Bu eser mali Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Çin tarafından desteklenmiştir (hibe: 81522022, 51461165302). Yazarlar tüm Du laboratuvar üyeler genel yardım için kabul etmek istiyorum.

hayvan deneyleri takip sıkı protokol hayvan Etik Komitesi üzerinde merkezi Biyomedikal analizi, Tsinghua Üniversitesi tarafından onaylanmıştır. Etik Kurulu onayı altında insan yağ dokusu, bölümü, plastik cerrahi, Pekin Birliği hastaneden ile aydınlatılmış onam hastalardan elde edildi.
 1. fabrikasyon 3D Microcryogels <ol><li>Tasarım ve imalat microstencil dizi fiş <ol><li>Kullanım ticari yazılım tasarım diziler daire gibi belirli geometrileri için elipsler, üçgenler veya yonca 14, sonraki uygulamaya bağlı olarak. 
		Not: Bölüm 2 rejeneratif tıp Protokolü'nün şu anlamlara ve uyuşturucu taraması Sökülüp takılması için iletişim kuralının 3 bölüm.</li>
		<li>Tasarım lazer oyma makine eşlik eden yazılım oyma lazer alın. Lazer oyma makinesi için lazer ayarlarla fabrika öneriler göre lazer-basık Poli (methymethacrylate) (PMMA) üzerine alınan Tasarım sayfaları.</li>
		<li>Microstencil dizi cips lazer oyma Enkazı temizlemek için deiyonize su ile yıkayın. Aylardır cips 60 ° C. mağaza oda sıcaklığında mühürlü bir torba kuru microstencil dizi.</li>
	</ol></li> <li>Microcryogel dizi cips imalatı <ol><li>yer 4 microstencil dizi örnek tepsi üzerindeki fişlere ve plazma temizleyici yerleştirin. Süpürge kapıyı kapat ve vakum pompası 2 min için açmak, sonra en fazla RF (microstencil dizi cips plazma temizleyici 3 dk hydrophilicity artırmak için oda sıcaklığında tedavi etmek için 18 W) açın.</li>
		<li>Ekle 0,06 g jelatin 1 mL deiyonize su formuna için % 6 (wt/vol) jelatin öncü çözüm (5 chips için yeterli). Sıcak bir su banyosunda yeterli erimeye 60 ° C'de. 5 dakika süreyle buz üzerinde kuluçkaya</li>
		<li>Oxazolidin % 0,3 son bir konsantrasyon jelatin öncü çözüm içine eklemek 3 µL. İyice karıştırın.</li>
		<li>Oxazolidin microstencil dizi çip üst yüzeyinin pipet 200 µL öncü çözüm. 
		Not: 200 µL bir 75 mm × 25 mm yonga tasarım ne olursa olsun için yeterlidir. Artmak belgili tanımlık miktar orantılı olarak çip yüzey alanı arttı.</li>
		<li>El ile dağıtmak çözüm eşit çipi geri kazıma ve ileri bir bükülmüş cam çubuk ile 2-3 kat. 
		Not: Her mikro-şey microstencil çip ile öncü çözüm hidrofilik onların doğası gereği plazma tedaviden sonra dolu olabilir.</li>
		<li>Hemen cryogelation için 16 h için-20 ° C dondurucuda öncü çözüm dolu dizi çip yerleştirin.</li>
		<li>Ayarla-40 ° c 30 dakika süreyle lyophilizer lyophilizer cryogelation sonra dizi cips yerleştirin ve 2 h vakum dizi patatese lyophilize. 
