Bu araştırma Ulusal Bilim Vakfı Çin tarafından (21474057 ve 21604076) destek verdi.

dikkat: ilgili tüm malzeme güvenlik bilgi formları (MSDS) kullanmadan önce lütfen danışın. Lütfen uygun güvenlik uygulamaları kimya deneyleri, bir duman hood ve kişisel koruyucu ekipman (koruyucu gözlük, koruyucu eldiven, önlük, vb) kullanımı da dahil olmak üzere yerine getirirken kullanın. Standart hücre işleme teknikleri (sterilizasyon, hücre kurtarma, cep passaging, hücre dondurma, hücre boyama, vb) protokolü gerektirir.
 1. hazırlık Hydrogels <ol><li><ol><li>öncesi kuruma, PEG benzaldehyde sentezi di functionalized polietilen glikol (DF PEG) sona polimer <ol><li>tartmak 4.00 g PEG (MW 4.000, 1.00 mmol), bir yuvarlak alt şişesi (250 mL) aktarmak ve toluen (100 mL) ekleyin. 
			Not: Farklı molekül ağırlıkları ile diğer mandal hidrojel oluşumu için çalışabilir ancak farklı sertlik götürecek.</li>
			<li>Isı tabancası (ya da sıcak bir tabak yaklaşık 40 ° C) hafif polimer çözülür yardımcı olmak için çözüm ısı. Tüm polimerler geçiyoruz sonra bir Buharlaştırıcı tüm çözücüler kaldırmak için kullanın. Bu erime ve kuru süreç kurutulmuş PEG polimerler yapmak için iki kez yineleyin. 
			Dikkat: Bu bir duman başlıklı aşırı özenle yapılmalıdır. Toluen yanıcı.</li>
		</ol></li> <li>Benzaldehyde fesih tepki PEG <ol><li>şişesi için manyetik karıştırıcı ve tetrahydrofuran (THF, 100 mL) ekleyip PEG bir karıştırıcı kullanarak geçiyoruz. 4-carboxybenzaldehyde (0,90 g, 6.0 mmol) ve 4-dimethylaminopyridine (0,07 g, 0.6 mmol) sırayla tüm katı tamamen erimesi için çözümler ekleyin.</li>
			<li>Ekle N, N &#39;-dicyclohexylcarbodiimide (DCC, 1,25 g, 6.0 mmol) çözümü ve susuz CaCl 2 şişeye doldurulur bir kurutma tüp ekleyin. Reaksiyon karıştırma altında oda sıcaklığında tutmak (~ 20 ° C) için yaklaşık 12 h.</li>
		</ol></li> <li>Sonrası tepki süreci <ol><li>reaksiyon tamamlandıktan sonra vakum tarafından çözümde oluşturulan beyaz katı filtre. Çözüm beyaz katı çökelti için karıştırma altında soğuk Dietil eter (500 mL) dökün. Beyaz katı göre filtrele toplamak ve katı bir duman başlıklı kuru.</li>
			<li>Beyaz katı THF yeniden dağıtılması, çözünmez herhangi bir beyaz katılar filtre, çözüm taze soğuk Dietil beyaz katı çökelti eter dökün ve kuru. 2-3 kez bu adımları tekrarlayın ve sonra beyaz katı bir vakum kurutma fırın (20 ° C, 0.1 mbar) onları tamamen kurumasını yerleştirin. Nihai ürün olarak beyaz toz toplamak: benzaldehyde sona DF PEG.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Hydrogels hazırlanması <ol><li>tartmak DF PEG (0,11 g, 0,028 mmol 0,22 g, 0,055 mmol; 0,44 g, 0.110 mmol) farklı miktarda bir tüp (10 mL), deiyonize su (5.0 mL) ekleyin ve bir girdap veya manyetik karıştırıcı yardımcı olması için kullanın Polimer çözülür.</li>
		<li>Glikol chitosan (0.495 g, x 10 -3 mmol 6,18) deiyonize su (15,0 mL) bir tüp (50 mL) dağıtılması ve kitosan çözüm (3 wt %) homojenize için birkaç dakika için bir girdap kullanın.</li>
		<li>Glikol kitosan çözüm (0.2 mL, 3 wt %) ve DF PEG Çözümleri (0.2 mL) sırayla bir tüp (2.0 mL) ekleyin. Bir girdap formu hydrogels homojen çözümlerinize birkaç dakika içinde karıştırmak için kullanın. Hydrogels farklı mekanik güçlü yapmak için Tablo 1 ' deki oranları izleyin. 
		Not: hidrojel zaten oluşmuş olup olmadığını belirlemek için tüp ters çevirme yöntemini kullanın.</li>
	</ol></li> <li>Reolojisi analizleri <ol><li>Reolojisi analizleri dönüş rheometer paralel bir çelik plaka üzerinde yürütmek (çapı: 20 mm). Jelleşme test için Glikol kitosan çözüm (0.2 mL, 3 wt %) daha düşük bir tabağa yayıldı. O zaman, DF PEG sulu çözümler (0.2 mL, 2 wt %) eşit olarak dropwise kitosan çözüm yüzeye ve hızlı bir şekilde bir pipet ile karıştırın. Düşük aşağı üst plaka ve test için başlar</li>
		<li>İçin hidrojel &#39; s sertlik testi, kesilmiş bir hidrojel bir çember içine (çapı: 20 mm) ve depolama modülü ölçmek (G &#39;) değerleri frekans analizleri % 1 zorlanma, karşı. Tipik G &#39;: 6,3 rad s değerleri &#8722; 1 Tablo 1 ' de listelenen. 
		Not: 0,5 h hidrojel Reolojisi analizleri hidrojel dinamik bağ istikrar sağlamak için hidrojel oluşumu sonra taşımak.</li>
		<li>İçin hidrojel &#39; s kendi kendine healable özelliği testi, bir hidrojel paramparça ve duyulursa ayrılmaz bir parçası için parçaları bir araya toplamak. Bir daire yapmak hidrojel parça kesme (çapı: 20 mm) ve Reolojisi analizlerini incelemek rheometer üzerinde koydu.</li>
	</ol></li></ol> 2. Hydrogels 3D cep ekimi <ol><li>hidrojel jelleşme çözümleri hazırlanması <ol><li>tartmak DF PEG (0,44 g, 0,11 mmol) steril tüp (4.0 mL), hücre kültürü medya (RPMI-1640, 2.0 eklemek mL) ve bir girdap veya karıştırıcı polimer çözüm (20 wt %) elde etmek için polimer çözülür yardımcı olması için kullanın. Çözüm bir şırınga (10.0 mL) içinde yük ve sonra mikrop bakteri kuvvetli filtreden (0,22 µm) geçirerek sterilize.</li>
		<li>Glikol chitosan (0,165 g, 2,06 x 10 -3 mmol) bir steril tüp (15,0 mL) tartmak, hücre kültürü medya (RPMI-1640, 4.0 mL) ve girdap glikol kitosan çözüm (4.0 wt %) elde etmek için polimer çözülür yardımcı olmak için ekleyin. Bir şırınga (10.0 mL) çözümde yük ve 0,22 µm bakteri kuvvetli filtre ile filtre.</li>
	</ol></li> <li>Hydrogels hücre ekimi dikkat: gerçekleştirmek tüm doku kültürü başlıklı ilgili yordamları cep. Steril tekniği konusunda temel bilgi bekleniyor.
	<ol><li>Hücre süspansiyon <ol><li>RPMI-1640 hücrelerde kültür L929 hazırlanması orta % 10 ile desteklenmiş FBS, %5 penisilin (10 mL) bir Petri çanak (çapı 10 cm) ve 37 ° C, % 5 CO 2 kuluçkaya. Orta kullanmadan önce her gün değiştirin.</li>
			<li>Hasat L929 hücreleri tripsin (0.025 w/v %) ve EDTA içeren PBS ile (% 0,01 w/v), (70 x g, 5 min) santrifüj kapasitesi ve RPMI-1640 orta (1.0 mL) hücreleri yeniden askıya alma. Kan sayım kurulu standart operasyon kullanarak hücre sayımı gerçekleştirmek. Hücre toplama ayarlamak için hücreleri yeniden askıya ~ 3.75 × 10 6 hücre/mL.</li>
		</ol></li> <li>Hydrogels hücre katma <ol><li>L929 hücre süspansiyonlar (0.4 mL, 3,75 x 10 6 hücre mL -1) glikol kitosan çözüm (0.4 mL) girdap tarafından bir tüp (4.0 mL) ile karıştırın. L929/glikol kitosan çözüm (0.8 mL) confocal Petri kabına ortasına pipette (çapı 2,0 cm). DF PEG Çözümleri (0.2 mL) aynı çanak içine pipette ve yavaşça çözüm mix ve hidrojel oluşumu teşvik pipet. 
			Not: hidrojel oluşumu petri kabına eğerek değerlendirmek.</li>
			<li>Doğrudan hücre kültürü için ek RPMI-1640 kültür medya (1.0 mL) hidrojel üstüne miktarda ekleyebilirsiniz. Gömülü hücre hydrogels (1.0 mL, 1,5 wt % glikol kitosan, 4.0 wt % DF PEG, 1.5 × 10 6 hücre mL -1) (37 ° C, % 5 CO 2) bir kuluçka makinesine koy ve orta her gün değiştirin. Gün 1, 3, 5 ve 7'den sonra hücre kapsülleme hücre görüntüleme için hazır olun.</li>
		</ol></li> <li>3D cep sonrası kültür için hydrogels enjeksiyon sonra yüklü hücre hidrojel hazırlamak (1.0 mL, bkz: adım 2.2.2) bir şırınga (10.0 mL, 48 G iğne) içinde. Sonra hidrojel formları hidrojel yavaş yavaş bir petri confocal görüntüleme için içine enjekte. Üstünde tepe-in hidrojel (1.0 mL) kültür ortamının ek bir miktar ekleyin ve her gün değiştirin. Petri kabına (37 ° C, % 5 CO 2) bir kuluçka makinesine koy ve daha sonra görüntüleme için hazır olun. 
		Dikkat: Lütfen kontrol edin ve bir şırınga Emanet işlem protokolü izleyin.</li>
	</ol></li> <li>Hücre canlılığı analizi <ol><li>Confocal gözlem <ol>
			<li>PBS (1.0 mL) ile hydrogels için iki kez yıkayın. Floresein diacetate (FDA, 0.5 mL, 0,05 mg/mL) ve propidium iyodür (PI, 0.5 mL, 0,08 mg/mL) çözümleri için 15 dk ile hydrogels leke. Boyama sonra tüm maddeleri kaldırın.</li>
			<li>Gözlemlemek confocal mikroskop altında uyarma dalgaboyu 488, kullanarak hydrogels nm ve 543 canlı görselleştirmek için nm ve ölü hücreleri, anılan sıraya göre. Z-yığınlar hücreler eşit dağılımı doğrulamak için hydrogels her 2 µm derinliğe üzerinden alın. 
			Not: PI ölü hücreleri lekeleri ise FDA canlı hücreleri lekeleri.</li>
		</ol></li> <li>Hidrojel (1.0 mL) Asetik asit (HAc, 3 v %, 1.0 mL) 5 min ve pipet ile bir tüpe (4.0 mL) bozulmasına yol açar. Hücreleri tarafından santrifüj (70 x g, 5 min) toplamak ve RPMI-1640 hücre kültür orta (1.0 mL) hücreleri yeniden askıya alma. Bir kan sayım kurulu kullanarak hücre sayımı gerçekleştirmek.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Hoffman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels+for+biomedical+applications.">Hydrogels for biomedical applications.</a> Adv. Drug. Deliver. Rev. 64, 18-23 (2012).</li><li>Seliktar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Designing+cell-compatible+hydrogels+for+biomedical+applications.">Designing cell-compatible hydrogels for biomedical applications.</a> Science. 336 (6085), 1124-1128 (2012).</li><li>Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels+as+extracellular+matrix+mimics+for+3D+cell+culture.">Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture.</a> Biotechnol. Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).</li><li>Sawicki, L. A., Kloxin, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-mediated+Formation+and+Patterning+of+Hydrogels+for+Cell+Culture+Applications.">Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications.</a> J. Vis. Exp. (115), (2016).</li><li>Haycock, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+cell+culture:+a+review+of+current+approaches+and+techniques.">3D cell culture: a review of current approaches and techniques.</a> 3D Cell Culture: Methods and Protocols. , 1-15 (2011).</li><li>Breslin, S., O&#8217;Driscoll, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+cell+culture:+the+missing+link+in+drug+discovery.">Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery.</a> Drug. Discov. Today. 18 (5), 240-249 (2013).</li><li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Facilely+prepared+inexpensive+and+biocompatible+self-healing+hydrogel:+a+new+injectable+cell+therapy+carrier.">Facilely prepared inexpensive and biocompatible self-healing hydrogel: a new injectable cell therapy carrier.</a> Polym. Chem. 3 (12), 3235-3238 (2012).</li><li>Zhang, Y., Tao, L., Li, S., Wei, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+multiresponsive+and+dynamic+chitosan-based+hydrogels+for+controlled+release+of+bioactive+molecules.">Synthesis of multiresponsive and dynamic chitosan-based hydrogels for controlled release of bioactive molecules.