Yazarlar aseptik prosedürleri kapsamında utero elektroporasyon gerçekleştirmek için yardım ettikleri için Dr Kathleen Mathers, Dr Jean-Philippe Mocho ve Dr Yolanda Saavedra Torres teşekkür etmek istiyorum, ve onun yardım için Hayley Ahşap çizimler hazırlamak için. EP Elizabeth Fisher ve Victor Tybulewicz için Wellcome Vakfı bursu ile Avrupa Biyokimya Dernekleri uzun vadeli Federasyonu (FEBS) burs ve Medical Research Council (MRC) kariyer geliştirme bursu, MAH (080174/B/06/Z) tarafından desteklenmiştir , HW, MRC Öğrencilik tarafından EMBO uzun vadeli dostluk ve RA tarafından. Bu çalışma Wellcome Trust (086947/Z/08/Z) bir proje hibe ile ve Grant-Aid yılında Tıbbi Araştırma Konseyi (U117570528) den FG tarafından desteklenmiştir

Birleşik Krallık&#39;ta, fareler, ev sahipliği yetiştirilen ve Hayvan (Scientific Procedures) Act 1986 kapsamında İçişleri Bakanlığı tarafından onaylanan yönergelere göre tedavi edilir. 1. Hazırlanışı: DNA Çözüm ve İğneler <ol><li> Bir Endotoksin ücretsiz Maxi hazırlık kiti ile plazmid DNA arındırın. Suda istenilen konsantrasyonda enjeksiyon için plazmid DNA çözeltisi hazırlayın ve enjeksiyonlar görselleştirmek için (% 0.05 final konsantrasyon) Fast Green ekleyin. Elektroporasyon verim DNA konsantrasyonu çok bağımlı olduğunu. 1 ug / ml arasında bir konsantrasyonda, genellikle kullanılır. Bu konsantrasyon onların gelişimini etkilemeden electroporated nöronlar görselleştirmek için yeterlidir. Bununla birlikte, plazmid vektörü olarak boyutu ve (sitomegalovirüs hızlandıncı / kuvvetlendirici, sitomegalovirüs acil erken geliştirici ve tavuk β-aktin promotör fusion (CAG) promotörü ile güçlü bir ifade ile düşük düzey ifade seviyesini) &#39;de kullanılan promotör göre<html> ifade edilen protein stabilitesi, bu konsantrasyon (0,25 ug / ml ila 5 ug / ul) ayarlanabilir. </li><li> Mikropipet çektirmenin kullanılarak cam iğneler çekin. </li></ol> 2. Cerrahi hazırlanması <ol><li> Cerrahi aletler ve fosfat tamponu (PBS) otoklavlayın. </li><li> PBS (Buprenorfin, 30 ug / ml &#39;lik Vetergesic, son konsantrasyon) analjezik çözeltisi hazırlayın. Gebe fare tartılır ve en az 30 dakika ameliyattan önce Vetergesic deri altına 0.1 mg / kg enjekte. Bu süre boyunca, cerrahi alanı hazırlamak. Isıtma pedleri ve kurtarma odası açın. Sıcak su banyosu ve steril örtüler tüm steril alet ve malzemelerin steril PBS yerleştirin. PBS dolu behere platin elektrot yerleştirin ve elektroporatörün bağlanın. Bir Microloader ucunu kullanarak DNA solüsyonu ile iğne doldurun, kılcal sahibine iğne bağlamak ve bir forseps ile iğne ucu çimdiklemek. </li></ol>DNA Enjeksiyon ve Elektroporasyon önce E_TITLE &quot;&gt; 3. Cerrahi <ol><li> Bir indüksiyon odalarını kullanarak (oksijen 2 lt / dk) oksijen taşıyıcı izofluran ile hamile bir fare (E14.5-E15.5) uyuşturan. Hayvan refleks doğrulma kaybeder kadar bekleyin. </li><li> Bir &quot;ön-cerrahi&quot; maskesi hayvan aktarın. Annenin genel anestezi altında iken gözler kornea ülseri önlemek için her göze göz jeli bir damla yerleştirin. Karın tıraş etmek için bir elektrik ustura kullanın. Uçan saç toplamak için clorhexidine ile bir kez traş alanı temizleyin. </li><li> Cerrahi alanında ikinci bir maske için hayvan aktarın. Isıtma yastığı sırtını ile fare yerleştirin. Pedal refleks kesildi cerrahi başlayın. </li><li> Maske ve steril eldiven giyin. Tıraş ve dezenfekte edilmemiş deri alanları ile kontamine olmaktan doku ve araçların önlemek için steril bir drape (karın üzerinde küçük bir delik ile) ile hayvan örtün. Bir traş alanı temizleyinen t clorhexidine ile 3 kez. Farklı bir steril pamuklu çubukla her zaman kullanın. Deri yoluyla orta hat (~ 1 inç uzunluğunda) boyunca dikey bir kesi yapmak için bir neşter kullanın. Makas kullanarak, linea alba (beyaz çizgi kollajen bağ dokusu çoğunlukla oluşan) boyunca karın kaslarının benzer bir kesi yapmak. </li><li> En erişilebilir embriyolar seçin ve iki embriyo arasında halka forseps yerleştirin ve dikkatlice karın boşluğu dışında embriyonik zinciri çekin. Bu noktadan itibaren, steril önceden ısıtılmış PBS ile embriyolar nemli tutar. </li></ol> No mikroskop görüntülenmesi için gereklidir. 4. DNA ve Elektroporasyon Enjeksiyon <ol><li> Daha kolay embriyolar electroporated edildiği izlemek için yapım, en lateral embriyoların biriyle başlayın. Bu kanama riskini artıracak gibi embriyo üzerinde çok fazla çekmeyin. Halka ve forseps kullanılarak amniyon kesesi içinde embriyonun konumu manipülehalkaları arasındaki embriyoların başı sabitlemek. Embriyo yakın rahim duvarına kadar itmek hafifçe sıkın. </li><li> Diğer elinizle kılcal tutucu almak ve lateral ventrikül hedef yarımkürenin orta dikkatlice iğneyi. Fast Green (dendritler okumaya az 1 ul) ile karışık DNA solüsyonu yaklaşık 1 mikrolitre enjekte etmek için pedal basın. Sen lateral ventrikül dolum yeşil boya gözetmelidir. Kritik adımlar: - iğne keskinliğini düzgün rahim duvarı delmek için çok önemlidir. Delikli bir genişleme amniyotik sıvı ve embriyo ölüm sızıntı neden olacaktır çünkü uterus duvar yüzeyinde ve ventrikül içine yerleştirildikten sonra iğne hareketi en aza indirmek için önemlidir. Bu kanama ve embriyo ölüme neden olacağı için, rahim duvarının delici kan damarları kaçının. - Bu neden olacaktır çünkü lateral ventrikül içine DNA bir çok büyük hacimli enjeksiyon için önemli değildirhidrosefali (E14.5 az 2 ul aşmayın). DNA&#39;yı hacminin deney amacına göre ayarlanır. 