		Not: buz lyophilizer cryogelation sublimes sırasında oluşan çünkü jelatin microcryogels birbirine bağlı macropores ile oluşurlar.</li>
		<li>Bölüm 2 kritik uzuv iskemi (CLI) tedavisinde ve yüksek-den geçerek uyuşturucu tarama için 3 bölüm için devam.</li>
	</ol></li></ol> 2. Form enjekte edilebilir 3D Microtissues için bireysel Microcryogels tedavi CLI için hasat <ol><li>hasat bireysel microcryogels <ol><li>Tasarım altında (75 mm × 25 mm), her biri 400 µm çapı, 600 çemberin içinde diziler ticari yazılım enjekte edilebilir 3D microtissue inşaat için. Microstencil dizi küçük parça imalatı ayrıntılı olarak açıklandığı Bölüm 1.1 olarak için 300 µm kalınlık PMMA kullanın.</li>
		<li>İmal microcryogel dizi fiş olarak bölümde 1.2.</li>
		<li>PDMS fırlatma Pin dizi adım 2.1.1 Standart yumuşak litografi 16 , tarafından 17 olduğu gibi aynı tasarımı ile imal.</li>
		<li>Microcryogel dizi çip üstünde tepe-in her microcryogel dizi üzerinde bir fırlatma iğne ile hizalama PDMS fırlatma Pin dizi yerleşimi. Microcryogel dizi çip PDMS fırlatma pin dizi bireysel microcryogels hasat için üzerinde microcryogels microwells çıkıntılı pimleri ile dışarı itmek için fırlatma pin dizi doğru basın.</li>
		<li>Microcryogel suya hasat ve hücre süzgeçler yardımıyla koleksiyon yapıyorum. Microcryogels (Yani, 600 microcryogels) bir küçük parça--dan toplamak için bir süzgeç kullanın.</li>
		<li>Yıkama microcryogels 0.1 M NaBH 4 buz herhangi bir uncross-bağlantılı aldehid kalıntı gidermek 20 dk için. 5 mL 0.1 M küçük parça başına NaBH 4 de kullanın. NaBH 4 atmak ve her zaman için 3-5 kez, 15 dk 5 mL deiyonize suyla yıka.</li>
		<li>Hücre süzgeç üzerinden su atın ve hücre süzgeç başına bir küme içine microcryogels toplamak ve tek bir küme bir 35 mm eğimli bir cımbız kullanarak kabında yer. 50-70 deiyonize µL her küme için su ve Petri kabına kapak kapak ekleyin. Böylece hiçbir microcryogels microcryogels monolayer Petri kabına yüzeyinde oluşturmak için başka bir microcryogel üstüne yalan Petri kabına seviyeye tüm microcryogels, dışarı masa üzerinde hafifçe dokunun.</li>
		<li>S (bkz. Adım 1.2.7) 2 için lyophilizing önce hasat microcryogels 4 ile 16 h için-20 ° C'de dondurmak. Microcryogels bir vakum oda sıcaklığında kadar daha fazla kullanılmasını depolamak.</li>
	</ol></li> <li>Microcryogels karakterizasyonu <ol><li>elektron mikroskobu (SEM) görüntüleme tarayarak microcryogels gözeneklerin değerlendirmek.
		<ol><li>Immobilize üzerine bir örnek sahibi tarafından çift taraflı yapışkan bant ve 90 için bir sputter coater altınla paltoyla hasat ve liyofilize microcryogels s, görüntüleme SEM 11 tarafından önce. Değerlendirmek ve yedi farklı SEM görüntüleri görüntü analiz yazılımı kullanarak microcryogel gözenek çapı dağılımı analiz.</li>
		</ol></li> <li>35-mm Petri kabına kurutulmuş jelatin microcryogels (GMs) ağırlığı için 600 liyofilize microcryogels oluşan bir küme tartın. 60 µL deiyonize su microcryogels liyofilize kümeye ekleyin ve 30 için bekleyin s tam olarak su emer ve güzel microcryogels için. Şişmiş microcryogels tartın.
		<ol><li>Belirleme denge şişme oranı ve microcryogels, gözeneklilik bu kurutulmuş jelatin microcryogels ve ağırlık microcryogels sulu microcryogels olan için yapılan su oranını şişmiş microcryogels ağırlığına oranı olarak, sırasıyla 13.</li>
		</ol></li> <li>Microcryogels dijital bir kuvvet ile entegre bir programlanabilir şırınga pompa kullanarak ölçü injectability ölçmek 14.
		Microcryogels Trypan tarafından <ol><li>leke 600 adet mavi ve homojen dağılımı elde etmek için 600 µL % 15 jelatin çözümde askıya alma. 1 mL microcryogel süspansiyon 1 mL şırınga yükleyin. Programlanabilir şırınga pompa akışı 1 mL/dk. hızında çalıştırarak 1 mL şırınga bağlı 27 lik bir iğne aracılığıyla karışımı enjekte</li>
			<li>Monitör gerçek zamanlı enjeksiyon kuvvet dijital güç tarafından test ölçmek ve kuvvet-zaman eğrisi çizmek. Enjeksiyon sonra microcryogels mikroskop altında bütünlüğünü gözlemlemek. 
			Not: % 15 (wt/vol) jelatin çözümde askıya GMs olabilir sorunsuz enjekte ve enjeksiyon sonra sağlam kaldı.</li>
		</ol></li> <li>Microcryogels çözünebilirlik karakterize.
