Riconosciamo che finanziamenti dal Consiglio europeo della ricerca (7 ° PQ/260916), Alexander von Humboldt-Stiftung (Sofja Kovalevskaja) e il Deutsche Forschungsgemeinschaft (DE1951 e SFB889).

Tutti gli esperimenti sugli animali descritti qui sono stati eseguiti in conformità con le linee guida per il benessere animale tedesco.
Nota: La linea temporale e i passaggi principali del protocollo sono illustrati nella Figura 1.
1. preparati
<ol><li>
Preparare le seguenti soluzioni.
	<ol>
<li>Preparare DMEM + per la coltura di astrociti MD poligonali: DMEM con 10% FCS, 100 U penicillina e 100 µ g/mL di streptomicina.</li>
		<li>Preparare NB + H per la coltura di astrociti stellari: neurobasal medio con 5 ng/mL HBEGF, 1x supplemento B-27, integratore di glutammina x 1, 100 U penicillina e 100 µ g/mL di streptomicina. Nota: Le aliquote di più alte concentrazioni di HBEGF possono essere preparate e conservate a-20 ° C per essere aggiunto al mezzo quando necessario.</li>
		<li>Preparare il supporto di dissezione (10 mM HEPES in HBSS).</li>
		<li>Preparare aliquote di 6-7 mL di tripsina-EDTA 0,05% e 6-7 mL 0,25% tripsina-EDTA in provette da 15 mL. Questi possono essere conservati a-20 ° C e scongelati a bagnomaria a 37 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Il giorno prima di iniziare il protocollo, cappotto piatti di coltura del tessuto-trattati di 10 cm con 5 mL di 0,04% polyethylenimine (PEI) ogni.</li>
	<li>Il giorno successivo, rimuovere il PEI e lavare i piatti con acqua deionizzata, distillata due volte. Aggiungere 12 mL di DMEM + ad ogni piatto e pre-equilibrare nell'incubatore a 37 ° C e 5% CO2 per almeno 30 min prima celle di placcatura.</li>
	<li>Preparare l'area di dissezione: In una cappa a flusso laminare dissezione, posizionare due 10cm di Petri riempito con il mezzo di dissezione su ghiaccio. Per ogni area del cervello ad essere isolato (ad es., corteccia, ippocampo), preparare un 15-tubo riempito di 14 mL liquido di dissezione e tenere sul ghiaccio. Spray strumenti di dissezione (forbice, Dumont #3 e #5 pinze) con etanolo al 70% e posto accanto al microscopio di dissezione nella cappa.</li>
</ol>2. rat o dissezione del cervello del Mouse
Nota: Entrambi i topi e ratti possono essere utilizzati. Gli animali più vecchi di P8 possono anche essere utilizzati (abbiamo testato fino a P12), ma rimuovendo le meningi diventerà sempre più difficile. Inoltre, il rendimento delle celle e salute diminuirà, poiché le cellule cerebrali da più vecchi animali avranno formato intricati processi e connessioni che possono rompersi durante la dissociazione del tessuto, che conduce alla morte aumentata delle cellule. Corticale preparazioni sono descritte qui, ma possono essere utilizzati anche altre regioni del cervello.
<ol><li>Posto 0.05% tripsina-EDTA in bagnomaria a 37 ° C.</li>
	<li>Eutanasia di animali (ratti incinti per E19 cuccioli o animali di P0-P8) alzando lentamente la concentrazione di CO2 e isolare i cervelli. La procedura seguente richiede una tecnica sterile.</li>
	<li>
Se lavora con tessuto embrionale, innanzitutto rimuovere gli embrioni dall'utero e aprire i sacchi embrionali, quindi immediatamente tagliato le teste con le forbici. Quando tutti i capi sono tagliati fuori, trasferirli nel mezzo di dissezione pre-raffreddata.
	<ol>
<li>Una volta che le teste sono sommersi nel mezzo, aprire il cranio (entrambi sono molto morbidi in animali giovani) e pelle con forcipe e pizzico fuori il cervelletto. Leva con attenzione il resto del cervello fuori dal cranio. Nota: Due-quattro E19 embrioni resa abbastanza tessuto per almeno otto piatti di 10cm di astrociti corticali placcati a 500.000 cellule per piatto del giorno di dissezione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Per i cuccioli appena nati o più anziani, tagliare le teste con le forbici e isolare i cervelli di medialmente tagliando la pelle in linea retta dalla parte posteriore della testa fino alla punta del naso. Tirare la pelle da parte e accuratamente tagliata il cranio sinistra e destra, poi ascensore le ossa fino. Tagliare il cervelletto, e leva il resto del cervello fuori dal cranio. Nota: Due o tre cuccioli di P0-P8 resa abbastanza tessuto per almeno otto piatti di 10cm di astrociti corticali placcati a 500.000 cellule per piatto del giorno di dissezione.</li>
	<li>Separare la corteccia dalla struttura sottostante del midbrain. Collocare la pinza entro la fessura longitudinale tra gli emisferi, quindi spostare la pinza tra le strutture del midbrain corteccia di un emisfero (perpendicolare alla fenditura longitudinale) pizzicare ogni emisfero gratis.</li>
	<li>Utilizzando le pinze, rimuovere tutte le meningi da ogni emisfero (e l'ippocampo), quindi separare ippocampi. Se gli astrociti ippocampali sono necessari, è possibile spostare ogni ippocampo in una provetta da 15 mL riempita con 14 mL di terreno di dissezione su ghiaccio.</li>
	<li>Rimuovere ulteriori aree dalla corteccia di ciascun emisfero se regioni specifiche sono necessari (ad es., corteccia frontale). Tagliare qualsiasi tessuto corticale da utilizzare per la generazione di astrociti in pezzi non più grande di 1 mm3. Raccogliere tutti i pezzi di tessuto corticale in un tubo separato 15 mL riempito con il mezzo di dissezione su ghiaccio.</li>
</ol>3. tessuto digestione e dissociazione
<ol><li>Una volta che tutti i pezzi di tessuto sono raccolti, attendere per loro di stabilirsi sul fondo del tubo, quindi aspirare tanto supporto, per quanto possibile.</li>
	<li>Aggiungere 2-3 mL di tripsina EDTA 0,05% utilizzando una pipetta sierologica e incubare le provette in bagnomaria a 37 ° C per 20 min. Nota: Rilasciare tutti tripsina-EDTA dalla pipetta a mescolare i pezzi di tessuto e permettono di depositare ancora rapidamente.</li>
	<li>Aspirare accuratamente la tripsina-EDTA, lasciando pezzi di tessuto in come poco liquido possibile, nella parte inferiore del tubo.</li>
	<li>Aggiungere 5 mL di mezzo di dissezione pre-raffreddata per lavare via il restante tripsina-EDTA. Pipettare al lato della parte superiore del tubo per ottenere i pezzi di tessuto di miscelazione.</li>
	<li>Aspirare il mezzo di dissezione e lasciare i pezzi di tessuto in come poco liquido possibile. Ripetere questo passaggio di lavaggio con il mezzo di dissezione pre-raffreddata altre due volte.</li>
	<li>Dopo il lavaggio finale, aggiungere 1 mL di DMEM + (riscaldato a temperatura ambiente) utilizzando un puntale di 1.000 µ l e triturare il tessuto pipettando su e giù senza introdurre bolle. Nota: È importante evitare la produzione di bolle, come questo può cambiare il pH della soluzione, a cui gli astrociti sono molto sensibili.</li>
	<li>Collocare un colino di cella di 100 µm nell'apertura di un tubo da 50 mL e pre-bagnato il filtro con 4,5 mL di pre-raffreddata DMEM +.</li>
	<li>Pipettare 1 mL di sospensione di tessuto dissociata sul filtro cella e aggiungere un altro 4,5 mL pre-raffreddato DMEM + per lavare le cellule attraverso il filtro delle cellule.</li>
</ol>4. cellula placcatura per arricchimento di astrociti di passaggio
<ol><li>Contare le celle, ad esempio, da diluire 10 µ l della sospensione delle cellule con 10 µ l di blu di trypan e pipettaggio il mix su un emocitometro.</li>
	<li>Piastra di 500.000 cellule in 12 mL DMEM + per ogni piatto di 10 cm. Nota: DMEM + è utile per la crescita astrocytic, tanto più rispetto per i neuroni o microglia. Durante l'agitazione, le forze fisiche che agiscono sulle lamelle di vetro all'interno di pozzi sono molto più forti di quelli che agiscono sui piatti 10 cm (senza lamelle). Se le cellule sono scossi su piastre da 24 pozzetti, diventano insalubri o morire. Solo piastra astrociti su piastre da 24 pozzetti dopo l'agitazione.</li>
	<li>Mantenere colture cellulari nell'incubatore a 37 ° C e 5% CO2 per sette giorni.</li>
	<li>Il giorno 6, il giorno prima agitazione e passaggio di cellule, preparare le piastre rivestite con PEI cultura come descritto nel passaggio 5.</li>
</ol>5. cellule di passaggio
<ol><li>
Il giorno prima di passaggio, cappotto piastre per colture cellulari con 0,04% PEI.
	<ol>
<li>Per immunocitochimica, trasduzione virale o trasfezione di plasmide, utilizzare piastre 24 pozzetti o 6 pozzetti (ciascuno contenente un sterilizzato 12 mm o 25 mm vetrino coprioggetti, rispettivamente).</li>
		<li>Sterilizzare le lamelle di vetro tramite incubazione in etanolo al 70% per almeno 1 h, quindi lavare tre volte in acqua deionizzata, distillata prima di mettere i coprioggetti nei pozzetti.</li>