1μl, genellikle en deneyler için kullanıldığı takdirde, DNA (yaklaşık 0.5 ul) daha küçük bir hacim dendrit ve omurga analizi için gereklidir. Gerçekten de birkaç izole hücrelerin electroporated nöronların dendritik çardak görselleştirmek ve ölçmek için hedef gerekir. </li><li> Korteks elektroporasyon için enjekte ventrikül olarak veya hipokampus elektroporasyon için enjekte ventrikül (Şekil 2) karşı tarafta aynı tarafta pozitif (+) raket ile embriyonun baş tarafında elektrotlar yerleştirin. Daha sonra 1 sn aralıklarla beş 30V elektrik darbeleri (50 msn süreli) uygulanır. Kritik adım: Bu embriyo ölüme neden olacak gibi plasenta arasında geçerli uygulamaktan kaçının. Hamile bir farenin tüm embriyolar herhangi bir karışıklığı önlemek için inşa genellikle aynı DNA ile, electroporated edilebilir. Bununla birlikte, uzun bir cerrahi azalma<html> embriyoların hayatta kalma oranı nedir. Karın boşluğuna 30 dakika daha uzun açılmamalıdır. </li></ol> 5.. Cerrahi sonrası elektroporasyon <ol><li> Embriyoların electroporating sonra, karın boşluğuna PBS ekleyin ve özgün konumunda uterin horn yerine halka forseps kullanabilir. Vicryl emilebilir dikişlerle karın duvarı ve cilt dikin. </li><li> Bir ısıtma yastığı üzerine yerleştirilen bir kafese aktarabilir sonra uyanır (genellikle 5-10 dk) ve kadar bir kurtarma odasında hayvan yerleştirin. </li></ol> 6. Post-cerrahi Ağrı, acı veya sıkıntı değerlendirmek ve cerrahi sonrası hayvanların 24 saat ve 48 saat tartmak farelerin davranışlarını kontrol edin. Gerekirse, analjezikler ağrı ve rahatsızlığı azaltmak için uygulanabilir. 7. Doku İşleme Deney için gerekli embriyonik ya da doğum sonrası aşamalarında electroporated embriyo veya yavrular toplayın. ove_content &quot;&gt; - embriyonik aşamalarında (örneğin hücre çoğalması veya göç çalışma) de analiz için: Servikal dislokasyon ile anne Euthanize ve embriyolar toplamak. Baş kesilerek, düzgün bir şekilde electroporated edilmiştir beyinleri seçmek gibi floresan sinyal miktarını ve konum ile belirtilen, bir floresan binoküler kullanılarak kafatası boyunca görüntülenmiştir. Kafatası beyin dışarı inceleyin ve% 20 sakkaroz / gece PBS içinde% 4 PFA gecede düzeltmek ve tekrar yerine. ° C ve bölüm kriyostat kullanarak -80 OKT bileşik, dondurucuda Embed. - Doğum sonrası aşamalarında (örneğin dendrit ve dikenler incelemek için) de analiz için: Pentobarbitone intraperitoneal (40-60 mg / kg) ile yavru veya yetişkin farelerin uyuşturmak ve PBS içinde% 4 PFA takiben PBS ile transcardial perfüzyon, gerçekleştirebilir. % 4 PFA gece içinde kafatası ve post-düzeltmenin beynini parçalara ayır. Bir vibratome (d için 100 mikron bölümlerini kullanarak PBS, bölüm beyinleri yıkamadan sonraendrite analizi). Görüntü dendrit ve dikene 0.16-0.19 mm kalınlığında lamelleri kullanarak Aqua Poly / mount bölümler monte edin. 8. Temsilcisi sonuçları Şekil 3 CA1 (Şekil 3C, D) ve hipokampus (Şekiller 3E, F) dentat gyrus&#39;ta serebral kortekse (Şekil 3A, B) &#39;de electroporated hücrelerinin örnekleri gösterilmektedir. Wild-tip fareler GFP yapı (PCA-b-EGFPm5 susturucu 3) ve beyinleri postnatal gün (P) 14 hasat edildi ile E14.5 az electroporated edildi. DNA solüsyonu bir küçük hacimli (1 ug / ml bir çözeltiden 0.5 ul veya daha az) enjekte edilerek, bir kaç hücreleri izole GFP + hücreleri (Şekil 3) ve aynı zamanda bunların omurga dendritik arborization görselleştirilmesi olanak sağlayan, etiketli yüksek büyütmede (Şekil 4). <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/4163/4163fig1.jpg" /> &lt;strong&gt; Şekil 1. dendrit ve dikenler incelemek için kullanılabilir elektroporasyon protokolleri şematik. (A) bir GFP arasında Elektroporasyon vahşi tip ve mutant farelerde dendritler, omurilikteki karşılaştırmak için yapı. (B) GFP-shRNA (GFP aynı yapı ile ifade edilir) ve Elektroporasyon oluşturmak dendritler ve bir shRNA ile electroporated farelerde omurga karşılaştırmak için bir ilgi genindeki (X) ya da bir kontrol shRNA için spesifik. (C) IUE arzu edilir bir süre için shRNA ifade kısıtlamak için bir Kre indüklenebilen sistemi ile birlikte kullanılabilir. Bu deneyde, bir vektör 4-hydroxytamoxifen ile aktive edilebilir Kre rekombinazı bir biçimi ifade (CAG-ER T2 CreER T2; 1 ug / ul) 10, bir Kre bağlı olarak, belirli bir shRNA eksprese eden bir vektör ile birlikte electroporated edilir şekilde (1 mcg / ml ve rekombinasyon göstergesi (Kre tarafından CALNL-GFP yapı, GFP indüklenebilir ile;. 1 mcg / ml) 10 Verimdevirme ve cy shRNA konsantrasyonu artırmanın yanında CAG-ER T2 CreER T2 konsantrasyonu artırarak geliştirilebilir. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/4163/4163fig2.jpg" /> Şekil 2. Elektroporasyon Mekansal kontrolü. Bu şekil serebral korteksteki veya hipokampus hedeflemek için DNA enjeksiyon göre paddle elektrotlar konumlandırmak için burada gösterir. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/4163/4163fig3.jpg" /> Şekil 3. Utero ve dendritik çardak Görselleştirme serebral korteks ve hipokampus hücrelerinin electroporated. (A, B) GFP + serebral korteksteki piramidal hücre, (CD) piramidal hipokampusun CA1 hücreleri ve (E, F), P14 azından dentat gyrus&#39;ta granül hücreleri gösteren koronalde. Bir GFP yapı (PCA-b-EGFPm5 susturucu 3) E14.5 de electroporated edildi. Yüksek büyütme resimleri (B, D, F) İEÜ dendritler görselleştirmek için etkili bir yöntem olduğunu göstermektedir. Ölçek çubukları 50 mikron (B, D ve F), 150 mikron (A, C, E) temsil eder. <img alt="Şekil 4" src="/files/ftp_upload/4163/4163fig4.jpg" /> Şekil 4. Inşa ifade eden bir GFP E14.5 az utero electroporated edildi P14 nöronlar dendritik dikenler Görselleştirilmesi. (A, B) hipokampal piramidal nöronların bazal dendritler gelen dikenlerin Yüksek büyütme görüntüler. Ölçek çubukları 5 um (A) ve 2 um (B) temsil eder.