		<ol><li>İlk olarak, bir küme içinde 35-mm Petri kabına kuru ağırlığı 600 liyofilize microcryogels ağırlığını ölçmek. O zaman, 600 liyofilize microcryogels 2 mL % 0,025 (vol/vol) tripsin/EDTA içinde kaybolmanızı.</li>
			<li>Toplamak microcryogels çözümden farklı zaman noktalarda bir hücre süzgeç kullanarak (örneğin, 10, 20, 30, 40, 50, 60 ve 70 dk). Wick bir doku ile dış görev aşırı çözüm. Microcryogels farklı zaman noktalarda ağırlığını ölçmek ve bozulma derecesi olarak microcryogel microcryogel zaman sıfır olan için belirli bir zaman noktasında ağırlığını oranını hesaplamak.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Autoloading hücre içine formu 3D microtissues için microcryogels <ol><li>microcryogels vac altında 12 h gaz giderme tarafından takip adım 2.1.8 etilen oksit sterilizasyon sistemi 12 h gaz pozlama ile tarafından Sterilizevardır.</li>
		<li>Fare iskemik hindlimb tedavisi için insan yağ kaynaklı Mezenkimal stromal hücreler (hMSCs) seçin. Aşağıdaki yordamlar tarafından izole hücreler daha önce bildirilen 18.</li>
		<li>Kültür hMSCs büyüme orta içeren % 2 fetal sığır serum (FBS), 10 -8 M deksametazon, 10 10 ng/mL epidermal büyüme faktörü (EGF), 10 ng/mL trombosit-türevi büyüme faktörü bb (PDGF-bb), 1 X insülin transferrin Selenyum (ITS) -4 M askorbik asit 2-fosfat, 100 U/mL penisilin ve DMEM/F12 100 µg/mL streptomisin. Senaryo Özeti oranı 1:3 konfluent ne zaman geçiş. Hücreleri geçiş 3-5 aşağıdaki deneylerde kullanın.</li>
		<li>Hasat tripsin ile hMSCs ve Fuchs-Rosenthal sayım odası kullanarak cep numarasını ölçmek ve 8 x 10 6 hücre/mL hMSCs büyüme orta yoğunluğunun resuspend.</li>
		2.1 bölümünden bir 35 mm tabak <li>pipet 60 µL hMSCs süspansiyon üzerine 600 microcryogels monolayer çapında 400 µm. Hücreleri otomatik olarak gözenekli mikro-yapıların microcryogels absorbe.</li>
		<li>Oksijen odasında koru ve hücreleri eklemek izin vermek 2 h 37 ° C'de kuluçkaya. Kuluçka 2 h sonra 2 mL kültür orta ekleyin. Orta 2 günde değiştirin. Kültür hMSCs yüklenen microcryogels 3D microtissues oluşturmak 2 gün.</li>
		Kültür, <li>sonra 2 gün iyi bir 96-şey plaka üzerinde başına 100 hMSCs yüklenen microcryogels pipet, üreticiye göre hazırlanan resazurin çalışma çözüm 120 µL eklemek &#39; s öğretim her kuyuya. 37 ° C'de 2 h için kuluçkaya
		Hücrelerin içinde bir uyarma ışık dalga boyu 560 nm ve emisyon ışık dalga boyu 590 ile Mikroplaka okuyucu tarafından metabolize resazurin <ol><li>Algıla Floresans nm. Cep numarasını floresan yoğunluğu gelecekteki deney seti protokolü 13 göre cep numarasından getirmek için hMSCs kullanarak Floresans vs standart bir eğri kurmak.</li>
		</ol></li> <li>HMSCs 0 günden microcryogels açıklandığı gibi 2.3.7 0 günden güne 4 adım resazurin kullanarak 4 gün içinde sayısını değerlendirmek.</li>
		<li>Leke microcryogels Calcein AM 1:500 seyreltme ve Propidium iyodür (canlı/ölü boyama olarak bilinen) 1:250 seyreltme fosfat tamponlu tuz (PBS) içinde hücreleri ve floresan mikroskop veya confocal floresan mikroskop altında dikkat.</li>
	</ol></li> <li>3D microtissues vivo içinde fare modeli CLI tedavisi için enjeksiyon <ol><li>kritik hindlimb iskemi kadın BALB/c çıplak fareleri bildirilen 11 , kurmak 3D microtissue tabanlı terapi tedavi edici etkisini belirlemek için 19.</li>
		<li>Microtissues adım 5 mL pipet bir hücre süzgeç kullanarak 2.3.6 aktarmak ve uzak kültür orta filtre.</li>
		<li>100 microcryogels 100 µL çözüm başına yoğunluğu, % 15 jelatin çözümünde hMSCs yüklü 3D microtissues resuspend.</li>
		<li>Ameliyatından önceki otoklav tarafından cerrahi .aletleri sterilize ve bir hayvan tesisi merkezi bir hayvan ameliyathanede ameliyatı.</li>
		<li>% 1-3 isoflurane 1 L/dak Uygula eritromisin kurutma önlemek için fareyi göze akış hızında % 100 oksijen içeren anestezi indüksiyon odasına fareyi getirin. 1 cm uzunluğunda cilt kesi, femoral arter ve dalları ile 5-10 ipek dikiş ligate ve tüketim 19.</li>
		<li>Enjekte indocyanine yeşil (ICG) (100 µg/mL 0.1 mL) kuyruk ven yoluyla kan akışını izlemek için enjeksiyon. ICG Floresans görüntüleme bir floresan görüntüleme sistemi kullanarak gerçekleştirmek (burada, ev yapımı sistem) yansıma geometri 11.</li>
		<li>İntramüsküler gracilis kas 23'lik iğne ile 1 mL şırınga kullanarak artere kesi çevresinde üç siteleri içine microtissues enjekte.</li>
		<li>Ameliyattan sonra fare kurtarma kafes içinde ısıtmalı bir yastık ile sıcak tutmak. Subkutan Meloksikam ağrı gidermek ve sürekli uyanık kadar izlemek için enjekte.</li>
		<li>Sonra 28 gün, 11 Imaging Floresans tarafından 3D bacak microtissue tedavi tedavi edici etkinliği izlemek. 