</a> Biomacromolecules. 12 (8), 2894-2901 (2011).</li><li>Cao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+injectable+hydrogel+formed+by+in+situ+cross-linking+of+glycol+chitosan+and+multi-benzaldehyde+functionalized+PEG+analogues+for+cartilage+tissue+engineering.">An injectable hydrogel formed by in situ cross-linking of glycol chitosan and multi-benzaldehyde functionalized PEG analogues for cartilage tissue engineering.</a> J. Mater. Chem. B. 3 (7), 1268-1280 (2015).</li><li>Ding, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dynamic+and+self-crosslinked+polysaccharide+hydrogel+with+autonomous+self-healing+ability.">A dynamic and self-crosslinked polysaccharide hydrogel with autonomous self-healing ability.</a> Soft Matter. 11 (20), 3971-3976 (2015).</li><li>Wei, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-healing+gels+based+on+constitutional+dynamic+chemistry+and+their+potential+applications.">Self-healing gels based on constitutional dynamic chemistry and their potential applications.</a> Chem. Soc. Rev. 43 (23), 8114-8131 (2014).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulus-regulated+3D-cell+proliferation+in+an+injectable+self-healing+hydrogel.">Modulus-regulated 3D-cell proliferation in an injectable self-healing hydrogel.</a> Colloid. Surface. B. 149, 168-173 (2017).</li><li>Tseng, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Injectable,+Self&#8208;Healing+Hydrogel+to+Repair+the+Central+Nervous+System.">An Injectable, Self&#8208;Healing Hydrogel to Repair the Central Nervous System.</a> Adv. Mater. 27 (23), 3518-3524 (2015).</li><li>Yu, L., Ding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injectable+hydrogels+as+unique+biomedical+materials.">Injectable hydrogels as unique biomedical materials.</a> Chem. Soc. Rev. 37 (8), 1473-1481 (2008).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+Tumor+Chemotherapy+Effect+by+Using+an+Injectable+Self-healing+Hydrogel+as+Drug+Carrier.">Improving Tumor Chemotherapy Effect by Using an Injectable Self-healing Hydrogel as Drug Carrier.</a> Polym. Chem. , (2017).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+magnetic+self-healing+hydrogel.">A magnetic self-healing hydrogel.</a> Chem. Commun. 48 (74), 9305-9307 (2012).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+an+injectable,+self-healable+and+dual+responsive+hydrogel+for+drug+delivery+and+3D+cell+cultivation.">Synthesis of an injectable, self-healable and dual responsive hydrogel for drug delivery and 3D cell cultivation.</a> Polym. Chem. 8 (3), 537-534 (2017).</li><li>Yang, C., Tibbitt, M. W., Basta, L., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+memory+and+dosing+influence+stem+cell+fate.">Mechanical memory and dosing influence stem cell fate.</a> Nat. Mater. 13 (6), 645-652 (2014).</li><li>Geerligs, M., Peters, G. W., Ackermans, P. A., Oomens, C. W., Baaijens, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Linear+viscoelastic+behavior+of+subcutaneous+adipose+tissue.">Linear viscoelastic behavior of subcutaneous adipose tissue.</a> Biorheology. 45 (6), 677-688 (2008).</li><li>Banerjee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+hydrogel+modulus+on+the+proliferation+and+differentiation+of+encapsulated+neural+stem+cells.">The influence of hydrogel modulus on the proliferation and differentiation of encapsulated neural stem cells.</a> Biomaterials. 30 (27), 4695-4699 (2009).</li><li>Benoit, D. S., Schwartz, M. P., Durney, A. R., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+functional+groups+for+controlled+differentiation+of+hydrogel-encapsulated+human+mesenchymal+stem+cells.">Small functional groups for controlled differentiation of hydrogel-encapsulated human mesenchymal stem cells.</a> Nat. Mater. 7 (10), 816-823 (2008).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu Protokolü (şekil 1) sunulan hidrojel iki ana bileşenden oluşur: doğal polimer glikol chitosan ve sentetik bir benzaldehyde sona polimer gelator DF PEG, hangi her iki Biyouyumlu malzemelerdir. DF PEG sentezi bir tek adımlı değişiklik tepki kullanılarak sunulur. Moleküler ağırlık 4.000 PEG bu protokol çözünürlük, değişiklik verimliliği gibi hidrojel sertlik endişelerini için seçildi. Hydrogels ile farklı mekanik güçlü bir dizi hazırlanan kullanarak farklı katı içeriği ve oranları glikol chitosan ve DF PEG. Jelleşme hız da seyreltik çözümleri tarafından yavaşlayabilir miyiz rağmen homojen hydrogels hızlı bir şekilde dakikada jelleşme çözümleri altında oda sıcaklığında, karıştırılarak oluşmuştur. Reolojisi test farklı hydrogels mekanik gücü değerlendirmek için istihdam edildi. Depolama dönmeler (G') bu hydrogels yaklaşık 900 farklı bulunmuştur Pa (yumuşak), 2.100 Pa (orta) 4.700 için Pa (sert) (Tablo 1 ve şekil 2A). Bu yüksek crosslinking yoğunluk daha yüksek depolama modülü (daha fazla sertlik) kaynaklanan hidrojel ağ daha fazla polimer gelators ekleyerek katkıda. Kendi kendine healable özelliği de hidrojel 's modülü (şekil 2B) kurtarma tarafından onaylanır. ECM sertlik için çeşitli dokularda farklıdır, bu nedenle hidrojel ayarlanabilir mekanik yardımlar teklif ve farklı araştırma gereksinimlerini karşılamak bu glikol chitosan ve DF PEG polimer gelators18arasında çeşitli oranları tarafından bilinmektedir.
L929 hücreleri, normal fare fibroblast hücre kültürünü vivo içinde çevre doku sertliği ile ~ 5.600 pa19, hidrojel içinde gömülü olabilir için bir hücre modeli olarak kullanıldı. Hydrogels hücre katma sonra bunu kolayca hydrogels hücrelerde son derece yüksek canlılık gösterdi görülebilmektedir (&#62; % 99) kültür süreci boyunca kitosan tabanlı hidrojel mükemmel Biyouyumluluk teyit. Hidrojel hücre yoğunluğu dikkate değer bir artış bu hidrojel L929 hücrelerin büyüme faktörleri (şekil 3A) ekstra ekledi olmadan da çoğalması destek olabilir ima etti. Kültür hidrojel içinde 7 gün sonra cep numarası (şekil 3B) % 300 arttı. Bu hücreler içinde iskele kültürlü hangi daha fazla araştırma bu 3D hidrojel kültür yöntemi kullanarak ima mekanik yardımlar20,21, takip ayırt bildirilmektedir.
Enjekte edilebilir hydrogels hücrelerle Reproduction büyük teslimat verimlilik ve implante hücreleri14canlılık geliştirmek için eşsiz avantajlar kazanmıştır. Dinamik imin çapraz ağ içinde hidrojel duyulursa enjeksiyon sonra olabilir. Kendi kendine healable özelliği enjekte edilebilir, olmak hidrojel hydrogels olarak enjekte edilebilir için potansiyel uygulamalar birden çok taşıyıcıları ima sağlar. Daha fazla bu hidrojel bir enjekte edilebilir hücre taşıyıcı olarak değerlendirmek için bir enjeksiyon taklit eden ve sonrası kodlamayla deneme gerçekleştirildi. Gömülü hücre hidrojel bir şırıngada yüklendi ve 48 G iğne ile bir petri 7 işlem sonrası ile hücre canlılığı ve yayılma hızı okudu kültür günde ardından, içine kalan.
Şekil 4Agörüldüğü gibi ezilmiş hidrojel adet tümleşik bir hidrojel yaklaşık 1 h hücre dağıtımında yardımcı olur enjeksiyon sonra reform duyulursa olabilir. Hidrojel hücrelerde için kapsülleme (4A rakam, sol Ekle), önemli ölçüde 7 gün sonra (4A rakam, orta Ekle) artmış hücre yoğunluğu hemen sonra görüntü ile karşılaştırıldığında aldı. Genişlemiş imgelemde, daha ayrıntılı bir hücre fissional süreç içinde bazı hücreler ikiye bölünmesine olanak bulunur (şekil 4A, doğru Ekle), doğrudan hidrojel 3D hücre çoğalması tarafından onaylandı. Şekil 4B enjeksiyon ve sonrası kültür deneme sonra canlı ölü hücre deneyleri confocal görüntüleri gösterir. Enjekte hücre yoğunluğu arttı tabii ki yüksek hücre canlılığı ile (&#62; % 99), enjeksiyon sonra 3D hidrojel içinde başarılı hücre çoğalması gösteren. Enjeksiyon hücre proliferasyon oranı etkilenen olsun, nicel istatistik analizi için hydrogels veya iğne olmadan Hücre proliferasyonu fiyatlarına karşılaştırması yapıldı öğrenmek için (şekil 4 c) yapılır. Hücre proliferasyon hızı enjeksiyon sonra biraz azalmış olsa da, üst düzey (~ %75) ve hücre sayısı artan %145 nispeten 7 gün içinde kesme Kuvvetleri enjeksiyon sırasında bir observable sahip gösteren hidrojel kültüründe kaldı sonra hücre çoğalması negatif etkisi sınırlı.
Biz bu hidrojel uygulamasının tipik bir prosedür açıklanan ancak araştırmacılar protokolünü belirli araştırma gereksinimlere uygun biçimde değiştirebilirsiniz. Polimer gelators hidrojel üzerinde önemli etkiler ve kolayca değiştirilebilir. Örneğin, bu hidrojel sertliği kolayca glikol chitosan ve DF PEG gelator farklı oranları tarafından manipüle. Bu arada, kullanım DF PEG diğer moleküler ağırlıkları da bu hedef yerine getirmek. Bu protokol için 4 K PEG kullandık ama PEG 2K 10K de işe yarayabilir. Diğer mandal kullanırken, sertlik ve jelleşme zamanı özellikle izlemek önemlidir. Araştırmacılar belirli fonksiyonel benzaldehyde sonlandırılmış polimerler17hazırlamak için sentez becerileri varsa diğer fonksiyonel polimer gelators de işe yarayabilir.
Bu iletişim kuralının bazı sınırlamaları vardır. İlk olarak, dinamik yapısı nedeniyle, bu hidrojel sertliği bir kovalent bağ çapraz hidrojel ile karşılaştırıldığında sınırlı. Bir hydrogels ile hazırlamak için hataları karşılaşabilirsiniz bir modülü tasarım çok yüksek. İkinci olarak, bu hidrojel biyo-böylece uzun vadeli hücre kültürü içinde hidrojel sınırlama parçalanabilir,. Üçüncü olarak, hidrojel Difüzyon endişeli bir 3D çapraz yetiştirme ortamı sunar. Bugüne kadar çoğu biyo analizler, 2D kültür üzerinde temel alır. 3D yapısı daha fazla hücre vivo çalışmalarda ilgili engel.
Bu iletişim kuralı kullanıldığında, izlenmesi gereken birkaç kritik adım vardır. İlk olarak, polimer gelator DF PEG sentezi sırasında dehidratasyon çok önemlidir. İkinci olarak, hücre ile ilgili yordamları gerçekleştirirken, steril kritik bir işlemdir. Üçüncü olarak, boyama zaman iyi hydrogels güzel confocal görüntüler elde etmek için kontrol edilmelidir.
Özet olarak, 3D hücre kültürü için bir platform olarak uygulanır ve ayarlanabilir mekanik yardımlar çeşitli araştırmalar için teklif verebilir, kitosan-esaslı enjekte edilebilir hydrogels facile hazırlanması protokol tanıttı. İlaç dağıtım, hücre tedavisi ve sadece performansını bir kanıtıdır, ama aynı zamanda Biyomedikal ap için potansiyel artar tümör kemoterapi ile ilgili alanlarda zaten uygulanmışaçık.