<ol>
	<li>Kolk, S. M., de Mooij-Malsen, A. J., Martens, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+Molecular+Approach+of+in+utero+Electroporation+to+Functionally+Decipher+Endophenotypes+in+Neurodevelopmental+Disorders.">Spatiotemporal Molecular Approach of in utero Electroporation to Functionally Decipher Endophenotypes in Neurodevelopmental Disorders.</a> Front Mol. Neurosci. 4, 37 (2011).</li><li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation.">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Dev. Biol. 240, 237-246 (2001).</li><li>Shimogori, T., Ogawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+application+with+in+utero+electroporation+in+mouse+embryonic+brain.">Gene application with in utero electroporation in mouse embryonic brain.</a> Dev. Growth Differ. 50, 499-506 (2008).</li><li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+in+utero+gene+transfer+system+to+the+developing+mouse+brain+using+electroporation:+visualization+of+neuronal+migration+in+the+developing+cortex.">Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex.</a> Neuroscience. 103, 865-872 (2001).</li><li>Tabata, H., Nakajima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Labeling+embryonic+mouse+central+nervous+system+cells+by+in+utero+electroporation.">Labeling embryonic mouse central nervous system cells by in utero electroporation.</a> Dev. Growth Differ. 50, 507-511 (2008).</li><li>Castro, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+function+of+the+proneural+factor+Ascl1+in+progenitor+proliferation+identified+by+genome-wide+characterization+of+its+targets.">A novel function of the proneural factor Ascl1 in progenitor proliferation identified by genome-wide characterization of its targets.</a> Genes Dev. 25, 930-945 (2011).</li><li>Pacary, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proneural+transcription+factors+regulate+different+steps+of+cortical+neuron+migration+through+Rnd-mediated+inhibition+of+RhoA+signaling.">Proneural transcription factors regulate different steps of cortical neuron migration through Rnd-mediated inhibition of RhoA signaling.</a> Neuron. 69, 1069-1084 (2011).</li><li>Marteau, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiopoietin-2+regulates+cortical+neurogenesis+in+the+developing+telencephalon.">Angiopoietin-2 regulates cortical neurogenesis in the developing telencephalon.</a> Cereb Cortex. 21, 1695-1702 (2011).</li><li>Ramon Moliner, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Comparative Methods in Neuroanatomy. , (1970).</li><li>Banks, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavioral+and+other+phenotypes+in+a+cytoplasmic+Dynein+light+intermediate+chain+1+mutant+mouse.">Behavioral and other phenotypes in a cytoplasmic Dynein light intermediate chain 1 mutant mouse.</a> J. Neurosci. 31, 5483-5494 (2011).</li><li>Elias, G. M., Elias, L. A., Apostolides, P. F., Kriegstein, A. R., Nicoll, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+trafficking+of+AMPA+and+NMDA+receptors+by+SAP102+and+PSD-95+underlies+synapse+development.">Differential trafficking of AMPA and NMDA receptors by SAP102 and PSD-95 underlies synapse development.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 20953-20958 (2008).</li><li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled+expression+of+transgenes+introduced+by+in+vivo+electroporation.">Controlled expression of transgenes introduced by in vivo electroporation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 1027-1032 (2007).</li><li>Navarro-Quiroga, I., Chittajallu, R., Gallo, V., Haydar, T. F. L. o. n. g. -. t. e. r. m. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=selective+gene+expression+in+developing+and+adult+hippocampal+pyramidal+neurons+using+focal+in+utero+electroporation.">selective gene expression in developing and adult hippocampal pyramidal neurons using focal in utero electroporation.</a> J. Neurosci. 27, 5007-5011 (2007).</li><li>Nakahira, E., Yuasa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+generation,+migration,+and+differentiation+in+the+mouse+hippocampal+primoridium+as+revealed+by+enhanced+green+fluorescent+protein+gene+transfer+by+means+of+in+utero+electroporation.">Neuronal generation, migration, and differentiation in the mouse hippocampal primoridium as revealed by enhanced green fluorescent protein gene transfer by means of in utero electroporation.</a> J. Comp. Neurol. 483, 329-340 (2005).</li><li>Ramos, R. L., Bai, J., LoTurco, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterotopia+formation+in+rat+but+not+mouse+neocortex+after+RNA+interference+knockdown+of+DCX.">Heterotopia formation in rat but not mouse neocortex after RNA interference knockdown of DCX.</a> Cereb Cortex. 16, 1323-1331 (2006).</li></ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

