Biz Linda Hildegard Bergersen ve Magnar Bjørås erişim için laboratuar ve donanımları, plazmid ve virüs üretim için Janelia moleküler biyoloji paylaşılan kaynak personel ve Koen Vervaeke lazer gücü ölçümleri hakkında yardım almak için hücre için teşekkür ederim. Bu eser Norveç sağlığı Derneği, Norveç Araştırma Konseyi tarafından finanse edildi ve mikroskopi ekipman Norbrain tarafından finanse edildi.

<ol>
	<li>Barry, C., Pearson, C., Barbarese, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+organization+of+oligodendrocyte+processes+during+development+in+culture+and+in+vivo.">Morphological organization of oligodendrocyte processes during development in culture and in vivo.</a> Dev. Neursosci. 18, 233-242 (1996).</li><li>Simpson, P. B., Mehotra, S., Lange, G. D., Russell, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+density+distribution+of+endoplasmic+reticulum+proteins+and+mitochondria+at+specialized+Ca2++release+sites+in+oligodendrocyte+processes.">High density distribution of endoplasmic reticulum proteins and mitochondria at specialized Ca2+ release sites in oligodendrocyte processes.</a> J. Biol. Chem. 272, 22654-22661 (1997).</li><li>Sterky, F. H., Lee, S., Wibom, R., Olson, L., Larsson, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+mitochondrial+transport+and+Parkin-independent+degeneration+of+respiratory+chain-deficient+dopamine+neurons+in+vivo.">Impaired mitochondrial transport and Parkin-independent degeneration of respiratory chain-deficient dopamine neurons in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1080, 12937-12942 (2011).</li><li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue.">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J. Neurosci. Methods. 37, 173-182 (1991).</li><li>De Simoni, A., Yu, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+organotypic+hippocampal+slice+cultures:+interface+method.">Preparation of organotypic hippocampal slice cultures: interface method.</a> Nat. Protoc. 1, 1439-1445 (2006).</li><li>Lim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+imaging+of+Schwann+cell+myelination+by+third+harmonic+generation+microscopy.">Label-free imaging of Schwann cell myelination by third harmonic generation microscopy.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 18025-18030 (2014).</li><li>Farrar, M. J., Wise, F. W., Fetcho, J. R., Schaffer, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+myelin+in+the+vertebrate+central+nervous+system+using+third+harmonic+generation+microscopy.">In vivo imaging of myelin in the vertebrate central nervous system using third harmonic generation microscopy.</a> Biophys. J. 100, 1362-1371 (2011).</li><li>Fu, Y., Wang, H., Huff, T. B., Shi, R., Cheng, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coherent+anti-Stokes+Raman+scattering+imaging+of+myelin+degradation+reveals+a+calcium-dependent+pathway+in+lyso-PtdCho-induced+demyelination.">Coherent anti-Stokes Raman scattering imaging of myelin degradation reveals a calcium-dependent pathway in lyso-PtdCho-induced demyelination.</a> J. Neurosci. Res. 85, 2870-2881 (2007).</li><li>Schain, A. J., Hill, R. A., Grutzendler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+in+vivo+imaging+of+myelinated+axons+in+health+and+disease+with+spectral+confocal+reflectance+microscopy.">Label-free in vivo imaging of myelinated axons in health and disease with spectral confocal reflectance microscopy.</a> Nat. Med. 20, 443-449 (2014).</li><li>Shin, J. H., Yue, Y., Duan, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+adeno-associated+viral+vector+production+and+purification.">Recombinant adeno-associated viral vector production and purification.</a> Methods Mol. Biol. 798, 267-284 (2012).</li><li>Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligonucleotide-directed+mutagenesis+without+phenotypic+selection.">Oligonucleotide-directed mutagenesis without phenotypic selection.</a> Curr. Prot. Neurosci. , 4.10.1-4.10.6 (2001).</li><li>Gow, A., Friedrich, V. L., Lazzarini, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+basic+protein+gene+contains+separate+enhancers+for+oligodendrocyte+and+Schwann+cell+expression.">Myelin basic protein gene contains separate enhancers for oligodendrocyte and Schwann cell expression.</a> J. Cell Biol. 119, 605-616 (1992).</li><li>Rinholm, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Movement+and+structure+of+mitochondria+in+oligodendrocytes+and+their+myelin+sheaths.">Movement and structure of mitochondria in oligodendrocytes and their myelin sheaths.</a> Glia. 64, 810-825 (2016).</li><li>Rintoul, G. L., Filiano, A. J., Brocard, J. B., Kress, G. J., Reynolds, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate+decreases+mitochondrial+size+and+movement+in+primary+forebrain+neurons.">Glutamate decreases mitochondrial size and movement in primary forebrain neurons.</a> J. Neurosci. 23, 7881-7888 (2003).</li><li>Jackson, J. G., O'Donnell, J. C., Takano, H., Coulter, D. A., Robinson, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+activity+and+glutamate+uptake+decrease+mitochondrial+mobility+in+astrocytes+and+position+mitochondria+near+glutamate+transporters.">Neuronal activity and glutamate uptake decrease mitochondrial mobility in astrocytes and position mitochondria near glutamate transporters.</a> J. Neurosci. 34, 1613-1624 (2014).</li><li>Macaskill, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Miro1+is+a+calcium+sensor+for+glutamate+receptor-dependent+localization+of+mitochondria+at+synapses.">Miro1 is a calcium sensor for glutamate receptor-dependent localization of mitochondria at synapses.</a> Neuron. 61, 541-555 (2009).</li><li>Karadottir, R., Attwell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+patch-clamping+of+cells+in+brain+slices+with+immunocytochemical+labeling+to+define+cell+type+and+developmental+stage.">Combining patch-clamping of cells in brain slices with immunocytochemical labeling to define cell type and developmental stage.</a> Nat. Protoc. 1, 1977-1986 (2006).</li><li>Rinholm, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+oligodendrocyte+development+and+myelination+by+glucose+and+lactate.">Regulation of oligodendrocyte development and myelination by glucose and lactate.</a> J. Neurosci. 31, 538-548 (2011).</li><li>Davison, A. N., Dobbing, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelination+as+a+vulnerable+period+in+brain+development.">Myelination as a vulnerable period in brain development.</a> Br. Med. Bull. 22, 40-44 (1966).</li><li>Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organotypic+brain+slice+cultures:+A+review.">Organotypic brain slice cultures: A review.</a> Neuroscience. 305, 86-98 (2015).</li><li>Noraberg, J., Kristensen, B. W., Zimmer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Markers+for+neuronal+degeneration+in+organotypic+slice+cultures.">Markers for neuronal degeneration in organotypic slice cultures.</a> Brain Res. Protoc. 3, 278-290 (1999).</li><li>Karra, D., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfection+techniques+for+neuronal+cells.">Transfection techniques for neuronal cells.</a> J. Neurosci. 30, 6171-6177 (2010).</li><li>Pignataro, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-Associated+Viral+Vectors+Serotype+8+for+Cell-Specific+Delivery+of+Therapeutic+Genes+in+the+Central+Nervous+System.">Adeno-Associated Viral Vectors Serotype 8 for Cell-Specific Delivery of Therapeutic Genes in the Central Nervous System.</a> Front. Neuroanat. 11 (2), (2017).</li><li>Hutson, T. H., Verhaagen, J., Yanez-Munoz, R. J., Moon, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corticospinal+tract+transduction:+a+comparison+of+seven+adeno-associated+viral+vector+serotypes+and+a+non-integrating+lentiviral+vector.">Corticospinal tract transduction: a comparison of seven adeno-associated viral vector serotypes and a non-integrating lentiviral vector.</a> Gene Ther. 19, 49-60 (2012).</li><li>Neumann, S., Campbell, G. E., Szpankowski, L., Goldstein, L. S. B., Encalada, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+composition+of+molecular+motors+on+moving+axonal+cargo+using+cargo+mapping+analysis.">Characterizing the composition of molecular motors on moving axonal cargo using cargo mapping analysis.</a> J. Vis. Exp. (92), e52029 (2014).</li></ol>

Yazarlar hiçbir çıkar çatışmaları bildirin.

