lenf düğümleri ve dalak (Tablo 1) izole hücrelerden lekeli. CD8 yayılması ölçme tarafından+ T hücreler lenf düğümleri ve dalak, biz daha yüksek CTL üretimi kapasitesi ADJ2 drenaj lenf nodlarında (Şekil 3) göre ADJ1, OVA yalnız veya PBS denetime teyit başardık. Buna ek olarak, biz ADJ2 sistemik bir kompartımanda (dalak) bir CTL yanıt üretmek mümkün değildi, oysa ADJ1 dalak CD8 tarafından proliferasyon gösteren yüksek düzeyde+ T hücreleri değil, gözlemledim sadece denetimleri (PBS ve OVA) ama aynı zamanda üstün karşılaştırıldığında ADJ1 için. Bu hızlı vivo içinde yayılması tahlil kullanarak eylem ADJ2, anatomi, güçlü eylem sistemik bir CTL jeneratör değil ama bir yerel olarak teyit edebilir. Ayrıca, ADJ1 enjeksiyon (drenaj lenf düğümleri) yerel sitesinde her ikisi de gibi sistemik ile artan bir OT davranır-ben dalak içinde yayılması. Elde edilen sonuçlar adjuvan'ın faaliyet ve ölçüde gözlenen etkileri ADJ2 (yerel) ve ADJ1 (sistemik) tarafından örneği kendi karakterize sağlamak.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57401/57401fig1.jpg"> Şekil 1: tahlil zaman çizelgesi. Tahlil zaman çizelgesi ilk OT temsil eder-Ben T hücre gün gün 1, 0, SC aşı ve örnekleme dalak ve lenf bezleri 2 gün sonra boşaltma aktarma. <a href="/files/ftp_upload/57401/57401fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57401/57401fig2.jpg"> Resim 2: akış diyagramı gating strateji takip CD8 yayılması ölçmek için+ T hücreleri (OT-ben Thy1.1+) tarafından akış sitometresi. İki örnek daha iyi görüntüleme için farklı renklerde (kırmızı ve açık mavi) temsil edilir. A-b Tek hücre birini ilk iki Gates'te art arda gelen ileri dağılım yükseklikte vs ileri dağılım alanı ve geniş dağılım yan yan dağılım alanı vs komplo tarafından ayrımcılığa. C. B geçitli hücreler (hücre bölümler/nükleer silahların yayılmasına karşı azalmak burada gösterir) onların CFSE yoğunluk 530/30 YG kanaldaki karşı çizilen onların floresans yoğunluklarda BV 650 kanal (otomatik floresans) tarafından görüntülenir. Bu kapıyı ayrımcılık tarafından doğru CFSE pozitif hücre seçimini sağlar yüksek otomatik floresans sahip olanlar. Ö CFSE pozitif hücrelerinin Pe-Cy7 onların yüksek floresan yoğunluğu ile geçişli (Thy1.1, OT için işaretleyici-ben hücreleri) kendi APC yoğunluğu (CD8) vs. E. BV APC (CD8) karşı için daha önce çizilen 450 (CD4) Thy1.1 pozitif hücrelerinin doğru CD8 seçmek için geçişli+ T hücreleri. F. daha önce geçişli CD8+ hücreleri çizilen bir histogram sonunda proliferated nüfus kapı için CFSE yoğunluk karşı. <a href="/files/ftp_upload/57401/57401fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57401/57401fig3.jpg"> Şekil 3: CTL üretimi tahrik adjuvan. Lokal veya sistemik CTL yanıt-e doğru çıkarmak için yetenek 2 farklı adjuvan tedavi (ADJ1 ve ADJ2) antijen ve PBS denetimleri için tasvir edilir. Adoptively aktarılan OT yayılması-ı T hücreleri muayene drenaj lenf nodu (inguinal örneği subkutan (SC) yönetim için) ve dalak, şekil satırlarda belirtildiği gibi. Hücre çoğalması ilgili tüm tedavilerde (sütunlar) doğru ölçüde bağışıklık yanıtının karşılaştırmak üzere yerel (drenaj lenf nodu) veya eylem sistemik (dalak) aralığı içinde ölçülür. <a href="/files/ftp_upload/57401/57401fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Boya - antikor</td>
			<td>Klon</td>
			<td>Fluorophore/kanal-filtre</td>
			<td>Konsantrasyon 2 X</td>
		</tr>
<tr>
<td>Thy1.1 (CD90.1)</td>
			<td>HIS51</td>
			<td>PE-Cy7-780/60 YG</td>
			<td>1:750</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD8</td>
			<td>53-6,7</td>
			<td>APC - 670/14 R</td>
			<td>1:280</td>
		</tr>
<tr>
<td>CD4</td>
			<td>RM4-5</td>
			<td>BV 421-450/50 V</td>
			<td>1: 100</td>
		</tr>
<tr>
<td>CFSE</td>
			<td>-</td>
			<td>FITC - 530/30 YG</td>
			<td>(CFSE boyama protokole göre)</td>
		</tr>
<tr>
<td>DCM (ölü hücre Marker)</td>
			<td>-</td>
			<td>-/ ULTRAVİYOLE - 450/50 UV</td>
			<td>1:500</td>
		</tr>
</tbody></table>Tablo 1: akış sitometresi için antikor stainings. Fluorophore-Birleşik antikor klonlar kullanılan ve konsantrasyonları (2 x) boyama önerilir.