		Not: subkutan Meloksikam fare spontan ekstremite amputasyonu gösterdiğimde ağrı gidermek için enjekte.</li>
		<li>İle karbon dioksit deneylerin tamamlanmasından sonra Euthanize fareler. 
		Not: Burada, ötenazi karbon dioksit ile gerçekleştirilen hayvan Etik Komitesi üzerinde merkezi Biyomedikal analizi, Tsinghua Üniversitesi tarafından onaylanmış kesin protokolüne göre.</li>
	</ol></li></ol> 3. Microtissue dizi çip uyuşturucu yüksek üretilen iş süzmek için Meclisi <ol><li>microcryogel dizinin üstünde-küçük parça hücre kültürü için derleme <ol><li>Değiştir Bölüm 1.1 geleneksel çok iyi plakası boyutları göre tasarımında Yani, 384-multi-da biçimi için tasarım bir dizi 16 × 24 Wells (satır sütununa göre), her biri 2 mm çap ve 4.5 mm Merkezden merkeze aralığı.</li>
		<li>Lazer basık bir 500 µm kalınlığında PMMA levha üzerine 1.1 bölümünde anlatıldığı gibi.</li>
		384-multi-da dizi çip elde edilen Bölüm 1.2 kullanımında açıklandığı gibi <li>Fabricate microcryogels 3.1.2 adım. Bu microcryogel içeren dizi microcryogel dizi kozu olarak atanır.</li>
		<li>Microcryogel dizi chip yıkama 50 mL 0.1 M NaBH 4 ile uncross-bağlantılı herhangi bir kalıntı aldehid gidermek için, sonra art arda 3 kez, 2s için 50 mL deiyonize su ile her zaman durulayın.</li>
		<li>Su atın, adım 1.2.7 göre lyophilizing daha önce microcryogel dizi çip 4 ile 16 h için-20 ° C'de dondurmak.</li>
		<li>Adım 3.1.1 16 × 24 içerecek şekilde değiştir 384-multi-da dizi tasarım kuyuları, her biri 3 mm çapında ve 4.5 mm Merkezden merkeze aralığı.</li>
		<li>Destek bir tarafı bir ultra-ince (10 µm) Biyouyumlu çift taraflı yapışkan bant sayfasından kaldırmak ve bir parça 3 mm kalınlığında PMMA sayfanın bir tarafına yapıştırın. Lazer Tasarım Bölüm 1.1 göre bu 3 mm kalınlığında PMMA sayfaya 3.1.4. adımdaki basık. Bu dizi rezervuar dizi olarak atanır.</li>
		<li>Hizala microcryogel dizi chip rezervuar dizi çip ile ve birlikte uygun 3D microcryogel dizi küçük parça üstünde-küçük parça hücre kültürü için sıkı bir şekilde birleştirmek için. 1 h. için ultraviyole radyasyon tarafından sterilize</li>
		<li>Mağaza 3D microcryogel dizi cips daha fazla deneyler için oda sıcaklığında vakum.</li>
	</ol></li> <li>3D microtissue diziler üzerinde uyuşturucu eleme <ol><li>ıslak bir kutu hücre kültürü için bir nem odası olarak hizmet için 25 mL steril de-iyonize su ile doldurunuz. Oksijen %5 ön ısı CO 2 kuluçka 37 ° c</li>
		<li>Hasat sigara küçük hücreli akciğer kanseri hücreleri (ncı-H460) ve Hepatosellüler karsinom hücrelerden (HepG2) doku kültürü plakaları standart protokolüne göre ve kültür medya 1.0 x 10 6 hücre/mL son yoğunluğunun yeniden askıya alma. İyice karıştırın. 
		Not: RPM1640 %10 FBS, 100 U/mL penisilin ve 100 µg/mL streptomisin ncı-H460 için kullanılır. Kullanmak DMEM %10 FBS, 100 U/mL penisilin ve 100 µg/mL streptomisin için HepG2.</li>
		<li>Kuluçka Gelişim makinesi nem odası kaldırın. Cımbız adım 3.1.9 nem odasında dikkatlice yere monte 3D microcryogel dizi çip için kullanın. Microcryogels odasında su ile ıslak değil dikkatli.</li>
		<li>Hücre süspansiyon karıştırın iyice, sonra aliquot 3 µL hücre süspansiyon doğrudan üzerine her kuyuya microcryogel. 
		Not: Pipet ucu hafifçe hücre süspansiyon kovma önce microcryogel yüzeye dokunun. Otomatik yüklenen içine emme tarafından microcryogel hücrelerdir. Hücrelerin periferik Wells tohum değil.</li>
		<li>Ekleyin 10 μL medya hücreleri çok kanallı pipet, 96-kanal sıvı işleyicisi gibi kullanarak microcryogel içine seribaşı sonra her şey için. Orta da periferik wells eklenir. 