Hydrogels çapraz polimer malzemeler büyük miktarda su ve yumuşak mekanik özellikleri ile ve birçok bio-tıbbi uygulamalar1,2' kullanılmıştır. Hydrogels hücreleri içinde vivoiçin fizyolojik çevre çok benzer bir yumuşak ve ıslak ortam sunmaktadır. Bu nedenle, hydrogels 3D hücre kültür3,4için en popüler iskele biri haline gelmiştir. 2D Petri kabına hücre kültürü için karşılaştırıldığında, 3D hücre kültürü, microenvironment başvurun ve yayılmasını önleme ve ayırt etme amacıyla5için bir araya hücreler için bir hücre dışı Matriks (ECM) taklit sunmak için hızla ilerlemiştir. Ayrıca, doğal polimerler içeren hydrogels biyo uyumlu ve teşvik ortamları çoğalırlar ve3ayırt etmek için hücreleri için önerebiliriz. Sentetik polimerler elde Hydrogels hayvan kökenli proteinler veya virüs gibi karmaşık etkileri dışlamak onların basit ve net bileşenleri için tercih edilir. Tüm hidrojel adaylar arasında 3D hücre kültürü için kolayca hazırlanır ve tutarlı bir özellik olan hydrogels her zaman tercih edilir. Farklı araştırma gereksinimleri uyacak hidrojel'ın özelliklerini ayarlamak için tesisin iyi6önemlidir.
Burada bir çok yönlü hidrojel platform 3D hücre kültür7için olur dinamik imin kimya kullanarak bir glikol kitosan tabanlı hidrojel facile hazırlanması tanıtmak. Bu yöntemde, iyi bilinen biyo uyumlu glikol kitosan çerçeveler hidrojel'ın ağlar kurmak için kullanılır. Onun amino grupları ile sona benzaldehyde polietilen glikol dinamik imin Tahvil hydrogels8crosslinkages oluşturmak için polimer gelator olarak tepki. Dinamik imin Tahvil formu ve çevresi, hydrogels mekanik olarak ayarlanabilir çapraz ağlar9,10,11ile endowing için geri döndürülebilir ve responsively ayrıştırmak. Yüksek su içeriği, biyo uyumlu malzemeler ve ayarlanabilir mekanik güçlü nedeniyle hidrojel başarıyla 3D hücre kültürü12,13L929 hücreler için bir iskele olarak uygulanır. İletişim kuralı burada polimer gelator sentezi, hidrojel hazırlama, hücre katıştırma ve 3D hücre kültürü çalışmalarının da dahil olmak üzere yordamlar, ayrıntıları.
Hidrojel aynı zamanda birçok diğer özellikleri nedeniyle çok duyarlı çeşitli biyo-uyarıcılara (asit/pH, B6 vitamini türevi piridoksal, protein papain, vb) dahil olmak üzere, hidrojel olabileceğini gösteren onun dinamik imin crosslinkages gösterir fizyolojik şartlarda8altında çürümeye bağlı. Hidrojel hidrojel minimal invaziv enjeksiyon yöntemi ile idare ve uyuşturucu ve hücre teslimatlar14,15dakika sonra bir avantaj Yani kendi kendine healable ve enjekte edilebilir, da. Hidrojel işlevsel katkı maddeleri veya belirli önceden tasarlanmış polimer gelators ekleyerek, manyetik, sıcaklık, pH duyarlı, hangi yerine vb16,17, gibi belirli özellikleri kazanıyor için uyumlu bir araştırma gereksinimleri çok çeşitli. Bu özellikleri bir enjekte edilebilir olmak potansiyel kapasite hidrojel'ın uyuşturucu ve hücreler içinde in vitro ve in vivo bio-Medikal araştırma ve uygulamalar için birden fazla taşıyıcıları ortaya koyuyor.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1151">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:276px;">Glycol chitosan</td>
			<td style="width:360px;">Wako Pure Chemical Industries</td>
			<td style="width:131px;">39280-86-9</td>
			<td style="width:385px;">90% degree of deacetylation</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">4-Carboxybenzaldehyde</td>
			<td>Shanghai Aladdin&#160;Bio-Chem Technology Co.,LTD</td>
			<td>619-66-9</td>
			<td>99%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">N, N&#39;-dicyclohexylcarbodiimide</td>
			<td>Shanghai Aladdin&#160;Bio-Chem Technology Co.,LTD</td>
			<td>538-75-0</td>
			<td>99%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Calcium chloride anhydrous</td>
			<td>Shanghai Aladdin&#160;Bio-Chem Technology Co.,LTD</td>
			<td>10043-52-4</td>
			<td>96%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">4-dimethylamiopryidine</td>
			<td>Shanghai Aladdin&#160;Bio-Chem Technology Co.,LTD</td>
			<td>1122-58</td>
			<td>99%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Polyethyleneglycol</td>
			<td>Sino-pharm Chemical Reagent</td>
			<td>5254-43-7</td>
			<td>99%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tetrahydrofuran</td>
			<td>Sino-pharm Chemical Reagent</td>
			<td>109-99-9</td>
			<td>99%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Toluene</td>
			<td>Sino-pharm Chemical Reagent</td>
			<td>108-88-3</td>
			<td>99%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ethyl ether</td>
			<td>Sino-pharm Chemical Reagent</td>
			<td>60-29-7</td>
			<td>99%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetic acid</td>
			<td>Sino-pharm Chemical Reagent</td>
			<td>64-19-7</td>
			<td>99%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anhydrous CaCl2</td>
			<td>Sino-pharm Chemical Reagent</td>
			<td>10043-52-4</td>
			<td>99%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fluorescein diacetate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>596-09-8</td>
			<td>99%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Propidium iodide&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>25535-16-4</td>
			<td>94%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">RPMI-1640 culture media</td>
			<td>Gibco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td></td>
			<td>0.25%</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS</td>
			<td>Solarbio</td>
			<td></td>
			<td>0.01 M</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin streptomycin solution</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td></td>
			<td>10,000 U/mL</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rheometer</td>
			<td>TA Instrument</td>
			<td></td>
			<td>AR-G2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Confocal microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>710-3channel</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L929 Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td>NCTC clone 929; L cell, L929, derivative of Strain L</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Evaporator</td>
			<td>EYELA</td>
			<td></td>
			<td>N-1100</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">48 guage needle</td>
			<td>ShanghaiZhiyu Medical Material Co., LTD</td>
			<td></td>
			<td>48-guage</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td>DM3000 B</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microscope software</td>
			<td>Imaris</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Heat gun</td>
			<td>Confu</td>
			<td></td>
			<td>KF-5843&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Petri dish</td>
			<td>NEST</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of chitosan-based injectable hydrogels and its application in 3d cell culture