Watch this Scientific Journal Video about Rapid In Vivo Assessment of Adjuvant's Cytotoxic T Lymphocytes Generation Capabilities for Vaccine Development at JoVE.com

Rapid In Vivo Assessment of Adjuvant's Cytotoxic T Lymphocytes Generation Capabilities for Vaccine Development

Burada bir standart immünolojik tekniği için bir uygulama mevcut (CFSE lekeli OT-Ben nükleer silahların yayılmasına karşı) hızla adjuvan-aracılı sitotoksik T lenfosit (CTL) üretimi izlemek amacıyla içinde vivo. Bu hızlı tahmini bir CTL kapasite hücre içi patojenlere karşı koruyucu aşıları aynı zamanda tedavi kanser aşıları gelişimi için yararlıdır.

Adjuvan'ın sitotoksik T lenfositler nesil yeteneklerini hızlı Vivo içinde değerlendirilmesi için aşı geliştirme

The assessment of modern sub-unit vaccines reveals that the generation of neutralizing antibodies is important but not sufficient for adjuvant selection. ...

rapid-vivo-assessment-adjuvant-s-cytotoxic-t-lymphocytes-generation

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Medicine

Rapid In Vivo Assessment of Adjuvant's Cytotoxic T Lymphocytes Generation Capabilities for Vaccine Development

8.6K Görüntüleme.  Helmholtz Centre for Infection Research. Burada bir standart immünolojik tekniği için bir uygulama mevcut (CFSE lekeli OT-Ben nükleer silahların yayılmasına karşı) hızla adjuvan-aracılı sitotoksik T lenfosit (CTL) üretimi izlemek amacıyla içinde vivo. Bu hızlı tahmini bir CTL kapasite hücre içi patojenlere karşı koruyucu aşıları aynı zamanda tedavi kanser aşıları gelişimi için yararlıdır.

Video: Rapid In Vivo Assessment of Adjuvant's Cytotoxic T Lymphocytes Generation Capabilities for Vaccine Development

Teratoma Generation in the Testis Capsule

Pluripotent stem cells (PSCs) have the unique characteristic that they can differentiate into cells from all three germ layers. This makes them a potentially valuable tool for the treatment of many different diseases. With the advent of induced pluripotent stem cells (iPSCs) and continuing research with human embryonic stem cells (hESCs) there is a need for assays that can demonstrate that a particular cell line is pluripotent. Germline transmission has been the gold standard for demonstrating the pluripotence of mouse embryonic stem cell (mESC) lines1,2,3. Using this assay, researchers can show that a mESC line can make all cell types in the embryo including germ cells4. With the generation of human ESC lines5,6, the appropriate assay to prove pluripotence of these cells was unclear since human ESCs cannot be tested for germline transmission. As a surrogate, the teratoma assay is currently used to demonstrate the pluripotency of human pluripotent stem cells (hPSCs)7,8,9. Though this assay has recently come under scrutiny and new technologies are being actively explored, the teratoma assay is the current gold standard7. In this assay, the cells in question are injected into an immune compromised mouse. If the cells are pluripotent, a teratoma will eventually develop and sections of the tumor will show tissues from all 3 germ layers10. In the teratoma assay, hPSCs can be injected into different areas of the mouse. The most common injection sites include the testis capsule, the kidney capsule, the liver; or into the leg either subcutaneously or intramuscularly11. Here we describe a robust protocol for the generation of teratomas from hPSCs using the testis capsule as the site for tumor growth.