Burada açıklanan organotypic kültürler yapmak için De Simoni ve Yu (2006)5tarafından açıklanan Protokolü'nün bir anlam değiştirici yorum18 iletişim kuralıdır. En önemli değişiklikler aşağıda açıklanan olmuştur. Tris arabellek dilimleri dışında da kuluçka viral iletim sırasında yaşama ve hücre orta değiştirerek geliştirir kültür ortamına eklenir. Sterilizasyon yordam konfeti için de değiştirilir. Diğer protokoller konfeti tarafından ısıyla sterilize iken, konfeti kıvırmak için birkaç neden olur çünkü biz bu tavsiye etmiyoruz. Bunlar üzerinde yetiştirilen dilimleri daha az sağlıklı olma eğilimi gibi kıvrılmış konfeti kullanmaktan kaçının. Bizim protokol fareler kullanır, değil fareler ve korteks hipokampüs, yerine kültür için modifiye biz bulmak de ince dilimleri (230 µm vs 300 µm) ile çalışır. Doğum sonrası gün yaklaşık 10-20 fareler ve sıçanlar19, kültürler içinde yapılmış myelination doruklarına gibi fareler p7-9 (ve ardından kültürlü 11-14 gün) myelinating oligodendrocytes çalışmak için en uygun değildir. 11-14 gün tüp bebek, kültürler kompakt miyelin kılıf13ile birkaç olgun oligodendrocytes içerir. Genç farelerde yapılan kültürler daha az olgun oligodendrocytes kültür dönemin sonunda içerir, kültürler büyük fareler yapılmış ise sağlıklı20tutmak için daha zorlu göstermiştir.
Organotypic dilim yapmak için yordamı birkaç kritik adımları içerir. Diseksiyon ve beyinlerinin montaj yanı sıra dilimleri konfeti, üzerine yerleştirerek yapılması gereken hızlı ve biraz beceri gerektirir. Genelde organotypic dilim kültürler yaparak ilk deneme daha az başarılı, ancak 2-3 mermi pratik sağlıklı kültürler kurmak için gerekli beceriler elde etmek için yeterli olacaktır. Steril bir ortam kültürlerin kirlenmesini önlemek için yordam boyunca tutmak önemlidir. Ayrıca, canlı hücreler ile çalışırken, bu her zaman doğru pH ve osmolalite hücre sağlığını korumak için çözümler sağlamak için zorunludur. Olduğunu, bu nedenle, osmolalite (270-310 mOsm/kg olmalıdır) ve özellikle ilk kez deneme yaparken dilimleri üzerinde kullanılan tüm çözümler pH kontrol etmek için iyi bir tavsiye. Organotypic kültürler için kültür ve diseksiyon çözümler pH göstergesi (fenol red) içerir, ama kültür orta sarı serum daha düşük bir izlenimi verebilir daha gerçek pH. Kültür orta penisilin, streptomisin ve nistatin enfeksiyon olasılığını en aza indirmek için içerir. Bu nedenle bu antibiyotikler ve antimycotics organotypic dilim kültür Teknik laboratuarda ayarlarken kullanmak için tavsiye edilir, ama uzman aseptik teknik uygulandığında daha sonra önlenebilir. Hücre canlılığı değerlendirmek için hücre morfolojisi geçerli protokolünü kullanır. Daha nicel bir muayene için dilimleri propidium iyodür veya açıklandığı gibi benzer Boyar maddeler ile başka bir yerde21yüklenebilir. Ancak, propidium iyodür emisyon spektrumu dsred, tdtomato ve diğer kırmızı göstergeleri ile çakışıyor farkında olmak önemlidir. Başka bir propidium iyodür ve benzer Kimyasalları onlar kolayca böylece hücre canlılığı hücreleri5üst tabakası için değerlendirilmesi sınırlayıcı dilim, derin katmanları girmeyin kısıtlamasıdır.
Gen teslim edilmek üzere çeşitli yöntemler bulunmaktadır. AAV iletim organotypic dilim kültürlerin organelleri görselleştirmek için kullanmanın ana avantajları aşağıdaki gibidir: AAV iletim için postmitotic oligodendrocytes non-viral transfection yöntemleri22ile karşılaştırıldığında daha iyi başarı oranına sahiptir. Ayrıca, organotypic kültürlerde tüm beyin hücre türlerinin bulunduğunu ve kompakt miyelin13de dahil olmak üzere bu görülen vivo içindeiçin benzer bir Morfoloji oligodendrocytes var. Bu hangi aksonlar ile iletişim eksikliği ve böylece kompakt miyelin yapmazlar Monokültür içinde oligodendrocytes farklıdır. Vitro Imaging vivo içinde ile daha kolay karşılaştırılır ve mitokondri gibi küçük organelleri Imaging zaman özel ilgi olan bir daha iyi Uzaysal çözünürlük, sunmaktadır. Gelecekteki araştırma görüntü vivo içindeama lipid zengini miyelin kılıf tarafından neden olduğu optik anomalileri ile büyük bir meydan yüzler amacı olacak. Ayrıca, AAV serotip tropism ve organizatörü özgüllük arasında in vivo ve in vitro koşulları13,23farklı olabilir. Burada sunulan iletişim kuralında, AAV2/8 MBP_mito_dsred ve AAV2/8 MBP_mito_GFP oligodendrocyte mitokondri görselleştirmek için kullanılır. AAV serotip 2/1 de MBP_mito_dsred ile test edildi ama oligodendrocytes (gösterilmez) organotypic dilimleri içinde daha düşük bir sayı bulaşmış. AAV2/8 CAG_GFP ve AAV2/8 CAG_tdtomato oligodendrocyte sitoplazma görselleştirmek için kullanıldı. Genel CAG organizatörü istimal bu için rağmen AAV 2/8 CAG_GFP ve CAG_tdtomato seçmeli olarak enfekte oligodendrocytes, yalnızca az sayıda astrocytes ve varlık bulaştırmak nöronlar ile (bunlar kolayca onların karakteristik Morfoloji tarafından belirlenmiştir). Bu seçicilik oligodendrocytes için muhtemelen AAV 2/8 serotip24tropism nedeniyle var. Ancak, ifade, organel hedefli için daha yüksek hücre özgüllüğü MBP - elde veya diğer oligodendrocyte özgü rehberleri tavsiye edilir. CAG_GFP ile tarafımızca test diğer serotipleri AAV 2/1, 2/2, 2/5, 2/7, 2/9, en hangi esas olarak sinir hücreleri ve astrocytes (gösterilmez) enfekte edildi.
Yapý ve deneysel koşullar bağlı olarak, hücre iletim değişiklik gerekli olacaktır. Transduced hücreler çok karanlık görünür, daha uzun bir zaman vitro hedefidirler sonra ifadeyi artırmak için deneyin. Hücreleri parlak ama sağlıksız görünüyorsa azaltmak belgili tanımlık zaman iletim sonra. Çok az sayıda hücre transduced AAV konsantrasyonu artırılabilir. Ancak, iletim sonra tüp bebek zaman çok uzun ve transduced hücreleri öldüğünü mümkündür. Burada kullanılan yapıları için ifade düzeyleri en iyi 4-6 gün sonra iletim olduğunu. 7-8 gün sonra iletim, hücreler daha az sağlıklı, boğum oluşum ile ortaya çıktı ve 10 gün sonra iletim, yalnızca bir kaç transduced hücreleri (gösterilmez) görünür.
Bu iletişim kuralı bir dik mikroskop organotypic dilimleri canlı görüntüleme için kullanır. Bu en düşük mono farklıdır- ve genellikle ters bir mikroskop kullanır ortak kültürler. Dilimleri sonra muhtemelen daha az sağlıklı olmak dilimleri neden yukarı, bakacak konfeti ile açık olması gerekir çünkü bir ters mikroskobu burada kullanmak için suboptimal. Bir dik mikroskop avantajı Elektrofizyoloji eklemeye imkanı vardır. Ayrıca, orta değiştirmek için bir pompa kullanımı uyuşturucu çözümleri kolayca eklenebilir ve hızlandırılmış görüntüleme sırasında kaldırılmış olduğunu anlamına gelir. Titreşim ve banyoda akımları nedeniyle odak bakımını yapma sorunları pompa ile bir dezavantajdır. Mikroskop altında hücrelerin yavaş yavaş olacak daha azsağlıklı. Bu nedenle dilimleri en fazla 1 saat için mikroskop altında tutuyoruz. Görüntülü dilimleri (özel atık) atılır. Görüntüleme koşulları en iyi durumda emin olmak için kontrol hücreleri, hangi zaten iyi mitokondrial hareketi karakterizedir, görüntüleme paralel olarak çalıştırılması gerekir. Transducing 2/1 Syn_mito_dsred (hangi dsred nöron özel synapsin düzenleyici tarafından ifade sürülür) veya AAV AAV ile örneğin, akson veya dendrites mitokondrial hareketi tarafından yansıması için 2/1 CAG_mito_dsred (immunostaining için ve ardından dilim hücre kimliğini onaylamak). Mitokondrial hareket analizi-ebilmek kılınmak içinde başka bir yerde25açıklandığı gibi ImageJ birden fazla kymograph aracını kullanarak.
Burada günahı miyelin görüntüleme sırasında canlı görüntüleme için çekirdek açıklayın. Üç uyarma dalga boylarında kullanan, skor9' la karşılaştırıldığında çekirdek sadece bir kullanır (488 nm) ve böylece uygulamak kolaydır. Puanı, her üç boyları farklı "parçalar" miyelin kılıf ve birlikte kılıf tam bir görüntü vermek ortaya koyuyor. Ayrıca, Puan miyelin kılıf yapıları sitoplazmik cepler gibi algılamak için kullanılabilir. Çekirdek içinde kullanılan tek dalga boyu ile daha az ayrıntılı bir görüş verilir ve kaplamalar toz veya kesintili görünebilir (Res. 3). Bununla birlikte, çekirdek için görüş alan yatay miyelin kılıfı % 100'ünü yakınındaki görüntüler. Bu nedenle, çekirdek miyelin kılıf tespiti için ancak miyelin yapıları ve bütünlük analizi için yararlıdır.