Protokol kitosan tabanlı hydrogels dinamik imin kimya kullanarak hazırlamak için facile, verimli ve çok yönlü bir yöntem sunuyor. Hidrojel çözümleri glikol kitosan, sentezlenmiş benzaldehyde sonlandırıldı polimer gelator ile karıştırılarak hazırlanır ve hydrogels verimli bir şekilde oda sıcaklığında birkaç dakika içinde elde edilir. Glikol kitosan, polimer gelator ve su içeriği arasında değişen oranlarda tarafından farklı jelleşme kez ve sertliği ile çok yönlü hydrogels elde edilir. Zarar görmüş, hidrojel onun Görünüşe ve modülü, dinamik imin Tahvil reversibility crosslinkages olarak nedeniyle kurtarabilirsiniz. Kendi kendine healable bu özellik hidrojel enjeksiyon işleminden sonra sıkılmış parçaları bir ayrılmaz toplu hidrojel kendi kendine iyileşmiş olabilir bu yana enjekte edilebilir olmasını sağlar. Hidrojel da çok farklı denge durumları dinamik imin Tahvil nedeniyle birçok biyo-aktif uyaranlara cevap veriyor. Bu hidrojel biyo uyumlu doğrulandı ve L929 fare fibroblast hücreleri katıştırılmış aşağıdaki Standart prosedürler ve Hücre proliferasyonu kolayca 3D cep ekimi işlemi tarafından değerlendirildi. Hidrojel farklı araştırma nerede bir 3D çevre hücreler için fizyolojik bir taklit kazançlı için ayarlanabilir bir platform sunar. Çok duyarlı, kendi kendine healable ve enjekte edilebilir özellikleri ile birlikte, hydrogels potansiyel olarak uyuşturucu ve gelecekteki bio-tıbbi uygulamalar hücrelerde birden çok taşıyıcıları olarak uygulanabilir.