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have the potential to treat a myriad of different diseases. The utility of these cells lies in the fact that they can differentiate into any cell type in the body. Here we describe the teratoma assay, which is used to demonstrate the pluripotence of hPSCs.

Testis Kapsül içinde teratom Üretimi

Pluripotent stem cells (PSCs) have the unique characteristic that they can differentiate into cells from all three germ layers.  This makes them a ...

Tıp

Rapid Point-of-Care Assay of Enoxaparin Anticoagulant Efficacy in Whole Blood

There is the need for a clinical assay to determine the extent to which a patient's blood is effectively anticoagulated by the low-molecular-weight-heparin (LMWH), enoxaparin. There are also urgent clinical situations where it would be important if this could be determined rapidly. The present assay is designed to accomplish this. We only assayed human blood samples that were spiked with known concentrations of enoxaparin. The essential feature of the present assay is the quantification of the efficacy of enoxaparin in a patient's blood sample by degrading it to complete inactivity with heparinase. Two blood samples were drawn into Vacutainer tubes (Becton-Dickenson; Franklin Lakes, NJ) that were spiked with enoxaparin; one sample was digested with heparinase for 5 min at 37 &deg;C, the other sample represented the patient's baseline anticoagulated status. The percent shortening of clotting time in the heparinase-treated sample, as compared to the baseline state, yielded the anticoagulant contribution of enoxaparin. We used the portable, battery operated Hemochron 801 apparatus for measurements of clotting times (International Technidyne Corp., Edison, NJ). The apparatus has 2 thermostatically controlled (37 &deg;C) assay tube wells. We conducted the assays in two types of assay cartridges that are available from the manufacturer of the instrument. One cartridge was modified to increase its sensitivity. We removed the kaolin from the FTK-ACT cartridge by extensive rinsing with distilled water, leaving only the glass surface of the tube, and perhaps the detection magnet, as activators. We called this our minimally activated assay (MAA). The use of a minimally activated assay has been studied by us and others. 2-4 The second cartridge that was studied was an activated partial thromboplastin time (aPTT) assay (A104). This was used as supplied from the manufacturer. The thermostated wells of the instrument were used for both the heparinase digestion and coagulation assays. The assay can be completed within 10 min. The MAA assay showed robust changes in clotting time after heparinase digestion of enoxaparin over a typical clinical concentration range. At 0.2 anti-Xa I.U. of enoxaparin per ml of blood sample, heparinase digestion caused an average decrease of 9.8% (20.4 sec) in clotting time; at 1.0 I.U. per ml of enoxaparin there was a 41.4% decrease (148.8 sec). This report only presents the experimental application of the assay; its value in a clinical setting must still be established.

Demonstration of a rapid quantitative assay of the inhibition of blood coagulation by the low-molecular-weight-heparin, enoxaparin. The contribution of enoxaparin is assessed by removing its influence through digestion with heparinase. A fuller description of the assay is detailed in our published paper.1 The assay still requires clinical confirmation.

Tüm Kan enoksaparin Antikoagülan Etkinliğinin Rapid Point-of-Care Assay

There is the need for a clinical assay to determine the extent to which a patient's blood is effectively anticoagulated by the ...

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. Here, we describe a general protocol for cell labeling, imaging, and image processing. The technique is applicable to various cell types and animal models, although here we focus on a typical mouse model for tracking murine immune cells. The most important issues for cell labeling are described, as these are relevant to all models. Similarly, key imaging parameters are listed, although the details will vary depending on the MRI system and the individual setup. Finally, we include an image processing protocol for quantification. Variations for this, and other parts of the protocol, are assessed in the Discussion section. Based on the detailed procedure described here, the user will need to adapt the protocol for each specific cell type, cell label, animal model, and imaging setup. Note that the protocol can also be adapted for human use, as long as clinical restrictions are met.