		<li>Aggiungere almeno 70 µ l 0,04% PEI al vetrino coprioggetti 12mm in piastre da 24 pozzetti e 600 µ l 0,04% PEI al vetrino coprioggetti 25mm in piastre da 6 pozzetti.</li>
		<li>Per Western blot o l'analisi di RNA-Seq, i piatti di 10cm già contenente le celle dopo la dissezione possono continuare ad essere utilizzati. Piatti solo bisogno di essere scosso, quindi le cellule vengono lavate con PBS 1X e trattate con NB + H (non si trasferiscono a nuovi piatti).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Il giorno in vitro (DIV) 7 dopo la dissezione, collocare i piatti di 10 cm con cellule in DMEM + su un agitatore di laboratorio nell'incubatrice e scuotere i piatti a 110 giri/min per 6 h.</li>
	<li>Lavare il PEI da lamelle rivestite con acqua deionizzata, distillata due volte. Aggiungere mezzo NB + H alle piastre (500 µ l per pozzetto per piastre da 24 pozzetti e 2 mL per pozzetto per piastre da 6 pozzetti). Pre-equilibrare le piastre nell'incubatore a 37 ° C e 5% CO2 mentre tremano i piatti di 10 cm, o per almeno 30 min.</li>
	<li>20-30 min prima della fine dello scuotimento 6h, pre-riscaldare 1 x PBS, DMEM + NB + H e 0,25% tripsina-EDTA a 37 ° C nel bagno d'acqua.</li>
	<li>Dopo 6 h di agitazione, togliere i piatti di cultura shaker e sostituire immediatamente il mezzo (che contiene microglia, oligodendrociti e neuroni scosso-off) con 10 mL pre-riscaldati 1X PBS per ogni piatto. Nota: È importante aspirare immediatamente il vecchio mezzo contenente cellule indipendente per evitare le cellule non-astrocytic ricollegare.</li>
	<li>Rimuovere il PBS e aggiungere 3 mL pre-riscaldato tripsina-EDTA per ogni piatto. Incubare ogni piatto per 4 min in incubatore a 37 ° C e 5% CO2. Nota: Se la preparazione dei campioni per Western blot o RNA-Seq, non aggiungere tripsina-EDTA. Al contrario, sostituire il PBS con 12 mL pre-riscaldati NB + H, dopo di che culture possono essere posizionate indietro nell'incubatrice.</li>
	<li>Aggiungere 5 mL pre-riscaldato DMEM + per la tripsina-EDTA 3 mL in ogni piatto, dispensare le cellule fuori il piatto utilizzando una pipetta sierologica di 5ml e raccogliere la sospensione cellulare in una provetta da 50 mL. Nota: Pipetta direttamente dalla parte inferiore del piatto - il piano del piatto dovrebbe diventare più chiaro come staccano le cellule. Solo uso contenenti siero medio (al posto di DMEM +), come siero inattiva la tripsina.</li>
	<li>Centrifugare la sospensione cellulare a 3.220 x g a 20 ° C per 4 min.</li>
	<li>Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 1 mL pre-riscaldati NB + H.</li>
</ol>6. cella placcatura per finale Astrocyte culture
<ol><li>Contare le celle.</li>
	<li>Piastra di 20.000 cellule per pozzetto in piastre da 6 pozzetti (in 2 mL di terreno di NB + H per pozzetto) o 5000 cellule per pozzetto in piastre da 24 pozzetti (in media 500 di NB + H di µ l per pozzetto).</li>
	<li>Mantenere le colture di cellule nell'incubatore a 37 ° C e 5% CO2 fino ad ulteriore trattamento o analisi.</li>
	<li>Cambio di mezzo il mezzo una volta a settimana. Nota: In ambienti basso-sostanza nutriente, astrociti interrompere proliferano ma qualsiasi restante microglia prolifereranno (sebbene nella nostra esperienza, nessun microglia apparvero nelle culture AWESAM). Lo scambio mezza il mezzo una volta a settimana previene arricchimento di qualsiasi microglia potenzialmente rimanenti8, e le monocolture rimangano sane per almeno tre settimane.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Puschmann, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioactive+3D+cell+culture+system+minimizes+cellular+stress+and+maintains+the+in+vivo-like+morphological+complexity+of+astroglial+cells.">Bioactive 3D cell culture system minimizes cellular stress and maintains the in vivo-like morphological complexity of astroglial cells.</a> Glia. 61 (3), 432-440 (2013).</li><li>Puschmann, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HB-EGF+affects+astrocyte+morphology,+proliferation,+differentiation,+and+the+expression+of+intermediate+filament+proteins.">HB-EGF affects astrocyte morphology, proliferation, differentiation, and the expression of intermediate filament proteins.</a> J Neurochem. 128 (6), 878-889 (2014).</li><li>Foo, L. 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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Quattro passi all'interno del protocollo sono fondamentali: 1) preparare la concentrazione di HBEGF e precisamente 5 ng/mL, poiché piccoli aumenti nella concentrazione possono condurre a culture immature, ad esempio, 10 ng/mL HBEGF de-differenziare astrociti4; 2) evita bolle nelle soluzioni che contengono il tessuto o le cellule, che possono cambiare il pH e ostacolare la salute di astrociti; 3) pre-riequilibranti media per raggiungere il pH ottimale e la temperatura per la crescita sani astrociti; 4) scambio solo metà il mezzo una volta a settimana perché qualsiasi restante microglia sono meno propensi a proliferare quando nutrienti sufficienti sono presenti e il mezzo è regolarmente scambiate8 (anche se nessun microglia sono stati trovati nelle culture AWESAM finora). Per quest'ultimo punto, è importante notare che fattori Astrocita-derivati nell'ambito della cultura non dovrebbero essere rimosso completamente, come essi potrebbero supportare proliferazione, differenziazione e sopravvivenza astrocytic.
È importante utilizzare DIV14 o più vecchie colture come la fonte di astrociti maturo (ma per la procedura di trasduzione o trasfezione, culture precedenti possono essere utilizzate) perché gli astrociti più giovani di DIV14 hanno ancora potenziale delle cellule staminali neurali9. Per trasduzione virale, colture di neuroni e astrociti trasformati su DIV7 miste (utilizzando virus adeno-associati) in modo efficiente express viralmente trasdotte GFP10. Per la transfezione di plasmide, vengono spesso utilizzati gli astrociti DIV10-DIV24 e proteine etichettate fluoroforo imaged 2-5 giorni più tardi11. Nella nostra esperienza, sia trasduzione virale e la transfezione di plasmide funzionano meglio se gli astrociti vengono trasdotti tra DIV9 e DIV14. L'efficienza di trasfezione e trasduzione dipendono il costrutto e il metodo, ma troviamo che l'efficienza di trasfezione è ~ 20% nelle monocolture Astrocita usando lipofectamine transfezione ed efficienza di trasduzione virus adeno-associato (AAV) è ~ 90% ( Vedi il nostro precedente lavoro4 per ulteriori dettagli, ad esempio, costrutto utilizzato). Quando transducing astrociti con particelle AAV e trasfezione di lipofectamine, possiamo almeno 5 e 2 giorni, rispettivamente, per l'espressione del costrutto. Prima di trasduzione o trasfezione, gli astrociti dovrebbero anche poter recuperare per almeno un giorno dopo il passaggio.
Inoltre, quando punti di preparazione culture per il confronto di espressione di RNA/proteine in tempi diversi, culture possono essere placcate a quote differenziate per raggiungere simili quantità di materiale, ad es., monocolture Astrocita devono essere raccolte presso DIV7 e DIV21 possono essere placcato a densità di 1 x 106 e 500.000 cellule per ogni piatto di 10 cm, rispettivamente. Ad esempio, il rendimento di lisato di intera proteina sarà intorno a 0,5 mg/mL su DIV14 al momento della raccolta dopo il placcaggio inizialmente 500.000 astrociti AWESAM su un piatto di 10 cm.
Il protocollo AWESAM rappresenta un modo veloce, semplice e poco costoso per gli astrociti di cultura in isolamento da neuroni ma con in vivo-come le caratteristiche di RNA e l'espressione della proteina, morfologia e Ca2 + segnalazione4, che finora è fornito da nessun altro protocollo. Gli astrociti AWESAM possono essere utilizzati per le analisi che sono tipiche per gli studi della coltura delle cellule, compreso immunocytochemistry, immunoblotting, analisi di espressione di RNA, microscopia TIRF e Ca2 + imaging4. In particolare, i recenti progressi in codificato geneticamente indicatori di Ca2 + consentono per la visualizzazione di processi astrocitari bene in maggiore dettaglio rispetto classica Ca2 + coloranti14. Segnalazione di CA2 + , assorbimento vescicolare ed esocitosi in processi astrocitari sottili e spessi è fisiologicamente rilevante, in quanto questi processi possono influenzare la funzione del cervello in termini di supporto trofico, flusso sanguigno, segnalazione sinaptica e plasticità, e comunicazione intercellulare. Il protocollo di AWESAM consente per lo studio dei processi astrocitari bene pertinenti per cervello fisiologia15 e malattia16,17, senza interferenze neuronali e con la grande accessibilità che in vitro forniture di cultura.