Bu protokol hidrojel hazırlık ve 3D hücre kültürü olarak kullanılmasını şematik bir sunumunu şekil 1' de sunulmaktadır. Bilgi hidrojel'ın içindekiler ve farklı mekanik güçlü ile hazırlanan oranları Tablo 1' de özetlenmiştir. Hidrojel kendi kendine healable ve depolama modülü Frekans testi Şekil 2' deki karşı tarafından hidrojel'ın sertlik Reolojisi özelliği sunar. Hücre confocal görüntüleri ve gün ile hücre sayısı hydrogels kültüründe hücre canlılık ve Hücre proliferasyonu ile 3D hücre kültürü teyit şekil 3' te sunulmaktadır. Şekil 4 mikroskobu, confocal resim ve Hücre proliferasyonu oranları enjeksiyon ve sonrası kültür acı hydrogels içinde gömülü hücreler için analizini sunar. Yüksek hücre canlılık ve Hücre proliferasyonu hidrojel içinde gömülü hücreleri yıkıcı zarar uğradığı ve hidrojel'ın injectability gösteren sonrası kültür tarafından geri olabilir gösterir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56253/56253fig1.jpg"> 
Resim 1 : Hidrojel ve 3D hücre kültürü olarak kullanılmasını hazırlanması. (A)hidrojel hazırlık; (B) hücre süspansiyon hazırlama; (C) 3D hücre kültüründe hydrogels veya iğne olmadan. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56253/56253fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56253/56253fig2.jpg"> 
Resim 2: Hidrojel sertlik. Depolama modülü G' karşı sıklığı özgün(a)ve (B) kendi kendine iyileşmiş hydrogels. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56253/56253fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56253/56253fig3.jpg"> 
Şekil 3 : 3D hücre kültüründe hidrojel. L929 hücreleri(a)3D confocal görüntülerini katıştırılmış sert güç hidrojel (yeşil: Canlı hücreler; Kırmızı: ölü hücreleri); (B) hücre sayım sonuçları L929 hücrelerinin hücre kapsülleme izotopu zaman sonra hidrojel içinde gömülü. Ölçek çubuğu 300 µm. sunulan ortalama ± SD veri = <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56253/56253fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56253/56253fig4.jpg"> 
Şekil 4 : 3D hücre hidrojel sonra enjeksiyon sonrası kültüründe. Enjeksiyon ve hücre yüklü hidrojel sonrası kültür (A) A şematik görüntüsü. Ekle: Hydrogels (solda) enjeksiyon öncesi ve sonrası hücre kültürü (orta ve sağ) 7 gün sonra hücrelerinin mikroskopisi görüntüleri gömülü. Ölçek çubuğu 100 µm; = (B) Confocal görüntüleri L929 hücrelerinin bir sert güç hidrojel gömülü ve sonra enjeksiyon sonrası kültürlü (yeşil: Canlı hücreler; Kırmızı: ölü hücreleri), ölçek çubuğu 300 µm; = (C) A nükleer silahların yayılmasına karşı oranı hydrogels ile ya da ezelî sonra kapsülleme enjeksiyon kültürlü hücre karşılaştırılması. Ortalama ± SD (uyarlama başvuru12; olarak sunulan veri Copyright © 2017 Elsevier). <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56253/56253fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Hidrojel sertlik</td>
			<td>Yumuşak</td>
			<td>Orta</td>
			<td>Sert</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glikol chitosan (mg)</td>
			<td>6,6</td>
			<td>6,6</td>
			<td>6,6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DF PEG (mg)</td>
			<td>4.4</td>
			<td>8.8</td>
			<td>17,6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polimer gelator içeriği (wt %)</td>
			<td>1</td>
			<td>2</td>
			<td>4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deiyonize su (mL)</td>
			<td>0,4</td>
			<td>0,4</td>
			<td>0,4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelaion süresi (dk)</td>
			<td>7.5</td>
			<td>5</td>
			<td>3.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G' (Pa)*</td>
			<td>900</td>
			<td>2100</td>
			<td>4700</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>* test altında frekans 6.3 rad s-1, zorlanma paralel bir tabak kullanarak % 1 (çapı 20 mm) dönme rheometer üzerinde.</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tablo 1: Bilgi farklı mekanik güçlü ile hazırlanan hydrogels.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Chitosan-based Injectable Hydrogels and Its Application in 3D Cell Culture at JoVE.com