In vivo 19F MRI for Cell Tracking

We describe a general protocol for in vivo cell tracking using MRI in a mouse model with ex vivo labeled cells. A typical protocol for cell labeling, image acquisition processing and quantification is included.

Hücre Takip için vivo 19 F MRG

In vivo 19F MRI allows quantitative cell tracking without the use of ionizing radiation. It is a noninvasive technique that can be applied to humans. ...

Cytotoxic Efficacy of Photodynamic Therapy in Osteosarcoma Cells In Vitro

In recent years, there has been the difficulty in finding more effective therapies against cancer with less systemic side effects. Therefore Photodynamic Therapy is a novel approach for a more tumor selective treatment.
Photodynamic Therapy (PDT) that makes use of a nontoxic photosensitizer (PS), which, upon activation with light of a specific wavelength in the presence of oxygen, generates oxygen radicals that elicit a cytotoxic response1. Despite its approval almost twenty years ago by the FDA, PDT is nowadays only used to treat a limited number of cancer types (skin, bladder) and nononcological diseases (psoriasis, actinic keratosis)2.
The major advantage of the use of PDT is the ability to perform a local treatment, which prevents systemic side effects. Moreover, it allows the treatment of tumors at delicate sites (e.g. around nerves or blood vessels). Here, an intraoperative application of PDT is considered in osteosarcoma (OS), a tumor of the bone, to target primary tumor satellites left behind in tumor surrounding tissue after surgical tumor resection. The treatment aims at decreasing the number of recurrences and at reducing the risk for (postoperative) metastasis.
In the present study, we present in vitro PDT procedures to establish the optimal PDT settings for effective treatment of widely used OS cell lines that are used to reproduce the human disease in well established intratibial OS mouse models. The uptake of the PS mTHPC was examined with a spectrophotometer and phototoxicity was provoked with laser light excitation of mTHPC at 652 nm to induce cell death assessed with a WST-1 assay and by the counting of surviving cells. The established techniques enable us to define the optimal PDT settings for future studies in animal models. They are an easy and quick tool for the evaluation of the efficacy of PDT in vitro before an application in vivo.

Cytotoxic Efficacy of Photodynamic Therapy in Osteosarcoma Cells In Vitro

The protocol reported here allows the evaluation of the efficacy of photodynamic therapy (PDT) in cell lines and the optimization of the PDT settings before applying the therapy in animal models.

Osteosarkom Hücrelerde Fotodinamik Tedavi sitotoksik etkinliği<em&gt; In Vitro</em

In recent years, there has been the difficulty in finding more effective therapies against cancer with less systemic side effects. Therefore Photodynamic ...

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in vivo demonstration of such cells has only recently been attained. Here, in vivo imaging techniques to investigate the role of endogenous osteogenic stem/progenitor cells (OSPCs) and their progeny in bone repair are provided. Using osteo-lineage cell tracing models and intravital imaging of induced microfractures in calvarial bone, OSPCs can be directly observed during the first few days after injury, in which critical events in the early repair process occur. Injury sites can be sequentially imaged revealing that OSPCs relocate to the injury, increase in number and differentiate into bone forming osteoblasts. These methods offer a means of investigating the role of stem cell-intrinsic and extrinsic molecular regulators for bone regeneration and repair.

Sequential In vivo Imaging of Osteogenic Stem/Progenitor Cells During Fracture Repair

Quantitative measurement of bone progenitor function in fracture healing requires high resolution serial imaging technology. Here, protocols are provided for using intravital microscopy and osteo-lineage tracking to sequentially image and quantify the migration, proliferation and differentiation of endogenous osteogenic stem/progenitor cells in the process of repairing bone fracture.

Ardışık<em&gt; In vivo</em&gt; Kırık Onarım sırasında Osteojenik Kök / Progenitör Hücrelerinin Görüntüleme

Bone turns over continuously and is highly regenerative following injury. Osteogenic stem/progenitor cells have long been hypothesized to exist, but in ...