Beynin beyaz madde sinir hücresi aksonlar miyelin, oligodendrocytes tarafından kurulan özel bir genişletilmiş plazma zarı sarılı oluşur. Miyelin hızlı ve güvenilir aksiyon potansiyeli yayılması ve myelinated akson uzun vadeli yaşam için gereklidir ve nörolojik disfonksiyon miyelin kaybına neden olabilir. Önemine rağmen oligodendrocytes özelliklerini daha az bilinen neurons ve astrocytes ile karşılaştırılır. Sonuç olarak, daha az araçları oligodendrocytes eğitimi için geliştirilmiştir.
Mitokondri, endoplasmatic retikulum (ER) veya farklı veziküler yapıları organelleri dinamik değişiklikleri zaman içinde eğitim yararlı olabilir gibi hücre organelleri görüntüleme yaşıyor. Geleneksel olarak, oturma oligodendrocytes görüntüleme monocultures1,2' gerçekleştirdi. Ancak, Monokültür oligodendrocytes kompakt miyelin görüntülenmez ve organotypic veya akut beyin dilimleri bu nedenle, daha iyi bir seçenek Yerelleştirme ve organelleri hareketin okurken olabilir. Yerelleştirme küçük organelleri ve miyelin kılıf protein myelinated akson ve çevresindeki miyelin kılıf arasında kısa bir mesafe nedeniyle zor olabilir. Böylece, ışık mikroskopik immunostaining yordamlar yalnız organelleri miyelin kılıf içinde ve bu myelinated akson arasında ayırımcılık Uzaysal çözünürlük var mı. Bu viral iletim flüoresan proteinler organel hedef hücre türüne özgü rehberleri tarafından tahrik için genleri olan tarafından çözülebilir. Avantajları dinamiği ve organel yerelleştirme doğru değerlendirme sağlar bir hücre özgü ve seyrek ifade vardır. Transjenik hayvanlar böyle bir hücre özgü ifade organel hedefli3elde etmek için de kullanılabilir. Ancak, üretim ve bakım Transjenik hayvanlar, pahalı ve genellikle viral yöntemlerle elde edilebilir seyrek ifade sunmuyor.
Yöntem tanımlamak burada miyelin temel protein düzenleyici tarafından (MBP-mito-dsred veya MBP-mito-GFP) görselleştirmek için tahrik oligodendrocytes floresan proteinler (dsred veya yeşil flüoresan protein, GFP) mitokondriyal hedefli ile viral iletim kullanır organotypic beyin dilimleri içinde oligodendrocyte mitokondri. Buna ek olarak, ifade (mito-dsred ile birlikte kullanılan GFP veya mito-GFP ile kullanılan tdtomato) sitoplazmada başka bir floresan proteinin hücre morfolojisi, miyelin kılıf sitoplazmik bölümler de dahil olmak üzere görselleştirme etkinleştirmek için kullanılır. Protokol organotypic beyin dilimleri (De Simoni ve Yu, 20064,5tarafından açıklanan protokol değiştirilmiş bir sürümü) yapmak için yordam içerir. Biz o zaman mitokondrial hareketi eğitim için hızlandırılmış görüntüleme açıklayınız. Bu yordam, sürekli bir değişim görüntüleme orta, uyuşturucu veya diğer Orta değişiklikleri görüntüleme sırasında uygulama kolaylığı sağlar bir kurulum ile dik bir confocal mikroskop kullanır. Hızlandırılmış görüntüleme yordam confocal herhangi bir mikroskopla aşağıda açıklandığı gibi yaşam dilimleri korumak için bazı ekstra ekipman üzerinde gerçekleştirilebilir. Protokol Ayrıca görüntüleme optimize etmek ve fototoksisite azaltmak için birkaç ipucu içerir.
Son olarak, günahı miyelin Confocal yansıma mikroskobu (çekirdek) tarafından görselleştirmek için hızlı ve basit bir şekilde açıklanmıştır. Bu miyelin kılıf canlı görüntüleme sırasında tanımlamak yararlı olabilir. Son yıllarda, gerekli herhangi bir boyama olmadan görüntü miyelin için çeşitli teknikler geliştirilmiştir, ancak bunların çoğu özel ekipman ve uzmanlık6,7,8gerektirir. Burada açıklanan yordamı kullanır miyelin kılıf yansıtıcı özellikleri ve spektral Confocal yansıma mikroskobu Basitleştirilmiş tek-uyarma dalga boyu sürümüdür (skor, içinde birkaç lazer dalga boyu miyelin görselleştirmek için birleştirilir) 9. çekirdek 488 nm lazer ve 470-500 nm bant emisyon filtre veya bir akort emisyon filtre vardır herhangi bir confocal mikroskobunun yapılabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="600">
	<tbody>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:167px;">Agarose&#160;</td>
			<td style="width:139px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:125px;">A9539</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="54">
			<td height="54" style="height:54px;width:167px;">BD Microlance 19G</td>
			<td style="width:139px;">BD</td>
			<td style="width:125px;">301500</td>
			<td style="width:171px;">Needles used for in- and outlet of bath</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:167px;">Bioxide gas</td>
			<td style="width:139px;">AGA</td>
			<td style="width:125px;">105701</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:167px;">Brand pipette bulbs</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:125px;">Z615927</td>
			<td style="width:171px;">Pipette bulbs</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;width:167px;">Bunsen burner (Liquid propane burner)</td>
			<td style="width:139px;">VWR</td>
			<td style="width:125px;">89038-530</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="56">
			<td height="56" style="height:56px;width:167px;">Cable assembly for heater controllers</td>
			<td style="width:139px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:125px;">64-0106&#160;</td>
			<td style="width:171px;">Temperature controller - thermometer part</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:167px;">CaCl2</td>
			<td style="width:139px;">Fluka</td>
			<td style="width:125px;">21100</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:167px;">CO2&#160;</td>
			<td style="width:139px;">AGA</td>
			<td style="width:125px;">100309</td>
			<td style="width:171px;">CO2 for incubator</td>
		</tr>
		<tr height="89">
			<td height="89" style="height:89px;width:167px;">Cover glass, square Corning</td>
			<td style="width:139px;">Thermo&#160; Fischer Scientific</td>
			<td style="width:125px;">13206778</td>
			<td style="width:171px;">To attach under bath for live imaging. Seal with glue or petrolium jelly.</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:167px;">D-(+)-Glucose</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:125px;">G7021</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:167px;">Delicate forceps</td>
			<td style="width:139px;">Finescience</td>
			<td style="width:125px;">11063-07</td>
			<td style="width:171px;">For dissection</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:167px;">Diamond scriber pen</td>
			<td style="width:139px;">Ted Pella Inc.</td>
			<td style="width:125px;">54463</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="73">
			<td height="73" style="height:73px;width:167px;">Disposable Glass Pasteur Pipettes 230 mm</td>
			<td style="width:139px;">VWR</td>
			<td style="width:125px;">612-1702</td>
			<td style="width:171px;">Glass pipettes</td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:167px;">Double edge stainless steel razor blade</td>
			<td style="width:139px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:125px;">#7200</td>
			<td style="width:171px;">Razor blade for vibratome</td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:167px;">Earle&#39;s Balanced Salt Solution (EBSS)</td>
			<td style="width:139px;">Gibco-Invitrogen</td>
			<td style="width:125px;">24010-043</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:167px;">Filter paper circles</td>
			<td style="width:139px;">Schleicher &#38; Schuell</td>
			<td style="width:125px;">300,220</td>
			<td style="width:171px;">Filter paper used for filtration of PFA</td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:167px;">Fun tack</td>
			<td style="width:139px;">Loctite</td>
			<td style="width:125px;">1270884</td>
			<td style="width:171px;">Use to connect/adjust position of in- and outlets in bath</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:167px;">Hand towel C-Fold 2</td>
			<td style="width:139px;">Katrin</td>
			<td style="width:125px;">344388</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="121">
			<td height="121" style="height:121px;width:167px;">Harp, Flat for RC-41 Chamber,</td>
			<td style="width:139px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:125px;">&#160;64-1418</td>
			<td style="width:171px;">Harp to hold down confetti in bath. Cut off strings before use with organotypic slices. 1.5 mm, 13mm, SHD-41/15</td>
		</tr>
		<tr height="30">
			<td height="30" style="height:30px;width:167px;">HEPES, FW: 260.3</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:125px;">H-7006</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="55">
			<td height="55" style="height:55px;width:167px;">Holten LaminAir, Model 1.2</td>
			<td style="width:139px;">Heto-Holten</td>
			<td style="width:125px;">96004000M</td>
			<td style="width:171px;">Laminar flow hood</td>
		</tr>
		<tr height="56">
			<td height="56" style="height:56px;width:167px;">Horse serum, heat inactivated</td>
			<td style="width:139px;">Gibco-Invitrogen</td>
			<td style="width:125px;">26050-088</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:167px;">KCl</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:125px;">P9541</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:167px;">LCR Membrane, PTFE,&#160;</td>
			<td style="width:139px;">Millipore</td>
			<td style="width:125px;">FHLC0130</td>
			<td style="width:171px;">Confetti&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:167px;">Leica VT1200</td>
			<td style="width:139px;">Leica</td>
			<td style="width:125px;">14048142065</td>
			<td style="width:171px;">Vibratome</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:167px;">MEM-Glutamax with HEPES</td>
			<td style="width:139px;">Thermo&#160; Fischer Scientific</td>
			<td style="width:125px;">42360024</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:167px;">MgCl2</td>
			<td style="width:139px;">R.P. Normapur</td>
			<td style="width:125px;">25 108.295</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:167px;">Micro Spoon Heyman Type B</td>
			<td style="width:139px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:125px;">62411-B</td>
			<td style="width:171px;">Small, rounded spatula with sharpened end for dissection</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Millex-GP filter unit</td>
			<td style="width:139px;">Millipore</td>
			<td style="width:125px;">SLGPM33RA</td>
			<td style="width:171px;">Syringe filter unit</td>
		</tr>
		<tr height="59">
			<td height="59" style="height:59px;width:167px;">Millicell cell culture insert, 30 mm</td>
			<td style="width:139px;">Millipore</td>
			<td style="width:125px;">PICM03050</td>
			<td style="width:171px;">Cell culture inserts</td>
		</tr>
		<tr height="90">
			<td height="90" style="height:90px;width:167px;">Minipuls 3 Speed Control Module</td>
			<td style="width:139px;">GILSON</td>
			<td style="width:125px;">F155001</td>
			<td style="width:171px;">Peristaltic pump for live imaging - Control module part (connect to two-cannel head)</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:167px;">Na2HPO4</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:125px;">S7907</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="31">
			<td height="31" style="height:31px;width:167px;">NaCl</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:125px;">S9888</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:167px;">NaH2PO4</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:125px;">S8282</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:167px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:139px;">Fluka</td>
			<td style="width:125px;">71628</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="52">
			<td height="52" style="height:52px;width:167px;">Nunclon Delta Surface</td>
			<td style="width:139px;">Thermo&#160; Fischer Scientific</td>
			<td style="width:125px;">140675</td>
			<td style="width:171px;">Culture plate</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:167px;">Nystatin Suspension</td>
			<td style="width:139px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:125px;">N1638</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="93">
			<td height="93" style="height:93px;width:167px;">Objective W &#34;Plan-Apochromat&#34; 40x/1.0 DIC&#160;</td>
			<td style="width:139px;">Zeiss</td>
			<td style="width:125px;">441452-9900-000&#160;</td>
			<td style="width:171px;">Water immersion objective used for live imaging. (WD=2.5mm), VIS-IR</td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:167px;">Parafilm</td>
			<td style="width:139px;">VWR</td>
			<td style="width:125px;">291-1211</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:167px;">Paraformaldehyde, granular</td>
			<td style="width:139px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:125px;">#19208</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="49">
			<td height="49" style="height:49px;width:167px;">PC-R perfusion chamber</td>
			<td style="width:139px;">SiSkiYou</td>
			<td style="width:125px;">&#160;15280000E</td>
			<td style="width:171px;">Bath for live imaging</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:167px;">Penicillin-Streptomycin, liquid</td>
			<td style="width:139px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:125px;">15070-063</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td height="34" style="height:34px;width:167px;">Petri dish 140 mm&#160;</td>
			<td style="width:139px;">Heger</td>
			<td style="width:125px;">1075</td>
			<td style="width:171px;">Large Petri dish&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:167px;">Petri dish 92x16 mm&#160;</td>
			<td style="width:139px;">Sarstedt&#160;</td>
			<td style="width:125px;">82.1473</td>
			<td style="width:171px;">Medium Petri dish&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:167px;">Petridish 55x14,2 mm</td>
			<td style="width:139px;">VWR</td>
			<td style="width:125px;">391-0868</td>
			<td style="width:171px;">Small Petri dish</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:167px;">Phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:125px;">P4417</td>
			<td style="width:171px;">PBS tablets</td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:167px;">R2 Two Channel Head&#160;</td>
			<td style="width:139px;">GILSON</td>
			<td style="width:125px;">F117800</td>
			<td style="width:171px;">Peristaltic pump for live imaging - Two channel head part (requires control module)</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:167px;">Round/Flat Spatulas, Stainless Steel</td>
			<td style="width:139px;">VWR</td>
			<td style="width:125px;">82027-528</td>
			<td style="width:171px;">Large spatula for dissection</td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:167px;">Sand paper</td>
			<td style="width:139px;">VWR</td>
			<td style="width:125px;">MMMA63119</td>
			<td style="width:171px;">Optional, for smoothing broken glass pipettes</td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:167px;">Scissors,&#160; 17,5 cm</td>
			<td style="width:139px;">Finescience</td>
			<td style="width:125px;">14130-17</td>
			<td style="width:171px;">Large scissors for dissection</td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:167px;">Scissors, 8,5&#160;</td>
			<td style="width:139px;">Finescience</td>
			<td style="width:125px;">14084-08</td>
			<td style="width:171px;">Small, sharp scissors for&#160; dissection</td>
		</tr>
		<tr height="70">
			<td height="70" style="height:70px;width:167px;">Single edge, gem blade</td>
			<td style="width:139px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:125px;">#71972</td>
			<td style="width:171px;">Single edge razor blade</td>
		</tr>
		<tr height="59">
			<td height="59" style="height:59px;width:167px;">Single inline solution heater SH-27B</td>
			<td style="width:139px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:125px;">64-0102</td>
			<td style="width:171px;">Temperature controller - heater part</td>
		</tr>
		<tr height="57">
			<td height="57" style="height:57px;width:167px;">Steritop-GP Filter unit, 500 ml , 45mm</td>
			<td style="width:139px;">Millipore</td>
			<td style="width:125px;">SCGPT05RE</td>
			<td style="width:171px;">Filter to sterilize solutions</td>
		</tr>
		<tr height="37">
			<td height="37" style="height:37px;width:167px;">Super glue precision</td>
			<td style="width:139px;">Loctite</td>
			<td style="width:125px;">1577386</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="56">
			<td height="56" style="height:56px;width:167px;">Surgical scalpel blade no. 22</td>
			<td style="width:139px;">Swann Morton Ltd.</td>
			<td style="width:125px;">209</td>
			<td style="width:171px;">Rounded scalpel blade</td>
		</tr>
		<tr height="113">
			<td height="113" style="height:113px;width:167px;">Temperature controller TC324B</td>
			<td style="width:139px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:125px;">64-0100</td>
			<td style="width:171px;">Temperature controller for live imaging (requires solution heater and cable assembly)</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:167px;">Trizma base</td>
			<td style="width:139px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:125px;">T1503</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:167px;">Trizma HCl</td>
			<td style="width:139px;">Sigma</td>
			<td style="width:125px;">T3253</td>
			<td style="width:171px;"></td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:167px;">Water jacketed incubator series II</td>
			<td style="width:139px;">Forma Scientific</td>
			<td style="width:125px;">78653-2882</td>
			<td style="width:171px;">Incubator</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization and live imaging of oligodendrocyte organelles in organotypic brain slices using adeno-associated virus and confocal microscopy