Astrociti influenzano la funzione del cervello attraverso supporto trofico, flusso sanguigno, segnalazione sinaptica e plasticità e comunicazione intercellulare - che sono tutti meccanismi che centro attorno i processi astrocitari sottili. Il protocollo AWESAM descritto qui permette lo studio di questi processi senza interferenze da parte di neuroni e glia altri, che è utile per esempio, perché l'espressione di molte proteine e anche di Ca2 + segnalazione si sovrappongono in tutto cellula cerebrale diversa tipi. Inoltre, questo metodo supera i limiti delle tecniche precedentemente disponibili. In particolare, il nostro protocollo prevede in vivo-come morfologia (astrociti stellari con sottili processi) e l'espressione genica in un veloce, facile e modo a buon mercato.
Morfologia delle cellule, espressione genica e molti altri processi normativi sono direttamente influenzati dall'ambiente. In una piastra di coltura, si riferisce a fattori rilasciati dalle cellule circostanti, ma anche il mezzo in cui le cellule sono cresciute. Per gli astrociti, HBEGF precedentemente è stata segnalata per indurre una morfologia stellari1 ma è stato anche trovato per-differenziare gli astrociti2. Tuttavia, concentrazioni più basse di HBEGF più successivamente sono state utilizzate per la generazione di più nel vivo-come astrociti come identificato tramite sequenziamento di RNA in due differenti protocolli3,4. Inoltre, la morfologia del astrocyte cambia con la composizione media, indipendentemente dal protocollo4: Neurobasal medio con una bassa concentrazione di HBEGF è ottima per la coltivazione di astrociti stellari, mentre altre composizioni medie (ad es., contenenti siero DMEM) produrre cellule poligonali (anche negli astrociti appena isolati di immunopanning).
Il protocollo AWESAM sormonta gli svantaggi delle precedenti tecniche per la coltivazione del astrocyte monocolture4. Tecniche precedenti per la coltivazione di monocolture Astrocita presentano i seguenti svantaggi: morfologia poligonale, che è inconsueta che gli astrociti stellari in vivo (MD metodo)5; la lunghezza e il costo del protocollo (preparazione astrociti da prende le cellule staminali pluripotenti indotte tre mesi e richiede molti reagenti, compresi costosi fattori di crescita)6; la bassa quantità di materiale (metodo immunopanning)3; e la de-differenziazione degli astrociti e requisito di una matrice 3D (Puschmann et al.) 1 , 2. al contrario, fornisce il protocollo AWESAM: in vivo-come la morfologia (astrociti stellari con sottili processi); un veloce, facile e a buon mercato metodo; grandi quantità di materiale; e di più nel vivo-come espressione genica rispetto a immunopanned e astrociti di MD. Inoltre, cultura 2D consente lo studio di segnalazione di Ca2 + e riciclaggio in sottili processi e in eventi vicino la membrana della vescicola (ad es., microscopia TIRF non è possibile in 3D culture).
Il metodo di MD è stato ampiamente utilizzato dalla sua pubblicazione nel 19805, che offre una tecnica semplice e veloce per monocolture Astrocita poligonale. In breve, il metodo di MD comporta crescita cellule cerebrali misto nel siero fetale di vitello (FCS)-contenente DMEM, seguita da agitazione passaggi che arricchiscono per gli astrociti (come tutte le altre cellule di cervello tipi staccano dal piatto) e ulteriormente cultura sullo stesso supporto. DMEM completate con FCS è utilizzato per molti altri tipi di cellule, che vanno dai fibroblasti e adipociti a linee cellulari tumorali differenti, tutti condividono la morfologia poligonale esibita da astrociti MD nella cultura. Fino al primi anni 20007, piccolo pensiero era stato rilasciato ai media su misura per gli astrociti, in particolare per favorire la loro tipica morfologia stellare trovato in vivo. Un protocollo pubblicato nel 2011 raggiungere tale morfologia stellare: chiamato il metodo immunopanning, impiega medium senza siero, ottimizzato per la coltura di astrociti3. Utilizzando questo metodo, le cellule cerebrali di recente isolate sono esposti a una serie di piatti rivestiti con anticorpi destinati a proteine di superficie delle cellule di tipo-specific cella, per arricchire per gli astrociti. Nonostante il più in vivo-come profilo di morfologia ed espressione dei astrocytes immunopanned, la maggior parte degli studi in vitro si basa ancora sul metodo Astrocita MD. Il metodo di MD è semplice e veloce, mentre il metodo di immunopanning comprende più lunghe e complesse fasi il primo giorno della cultura (ad esempio lunghi periodi di digestione degli enzimi, attenta stratificazione delle soluzioni di diversa densità, immunopanning stesso, e diversi centrifugazione passi - tutto prima di placcatura). Tuttavia, utilizzando il mezzo più specializzato, il metodo AWESAM offre sia la velocità del metodo MD e lo in vivo-come la morfologia del protocollo immunopanning.
Nel complesso, il protocollo AWESAM è utile per studiare più in vivo-come astrociti in 2D monocolture isolate da neuroni e glia altri (come precedentemente caratterizzati4 immunostainings, immunoblots e sequenziamento di RNA). Esso consente lo studio dei processi astrocitari sottili e fornisce grande accessibilità per la visualizzazione di Ca2 + segnalazione spontanea ed eventi vicino la membrana (ad es., ripreso da microscopia TIRF).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="898">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">0.05% trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:171px;">Gibco</td>
			<td style="width:344px;">25300054</td>
			<td style="width:167px;">warm in 37 &#186;C waterbath before use</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">0.25% trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>warm in 37 &#186;C waterbath before use</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">B-27 supplement</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>50X stock</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Glutamax</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>100X stock</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Penicillin / streptomycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15070-063</td>
			<td>50 stock; penicillin: 5000 U/ml; streptomycin: 5000 &#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Neurobasal medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21103049</td>
			<td>without L-glutamine</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>41966029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HBEGF</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>4643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14170112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">FCS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10437028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10010049</td>
			<td>1X</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">100 &#956;m nylon cell strainer</td>
			<td>BD</td>
			<td style="width:344px;">352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trypan Blue</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8154&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Cell culture incubator</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>Hera Cell 240i cell culture incubator</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Laboratory shaker</td>
			<td>Heidolph</td>
			<td>Rotamax 120&#160;</td>
			<td>use inside cell culture incubator</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810 R&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culturing in vivo-like murine astrocytes using the fast, simple, and inexpensive awesam protocol