Assessment of Ovarian Cancer Spheroid Attachment and Invasion of Mesothelial Cells in Real Time

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not accurately model the behaviors of cancer cells within a nonadherent environment, as cancer cells inherently aggregate into multicellular structures which contribute to the metastatic process by attaching to and invading the peritoneal lining to form secondary tumors. To model this important stage of ovarian cancer metastasis, multicellular aggregates, or spheroids, can be generated from established ovarian cancer cell lines maintained under nonadherent conditions. To mimic the peritoneal microenvironment encountered by tumor cells in vivo, a spheroid-mesothelial co-culture model was established in which preformed spheroids are plated on top of a human mesothelial cell monolayer, formed over an extracellular matrix barrier. Methods were then developed using a real-time cell analyzer to conduct quantitative real time measurements of the invasive capacity of different ovarian cancer cell lines grown as spheroids. This approach allows for the continuous measurement of invasion over long periods of time, which has several advantages over traditional endpoint assays and more laborious real time microscopy image analyses. In short, this method enables a rapid, determination of factors which regulate the interactions between ovarian cancer spheroid cells invading through mesothelial and matrix barriers over time.

Ovarian cancer cell invasion into the mesothelial lining of the peritoneum is a dynamic process over time. Utilizing a real time analyzer, the invasive capacity of ovarian cancer cells in a spheroid-mesothelial cell co-culture model can be quantified over prolonged time periods, providing insights into factors regulating the metastatic process.

Real Time Mezotelyal Hücrelerinin Yumurtalık Kanseri Sferoid Ek ve Invasion Değerlendirilmesi

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not ...

Collection and Extraction of Saliva DNA for Next Generation Sequencing

The preferred source of DNA in human genetics research is blood, or cell lines derived from blood, as these sources yield large quantities of high quality DNA. However, DNA extraction from saliva can yield high quality DNA with little to no degradation/fragmentation that is suitable for a variety of DNA assays without the expense of a phlebotomist and can even be acquired through the mail. However, at present, no saliva DNA collection/extraction protocols for next generation sequencing have been presented in the literature. This protocol optimizes parameters of saliva collection/storage and DNA extraction to be of sufficient quality and quantity for DNA assays with the highest standards, including microarray genotyping and next generation sequencing.

DNA extraction from saliva can provide a readily available source of high molecular weight DNA, with little to no degradation/fragmentation. This protocol provides optimized parameters for saliva collection/storage and DNA extraction to be of sufficient quality and quantity for downstream DNA assays with high quality requirements.

Yeni Nesil dizinleri için Toplama ve Tükrük DNA çıkarımı

The preferred source of DNA in human genetics research is blood, or cell lines derived from blood, as these sources yield large quantities of high quality ...

Assessment of Viability of Human Fat Injection into Nude Mice with Micro-Computed Tomography

Lipotransfer is a vital tool in the surgeon&#8217;s armamentarium for the treatment of soft tissue deficits of throughout the body. Fat is the ideal soft tissue filler as it is readily available, easily obtained, inexpensive, and inherently biocompatible.1 However, despite its burgeoning popularity, fat grafting is hampered by unpredictable results and variable graft survival, with published retention rates ranging anywhere from 10-80%. 1-3
To facilitate investigations on fat grafting, we have therefore developed an animal model that allows for real-time analysis of injected fat volume retention. Briefly, a small cut is made in the scalp of a CD-1 nude mouse and 200-400 &#181;l&#160;of processed lipoaspirate is placed over the skull. The scalp is chosen as the recipient site because of its absence of native subcutaneous fat, and because of the excellent background contrast provided by the calvarium, which aids in the analysis process. Micro-computed tomography (micro-CT) is used to scan the graft at baseline and every two weeks thereafter. The CT images are reconstructed, and an imaging software is used to quantify graft volumes.
Traditionally, techniques to assess fat graft volume have necessitated euthanizing the study animal to provide just a single assessment of graft weight and volume by physical measurement ex vivo. Biochemical and histological comparisons have likewise required the study animal to be euthanized. This described imaging technique offers the advantage of visualizing and objectively quantifying volume at multiple time points after initial grafting without having to sacrifice the study animal. The technique is limited by the size of the graft able to be injected as larger grafts risk skin and fat necrosis. This method has utility for all studies evaluating fat graft viability and volume retention. It is particularly well-suited to providing a visual representation of fat grafts and following changes in volume over time.