		Not: Kullanım RPM1640 medya ile %10 FBS, 100 U/mL penisilin ve 100 µg/mL streptomycin H460 hücreler için. DMEM medya HepaG2 hücreler için %10 FBS, 100 U/mL penisilin ve 100 µg/mL streptomisin kullanın.</li>
		<li>Kültür microcryogel hücre dolu dizi chip için oksijen %5 24 h nem odasında CO 2 kuluçka formu 3D microtissue diziye 37 ° C'de.</li>
		<li>Erime doksorubisin ve IMMLG-8439 9 Dimetil sülfoksit (DMSO 10 mM hisse senedi bir çözüm oluşturmak için). Kültür 2 10 kat seyreltme konsantrasyon degrade oluşturmak için orta ilaçlarla sulandırmak için 200 µM nM.</li>
		<li>Ekleyin 10 µL uyuşturucu çözümleri her şey. (Orta seyreltilmiş) % 0,1 DMSO denetimi olarak kullanın. Oksijen %5 uyuşturucu dolu 3D microtissue dizide kuluçkaya CO 2 kuluçka 37 ° C'de 24 h için</li>
		<li>Eklemek 4 µL resazurin hisse senedi çözüm her şey için. 2 h. yer 3D microtissue dizide Mikroplaka okuyucu için 37 ° C'de kuluçkaya ve hücrelerin uyarma ışık dalga boyu 560 nm ve emisyon ışık dalga boyu 590 adlı tarafından metabolize resazurin floresan algılamak nm.</li>
		<li>Resazurin temel sinyal daha fazla veri işleme önce bütün kuyulardan çıkarma. Floresan sinyallerini kontrol wells ortalama Floresans sinyalinin tarafından bölünmesi ile hücre canlılığı kesir her iyi hesaplamak.</li>
		<li>Doz-yanıt eğrisi içinde çizim yazılımı temel 10 logaritmasını uyuşturucu konsantrasyon olarak x ekseni ve y ekseni olarak hücre canlılığı kesir ile çizmek. % 50 inhibisyon konsantrasyonu (IC50) 0,5 hücre canlılığı kesir katmak.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Rejeneratif tıp ve vitro ilaç tarama için doku Mühendisliği5,6,7,8,9için iki önemli uygulamalar modellerdir. Bu iki uygulama büyük ölçüde farklı ihtiyaçları varken, bunların arasında ortak bir zemin hücre fonksiyonları19geliştirmek için koşulu kültür bir daha fazla biomimetic için ihtiyaç yatıyor. Yalnızca gelişmiş hücre fonksiyonları araştırma ile hastalıkların daha iyi20,21iyileştirebiliriz ve kültürlü hücreleri uyuşturucu yanıt daha doğru yansıtacak Eğer uyuşturucu keşif6,7hızlandırabilir. Üretilen iş uyuşturucu tarama için bileşiklerin binlerce işlenecek bir anda önemli olmakla birlikte hücre sağkalım sonra engraftment vivo içinde rejeneratif tıp için çok önemli bir gereksinimdir. Bu iki gereksinim ilgili uygulamalarını özeldir ve nadiren bir teknoloji her iki ihtiyaçlarına cevap verebilecek. Böylece, biz benzersiz olarak microfabrication teknoloji çip dışı hasat rejeneratif tedavi için tek tek hücre yüklü taşıyıcıları olarak olabilir, ya da daha fazla üstünde küçük parça için muhafaza macroporous microcryogels üretmek için cryogel hazırlık ile entegre etmiş derleme yüksek üretilen iş uyuşturucu taraması diziye. Microscale ve macroporosity bu roman microcryogels, otomatik ve homojen hücrelerinin basit absorpsiyonu ile yükleme sağlar. Roman microstencil imalat microcryogel dizi fiş kullanarak, yüzlerce ve binlerce microscale cryogels düzgün ve tekrarlanabilir geometrik özellikleri ile kolayca ve verimli bir şekilde oluşturulabilir. Microcryogels hazırlanan ve 3D microtissues hazırlanması ortak kolaylaştırmak için bir kapalı, kullanıma hazır ürün olarak laboratuvarlar izleyen uygulamalar için ambalaj vakum tarafından saklanır. Bu imalat tekniği kullanarak, biz ortak bir zemin (3D kültür durumu daha iyi Biyomimikri için) ve iki farklı uygulamalar için belirli gereksinimleri karşılamak mümkün (rejeneratif tıp için enjeksiyon sırasında hücreleri korumak için esneklik ve yüksek-den geçerek uyuşturucu tarama için bir dizi biçiminde).