Il AWESAM (un low-costo easy stellate unstrocyte metodo) protocollo comporta un modo veloce, semplice e poco costoso per generare grandi quantità di in vivo-piace monocolture di astrociti di topo e di ratto : Le cellule cerebrali possono essere isolate da diverse regioni del cervello, e dopo una settimana di coltura delle cellule, cellule non-astrocytic sono scrollate di dosso inserendo i piatti di cultura su un agitatore per 6 h nell'incubatrice. Gli astrociti rimanenti sono quindi attraversati in nuove piastre con un mezzo di Astrocita-specifici (chiamato NB + H). NB + H contiene basse concentrazioni di eparina-legante EGF-like growth factor (HBEGF), che viene utilizzato al posto del siero in mezzo. Dopo essere cresciuto in NB + H, gli astrociti AWESAM hanno una morfologia stellare e processi impercettibili e funzionalità. Inoltre, questi astrociti hanno più in vivo-come l'espressione genica di astrociti generati dai metodi precedentemente pubblicati. CA2 + imaging, dinamiche della vescicola e altri eventi vicino la membrana possono essere studiati così nello bene processi astrocytic in vitro, ad esempio, utilizzando cellule vive confocale o microscopia TIRF. In particolare, gli astrociti AWESAM inoltre esibiscono spontanea Ca2 + segnalazione simile a astrociti in vivo.