Nöronlar elektrik izolasyon ve myelinating oligodendrocytes trofik desteğiyle güveniyor. Önemini oligodendrocytes rağmen şu anda nöronlar, eğitim için kullanılan gelişmiş araçlar yalnızca kısmen atılmıştır oligodendrocyte araştırmacılar tarafından. Hücre türüne özgü tarafından viral iletim boyama canlı organel dynamics eğitim için yararlı bir yaklaşımdır. Bu kağıt ile adeno ilişkili virüs (AAV) transkripsiyon kontrolü altında mitokondrial hedeflenen floresan proteinler için gen taşıyan iletim tarafından oligodendrocyte mitokondri organotypic beyin dilimleri içinde görüntülenmesi için bir iletişim kuralı açıklar miyelin temel protein organizatörü. Koronal fare beyin dilimler organotypic yapmak için iletişim kuralı içerir. Bir yordam için hızlandırılmış düşsel mitokondri, sonra arkasından gelir. Bu yöntem diğer organelleri için transfer edilebilir ve organelleri miyelin kılıf içinde çalışmak için özellikle yararlı olabilir. Son olarak, Confocal yansıma mikroskobu (çekirdek) tarafından yaşam dilimleri içinde günahı miyelin görselleştirme için hazır bir tekniği tarif. Çekirdek hiçbir ekstra ekipman gerektirir ve canlı görüntüleme sırasında miyelin kılıf tanımlamak yararlı olabilir.