İEÜ uzayda değil, zaman sadece gen ekspresyonu işlemek için güçlü bir araçtır. Biz bu tekniğin serebral korteks ve farelerin hipokampus dendrit ve dikenleri görselleştirmek ve genetik işlemek için kullanılabileceğini burada göstermektedir. Daha önce anılan avantajları yanında, İEÜ, yöntem Golgi aksine, immünhistokimya ile veya fenotip electroporated hücreleri örneğin sağlar situ hibridizasyon, kombine edilebilir dikkati çekiyor. Bu prosedür göreceli invaziv rağmen belirgin beyin anormallikleri neden olmadığını belirtmeyi de önemlidir. Buna ek olarak, hücresel seviyede, IUE electroporated nöronların 13 elektrofizyolojik özelliklerini değiştirmek değildir. Bizim gösteri dendrit ve omurga morfolojilerinin görselleştirme odaklanırken, E14.5 kortikal veya hipokampal nöronların İEÜ ayrıca akson oluşumu ve rehberlik gibi diğer gelişimsel olayları incelemek için kullanılabilir. Ekleyinition, protokol aynı tür farklı toplumlarda hedef embriyonik gelişimin diğer aşamalarında uygulanabilir. Örneğin, E18.5 bir developmentally çok geç kortikal elektroporasyon paradigma astrositik progenitörlerin 1 ifade sürmek için gerçekleştirilebilir. E14.5 de hipokampus bir elektroporasyon aynı zamanda CA1-CA3 piramidal nöron ataları ve dentat granül hücre progenitör hedef sağlar Benzer şekilde, bir geç hipokampal elektroporasyon (E18.5 veya erken doğum sonrası) farklı dentat granül hedef için izin verecek progenitörlerin 14. Bu durumda, DNA enjekte hacmi akım yoğunluğu yanı sıra arttırılabilir. İEÜ tarafından tanıtıldı transgenlerin epizomal kalması görünür ve bu nedenle ardışık hücre bölünmeleri takip hücrelerinden kaybolur. Bu nöronların olarak postmitotik hücreleri ise, epizomal transgenlerin uzun vadeli çalışma 13 izin elektroporasyon sonra ay için aktif kalması, 15. Bizim çalışmamızda, erken gelişimsel zaman noktalarından transgen ısrarla ifade İEÜ sonuçlarını kullanarak kortikal ve hipokampal nöron öncüleri hedefleme embriyonik belirten doğumdan sonra 7 hafta (biz analiz en son saat noktası) parlak GFP + hücreler kadar gözlemledim yetişkinliğe. Tekniğin bir akım sınırlama electroporated hücrelerin sayısı üzerinde ince bir kontrol uygulamak zor olmasıdır. Ancak DNA solüsyonu enjekte hacmi azaldığı için, bunun birkaç hücre etiketlemek ve izole GFP + hücrelerin yanı sıra dikenler dendritik arborization görselleştirmek mümkün olduğunu göstermiştir. Transfekte alan boyutu ve aynı zamanda, mevcut darbelerinin sayısı ya elektroporasyon kolları çapı yoğunluğu olarak elektroporasyon parametreleri değiştirerek ayarlanabilir. Toplamda İEÜ, uygulanması kolay hızlı bir yöntem vein vivo olarak dendrit ve dikenler incelemek için verimli.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td colspan="4"> Enjeksiyon iğneleri ve DNA çözeltisinin hazırlanması </td></tr><tr><td> Endofree Plazmid Maxi Seti </td><td> Qiagen </td><td> 12362 </td><td></td></tr><tr><td> Fast Green </td><td> Sigma </td><td> F-7258 </td><td></td></tr><tr><td> Borosilikat cam kılcal 1.0 mm OD x 0,58 mm ID </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 30-0016 </td><td></td></tr><tr><td> Microloader ipuçları </td><td> Eppendorf </td><td> 5242956003 </td><td> Eppendorf 0.5 ul-10 ul / 2-20 ul pipetler için </td></tr><tr><td></td><td></td><td> &amp; Nbsp; </td><td> Cerrahi için Malzeme </td></tr><tr><td> Ekstra ince Iris makas </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 14088-10 </td><td></td></tr><tr><td> Kavisli Forseps </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 91197-00 </td><td></td></tr><tr><td> Halka forseps </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 11103-09 </td><td></td></tr><tr><td> İğne tutucu </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 12002-12 </td><td></td></tr><tr><td> Graefe Forseps </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 11050-10 </td><td></td></tr><tr><td> Vicryl emilebilir sütür </td><td> Ethicon Inc (Johnson &amp; Johnson) </td><td> W9074 </td><td></td></tr><tr><td> Steril örtüler 30cm x 45 cm </td><td> Buster </td><td> 141765 </td><td></td></tr><tr><td> Steril bezlerden </td><td> Shermond </td><td> Huby-340 </td&gt; <td></td></tr><tr><td> Pamuk tomurcukları </td><td> Temiz Çapraz Co, Ltd </td><td> 1860 </td><td></td></tr><tr><td> Buprenorfin (Vetergesic) </td><td> Alstoe Hayvan Sağlığı </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Clorhexidine </td><td> Vetasept </td><td> XHG007 </td><td></td></tr><tr><td> Göz jeli Viscotears </td><td> Novartis </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Izofluran </td><td> Abbott Laboratories </td><td> B506 </td><td></td></tr><tr><td> Pentoject, Pentobarbitone Sodyum% 20 </td><td> Animalcare </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td colspan="4"> Elektroporasyon </td></tr><tr><td> Elektroporatör </td><td> BTX </td><td> ECM830 </td><td></td></tr><tr><td> Platin Tweezertrode-5mm </td><td> BTX, Harvard Apparatus </td><td> 45-0489 </td><td></td></tr><tr><td> FemtoJet mikroenjektör </td><td> Eppendorf </td><td> 5247000030 </td><td></td></tr><tr><td> FemtoJet mikroenjektör için ayak Kontrolü </td><td> Eppendorf </td><td> 5247623002 </td><td></td></tr><tr><td> Kılcal tutucu </td><td> Eppendorf </td><td> 5176190002 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Doku işleme </td></tr><tr><td> Paraformaldehyde </td><td> Sigma </td><td> P6148 </td><td></td></tr><tr><td> Sakaroz </td><td> VWR (Prolabo) </td><td> 27480.294 </td><td></td></tr><tr><td> Mikroskop slaytlar </td><td> ThermoScientific (Menzel-Gläser) </td><td> J1800AMNZ </td><td></td></tr><tr><td> Lameller </td><td> Menzel-Gläser </td><td></td><td> 22 x 50 mm # 1,5 </td></tr><tr><td> Aqua Poly / montaj </td><td> Polysciences, Inc </td><td> 18606 </td><td></td></tr></tbody></table>