Fat grafting is an essential technique for reconstructing soft tissue deficits. However, it remains an unpredictable procedure characterized by variable graft survival. Our goal was to devise a mouse model that utilizes a novel imaging method to compare volume retention between differing techniques of fat graft preparation and delivery.

Mikro-Bilgisayarlı Tomografi ile Çıplak Fareler içine İnsan Yağ Enjeksiyonu Canlılığına Değerlendirilmesi

Lipotransfer is a vital tool in the surgeon&#8217;s armamentarium for the treatment of soft tissue deficits of throughout the body. Fat is the ideal soft ...

Generation of Microtumors Using 3D Human Biogel Culture System and Patient-derived Glioblastoma Cells for Kinomic Profiling and Drug Response Testing

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are time consuming, expensive, and labor intensive. To overcome these obstacles, many research groups have turned to spheroid cultures of cancer cells. While useful, tumor spheroids or aggregates do not replicate cell-matrix interactions as found in vivo. As such, three-dimensional (3D) culture approaches utilizing an extracellular matrix scaffold provide a more realistic model system for investigation. Starting from subcutaneous or intracranial xenografts, tumor tissue is dissociated into a single cell suspension akin to cancer stem cell neurospheres. These cells are then embedded into a human-derived extracellular matrix, 3D human biogel, to generate a large number of microtumors. Interestingly, microtumors can be cultured for about a month with high viability and can be used for drug response testing using standard cytotoxicity assays such as 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) and live cell imaging using Calcein-AM. Moreover, they can be analyzed via immunohistochemistry or harvested for molecular profiling, such as array-based high-throughput kinomic profiling, which is detailed here as well. 3D microtumors, thus, represent a versatile high-throughput model system that can more closely replicate in vivo tumor biology than traditional approaches.

Patient-derived xenografts of glioblastoma multiforme can be miniaturized into living microtumors using 3D human biogel culture system. This in vivo-like 3D tumor assay is suitable for drug response testing and molecular profiling, including kinomic analysis.

Kinomic Profil Yöntemi ve İlaç Tepki Testi için 3D İnsan BIOGEL Kültür Sisteminin Kullanılması Microtumors ve Hasta kaynaklı Glioblastom Hücreleri Üretimi

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are ...

Depletion of Mouse Cells from Human Tumor Xenografts Significantly Improves Downstream Analysis of Target Cells

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic patient tumors in different assays1. Human tumor xenografts represent the gold standard with respect to tumor biology, drug discovery, and metastasis research 2-4. Tumor xenografts can be derived from different types of material like tumor cell lines, tumor tissue from primary patient tumors4 or serially transplanted tumors. When propagated in vivo, xenografted tissue is infiltrated and vascularized by cells of mouse origin. Multiple factors such as the tumor entity, the origin of xenografted material, growth rate and region of transplantation influence the composition and the amount of mouse cells present in tumor xenografts. However, even when these factors are kept constant, the degree of mouse cell contamination is highly variable.
Contaminating mouse cells significantly impair downstream analyses of human tumor xenografts. As mouse fibroblasts show high plating efficacies and proliferation rates, they tend to overgrow cultures of human tumor cells, especially slowly proliferating subpopulations. Mouse cell derived DNA, mRNA, and protein components can bias downstream gene expression analysis, next-generation sequencing, as well as proteome analysis 5. To overcome these limitations, we have developed a fast and easy method to isolate untouched human tumor cells from xenografted tumor tissue. This procedure is based on the comprehensive depletion of cells of mouse origin by combining automated tissue dissociation with the benchtop tissue dissociator and magnetic cell sorting. Here, we demonstrate that human target cells can be can be obtained with purities higher than 96% within less than 20 min independent of the tumor type.

Human tumor xenografts are vascularized and infiltrated by cells of mouse origin during the growth phase in vivo. To circumvent the bias caused by these contaminating cells during downstream analysis, we developed a method allowing for comprehensive depletion of all mouse cells by magnetic cell sorting.

İnsan Tümör ksenogratflarının gelen Fare Hücrelerinin tükenmesi Anlamlı Hedef Hücre Alt Analizi geliştirir

The use of in vitro cell line models for cancer research has been a useful tool. However, it has been shown that these models fail to reliably mimic ...