Gli astrociti che sono co-coltivati con i neuroni e sviluppati in NB + medium appaiono stellari dopo 2 settimane di cultura (Figura 2). Oltre a NB + medio, gli astrociti co-coltivati sono anche esposti a fattori sconosciuti del neurone-derivato che probabilmente contribuiscono alla loro sopravvivenza e la morfologia. Al contrario, gli astrociti MD coltivati in DMEM + come monocolture (dopo aver agitato fuori altri tipi di cella prima del passaggio) appaiono poligonali dopo 2 settimane. Gli astrociti AWESAM coltivati in NB + H dopo l'agitazione, appaiono stellari con molti processi bene dopo 2 settimane di cultura.
Precedentemente abbiamo mostrato che il profilo di espressione di RNA dei astrocytes AWESAM è più vicino a quella di astrociti in vivo rispetto ai astrocytes MD e immunopanned4. In termini di espressione della proteina Astrocita-specifici, astrociti corticali esprimono alti livelli di ALDH1L1 e bassi livelli di GFAP in vivo12. Questo vale anche per gli astrociti AWESAM e immunostaining di ALDH1L1, come un enzima citoplasmatico, rivela dettagli più precisi rispetto alla proteina del citoscheletro GFAP (Figura 2B).
A parte l'espressione di RNA e proteine, astrociti in vivo mostrano spontanea Ca2 + (cioè, senza stimolazione esterna) di segnalazione, ma poligonale MD astrociti in vitro spesso richiedono la stimolazione a suscitare Ca2 + segnalazione, per esempio, con l'aggiunta di ATP o glutammato. Gli astrociti AWESAM esibiscono spontanea Ca2 + segnalazione in vivo, in corpi cellulari e processi impercettibili, che possono essere visualizzati da viralmente transducing cellule con il targeting per membrana Lck-GCaMP3 (Figura 3). Spontanee ondate di Ca2 + in tutto gli astrociti adiacenti anche verificano (Figura 3A). Astrocitari Ca2 + (Figura 3B) di segnalazione in microdomini e processi impercettibili possono essere analizzati usando freeware specifico di astrociti13.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56092/56092fig1.jpg"> Figura 1 : Protocollo timeline. Una linea temporale che mostra i passaggi principali del protocollo AWESAM, compreso il tempo necessario per eseguire queste operazioni su DIV0 (giorno della dissezione), DIV7 (giorno del passaggio) e cosa aspettarsi in momenti successivi. Casella verde illustra quando cellule possono essere raccolto come astrociti stellari, dove più leggero rispetto a tonalità più scure rappresentano meno contro più complessa morfologia stellare e maturità, rispettivamente. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56092/56092fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56092/56092fig2v3.jpg"> Figura 2 : Medium determina morfologia. Schema (A) mostrando come morfologia Astrocita cambia quando co-coltivate con neuroni (come descritto in precedenza4) vs coltivata come monocolture e, a seconda del mezzo. Astrocita-specifica colorazione con contorni GFAP la morfologia stellare in co-colture e astrociti AWESAM e la morfologia poligonale negli astrociti MD. (B), GFAP etichette astrociti MD più fortemente di ALDH1L1 e ALDH1L1 (ma non GFAP) delinea i processi impercettibili degli astrociti AWESAM. Né monocoltura Astrocita esibisce il marcatore neuronale MAP2. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56092/56092fig2v3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56092/56092fig3.jpg"> Figura 3 : Spontanea Ca2 + segnalazione negli astrociti. (A) AWESAM GCaMP-trasdotte astrociti espositivo spontanea Ca2 + eventi tutto reti di astrociti, compresi nei processi sottili (frecce). Un'onda di Ca2 + viaggia attraverso diversi astrociti da sinistra a destra in immagini da punti di tempo distinti, dove colore chiaro raffigura aree di alte concentrazioni di Ca2 + , e le aree nere rappresentano regioni extracellulari. Immagini sono state acquisite usando la microscopia confocal di cellule vive. (B) il Ca2 + concentrazioni cambiano nelle regioni color-coded in (A) nel corso del tempo, indicato come tracce di intensità di fluorescenza GCaMP che illustrano come Ca2 + segnalazione onda si diffonde attraverso diversi astrociti. <a href="//cloudflare-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/56092/56092fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