Preparation of Chitosan-based Injectable Hydrogels and Its Application in 3D Cell Culture

Burada facile hazırlanması enjekte edilebilir hydrogels kitosan tabanlı dinamik imin kimya kullanarak açıklar. Hidrojel'ın mekanik mukavemeti ve 3D hücre kültürü kendi uygulamasında ayarlamak için yöntemleri sunulmaktadır.

Kitosan-esaslı enjekte edilebilir Hydrogels ve kendi uygulamasında 3D hücre kültürü hazırlanması

The protocol presents a facile, efficient, and versatile method to prepare chitosan-based hydrogels using dynamic imine chemistry. The hydrogel is ...

preparation-chitosan-based-injectable-hydrogels-its-application-3d

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Chemistry

18.9K Görüntüleme.  Tsinghua University. Burada facile hazırlanması enjekte edilebilir hydrogels kitosan tabanlı dinamik imin kimya kullanarak açıklar. Hidrojel'ın mekanik mukavemeti ve 3D hücre kültürü kendi uygulamasında ayarlamak için yöntemleri sunulmaktadır.

Video: Preparation of Chitosan-based Injectable Hydrogels and Its Application in 3D Cell Culture

Synthesis, Cellular Delivery and In vivo Application of Dendrimer-based pH Sensors

The development of fluorescent indicators represented a revolution for life sciences. Genetically encoded and synthetic fluorophores with sensing abilities allowed the visualization of biologically relevant species with high spatial and temporal resolution. Synthetic dyes are of particular interest thanks to their high tunability and the wide range of measureable analytes. However, these molecules suffer several limitations related to small molecule behavior (poor solubility, difficulties in targeting, often no ratiometric imaging allowed). In this work we introduce the development of dendrimer-based sensors and present a procedure for pH measurement in vitro, in living cells and in vivo. We choose dendrimers as ideal platform for our sensors for their many desirable properties (monodispersity, tunable properties, multivalency) that made them a widely used scaffold for several biomedical devices. The conjugation of fluorescent pH indicators to the dendrimer scaffold led to an enhancement of their sensing performances. In particular dendrimers exhibit reduced cell leakage, improved intracellular targeting and allow ratiometric measurements. These novel sensors were successfully employed to measure pH in living HeLa cells and in vivo in mouse brain.

Synthesis, Cellular Delivery and In vivo Application of Dendrimer-based pH Sensors

Fluorescence sensors are powerful tools in life science. Here we describe a methodology to synthesize and use dendrimer-based fluorescent sensors to measure pH in living cells and in vivo. The dendritic scaffold enhances the properties of conjugated fluorescent dyes leading to improved sensing properties.

Sentez, Hücresel Teslimat ve<em&gt; In vivo</em&gt; Dendrimer tabanlı pH Sensörlerin Uygulamaları

The development of  fluorescent indicators represented a revolution for life sciences. Genetically  encoded and synthetic fluorophores with sensing ...

Kimya

Isolation and Preparation of Bacterial Cell Walls for Compositional Analysis by Ultra Performance Liquid Chromatography

The bacterial cell wall is critical for the determination of cell shape during growth and division, and maintains the mechanical integrity of cells in the face of turgor pressures several atmospheres in magnitude. Across the diverse shapes and sizes of the bacterial kingdom, the cell wall is composed of peptidoglycan, a macromolecular network of sugar strands crosslinked by short peptides. Peptidoglycan&#8217;s central importance to bacterial physiology underlies its use as an antibiotic target and has motivated genetic, structural, and cell biological studies of how it is robustly assembled during growth and division. Nonetheless, extensive investigations are still required to fully characterize the key enzymatic activities in peptidoglycan synthesis and the chemical composition of bacterial cell walls. High Performance Liquid Chromatography (HPLC) is a powerful analytical method for quantifying differences in the chemical composition of the walls of bacteria grown under a variety of environmental and genetic conditions, but its throughput is often limited. Here, we present a straightforward procedure for the isolation and preparation of bacterial cell walls for biological analyses of peptidoglycan via HPLC and Ultra Performance Liquid Chromatography (UPLC), an extension of HPLC that utilizes pumps to deliver ultra-high pressures of up to 15,000 psi, compared with 6,000 psi for HPLC. In combination with the preparation of bacterial cell walls presented here, the low-volume sample injectors, detectors with high sampling rates, smaller sample volumes, and shorter run times of UPLC will enable high resolution and throughput for novel discoveries of peptidoglycan composition and fundamental bacterial cell biology in most biological laboratories with access to an ultracentrifuge and UPLC.

The bacterial cell wall is composed of peptidoglycan, a macromolecular network of sugar strands crosslinked by peptides. Ultra Performance Liquid Chromatography provides high resolution and throughput for novel discoveries of peptidoglycan composition. We present a procedure for the isolation of cell walls (sacculi) and their subsequent preparation for analysis via UPLC.

Ultra Performanslı Sıvı Kromatografisi ile Bileşimsel Analiz için Bakteriyel Hücre Duvarlarının İzolasyonu ve Hazırlanması

The bacterial cell wall is critical for the determination of cell shape during growth and division, and maintains the mechanical integrity of cells in the ...