visualization and genetic manipulation of dendrites and spines in the mouse cerebral cortex and hippocampus using in utero electroporation

Utero elektroporasyon yılında (İEÜ) Embriyonik sinir sisteminden 1-5 farklı yörelerin kalkınmasına çalışmak için güçlü bir tekniği haline gelmiştir. Bu araç yaygın olarak hücresel çoğalma, farklılaşma ve özellikle gelişmekte olan serebral korteks 6-8 nöronal göçün düzenlenmesi incelemek için kullanılır olmuştur bugüne kadar. Burada detaylı bizim protokol utero serebral korteks ve hipokampus electroporate ve bu yaklaşımı, bu iki beyin bölgelerinde dendrit ve dikenler incelemek için kullanılabilir kanıt sağlamak. Primer kültürlerinde nöronların Görselleştirme ve manipülasyon dendrit, omurga ve sinaps geliştirilmesinde rol süreçlerin daha iyi anlaşılmasına katkıda bulunmuştur. Ancak in vitro büyüyen nöronların normal gelişim sırasında dendrit ve / veya omurga oluşumu ve bakım etkileyebilecek tüm fizyolojik ipuçları maruz değildir. Dendrit ve omurga yapıları bilgilerimiz <eyabani türde veya mutant farelerde in vivo m&gt; Golgi-Cox yöntemi kullanılarak 9 gözlemler, çoğunlukla gelir. Bununla birlikte, Golgi boyama öngörülemeyen olarak kabul edilir. Gerçekten de, sinir hücreleri ve lif yolları grupları bitişik alanları boyama yoksun ise belirli alanlarda genellikle tamamen lekeli görünmesi ile, rastgele etiketlenir. Son çalışmalar floresan yapıları İEÜ mutant / wild-tip farelerden 10-11 (Şekil 1A) olarak dendrit dikenler gibi sinaps çalışmak için cazip bir alternatif yöntem temsil ettiğini göstermiştir. Dahası fare Knockouts üretimi ile karşılaştırıldığında, IUE belirli bir zaman süresince penceresi hücrelerin spesifik popülasyonda fonksiyonu çalışmaların kazanç-kayıp gerçekleştirmek için hızlı bir yaklaşımı temsil eder. Buna ek olarak, başarılı bir şekilde IUE RNAi bir gen ya da shRNA 12 ifadesi üzerindeki zamansal kontrolü rafine yaklaşır indüklenebilen gen ekspresyonu ya indüklenebilen ile birlikte kullanılmıştır. İEÜ Bu avantajları dolayısıyla opene vard yeni boyutları sadece belirli beyin yapıları (Şekil 1B) değil, aynı zamanda gelişimi belirli bir zaman noktasında (Şekil 1C) olarak dendrit ve dikenler üzerinde gen ekspresyonu / bastırma etkisinin araştırılması amaçlanmıştır. Son olarak, İEÜ dendrit, omurga ve / veya sinaps geliştirme ilgili genler arasında işlevsel etkileşimleri belirlemek için yararlı bir araç sağlar. Gerçekten de, bu tür virüsler gibi diğer yöntemler gen aktarımı aksine, bu hücrelerin, aynı popülasyon içinde birden çok RNAi ya transgenlerin birleştirmek için açıktır. Özet olarak, zaten IUE beyin fonksiyonu ve hastalık moleküler mekanizmaları karakterizasyonu katkıda bulunan ve aynı zamanda dendritler ve omurga çalışması ve yardımcı olacaktır güçlü bir yöntemdir.