Hücre tabanlı terapisi çeşitli hasarlı doku veya organ24tamiri için büyük söz sahibidir. Ancak, hücre saklama, hücre hayatta kalma ve tekrarlanabilirlik tedavi enjeksiyon, çevre dokular ve iskemi ve inflamasyon lezyon içinde in vivo ortamda yüksek sızıntı sırasında mekanik hasar nedeniyle hala yoksul doku25. Bazı araştırmacılar ön şekillendirilmesi hücresel toplamları boş hücreye enjeksiyon geliştirmek için kullandık. Ancak, yüksek maliyet, üniform olmayan boyutu ve kontrol edilemeyen toplama numaraları26yol açar formu hücre toplamları, hücrelere büyük bir miktarda gerektirir. Ayrıca, mekanik yaralanma ve hücre ölümü enjeksiyon sırasında hala kaçınılmazdır. Alternatif olarak, biomaterial destekli hücre tedavisi hangi duyarlı Biyomalzeme (örneğin, termal veya pH duyarlı hidrojel) hücreleri ve hücre saklama27gerçekleştirmek için jelleşme situ ile karışabilir geliştirilmiştir. Ancak, situ çapraz bağlı Biyomalzeme astar hücreleri vitro ve sonuç hücreleri hemen poz için iskemik ve inflamatuar microenvironment lezyon sitesinde içinde izin vermez. Terapötik verimliliği artırmak için bu sorunları çözmek için acil bir durum. Bu iletişim kuralını kullanan fabrikasyon microcryogels önemli bir avantajı onların istenen injectability sonucu olarak küçültülmüş boyutu ve olağanüstü esneklik, hücre teslim uygulama onların kolaylaştırmak olduğunu. Microcryogels injectability hücre teslimat sırasında hücre koruma sağlar, bu nedenle onlar 3D enjekte edilebilir microtissues her iki hücre dışı Matriks (ECM) protein artırmak için microcryogel hücrelerinin vitro priming sonra kurulur biriktirme gibi hücre-hücre etkileşimleri. 3D enjekte edilebilir microtissues hücre koruma, engraftment, hayatta kalma kolaylaştırmak için bir en uygun teslimat stratejisi temsil eden microscale doku benzeri topluluklar içinde neden ve bu nihai tedavi edici etkileri lezyon sitesinde artırır.
Hücre tedavisi için geliştirilmiş tedavi edici etkileri yanı sıra bizim sonuçları da hücresel ilaç yanıt üzerinde 3D microenvironment karmaşık etkisini göstergesidir. Biomimicking kültür koşulları kullanmak, vitro hücresel ilaç yanıt vivo yanıtları, dolayısıyla ilaç keşif6,7hızlanan daha temsilcisi temin mümkün olabilir, 28. Pulcuklarının 3D hücre kültür yapılandırmasının popüler seçenek var ve birçok teknikleri geliştirilmiştir yardımcı olmak için araştırmacılar pulcuklarının oluşturun. Nano-diziniz8 ile değiştirilen düşük yapışkanlı doku kültürü tabak29 veya plaka yüzeyler de hücreleri zorlamak için kullanılmıştır hücre-matris yapışması önleme tarafından toplanacak. Bu tekniklerin kullanımı nispeten basit olmakla birlikte, pulcuklarının değişkenliği boyutu yanı sıra pulcuklarının medyası takası ve diğer işlemleri sırasında kaybı gibi sorunları bu tür teknoloji6büyük ölçekli kabulü engelleyen sorunları vardır. Daha homojen pulcuklarının-var oluşan asılı kullanarak30,31,32,33bırakın, ancak emek yoğun değil istimal öyle plakaları uzman. Kullanarak çok iyi açılan tabak asılı ve otomatik sıvı sistemleri6,31işleme entegre uzman, yüksek üretilen iş tarama fark. Küresel kültürünün en büyük dezavantajı tüm fizyolojik ve patolojik doku gelişmeler34hayati rolleri oynamak için tanımlanan ECM olmaması. Bir beyin modeli çalışma içinde saf pulcuklarının, ile karşılaştırıldığında bir ECM iskele kültürlü pulcuklarının ilaç direnci artmış, asidoz nedeniyle daha yüksek laktat üretim gelişmiş ve ilgili ifadesi artan angiogenez geliştirilmiş saptandı 34faktörler. Diğer çalışmalarda da matris varlığı gerekli mekanik istila ve metastaz3,35,36 gibi tümör özelliklerinin EMT ve destekler Rekapitülasyon tanıtmak için Sinyal verici sağlayabilir göstermiştir , 37.