Kültürlü ve yukarıda açıklandığı gibi transduced Organotypic beyin dilimleri kortikal oligodendrocytes mito_dsred ve GFP ifade seyrek bir dağılım gösterdi. Immunostaining Olig2 ve MBP karşı antikorlar ile ifade oligodendrocytes (şekil 1) belirli olduğunu doğruladı.
Canlı görüntüleme için transduced oligodendrocytes (şekil 1 ve şekil 2A) paralel olarak çalışan birkaç miyelin kılıf karakteristik onların morfolojisi tarafından kabul. Transduced oligodendrocytes zaman hata görüntüleme gerçekleştirerek, mitokondri birincil süreçleri ve miyelin kılıfı (şekil 2B-D) hareketi izlemek mümkündür.
Düşük GFP ifade ile hücrelerde, miyelin kılıf canlı görüntüleme sırasında örneği 488'aydınlatıcı tarafından teşhis edilebileceğini nm ve yayılan yakalayan ışık 470-500 nm (şekil 3A). Bu Confocal yansıma mikroskobu (çekirdek) tekniği de çalıştı PFA sabit ve immunostained doku, miyelin çıktı dimmer (şekil 3B-C) kaplamalar olmasına rağmen. Miyelin temel protein (MBP) karşı antikor ile immunostaining tarafından miyelin kılıf döşeme % 100 yakın yatay (tarafından ok uçları, şekil 3B-Cbelirtilir) görüntüleme uçağa bulduk miyelin kaplamalar ise çekirdek ile görülebilir o yatıyordu dikey (tarafından yıldız, şekil 3B-Cbelirtilir) görüş alanı olarak daha az veya hiç de görünür vardır. Neredeyse tüm internodes görselleştirildiği rağmen birçok internodes görünür değil varlık kılıf (3A şekil Ekle) küçük bir kısmı ile kesintili, görüntülenir. Bu küçük "boşluklar" miyelin yanında düşsel üç tamamlayıcı dalga boylarında, sözde Puan9ile doldurulabilir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56237/56237fig1.jpg"> 
Resim 1 : İmmünhistokimya MBP-mito-dsred seçmeli olarak Olig2 ve MBP için bağışıklık olumlu olan oligodendrocytes, ifade onaylar.  Transduced (AAV2/8) ile MBP-mito-dsred (kırmızı, mitokondrial marker) ve CAG-GFP (yeşil, sitozol) kültürlü fare beyin dilimleri yeni korteksimiz görüntülerdir. Dilimleri miyelin marker miyelin temel Protein (MBP, mavi) ve Olig2 için immunolabeled idi (oligodendrocyte silsilesi hücre nükleer marker, macenta). (Şekil başvuru13güncelleme) <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56237/56237fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56237/56237fig2.jpg"> 
Resim 2 : Oligodendrocytes mitokondrial hareketi izlemek için hızlandırılmış Imaging. Z-yığın (optik Bölüm 10,35 µm) oligodendrocyte MBP_mito_dsred (kırmızı mitokondri) ve CAG_GFP (yeşil floresan) ile transduced(a)projeksiyon. (B) tek confocal görüntüsü (optik Bölüm 1.04 µm) aynı hücreyi. Kare zaman hata görüntüleme (C) için seçilen bölge gösterir ve kymographs (kym) yapmak için (D) çizilmiş satırları gösterilir. (C) imge--dan a hücrenin hızlandırılmış kayıt ve farklı zaman zamanlarda alınan B. Hareketli mitokondri belirtilen (Kırmızı oklar) vardır. Yörüngeler dan (D) Kymographs (B) gösterilir. Sabit mitokondri düz dikey çizgiler olarak görülür ve hareketli mitokondri çapraz çizgiler görülmektedir. Kymographs ve (C) zaman ders Albümdeki görüldüğü gibi yalnızca mitokondri Kymograph 1 (Kym 1) işaretli birincil süreç içinde hareket ediyor. Mitokondri içinde diğer üç kymographs hızlandırılmış kayıt sırasında sabit vardır. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56237/56237fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56237/56237fig3.jpg"> 
Şekil 3 : Confocal yansıma mikroskobu (çekirdek) tarafından günahı miyelin görselleştirme. Z-yığından (optik Bölüm 10,35 µm) yeni korteksimiz bir canlı organotypic beyin dilim(a)projeksiyon. Burada gösterilen (yeşil hücre vücut) oligodendrocyte GFP ifadede çok için birincil süreç ve miyelin kılıf tanımlama karanlık. Bunun yerine, miyelin kılıf 488 nm, uyarma ve 470-500 nm (magenta içinde gösterilmiştir) yakalama verilmiş ışık tarafından görüntülenmiştir. GFP + oligodendrocyte sitoplazma zengini paranodes bazıları miyelin internodes (oklar) ipuçları görülebilir. Ekle: Büyütülmüş kısmını miyelin kılıf çekirdek ile görüntülenmiştir miyelin görünür "düzensiz" veya kesintili gösterir (bkz: ayrıntılı bilgi için ana metin). (B-C) Confocal görüntülerini striatum (B) ve stratum radiatum Hipokampus CA1, (C) Akut fare beyin dilimlerden %4 PFA ve immunostained miyelin temel protein (MBP) için sabit olmuştur. Görüş alanı için (yıldızlar) dik kaplamalar genellikle görünür değildir, ancak yatay miyelin kılıfı (ok uçları) çekirdek ile görülebilir. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56237/56237fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
Reaktifler tablo: <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56237/REAGENTS_table_Kennedy_and_Rinholm_april.xlsx" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy at JoVE.com

Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy

Myelinating oligodendrocytes hızlı aksiyon potansiyeli yayılması ve nöronal hayatta kalma teşvik. Burada açıklanan bir oligodendrocyte özel mesaj organotypic floresan proteinlerin beyin dilimleri ile sonraki zaman hata görüntüleme iletişim kuralıdır. Ayrıca, günahı miyelin görüntülenmesi için basit bir prosedür sunulur.

Görselleştirme ve Oligodendrocyte organelleri Adeno ilişkili virüs ve Confocal mikroskobu kullanılarak Organotypic beyin dilimleri içinde canlı görüntüleme

Neurons rely on the electric insulation and trophic support of myelinating oligodendrocytes. Despite the importance of oligodendrocytes, the advanced ...

visualization-live-imaging-oligodendrocyte-organelles-organotypic

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.7K Görüntüleme.  University of Oslo. Myelinating oligodendrocytes hızlı aksiyon potansiyeli yayılması ve nöronal hayatta kalma teşvik. Burada açıklanan bir oligodendrocyte özel mesaj organotypic floresan proteinlerin beyin dilimleri ile sonraki zaman hata görüntüleme iletişim kuralıdır. Ayrıca, günahı miyelin görüntülenmesi için basit bir prosedür sunulur.

Video: Visualization and Live Imaging of Oligodendrocyte Organelles in Organotypic Brain Slices Using Adeno-associated Virus and Confocal Microscopy

Intracranial Injection of Adeno-associated Viral Vectors

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific subsets of cells in different brain regions both in vivo and in brain sections. Unlike the injection of fluorescent dyes, viral labeling offers targeting of individual cell types and is less expensive and time consuming than establishing transgenic mouse lines. In this technique, an adeno-associated viral (AAV) vector is injected intracranially using stereotaxic coordinates, a micropipette and an automated pump for precise delivery of AAV to the desired area with minimal damage to the surrounding tissue. Injection parameters can be tailored to individual experiments by adjusting the animal age at injection, injection location, volume of injection, rate of injection, AAV serotype and the promoter driving gene expression. Depending on the conditions chosen, virally-induced transgene expression can allow visualization of groups of cells, individual cells or fine cellular processes, down to the level of dendritic spines. The experiment shown here depicts an injection of double-stranded AAV expressing green fluorescent protein for the labeling of neurons and glia in the mouse primary visual cortex.

Here we present the intracranial injection of AAV vectors for fluorescent labeling of neurons and glia in the visual cortex.

Adeno-ilişkili Viral Vektörler İntrakranial Enjeksiyon

Intracranial injection of viral vectors engineered to express a fluorescent protein is a versatile labeling technique for visualization of specific ...