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Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

Il protocollo AWESAM descritto qui è ottimo per la coltura di astrociti murini in isolamento da altre cellule del cervello in modo veloce, semplice ed economica. Gli astrociti AWESAM esibiscono spontanea Ca2 + segnalazione, morfologia e gene expression profili simili a astrociti in vivo.

Coltura In Vivo-piace murini astrociti utilizzando il protocollo AWESAM veloce, semplice e poco costoso

The AWESAM (a low-cost easy stellate astrocyte method) protocol entails a fast, simple, and inexpensive way to generate large quantities of in vivo-like ...

culturing-vivo-like-murine-astrocytes-using-fast-simple-inexpensive

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Culturing In Vivo-like Murine Astrocytes Using the Fast, Simple, and Inexpensive AWESAM Protocol

8.3K Views.  University of Oxford. Il protocollo AWESAM descritto qui è ottimo per la coltura di astrociti murini in isolamento da altre cellule del cervello in modo veloce, semplice ed economica. Gli astrociti AWESAM esibiscono spontanea Ca2 + segnalazione, morfologia e gene expression profili simili a astrociti in vivo.

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Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Veloce micro-ionoforesi di glutammato e GABA: un utile strumento per indagare l&#39;integrazione Synaptic

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

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Consensus Brain-derived Protein, Extraction Protocol for the Study of Human and Murine Brain Proteome Using Both 2D-DIGE and Mini 2DE Immunoblotting

Two-dimensional gel electrophoresis (2DE) is a powerful tool to uncover proteome modifications potentially related to different physiological or pathological conditions. Basically, this technique is based on the separation of proteins according to their isoelectric point in a first step, and secondly according to their molecular weights by SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). In this report an optimized sample preparation protocol for little amount of human post-mortem and mouse brain tissue is described. This method enables to perform both two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis (2D-DIGE) and mini 2DE immunoblotting. The combination of these approaches allows one to not only find new proteins and/or protein modifications in their expression thanks to its compatibility with mass spectrometry detection, but also a new insight into markers validation. Thus, mini-2DE coupled to western blotting permits to identify and validate post-translational modifications, proteins catabolism and provides a qualitative comparison among different conditions and/or treatments. Herein, we provide a method to study components of protein aggregates found in AD and Lewy body dementia such as the amyloid-beta peptide and the alpha-synuclein. Our method can thus be adapted for the analysis of the proteome and insoluble proteins extract from human brain tissue and mice models too. In parallel, it may provide useful information for the study of molecular and cellular pathways involved in neurodegenerative diseases as well as potential novel biomarkers and therapeutic targets.

A common protein extraction protocol using urea/thiourea/SDS buffer for human and mice brain tissue allows indentification of proteins by 2D-DIGE and their subsequent characterization by mini 2DE immunoblotting. This method enables one to obtain more reproducible and reliable results from human biopsies and experimental models.

Protein Consenso Brain-derived, estrazione protocollo per lo studio dei diritti dell&#39;uomo e murini Cervello Proteome Uso Sia 2D-DIGE e Mini 2DE Immunoblotting

Two-dimensional gel electrophoresis (2DE) is a powerful tool to uncover proteome modifications potentially related to different physiological or ...

A Simple and Inexpensive Method for Determining Cold Sensitivity and Adaptation in Mice

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life. The cold plantar assay allows the objective and inexpensive assessment of cold sensitivity in mice, and can quantify both analgesia and hypersensitivity. Mice are acclimated on a glass plate, and a compressed dry ice pellet is held against the glass surface underneath the hindpaw. The latency to withdrawal from the cooling glass is used as a measure of cold sensitivity.
Cold sensation is also important for survival in regions with seasonal temperature shifts, and in order to maintain sensitivity animals must be able to adjust their thermal response thresholds to match the ambient temperature. The Cold Plantar Assay (CPA) also allows the study of adaptation to changes in ambient temperature by testing the cold sensitivity of mice at temperatures ranging from 30 &#176;C to 5 &#176;C. Mice are acclimated as described above, but the glass plate is cooled to the desired starting temperature using aluminum boxes (or aluminum foil packets) filled with hot water, wet ice, or dry ice. The temperature of the plate is measured at the center using a filament T-type thermocouple probe. Once the plate has reached the desired starting temperature, the animals are tested as described above.
This assay allows testing of mice at temperatures ranging from innocuous to noxious. The CPA yields unambiguous and consistent behavioral responses in uninjured mice and can be used to quantify both hypersensitivity and analgesia. This protocol describes how to use the CPA to measure cold hypersensitivity, analgesia, and adaptation in mice.

The Cold Plantar Assay (CPA) measures cold responsiveness between 30 &#176;C and 5 &#176;C, and can also measure cold adaptation. This protocol describes how to use the CPA to measure cold hypersensitivity, analgesia, and adaptation in mice.

Un metodo semplice e poco costoso per la determinazione fredda sensibilità e adattamento nei topi

Cold hypersensitivity is a serious clinical problem, affecting a broad subset of patients and causing significant decreases in quality of life.  The cold ...