ECM önemine patolojik kalkınma anlayışı ile artan, ECM 3D kültür yöntemleri birleşmeyle vivo içinde durumlarda daha iyi6taklit yardım edebileceğini hiç şüphe yoktur. Hydrogels doğal veya sentetik malzeme chemotherapeutics esnekliği nedeniyle değerlendirilmesi ve kontrol edilebilirlik biyofiziksel özellikleri (örneğin, rijidite)38 için birkaç vitro 3D tümör modelleri oluşturmak için uygulanan , 39 , 40 , 41 , 42. hydrogels tunable biyofiziksel özellikleri ile gerçekten de daha doğru ilaç tarama kolaylaştırmak için tümör hücrelerinin önemli biyolojik özellikleri örnek alınarak iken, bu yöntemin çeşitli dezavantajları yaygın kullanımı ile uyuşturucu engel Eleme. Polimerler hücreleri huzurunda polietilenin hücreler hücreleri zarar verebilir hidrojel matris içinde kapsüllemek gereklidir. Sadece öyle değil, hydrogels farklı biyofiziksel özellikleri içinde kapsüllü hücrelere farklı sorunlar mevcut. Yumuşak hydrogels, yüksek su içeriği hücre büyümesini destekleyebilir ancak böyle hydrogels hızlı bir şekilde, 3D hücre kültürü için kısa vadeli destek veren rengini. Öte yandan, yüksek cross-linking ile sert hydrogels bozulması yavaş olabilir ama düşük su içeriği hücre büyümesini desteklemiyor ve yüksek crosslinker konsantrasyonu genellikle yüksek cytotoxicit neden olmaktadıry43,44. Sadece Yani, 3D hücre kültürü ile hydrogels hazırlanması ve emek yoğun sıcaklık kontrolü hidrojel öncü çözüm önemlidir ve ince losyonlu ipuçları sıkışma neden olabilir işleme sistemlerini en yüksek işlem hacmi sıvı ile uyumlu değil İpuçları içinde hidrojel jelleşme. Bu dezavantajları böylece alternatif ECM Suretler için Yani, ECM34iskele tabanlı arama istenir.
Önceden biçimlendirilmiş iskele kullanılması, hücreleri biomaterial imalat işleminden muaf ve sert koşullar hücreleri zarar korkusu kullanılma dolayısıyla iskele imalatı üzerinde daha fazla denetim için imkanı sağlar. 3D iskele kültürlü tümör hücreleri artan malignite ve gelişmiş hücre-ECM etkileşim45,46, nedeniyle 2D kültürlü hücreleri ile karşılaştırıldığında daha yüksek ilaç direnci görüntülemek çeşitli araştırmalar göstermiştir 47. bu tür gözlemler burada sunulan bizim sonuçları ile uyumludur. Bizim diğer eserlerinde, biz daha fazla 3D microtissue dizi ve yukarıda bahsedilen diğer teknikleri üzerinde kendi avantajları çok yönlülük gösterdi. Son bir iş, bir 3D microtissue dizisinin kültür tarafından HepaRG hücreleri epitelyal fenotip teşvik ederek hepatik fonksiyon geliştirmek başardık ve böyle dizi için uyuşturucu hepatotoxicity değerlendirme47uygulandı. Gözenek boyutları içinde 3D macroporous iskele tekdüzelik nedeniyle karaciğer hücre pulcuklarının aralığı 50-80 µm, ilk hücre tohum yoğunluğu ne olursa olsun içinde boyutunu denetlemek başardık. Bu ücretsiz oluşturmayan üzerinde önemli bir avantaj sağlar pulcuklarının üniform olmayan boyutları ile. Sadece pulcuklarının düzgün her iskele içinde büyümek, hücreler arasında kuyu Ayrıca düzgün tohumlari, katsayısı, değişim (CV) 2D tohum hücreleri ile karşılaştırılabilir vererek (Yani, CV 0,09 3D microtissue dizi ve CV = = 0,05 2D ticari plaka ; veri) gösterilmez. Başka bir çalışmada, karaciğer microtumor stromal tümör etkileşimlerin Kombinatorik terapi stroma yeniden programlanan48filtreleme için özetlemek için 3D microtissue dizi oluşturmak başardık göstermiştir. Karaciğer mikrotümörler fibroblastlar yüksek yoğunluklu, tümör hücreleri ile uzun vadeli (5 gün) ortak kültür tarafından oluşturulan. Biz uyuşturucu Difüzyon kompakt cep ve benzer şekilde vivo içinde32gözlendi karaciğer microtumor kurulan ECM yapısı nedeniyle doğru engelleri görülmektedir. Luciferase etiketli kanser hücreleri ve kanser hücrelerinin için belirli eşleştirmeyi olarak biyoluminesans ışıma ile birlikte mekanik astarlanmalıdır stromal hücreler kullanarak yüksek-den geçerek roman terapötik ajanlar veya kombinasyonları karşı stromal tümör tarama etkileşim mümkün olmaktadır.
Rağmen birçok benzersiz avantaj bizim teknik olmayan-detaylı optik gözlem microcryogels hücrelerinin engelleyen şeffaflık, geçerli microcryogels bir dezavantajıdır. Bu microcryogels için daha fazla iyileştirmeler optik özelliklerini görüntüleme gözlem için microcryogels hücrelerinin geliştirmek için ince ayar içerir. Ayrıca, rijidite gibi önemli biyofiziksel özellikleri farklı biyofiziksel özellikleri fizyolojik ve patolojik dokuların daha iyi taklit etmek istiyorsak ele alınması gereken bizim teknikte araştırılmalıdır değil.