Nörobilim

Functional Neuroimaging Using Ultrasonic Blood-brain Barrier Disruption and Manganese-enhanced MRI

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains technically challenging. One approach, Activation-Induced Manganese-enhanced MRI (AIM MRI), has been used successfully to map neuronal activity in rodents 1-5. In AIM MRI, Mn2+ acts a calcium analog and accumulates in depolarized neurons 6,7. Because Mn2+ shortens the T1 tissue property, regions of elevated neuronal activity will enhance in MRI. Furthermore, Mn2+ clears slowly from the activated regions; therefore, stimulation can be performed outside the magnet prior to imaging, enabling greater experimental flexibility. However, because Mn2+ does not readily cross the blood-brain barrier (BBB), the need to open the BBB has limited the use of AIM MRI, especially in mice.
One tool for opening the BBB is ultrasound. Though potentially damaging, if ultrasound is administered in combination with gas-filled microbubbles (i.e., ultrasound contrast agents), the acoustic pressure required for BBB opening is considerably lower. This combination of ultrasound and microbubbles can be used to reliably open the BBB without causing tissue damage 8-11.
Here, a method is presented for performing AIM MRI by using microbubbles and ultrasound to open the BBB. After an intravenous injection of perflutren microbubbles, an unfocused pulsed ultrasound beam is applied to the shaved mouse head for 3 minutes. For simplicity, we refer to this technique of BBB Opening with Microbubbles and UltraSound as BOMUS 12. Using BOMUS to open the BBB throughout both cerebral hemispheres, manganese is administered to the whole mouse brain. After experimental stimulation of the lightly sedated mice, AIM MRI is used to map the neuronal response.
To demonstrate this approach, herein BOMUS and AIM MRI are used to map unilateral mechanical stimulation of the vibrissae in lightly sedated mice 13. Because BOMUS can open the BBB throughout both hemispheres, the unstimulated side of the brain is used to control for nonspecific background stimulation. The resultant 3D activation map agrees well with published representations of the vibrissae regions of the barrel field cortex 14. The ultrasonic opening of the BBB is fast, noninvasive, and reversible; and thus this approach is suitable for high-throughput and/or longitudinal studies in awake mice.

A technique is described for broadly opening the blood-brain barrier in the mouse using microbubbles and ultrasound. Using this technique, manganese can be administered to the mouse brain. Because manganese is an MRI contrast agent that accumulates in depolarized neurons, this approach enables imaging of neuronal activity.

Ultrasonik Kan-beyin bariyeri bozulması ve Manganez kontrastlı MRG kullanma İşlevsel beyin görüntüleme

Although mice are the dominant model system for studying the genetic and molecular underpinnings of neuroscience, functional neuroimaging in mice remains ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

Kullanarak Fare Serebral Korteks ve Hippocampus Görselleştirme ve Dendritler ve Spine Genetik Manipülasyon<em&gt; Utero olarak</em&gt; Elektroporasyon

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During embryonic and postnatal development they actively proliferate and generate myelinating oligodendrocytes. These cells have commonly been studied in primary dissociated cultures, neuron cocultures, and in fixed tissue. Using newly available transgenic mouse lines slice culture systems can be used to investigate proliferation and differentiation of oligodendrocyte lineage cells in both gray and white matter regions of the forebrain and cerebellum. Slice cultures are prepared from early postnatal mice and are kept in culture for up to 1 month. These slices can be imaged multiple times over the culture period to investigate cellular behavior and interactions. This method allows visualization of NG2 cell division and the steps leading to oligodendrocyte differentiation while enabling detailed analysis of region-dependent NG2 cell and oligodendrocyte functional heterogeneity. This is a powerful technique that can be used to investigate the intrinsic and extrinsic signals influencing these cells over time in a cellular environment that closely resembles that found in vivo.

A technique to study NG2 cells and oligodendrocytes using a slice culture system of the forebrain and cerebellum is described. This method allows examination of the dynamics of proliferation and differentiation of cells within the oligodendrocyte lineage where the extracellular environment can be easily manipulated while maintaining tissue cytoarchitecture.

Organotipik Dilim Kültürler Oligodendrosit Dinamikler ve miyelinasyonun incelemek için

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct electrophysiological characterization of the synaptic connections between individual neurons, but also pharmacological manipulation of either the presynaptic or the postsynaptic neuron. When carried out in organotypic hippocampal slice cultures, the probability that two neurons are synaptically connected is significantly increased. This preparation readily enables identification of cell types, and the neurons maintain their morphology and properties of synaptic function similar to that in native brain tissue. A major advantage of paired whole cell recordings is the highly precise information it can provide on the properties of synaptic transmission and plasticity that are not possible with other more crude techniques utilizing extracellular axonal stimulation. Paired whole cell recordings are often perceived as too challenging to perform. While there are challenging aspects to this technique, paired recordings can be performed by anyone trained in whole cell patch clamping provided specific hardware and methodological criteria are followed. The probability of attaining synaptically connected paired recordings significantly increases with healthy organotypic slices and stable micromanipulation allowing independent attainment of pre- and postsynaptic whole cell recordings. While CA3-CA3 pyramidal cell pairs are most widely used in the organotypic slice hippocampal preparation, this technique has also been successful in CA3-CA1 pairs and can be adapted to any neurons that are synaptically connected in the same slice preparation. In this manuscript we provide the detailed methodology and requirements for establishing this technique in any laboratory equipped for electrophysiology.

Pair recordings are simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling precise electrophysiological and pharmacological characterization of the synapses between individual neurons. Here we describe the detailed methodology and requirements for establishing this technique in organotypic hippocampal slice cultures in any laboratory equipped for electrophysiology.

Organotipik Hipokampal Dilimleri eşleştirilmiş Tüm Hücre Kayıtlar

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Regioselective Biolistic Targeting in Organotypic Brain Slices Using a Modified Gene Gun

Transfection of DNA has been invaluable for biological sciences and with recent advances to organotypic brain slice preparations, the effect of various heterologous genes could thus be investigated easily while maintaining many aspects of in vivo biology. There has been increasing interest to transfect terminally differentiated neurons for which conventional transfection methods have been fraught with difficulties such as low yields and significant losses in viability. Biolistic transfection can circumvent many of these difficulties yet only recently has this technique been modified so that it is amenable for use in mammalian tissues.
New modifications to the accelerator chamber have enhanced the gene gun&#39;s firing accuracy and increased its depths of penetration while also allowing the use of lower gas pressure (50 psi) without loss of transfection efficiency as well as permitting a focused regioselective spread of the particles to within 3 mm. In addition, this technique is straight forward and faster to perform than tedious microinjections. Both transient and stable expression are possible with nanoparticle bombardment where episomal expression can be detected within 24 hr and the cell survival was shown to be better than, or at least equal to, conventional methods. This technique has however one crucial advantage: it permits the transfection to be localized within a single restrained radius thus enabling the user to anatomically isolate the heterologous gene&#39;s effects. Here we present an in-depth protocol to prepare viable adult organotypic slices and submit them to regioselective transfection using an improved gene gun.

Recent improvements in organotypic brain slice preparations have permitted their exploitation for biotechnological applications. Organotypic slices maintain local structural characteristics of in vivo biology, including functional synaptic connections. Here we present a regioselective biolistic delivery method to label and genetically manipulate these slices.

Regioseçici Biolistik Modifiye Gen Tabancası kullanarak Organotipik Beyin Dilimleri Hedefleme

Transfection of DNA has been invaluable for biological sciences and with recent advances to organotypic brain slice preparations, the effect of various ...

Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) Vector Delivery in Adult Mice

The successful development of a subpial adeno-associated virus 9 (AAV9) vector delivery technique in adult rats and pigs has been reported on previously. Using subpially-placed polyethylene catheters (PE-10 or PE-5) for AAV9 delivery, potent transgene expression through the spinal parenchyma (white and gray matter) in subpially-injected spinal segments has been demonstrated. Because of the wide range of transgenic mouse models of neurodegenerative diseases, there is a strong desire for the development of a potent central nervous system (CNS)-targeted vector delivery technique in adult mice. Accordingly, the present study describes the development of a spinal subpial vector delivery device and technique to permit safe and effective spinal AAV9 delivery in adult C57BL/6J mice. In spinally immobilized and anesthetized mice, the pia mater (cervical 1 and lumbar 1-2 spinal segmental level) was incised with a sharp 34 G needle using an XYZ manipulator. A second XYZ manipulator was then used to advance a blunt 36G needle into the lumbar and/or cervical subpial space. The AAV9 vector (3-5 &#181;L; 1.2 x 1013 genome copies (gc)) encoding green fluorescent protein (GFP) was then injected subpially. After injections, neurological function (motor and sensory) was assessed periodically, and animals were perfusion-fixed 14 days after AAV9 delivery with 4% paraformaldehyde. Analysis of horizontal or transverse spinal cord sections showed transgene expression throughout the entire spinal cord, in both gray and white matter. In addition, intense retrogradely-mediated GFP expression was seen in the descending motor axons and neurons in the motor cortex, nucleus ruber, and formatio reticularis. No neurological dysfunction was noted in any animals. These data show that the subpial vector delivery technique can successfully be used in adult mice, without causing procedure-related spinal cord injury, and is associated with highly potent transgene expression throughout the spinal neuraxis.

Subpial Adeno-associated Virus 9 AAV9 Vector Delivery in Adult Mice

The goal of the present study was to develop and validate the potency and safety of spinal adeno-associated virus 9 (AAV9)-mediated gene delivery by using a novel subpial gene delivery technique in adult mice.

Yetişkin Farelerde Subpial Adeno-ilişkili Virüs 9 (AAV9) Vektör Teslimatı

The successful development of a subpial adeno-associated virus 9 (AAV9) vector delivery technique in adult rats and pigs has been reported on previously. ...

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It has helped to describe the different steps of radial migration and characterize the molecular mechanisms controlling this process. To directly and dynamically analyze migrating neurons they have to be traced over time. This protocol describes a workflow that combines in utero electroporation with organotypic slice culture and time-lapse confocal imaging, which allows for a direct examination and dynamic analysis of radially migrating cortical neurons. Furthermore, detailed characterization of migrating neurons, such as migration speed, speed profiles, as well as radial orientation changes, is possible. The method can easily be adapted to perform functional analyses of genes of interest in radially migrating cortical neurons by loss and gain of function as well as rescue experiments. Time-lapse imaging of migrating neurons is a state-of-the-art technique that once established is a potent tool to study the development of the cerebral cortex in mouse models of neuronal migration disorders.

Time-lapse Confocal Imaging of Migrating Neurons in Organotypic Slice Culture of Embryonic Mouse Brain Using In Utero Electroporation

This protocol provides instructions for direct observation of radially migrating cortical neurons. In utero electroporation, organotypic slice culture, and time-lapse confocal imaging are combined to directly and dynamically study the effects of overexpression or downregulation of genes of interest in migrating neurons and to analyze their differentiation during development.

Embriyonik Fare Beyni Organotipik Dilim Kültüründe Nöronların Geçiş Sürekli Konfokal Görüntüleme Kullanımı<em&gt; Utero&#39;da</em&gt; Elektroporasyon

In utero electroporation is a rapid and powerful approach to study the process of radial migration in the cerebral cortex of developing mouse embryos. It ...

Methods and Tips for Intravenous Administration of Adeno-associated Virus to Rats and Evaluation of Central Nervous System Transduction

Adeno-associated virus (AAV) vectors are a key reagent in the neurosciences for clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR), optogenetics, cre-lox targeting, etc. The purpose of this manuscript is to aid the investigator attempting expansive central nervous system (CNS) gene transfer in the rat via tail vein injection of AAV. Wide-scale expression is relevant for conditions with widespread pathology, and a rat model is significant due to its greater size and physiologic similarities to humans compared to mice. In this example application, a wide-scale neuronal transduction is used to mimic a neurodegenerative disease that affects the entire spinal cord, amyotrophic lateral sclerosis (ALS). The efficient wide-scale CNS transduction can also be used to deliver therapeutic protein factors in pre-clinical studies. After a post-injection expression interval of several weeks, the effects of the transduction are evaluated. For a green fluorescent protein (GFP) control vector, the amount of GFP in the cerebellum is estimated quickly and reliably by a basic imaging program. For motor disease phenotypes that are induced by the ALS related protein transactive response DNA-binding protein of 43 kDa (TDP-43), the deficits are scored by escape reflex and rotarod. Beyond disease modeling and gene therapy, there are diverse potential applications for the wide-scale gene targeting described here. The expanded use of this method will aid in expediting hypothesis testing in the neurosciences and neurogenetics.

Methods for a wide-scale central nervous system gene delivery in the rat are covered. In this example, the purpose is to mimic a disease that affects the entire spinal cord. The widespread transduction can be used to deliver a therapeutic protein to the CNS from a one-time, peripheral administration.

Yöntemleri ve merkezi sinir sistemi iletim değerlendirilmesi ve Adeno ilişkili virüs fareler için intravenöz Yönetim için ipuçları

Adeno-associated virus (AAV) vectors are a key reagent in the neurosciences for clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR), ...

Adeno-associated Virus-mediated Transgene Expression in Genetically Defined Neurons of the Spinal Cord

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or triple transgenic mice are generated in order to achieve selective expression of a reporter or effector gene (e.g., from the Rosa26 locus) in the desired spinal population. 2) Intraspinal injection of Cre-dependent recombinant adeno-associated virus (rAAV); here Cre-dependent AAV vectors coding for the reporter or effector gene of choice are injected into the spinal cord of mice expressing Cre recombinase in the desired neuronal subpopulation. This protocol describes how to generate Cre-dependent rAAV vectors and how to transduce neurons in the dorsal horn of the lumbar spinal cord segments L3-L5 with rAAVs. As the lumbar spinal segments L3-L5 are innervated by those peripheral sensory neurons that transmit sensory information from the hindlimbs, spontaneous behavior and responses to sensory tests applied to the hindlimb ipsilateral to the injection side can be analyzed in order to interrogate the function of the manipulated neurons in sensory processing. We provide examples of how this technique can be used to analyze genetically defined subsets of spinal neurons. The main advantages of virus-mediated transgene expression in Cre transgenic mice compared to classical reporter mouse-induced transgene expression are the following: 1) Different Cre-dependent rAAVs encoding various reporter or effector proteins can be injected into a single Cre transgenic line, thus overcoming the need to create several multiple transgenic mouse lines. 2) Intraspinal injection limits manipulation of Cre-expressing cells to the injection site and to the time after injection. The main disadvantages are: 1) Reporter gene expression from rAAVs is more variable. 2) Surgery is required to transduce the spinal neurons of interest. Which of the two methods is more appropriate depends on the neuron population and research question to be addressed.

Intraspinal injection of recombinase dependent recombinant adeno-associated virus (rAAV) can be used to manipulate any genetically labelled cell type in the spinal cord. Here we describe how to transduce neurons in the dorsal horn of the lumbar spinal cord. This technique enables functional interrogation of the manipulated neuron subtype.

Omurilik genetik olarak tanımlanmış nöronlar Adeno ilişkili virüs-aracılı Transgene ifade

Selective manipulation of spinal neuronal subpopulations has mainly been achieved by two different methods: 1) Intersectional genetics, whereby double or ...