Watch this Scientific Journal Video about Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation at JoVE.com

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Bu makalede ayrıntılı olarak utero serebral korteks ve farelerde E14.5 de hipokampus electroporate bir protokol tanımlamaktadır. Biz de bu bu iki beyin bölgelerinde dendrit ve dikenler incelemek için değerli bir yöntem olduğunu göstermektedir.

Kullanarak Fare Serebral Korteks ve Hippocampus Görselleştirme ve Dendritler ve Spine Genetik Manipülasyon<em&gt; Utero olarak</em&gt; Elektroporasyon

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

visualization-genetic-manipulation-dendrites-spines-mouse-cerebral

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

17.9K Görüntüleme.  MRC National Institute for Medical Research. Bu makalede ayrıntılı olarak utero serebral korteks ve farelerde E14.5 de hipokampus electroporate bir protokol tanımlamaktadır. Biz de bu bu iki beyin bölgelerinde dendrit ve dikenler incelemek için değerli bir yöntem olduğunu göstermektedir.

Video: Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the olfactory bulb (OB). The molecular mechanisms of OSN axon growth and targeting are not well understood. Manipulating gene expression and subsequent 
visualizing of single OSN axons and their terminal arbor morphology have thus far been challenging. To study gene function at the single cell level within a specified 
time frame, we developed a lentiviral based technique to manipulate gene expression in OSNs in vivo. Lentiviral particles are delivered to OSNs by microinjection 
into the olfactory epithelium (OE). Expression cassettes are then permanently integrated into the genome of transduced OSNs. Green fluorescent protein expression 
identifies infected OSNs and outlines their entire morphology, including the axon terminal arbor. Due to the short turnaround time between microinjection and 
reporter detection, gene function studies can be focused within a very narrow period of development. With this method, we have detected GFP expression within as 
few as three days and as long as three months following injection. We have achieved both over-expression and shRNA mediated knock-down by lentiviral microinjection. 
This method provides detailed morphologies of OSN cell bodies and axons at the single cell level in vivo, and thus allows characterization of candidate gene function 
during olfactory development.

Lentivirus-mediated Genetic Manipulation and Visualization of Olfactory Sensory Neurons in vivo

We present a lentiviral technique for genetic manipulation and visualization of single olfactory sensory neuron axon and its terminal arborization in vivo.

Koku Duyu Nöronlar lentivirüs aracılı Genetik Manipülasyon ve Görselleştirme In vivo</em

Development of a precise olfactory circuit relies on accurate projection of olfactory sensory neuron (OSN) axons to their synaptic 
targets in the ...

Nörobilim

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance molecules, local gene transfer or knock- out is required. Gene targeting knock-in or knock-out into local regions is possible to perform with combination with a specific CRE line, which is laborious, costly, and time consuming. Therefore, a simple transfection method, an in utero electroporation technique, which can be performed with short time, will be handy to test the possible function of candidate genes prior to the generation of transgenic animals 1,2. In addition to this, in utero electroporation targets areas of the brain where no specific CRE line exists, and will limit embryonic lethality 3,4. Here, we present a method of in utero electroporation combining two different types of electrodes for simple and convenient gene transfer into target areas of the developing brain. First, a unique holding method of embryos using an optic fiber optic light cable will make small embryos (from E9.5) visible for targeted DNA solution injection into ventricles and needle type electrodes insertion to the targeted brain area 5,6. The patterning of the brain such as cortical area occur at early embryonic stage, therefore, these early electroporation from E9.5 make a big contribution to understand entire area patterning event. Second, the precise shape of a capillary prevents uterine damage by making holes by insertion of the capillary. Furthermore, the precise shape of the needle electrodes are created with tungsten and platinum wire and sharpened using sand paper and insulated with nail polish 7, a method which is described in great detail in this protocol. This unique technique allows transfection of plasmid DNA into restricted areas of the brain and will enable small embryos to be electroporated. This will help to, open a new window for many scientists who are working on cell differentiation, cell migration, axon guidance in very early embryonic stage. Moreover, this technique will allow scientists to transfect plasmid DNA into deep parts of the developing brain such as thalamus and hypothalamus, where not many region-specific CRE lines exist for gain of function (GOF) or loss of function (LOF) analyses.

Mouse in Utero Electroporation: Controlled Spatiotemporal Gene Transfection

A gene transfer method into the developing mouse brain is described by using a unique surgical method and special shape of electrodes. This unique technique allows transfection of plasmid DNA temporally and spatially, which will aid many neuroscientists in studying brain development.

Fare Utero Elektroporasyon: Kontrollü Spatiotemporal Gen Transfeksiyon

In order to understand the function of genes expressed in specific region of the developing brain, including signaling molecules and axon guidance ...

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the first born neurons remain closer to the ventricle while the last born neurons migrate past the first born neurons towards the surface of the brain1. In addition to neuronal migration2, a key process for normal cortical function is the regulation of neuronal morphogenesis3. While neuronal morphogenesis can be studied in vitro in primary cultures, there is much to be learned from how these processes are regulated in tissue environments.
We describe techniques to analyze neuronal migration and/or morphogenesis in organotypic slices of the cerebral cortex4,6. A pSilencer modified vector is used which contains both a U6 promoter that drives the double stranded hairpin RNA and a separate expression cassette that encodes GFP protein driven by a CMV promoter7-9. Our approach allows for the rapid assessment of defects in neurite outgrowth upon specific knockdown of candidate genes and has been successfully used in a screen for regulators of neurite outgrowth8. Because only a subset of cells will express the RNAi constructs, the organotypic slices allow for a mosaic analysis of the potential phenotypes. Moreover, because this analysis is done in a near approximation of the in vivo environment, it provides a low cost and rapid alternative to the generation of transgenic or knockout animals for genes of unknown cortical function. Finally, in comparison with in vivo electroporation technology, the success of ex vivo electroporation experiments is not dependant upon proficient surgery skill development and can be performed with a shorter training time and skill.