Preparation and Use of Carbonyl-decorated Carbenes in the Activation of White Phosphorus

Here we present a protocol for the synthesis of two distinct carbonyl-decorated carbenes. Both carbenes can be prepared using nearly identical procedures in multi-gram scale quantities. The goal of this manuscript is to clearly detail how to handle and prepare these unique carbenes such that a synthetic chemist of any skill level can work with them. The two carbenes described are a diamidocarbene (DAC, carbene 1) and a monoamidoaminocarbene (MAAC 2). These carbenes are highly electron-deficient and as such display reactivity profiles that are atypical of more traditional N-heterocyclic carbenes. Additionally, these two carbenes only differ in their electrophilic character and not their steric parameters, making them ideal for studying how carbene electronics influence reactivity. To demonstrate this phenomenon, we are also describing the activation of white phosphorus (P4) using these carbenes. Depending on the carbene used, two very different phosphorus-containing compounds can be isolated. When the DAC 1 is used, a tris(phosphaalkenyl)phosphane can be isolated as the exclusive product. Remarkably however, when MAAC 2 is added to P4 under identical reaction conditions, an unexpected carbene-supported P8&#160;allotrope of phosphorus is isolated exclusively. Mechanistic studies demonstrate that this carbene-supported P8allotrope forms via a [2+2] cycloaddition dimerization of a transient diphosphene which has been trapped by treatment with 2,3-dimethyl-1,3-butadiene.

Here, we present a protocol for the synthesis of two carbonyl-decorated carbenes. The protocol makes these interesting compounds readily available to chemists of all skill levels. In addition to the synthesis of these two carbenes, their use in the activation of white phosphorus is also described.

Beyaz Fosfor harekete geçirmek Karbonil dekore Karbenlerin hazırlanması ve kullanımı

Here we present a protocol for the synthesis of two distinct carbonyl-decorated carbenes. Both carbenes can be prepared using nearly identical procedures ...

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of heteroxylans. De-starched wheat endosperm cell walls were isolated as an alcohol-insoluble residue (AIR)1 and sequentially extracted with water (W-sol Fr) and 1 M KOH containing 1% NaBH4 (KOH-sol Fr) as described by Ratnayake et al. (2014)2. Two different approaches (see summary in Figure 1) are adopted. In the first, intact W-sol AXs are treated with 2AB to tag the original RE backbone chain sugar residue and then treated with an endoxylanase to generate a mixture of 2AB-labelled RE and internal region reducing oligosaccharides, respectively. In a second approach, the KOH-sol Fr is hydrolyzed with endoxylanase to first generate a mixture of oligosaccharides which are subsequently labelled with 2AB. The enzymically released ((un)tagged) oligosaccharides from both W- and KOH-sol Frs are then methylated and the detailed structural analysis of both the native and methylated oligosaccharides is performed using a combination of MALDI-TOF-MS, RP-HPLC-ESI-QTOF-MS and ESI-MSn. Endoxylanase digested KOH-sol AXs are also characterized by nuclear magnetic resonance (NMR) that also provides information on the anomeric configuration. These techniques can be applied to other classes of polysaccharides using the appropriate endo-hydrolases.

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical Methylation and Physical Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance Techniques

This protocol describes the specific techniques used for the structural characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of heteroxylans by tagging the RE with 2 aminobenzamide prior to enzymatic (endoxylanase) hydrolysis and then analysis of the resultant oligosaccharides using mass spectrometry (MS) and nuclear magnetic resonance (NMR).

Enzimatik, kimyasal (Metilasyon) ve Fiziksel (Kütle Spektrometre, Nükleer Manyetik Rezonans) Teknikleri Kullanarak Bitki Duvar heteroksilanlar sıralanması

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of ...

Investigations on the Ga(III) Complex of EOB-DTPA and Its 68Ga Radiolabeled Analogue

We demonstrate a method for the isolation of EOB-DTPA (3,6,9-triaza-3,6,9-tris(carboxymethyl)-4-(ethoxybenzyl)-undecanedioic acid) from its Gd(III) complex and protocols for the preparation of its novel non-radioactive, i.e., natural Ga(III) as well as radioactive 68Ga complex. The ligand as well as the Ga(III) complex were characterized by nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy, mass spectrometry and elemental analysis. 68Ga was obtained by a standard elution method from a 68Ge/68Ga generator. Experiments to evaluate the 68Ga-labeling efficiency of EOB-DTPA at pH 3.8&#8211;4.0 were performed. Established analysis techniques radio TLC (thin layer chromatography) and radio HPLC (high performance liquid chromatography) were used to determine the radiochemical purity of the tracer. As a first investigation of the 68Ga tracers&#39; lipophilicity the n-octanol/water distribution coefficient of 68Ga species present in a pH 7.4 solution was determined by an extraction method. In vitro stability measurements of the tracer in various media at physiological pH were performed, revealing different rates of decomposition.

Investigations on the GaIII Complex of EOB-DTPA and Its 68Ga Radiolabeled Analogue

A procedure for the isolation of EOB-DTPA and subsequent complexation with natural Ga(III) and 68Ga is presented herein, as well as a thorough analysis of all compounds and investigations on labeling efficiency, in vitro stability and the n-octanol/water distribution coefficient of the radiolabeled complex.

EOB-DTPA ve Ga (III) Complex Araştırmalar Onun<sup&gt; 68</sup&gt; Ga Radyoaktif Analog

We demonstrate a method for the isolation of EOB-DTPA (3,6,9-triaza-3,6,9-tris(carboxymethyl)-4-(ethoxybenzyl)-undecanedioic acid) from its Gd(III) ...

Preparation and Characterization of C60/Graphene Hybrid Nanostructures

Physical thermal deposition in a high vacuum environment is a clean and controllable method for fabricating novel molecular nanostructures on graphene. We present methods for depositing and passively manipulating C60 molecules on rippled graphene that advance the pursuit of realizing applications involving 1D C60/graphene hybrid structures. The techniques applied in this exposition are geared towards high vacuum systems with preparation areas capable of supporting molecular deposition as well as thermal annealing of the samples. We focus on C60 deposition at low pressure using a homemade Knudsen cell connected to a scanning tunneling microscopy (STM) system. The number of molecules deposited is regulated by controlling the temperature of the Knudsen cell and the deposition time. One-dimensional (1D) C60 chain structures with widths of two to three molecules can be prepared via tuning of the experimental conditions. The surface mobility of the C60 molecules increases with annealing temperature allowing them to move within the periodic potential of the rippled graphene. Using this mechanism, it is possible to control the transition of 1D C60 chain structures to a hexagonal close packed quasi-1D stripe structure.

Preparation and Characterization of C60/Graphene Hybrid Nanostructures

Here we present a protocol for the fabrication of C60/graphene hybrid nanostructures by physical thermal evaporation. Particularly, the proper manipulation of deposition and annealing conditions allow the control over the creation of 1D and quasi 1D C60 structures on rippled graphene.

C60/Graphene hibrid nanoyapıların malzemelerin hazırlık ve

Physical thermal deposition in a high vacuum environment is a clean and controllable method for fabricating novel molecular nanostructures on graphene. We ...