Protocol for Three-dimensional Confocal Morphometric Analysis of Astrocytes

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify their functional and structural properties, a condition called reactive astrogliosis. Here, a protocol for assessment of the morphological properties of astrocytes is presented. This protocol includes quantification of 12 different parameters i.e. the surface area and volume of the tissue covered by an astrocyte (astrocyte territory), the entire astrocyte including branches, cell body, and nucleus, as well as total length and number of branches, the intensity of fluorescence immunoreactivity of antibodies used for astrocyte detection, and astrocyte density (number/1,000 &#181;m2). For this purpose three-dimensional (3D) confocal microscopic images were created, and 3D image analysis software such as Volocity 6.3 was used for measurements. Rat brain tissue exposed to amyloid beta1-40 (A&#946;1-40) with or without a therapeutic&#160;intervention was used to present the method. This protocol can also be used for 3D morphometric analysis of other cells from either in vivo or in vitro conditions.

Astrocytes in the CNS change their functional and structural properties in response to harmful stimuli. This report presents a protocol for assessment of three-dimensional astrocyte morphology in diseased conditions or after therapeutic interventions.

Protocollo per tridimensionale confocale morfometrica Analisi di astrociti

As glial cells in the brain, astrocytes have diverse functional roles in the central nervous system. In the presence of harmful stimuli, astrocytes modify ...

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We demonstrate a simple way to tap into the fly reward system, modify experiences related to natural reward, and use voluntary ethanol consumption as a measure for changes in reward states. The approach serves as a relevant tool to study the neurons and genes that play a role in experience-mediated changes of internal state. The protocol is composed of two discrete parts: exposing the flies to rewarding and nonrewarding experiences, and assaying voluntary ethanol consumption as a measure of the motivation to obtain a drug reward. The two parts can be used independently to induce the modulation of experience as an initial step for further downstream assays or as an independent two-choice feeding assay, respectively. The protocol does not require a complicated setup and can therefore be applied in any laboratory with basic fly culture tools.

A Simple Way to Measure Alterations in Reward-seeking Behavior Using Drosophila melanogaster

We describe a protocol for inducing rewarding and nonrewarding experiences in fruit flies (Drosophila melanogaster) using voluntary ethanol consumption as a measure for changes in reward states.

Un modo semplice per misurare alterazioni in ricompensa il comportamento di ricerca Utilizzando<em&gt; Drosophila melanogaster</em

We describe a protocol for measuring ethanol self-administration in fruit flies (Drosophila melanogaster) as a proxy for changes in reward states. We ...

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the molecular and cellular basis of higher brain functions. A whole-mount preparation of adult brains with well-preserved morphology is critical for such whole brain-based studies, but can be technically challenging and time-consuming. This protocol describes an easy-to-learn, one-step dissection approach of an adult fly head in less than 10 s, while keeping the intact brain attached to the rest of the body to facilitate subsequent processing steps. The procedure helps remove most of the eye and tracheal tissues normally associated with the brain that can interfere with the later imaging step, and also places less demand on the quality of the dissecting forceps. Additionally, we describe a simple method that allows convenient flipping of the mounted brain samples on a coverslip, which is important for imaging both sides of the brains with similar signal intensity and quality. As an example of the protocol, we present an analysis of dopaminergic (DA) neurons in adult brains of WT (w1118) flies. The high efficacy of the dissection method makes it particularly useful for large-scale adult brain-based studies in Drosophila.

A Simple One-step Dissection Protocol for Whole-mount Preparation of Adult Drosophila Brains

The adult Drosophila brain is a valuable system for studying neuronal circuitry, higher brain functions, and complex disorders. An efficient method to dissect whole brain tissue from the small fly head will facilitate brain-based studies. Here we describe a simple, one-step dissection protocol of adult brains with well-preserved morphology.

Un semplice passo-dissezione Protocollo per tutto il montaggio Preparazione per adulti<em&gt; Drosophila</em&gt; Brains

There is an increasing interest in using Drosophila to model human brain degenerative diseases, map neuronal circuitries in adult brains, and study the ...

Analyzing the Size, Shape, and Directionality of Networks of Coupled Astrocytes

It has become increasingly clear that astrocytes modulate neuronal function not only at the synaptic and single-cell levels, but also at the network level. Astrocytes are strongly connected to each other through gap junctions and coupling through these junctions is dynamic and highly regulated. An emerging concept is that astrocytic functions are specialized and adapted to the functions of the neuronal circuit with which they are associated. Therefore, methods to measure various parameters of astrocytic networks are needed to better describe the rules governing their communication and coupling and to further understand their functions.
Here, using the image analysis software (e.g., ImageJFIJI), we describe a method to analyze confocal images of astrocytic networks revealed by dye-coupling. These methods allow for 1) an automated and unbiased detection of labeled cells, 2) calculation of the size of the network, 3) computation of the preferential orientation of dye spread within the network, and 4) repositioning of the network within the area of interest.
This analysis can be used to characterize astrocytic networks of a particular area, compare networks of different areas associated to different functions, or compare networks obtained under different conditions that have different effects on coupling. These observations may lead to important functional considerations. For instance, we analyze the astrocytic networks of a trigeminal nucleus, where we have previously shown that astrocytic coupling is essential for the ability of neurons to switch their firing patterns from tonic to rhythmic bursting1. By measuring the size, confinement, and preferential orientation of astrocytic networks in this nucleus, we can build hypotheses about functional domains that they circumscribe. Several studies suggest that several other brain areas, including the barrel cortex, lateral superior olive, olfactory glomeruli, and sensory nuclei in the thalamus and visual cortex, to name a few, may benefit from a similar analysis.

Here we present a protocol to assess the organization of astrocytic networks. The described method minimizes bias to provide descriptive measures of these networks such as cell count, size, area, and position within a nucleus. Anisotropy is assessed with a vectorial analysis.

Analizzando le dimensioni, la forma e la direzionalità delle reti dei Astrocytes accoppiato

It has become increasingly clear that astrocytes modulate neuronal function not only at the synaptic and single-cell levels, but also at the network ...