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

To conduct a rapid assessment of the function of genes in the development of cerebral cortex, we describe methods involving the ex vivo electroporation of plasmids co-expressing inhibitory RNA (RNAi) and GFP in murine embryonic cortex. This protocol is amenable to the study of various aspects of neurodevelopment such as neurogenesis, neuronal migration and neuronal morphogenesis including dendrite and axon outgrowth.

Nöronal Morphogenesis Çalışması Yöntemleri:<em&gt; Ex vivo</emEmbriyonik Mürin Serebral Korteks olarak&gt; RNAi Elektroporasyon

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the ...

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other insects proprioception is provided by specialized sensory organs termed chordotonal organs (ChOs) 2. Like many other organs in Drosophila, ChOs develop twice during the life cycle of the fly. First, the larval ChOs develop during embryogenesis. Then, the adult ChOs start to develop in the larval imaginal discs and continue to differentiate during metamorphosis.
The development of larval ChOs during embryogenesis has been studied extensively 10,11,13,15,16. The centerpiece of each ChO is a sensory unit composed of a neuron and a scolopale cell. The sensory unit is stretched between two types of accessory cells that attach to the cuticle via specialized epidermal attachment cells 1,9,14. When a fly larva moves, the relative displacement of the epidermal attachment cells leads to stretching of the sensory unit and consequent opening of specific transient receptor potential vanilloid (TRPV) channels at the outer segment of the dendrite 8,12. The elicited signal is then transferred to the locomotor central pattern generator circuit in the central nervous system.
Multiple ChOs have been described in the adult fly 7. These are located near the joints of the adult fly appendages (legs, wings and halters) and in the thorax and abdomen. In addition, several hundreds of ChOs collectively form the Johnston's organ in the adult antenna that transduce acoustic to mechanical energy 3,5,17,4.
In contrast to the extensive knowledge about the development of ChOs in embryonic stages, very little is known about the morphology of these organs during larval stages. Moreover, with the exception of femoral ChOs 18 and Johnston's organ, our knowledge about the development and structure of ChOs in the adult fly is very fragmentary.
Here we describe a method for staining and visualizing ChOs in third instar larvae and pupae. This method can be applied together with genetic tools to better characterize the morphology and understand the development of the various ChOs in the fly.

Visualization of Proprioceptors in Drosophila Larvae and Pupae

A method to immunostain and visualize chordotonal organs in larvae and pupae of Drosophila melanogaster is described.

Içinde proprioseptörlere Görselleştirmesi<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva ve Pupa

Proprioception is the ability to sense the motion, or position, of body parts by responding to stimuli arising within the body. In fruitflies and other ...

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding how the brain works. The primary function of any nerve cell is to process electrical signals, usually from multiple sources. Electrical properties of neuronal processes are extraordinarily complex, dynamic, and, in the general case, impossible to predict in the absence of detailed measurements. To obtain such a measurement one would, ideally, like to be able to monitor, at multiple sites, subthreshold events as they travel from the sites of origin on neuronal processes and summate at particular locations to influence action potential initiation. This goal has not been achieved in any neuron due to technical limitations of measurements that employ electrodes. To overcome this drawback, it is highly desirable to complement the patch-electrode approach with imaging techniques that permit extensive parallel recordings from all parts of a neuron. Here, we describe such a technique - optical recording of membrane potential transients with organic voltage-sensitive dyes (Vm-imaging) - characterized by sub-millisecond and sub-micrometer resolution. Our method is based on pioneering work on voltage-sensitive molecular probes 2. Many aspects of the initial technology have been continuously improved over several decades 3, 5, 11. Additionally, previous work documented two essential characteristics of Vm-imaging. Firstly, fluorescence signals are linearly proportional to membrane potential over the entire physiological range (-100 mV to +100 mV; 10, 14, 16). Secondly, loading neurons with the voltage-sensitive dye used here (JPW 3028) does not have detectable pharmacological effects. The recorded broadening of the spike during dye loading is completely reversible 4, 7. Additionally, experimental evidence shows that it is possible to obtain a significant number (up to hundreds) of recordings prior to any detectable phototoxic effects 4, 6, 12, 13. At present, we take advantage of the superb brightness and stability of a laser light source at near-optimal wavelength to maximize the sensitivity of the Vm-imaging technique. The current sensitivity permits multiple site optical recordings of Vm transients from all parts of a neuron, including axons and axon collaterals, terminal dendritic branches, and individual dendritic spines. The acquired information on signal interactions can be analyzed quantitatively as well as directly visualized in the form of a movie.

An imaging technique for monitoring of membrane potential changes with sub-micrometer spatial and sub-millisecond temporal resolution is described. The technique, based on laser excitation of voltage-sensitive dyes, allows measurements of signals in axons and axon collaterals, terminal dendritic branches, and individual dendritic spines.

Aksonlar, Dendrit ve Beyin Dilimleri Bireysel Nöron Dendritik Spine kaynaklanan voltaj duyarlı Boya Kaydı

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding ...