Bio-inspired Polydopamine Surface Modification of Nanodiamonds and Its Reduction of Silver Nanoparticles

Surface functionalization of nanodiamonds (NDs) is still challenging due to the diversity of functional groups on the ND surfaces. Here, we demonstrate a simple protocol for the multifunctional surface modification of NDs by using mussel-inspired polydopamine (PDA) coating. In addition, the functional layer of PDA on NDs could serve as a reducing agent to synthesize and stabilize metal nanoparticles. Dopamine (DA) can self-polymerize and spontaneously form PDA layers on ND surfaces if the NDs and dopamine are simply mixed together. The thickness of a PDA layer is controlled by varying the concentration of DA. A typical result shows that a thickness of ~5 to ~15 nm of the PDA layer can be reached by adding 50 to 100 &#181;g/mL of DA to 100 nm ND suspensions. Furthermore, the PDA-NDs are used as a substrate to reduce metal ions, such as Ag[(NH3)2]+, to silver nanoparticles (AgNPs). The sizes of the AgNPs rely on the initial concentrations of Ag[(NH3)2]+. Along with an increase in the concentration of Ag[(NH3)2]+, the number of NPs increases, as well as the diameters of the NPs. In summary, this study not only presents a facile method for modifying the surfaces of NDs with PDA, but also demonstrates the enhanced functionality of NDs by anchoring various species of interest (such as AgNPs) for advanced applications.

A facile protocol is presented to functionalize the surfaces of nanodiamonds with polydopamine.

Nanodiamonds ve gümüş nano tanecikleri onun azaltılması biyo-ilham Polydopamine yüzey modifikasyonu

Surface functionalization of nanodiamonds (NDs) is still challenging due to the diversity of functional groups on the ND surfaces. Here, we demonstrate a ...

Photogeneration of N-Heterocyclic Carbenes: Application in Photoinduced Ring-Opening Metathesis Polymerization

We report a method to generate the N-heterocyclic carbene (NHC) 1,3-dimesitylimidazol-2-ylidene (IMes) under UV-irradiation at 365 nm to characterize IMes and determine the corresponding photochemical mechanism. Then, we describe a protocol to perform ring-opening metathesis polymerization (ROMP) in solution and in miniemulsion using this NHC-photogenerating system. To photogenerate IMes, a system comprising 2-isopropylthioxanthone (ITX) as the sensitizer and 1,3-dimesitylimidazolium tetraphenylborate (IMesH+BPh4-) as the protected form of NHC is employed. IMesH+BPh4- can be obtained in a single step by anion exchange between 1,3-dimesitylimidazolium chloride and sodium tetraphenylborate. A real-time steady-state photolysis setup is described, which hints that the photochemical reaction proceeds in two consecutive steps: 1) ITX triplet is photo-reduced by the borate anion and 2) subsequent proton transfer takes place from the imidazolium cation to produce the expected NHC IMes. Two separate characterization protocols are implemented. Firstly, CS2 is added to the reaction media to evidence the photogeneration of NHC through formation of the IMes-CS2 adduct. Secondly, the amount of NHC released in situ is quantified using acid-base titration. The use of this NHC photo-generating system for the ROMP of norbornene is also discussed. In solution, a photopolymerization experiment is conducted by mixing ITX, IMesH+BPh4-, [RuCl2(p-cymene)]2 and norbornene in CH2Cl2, then irradiating the solution in a UV reactor. In a dispersed medium, a monomer miniemulsion is first formed then irradiated inside an annular reactor to produce a stable poly(norbornene) latex.

We describe a protocol to photogenerate N-heterocyclic carbenes (NHCs) by UV irradiation of a 2-isopropylthioxanthone/imidazolium tetraphenylborate salt system. Methods to characterize the photoreleased NHC and elucidate the photochemical mechanism are proposed. The protocols for ring-opening metathesis photopolymerization in solution and miniemulsion illustrate the potential of this 2-component NHC photogenerating system.

N oluşur Carbenes Photogeneration: Photoinduced yüzük-açılış sentezde polimerizasyon uygulamada

We report a method to generate the N-heterocyclic carbene (NHC) 1,3-dimesitylimidazol-2-ylidene (IMes) under UV-irradiation at 365 nm to characterize IMes ...

Preparation and Application of a New Bacterial Biosensor for the Presumptive Detection of Gunshot Residue

MicRoboCop is a biosensor that has been designed for a unique application in forensic chemistry. MicRoboCop is a system made up of three devices that, when used together, can indicate the presence of gunshot residue (GSR) by producing a fluorescence signal in the presence of three key analytes (antimony, lead, and organic components of GSR). The protocol describes the synthesis of the biosensors using Escherichia coli (E. coli), and the analytical chemistry methods used to evaluate the selectivity and sensitivity of the sensors. The functioning of the system is demonstrated by using GSR collected from the inside of a spent cartridge casing. Once prepared, the biosensors can be stored until needed and can be used as a test for these key analytes. A positive response from all three analytes provides a presumptive positive test for GSR, while each individual device has applications for detecting the analytes in other samples (e.g., a detector for lead contamination in drinking water). The main limitation of the system is the time required for a positive signal; future work may involve studying different organisms to optimize the response time.

A protocol is presented using synthetic biology techniques to synthesize a set of bacterial biosensors for the analysis of gunshot residue, and to test the functioning of the devices for their intended use using fluorescence spectroscopy.

Silah kalıntılarının varsayımsal tespiti için yeni bir bakteriyel biyosensörün hazırlanması ve uygulanması

MicRoboCop is a biosensor that has been designed for a unique application in forensic chemistry. MicRoboCop is a system made up of three devices that, ...

Preparation of Graphene-Supported Microwell Liquid Cells for In Situ Transmission Electron Microscopy

The fabrication and preparation of graphene-supported microwell liquid cells (GSMLCs) for in situ electron microscopy is presented in a stepwise protocol. The versatility of the GSMLCs is demonstrated in the context of a study about etching and growth dynamics of gold nanostructures from a HAuCl4 precursor solution. GSMLCs combine the advantages of conventional silicon- and graphene-based liquid cells by offering reproducible well depths together with facile cell manufacturing and handling of the specimen under investigation. The GSMLCs are fabricated on a single silicon substrate which drastically reduces the complexity of the manufacturing process compared to two-wafer-based liquid cell designs. Here, no bonding or alignment process steps are required. Furthermore, the enclosed liquid volume can be tailored to the respective experimental requirements by simply adjusting the thickness of a silicon nitride layer. This enables a significant reduction of window bulging in the electron microscope vacuum. Finally, a state-of-the-art quantitative evaluation of single particle tracking and dendrite formation in liquid cell experiments using only open source software is presented.

Preparation of Graphene-Supported Microwell Liquid Cells for In Situ Transmission Electron Microscopy

A protocol for preparation of graphene-supported microwell liquid cells for in situ electron microscopy of gold nanocrystals from HAuCl4 precursor solution is presented. Furthermore, an analysis routine is presented to quantify observed etching and growth dynamics.

Situ şanzıman elektron mikroskobu Için Graphene destekli Mikrowell sıvı hücrelerinin hazırlanması

The fabrication and preparation of graphene-supported microwell liquid cells (GSMLCs) for in situ electron microscopy is presented in a stepwise protocol. ...