An Emerging Target Paradigm to Evoke Fast Visuomotor Responses on Human Upper Limb Muscles

To reach towards a seen object, visual information has to be transformed into motor commands. Visual information such as the object&#8217;s color, shape, and size are processed and integrated within numerous brain areas, then ultimately relayed to the motor periphery. In some instances, a reaction is needed as fast as possible. These fast visuomotor transformations, and their underlying neurological substrates, are poorly understood in humans as they have lacked a reliable biomarker. Stimulus-locked responses (SLRs) are short latency (&#60;100 ms) bursts of electromyographic (EMG) activity representing the first wave of muscle recruitment influenced by visual stimulus presentation. SLRs provide a quantifiable output of rapid visuomotor transformations, but SLRs have not been consistently observed in all subjects in past studies. Here we describe a new, behavioral paradigm featuring the sudden emergence of a moving target below an obstacle that consistently evokes robust SLRs. Human participants generated visually guided reaches toward or away from the emerging target using a robotic manipulandum while surface electrodes recorded EMG activity from the pectoralis major muscle. In comparison to previous studies that investigated SLRs using static stimuli, the SLRs evoked with this emerging target paradigm were larger, evolved earlier, and were present in all participants. Reach reaction times (RTs) were also expedited in the emerging target paradigm. This paradigm affords numerous opportunities for modification that could permit systematic study of the impact of various sensory, cognitive, and motor manipulations on fast visuomotor responses. Overall, our results demonstrate that an emerging target paradigm is capable of consistently and robustly evoking activity within a fast visuomotor system.

Presented here is a behavioral paradigm that elicits robust fast visuomotor responses on human upper limb muscles during visually guided reaches.

Un paradigma bersaglio emergente per evocare risposte visuomotor veloci sui muscoli degli arti superiori umani

To reach towards a seen object, visual information has to be transformed into motor commands. Visual information such as the object&#8217;s color, shape, ...

In vitro Modeling for Neurological Diseases using Direct Conversion from Fibroblasts to Neuronal Progenitor Cells and Differentiation into Astrocytes

Research on neurological disorders focuses primarily on the impact of neurons on disease mechanisms. Limited availability of animal models severely impacts the study of cell type specific contributions to disease. Moreover, animal models usually do not reflect variability in mutations and disease courses seen in human patients. Reprogramming methods for generation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) have revolutionized patient specific research and created valuable tools for studying disease mechanisms. However, iPSC technology has disadvantages such as time, labor commitment, clonal selectivity and loss of epigenetic markers. Recent modifications of these methods allow more direct generation of cell lineages or specific cell types, bypassing clonal isolation or a pluripotent stem cell state. We have developed a rapid direct conversion method to generate induced Neuronal Progenitor Cells (iNPCs) from skin fibroblasts utilizing retroviral vectors in combination with neuralizing media. The iNPCs can be differentiated into neurons (iNs) oligodendrocytes (iOs) and astrocytes (iAs). iAs production facilitates rapid drug and disease mechanism testing as differentiation from iNPCs only takes 5 days. Moreover, iAs are easy to work with and are generated in pure populations at large numbers. We developed a highly reproducible co-culture assay using mouse GFP+ neurons and patient derived iAs to evaluate potential therapeutic strategies for numerous neurological and neurodegenerative disorders. Importantly, the iA assays are scalable to 384-well format facilitating the evaluation of multiple small molecules in one plate. This approach allows simultaneous therapeutic evaluation of multiple patient cell lines with diverse genetic background. Easy production and storage of iAs and capacity to screen multiple compounds in one assay renders this methodology adaptable for personalized medicine.

We describe a protocol to reprogram human skin-derived fibroblasts into induced Neuronal Progenitor Cells (iNPCs), and their subsequent differentiation into induced Astrocytes (iAs). This method leads to fast and reproducible generation of iNPCs and iAs in large quantities.

Modellazione in vitro per malattie neurologiche utilizzando la conversione diretta dai fibroblasti alle cellule progenitrici neuronali e la differenziazione in astrociti

Research on neurological disorders focuses primarily on the impact of neurons on disease mechanisms. Limited availability of animal models severely ...

Imaging Mitochondrial Ca2+ Uptake in Astrocytes and Neurons using Genetically Encoded Ca2+ Indicators (GECIs)

Mitochondrial Ca2+ plays a critical role in controlling cytosolic Ca2+ buffering, energy metabolism, and cellular signal transduction. Overloading of mitochondrial Ca2+ contributes to various pathological conditions, including neurodegeneration and apoptotic cell death in neurological diseases. Here we present a cell-type specific and mitochondria targeting molecular approach for mitochondrial Ca2+ imaging in astrocytes and neurons in vitro and in vivo. We constructed DNA plasmids encoding mitochondria-targeting genetically encoded Ca2+ indicators (GECIs) GCaMP5G or GCaMP6s (GCaMP5G/6s) with astrocyte- and neuron-specific promoters gfaABC1D and CaMKII and mitochondria-targeting sequence (mito-). For in vitro mitochondrial Ca2+ imaging, the plasmids were transfected in cultured astrocytes and neurons to express GCaMP5G/6s. For in vivo mitochondrial Ca2+ imaging, adeno-associated viral vectors (AAVs) were prepared and injected into the mouse brains to express GCaMP5G/6s in mitochondria in astrocytes and neurons. Our approach provides a useful means to image mitochondrial Ca2+ dynamics in astrocytes and neurons to study the relationship between cytosolic and mitochondrial Ca2+ signaling, as well as astrocyte-neuron interactions.

Imaging Mitochondrial Ca2+ Uptake in Astrocytes and Neurons using Genetically Encoded Ca2+ Indicators GECIs

This proctocol aims to provide a method for in vitro and in vivo mitochondrial Ca2+ imaging in astrocytes and neurons.

Imaging Dell'assorbimento mitocondriale di Ca2+ in astrociti e neuroni utilizzando indicatori Ca2+ geneticamente codificati (GECI)

Mitochondrial Ca2+ plays a critical role in controlling cytosolic Ca2+ buffering, energy metabolism, and cellular signal transduction. Overloading of ...