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

Although the brain represents less than 5% of the body by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body at rest1. The function of non rapid eye movement sleep (NREMS), the largest portion of sleep by time, is uncertain. However, one salient feature of NREMS is a significant reduction in the rate of cerebral glucose utilization relative to wakefulness2-4. This and other findings have led to the widely held belief that sleep serves a function related to cerebral metabolism. Yet, the mechanisms underlying the reduction in cerebral glucose metabolism during NREMS remain to be elucidated.
	One phenomenon associated with NREMS that might impact cerebral metabolic rate is the occurrence of slow waves, oscillations at frequencies less than 4 Hz, in the electroencephalogram5,6. These slow waves detected at the level of the skull or cerebral cortical surface reflect the oscillations of underlying neurons between a depolarized/up state and a hyperpolarized/down state7. During the down state, cells do not undergo action potentials for intervals of up to several hundred milliseconds. Restoration of ionic concentration gradients subsequent to action potentials represents a significant metabolic load on the cell8; absence of action potentials during down states associated with NREMS may contribute to reduced metabolism relative to wake.
	Two technical challenges had to be addressed in order for this hypothetical relationship to be tested. First, it was necessary to measure cerebral glycolytic metabolism with a temporal resolution reflective of the dynamics of the cerebral EEG (that is, over seconds rather than minutes). To do so, we measured the concentration of lactate, the product of aerobic glycolysis, and therefore a readout of the rate of glucose metabolism in the brains of mice. Lactate was measured using a lactate oxidase based real time sensor embedded in the frontal cortex. The sensing mechanism consists of a platinum-iridium electrode surrounded by a layer of lactate oxidase molecules. Metabolism of lactate by lactate oxidase produces hydrogen peroxide, which produces a current in the platinum-iridium electrode. So a ramping up of cerebral glycolysis provides an increase in the concentration of substrate for lactate oxidase, which then is reflected in increased current at the sensing electrode. It was additionally necessary to measure these variables while manipulating the excitability of the cerebral cortex, in order to isolate this variable from other facets of NREMS.
	We devised an experimental system for simultaneous measurement of neuronal activity via the elecetroencephalogram, measurement of glycolytic flux via a lactate biosensor, and manipulation of cerebral cortical neuronal activity via optogenetic activation of pyramidal neurons. We have utilized this system to document the relationship between sleep-related electroencephalographic waveforms and the moment-to-moment dynamics of lactate concentration in the cerebral cortex. The protocol may be useful for any individual interested in studying, in freely behaving rodents, the relationship between neuronal activity measured at the electroencephalographic level and cellular energetics within the brain.

A procedure is described for manipulating the activity of cerebral cortical pyramidal neurons optogenetically while the electroencephalogram, electromyogram, and cerebral lactate concentration are monitored. Experimental recordings are performed on cable-tethered mice while they undergo spontaneous sleep/wake cycles. Optogenetic equipment is assembled in our laboratory; recording equipment is commercially available.

Eşzamanlı Elektroensefalografi, Kemirgen Serebral Korteks Laktat Konsantrasyonu ve Nöronal Faaliyet Optogenetic Manipülasyon Gerçek zamanlı ölçüm

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

Akut Hipokampal Dilimler içinde Synaptically-uyarılmış astroglial ve Nöronal Cevaplarının İkili Elektrofizyolojik Kayıtlar

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Genetic modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very powerful experimental approach. However, generating novel mouse mutants is often frustratingly slow. It has been shown that access to the mouse brain developing in utero with reasonable post-operatory survival is possible. Still, results with this procedure have been reported almost exclusively for the most superficial and easily accessible part of the developing brain, i.e. the cortex. The thalamus, a narrower and more medial region, has proven more difficult to target. Transfection into deeper nuclei, especially those of the hypothalamus, is perhaps the most challenging and therefore very few results have been reported. Here we demonstrate a procedure to target the entire hypothalamic neuroepithelium or part of it (hypothalamic regions) for transfection through electroporation. The keys to our approach are longer narcosis times, injection in the third ventricle, and appropriate kind and positioning of the electrodes. Additionally, we show results of targeting and subsequent histological analysis of the most recessed hypothalamic nucleus, the mammillary body.

Genetic Manipulation of the Mouse Developing Hypothalamus through In utero Electroporation

Despite the functional and medical importance of the hypothalamus, in utero genetic manipulation of its development has rarely been attempted. We show a detailed procedure for in utero electroporation into the mouse hypothalamus and show representative results of total and partial (regional) hypothalamic transfection.

Fare Genetik Manipülasyon yoluyla Hipotalamus geliştirilmesi<em&gt; Utero olarak</em&gt; Elektroporasyon

Genetic  modification of specific regions of the developing mammalian brain is a very  powerful experimental approach. However, generating novel mouse ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Serebellar Granül Nöronlar Genetik Manipülasyon<em&gt; In Vitro</em&gt; Ve<em&gt; In Vivo</em&gt; Nöronal morfoloji ve Göç Eğitim için

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as addition/removal of synapses, occur in an experience-dependent manner, providing the structural foundation of neuronal plasticity. As postsynaptic components of the most excitatory synapses in the cortex, dendritic spines are considered to be a good proxy of synapses. Taking advantages of mouse genetics and fluorescent labeling techniques, individual neurons and their synaptic structures can be labeled in the intact brain. Here we introduce a transcranial imaging protocol using two-photon laser scanning microscopy to follow fluorescently labeled postsynaptic dendritic spines over time in vivo. This protocol utilizes a thinned-skull preparation, which keeps the skull intact and avoids inflammatory effects caused by exposure of the meninges and the cortex. Therefore, images can be acquired immediately after surgery is performed. The experimental procedure can be performed repetitively over various time intervals ranging from hours to years. The application of this preparation can also be expanded to investigate different cortical regions and layers, as well as other cell types, under physiological and pathological conditions.

Two-Photon in vivo Imaging of Dendritic Spines in the Mouse Cortex Using a Thinned-skull Preparation

Time-lapse imaging in the living animal provides valuable information on structural reorganization in the intact brain. Here, we introduce a thinned-skull preparation that allows transcranial imaging of fluorescently labeled synaptic structures in the living mouse cortex by two-photon microscopy.

İki-Foton<em&gt; In vivo</em&gt; Bir inceltilmiş-kafatası Hazırlık kullanarak Fare Cortex dendritik dikenler Görüntüleme

In the mammalian cortex, neurons form extremely complicated networks and exchange information at synapses. Changes in synaptic strength, as well as ...