Bizim tekniği basit nesil 3D microtissues için izin verirken, bazı uyarılar başarılı deneyler için alınmalıdır. 3D microcryogels microstencil dizi yonga üzerinde imalatı microcryogels lyophilizer içinde yerleştirildiğinde donmuş kalmasını sağlamak önemlidir. Dolayısıyla lyophilizer önceden soğutmak için ve microcryogels-20 ° C dondurucudan lyophilizer için hızlı bir şekilde aktarmak için esastır. Microcryogels lyophilizing önce veya lyophilizing erime daraltmak ve dolayısıyla fabrikasyon microcryogels porozite etkiler gözenekleri neden olur. Dizi formatında 3D microtissues kültür dikkat adhesiveness iki dizileri arasında çapraz bulaşma kuyular arasında önlemek için yeterli olduğundan emin olmak için gerekli. Ayrıca, hücre kültürü miniaturizing daha fazla işlem hacmi artan onun avantajı vardır ve reaktif tüketimi azaltmak, onun bu dezavantajı ise düşük kültür birim sık medya stok yenileme olmadan uzun vadeli hücre kültür desteği. Sadece çok, hücre canlılığı hücre süspansiyon, sadece bir kaç microliters beri medya buharlaşma nedeniyle etkisi önlemek için kültür ortamının nem korumak için önemlidir veya medya eklenir. Buharlaşma de hücrelerin periferik Wells canlılığı etkiler, bu nedenle bu Wells hücre kültürü çalışmalarının önlemek için önemlidir.
Yine de, bizim sağlam tekniği potansiyel olarak 3D kültür temel ve çevirim bilim hızlandırmak için çoğu laboratuvarları için ortak bir hücre işleme yöntemi yapabilirdiniz bir kullanımı kolay şekilde 3D microtissues oluşturmak için bir seçenek sağlar gelişmeler.

Yüzeylerde düzleştirilmiş iki boyutlu (2B), bir kültür yemek veya çok iyi Kaplamalar, gibi geleneksel hücre kültürü pek hücre davranışları onların yerli Birleşik yakın temin. Çeşitli hücre tipleri, hücre dışı Matrisler ve biyoaktif çözünür faktörler üç boyutlu (3D) mimarileri1,2,3 oluşturan yerel hücresel microenvironments doğru tekrarlama ,4, biomimicking doku vitro doku Mühendisliği, rejeneratif tıp uygulamalarında oluşturmak için gerekli temel Biyoloji Araştırma ve ilaç keşif5,6,7 ,8,9.
2D hücre kültürü, yerine 3D hücre kültürü biomimetic mikro mimari ilerlemek için yaygın olarak kullanılan ve işlevsel özellikleri hücre vitrokültürlü. Bir popüler 3D hücre kültür toplama pulcuklarının7,8,9,10hücrelere yapılandırmaktır. Hücresel pulcuklarının yaralı dokulara gelişmiş hücresel saklama ve hayatta kalma ile karşılaştırıldığında enjeksiyon dağınık hücrelerinin enjekte. Ancak, üniform olmayan küresel boyut ve hücre enjeksiyon sırasında sıvı kesme zorla dayatılan kaçınılmaz mekanik yaralanma kötü hücre tedavi edici etkileri11,12,13için neden. Benzer şekilde, doğal olmayan-tekdüzelik pulcuklarının toplama sırasında zorlu10eleme 3D hücre tabanlı yüksek üretilen iş uyuşturucu onların çeviri yaptı.
3D hücre kültürü için başka bir yöntem genellikle sulu hydrogels veya gözenekli iskele hücreler kapsüller Biyomalzeme, yardımı ile elde edilir. 3D mimarileri oluşturarak büyük esneklikleri izin veren bir yayın. Terapi için toplu iskele içinde kapsüllü hücreleri genellikle hayvan vücudu invaziv ve travmatik, bu nedenle geniş kendi çeviri başucu için kısıtlama cerrahi implantasyon yoluyla teslim edilir. Öte yandan, sulu hydrogels hayvan cesetleri, situ jelleşme üzerinden termo-, kimyasal veya enzimatik crosslinking11izin içine hidrojel habercisi çözümde askıya hücreleri enjekte edilerek minimal invaziv tedavi etkinleştirin. Whilst hidrojel öncüleri hala sulu bir durumda hücreleri teslim gibi Ancak, onlar da mekanik makas için enjeksiyon sırasında maruz kalır. Sadece öyle değil, kimyasal veya enzimatik crosslinking hidrojel in situ jelleşme sırasında da içindeki hücreleri hasar empoze olabilir. Uyuşturucu tarama için biomaterial destekli hücre kültürleri tekdüzelik, kontrol edilebilirlik ve işlem hacmi ile sorunlarla karşı karşıya. Hydrogels kullanarak, hücreleri genellikle sırasında jelleşme, hangi hücre canlılığı ve işlev süreci etkileyebilir katılmaktadırlar. Hücre tohum sırasında jelleşme Ayrıca kullanımı en yüksek üretilen iş ekipmanı tarafından hidrojel jelleşme tohum hücre önce önlemek için buz üstünde tutulması gereken ve hidrojel için doğruluğunu sağlamak için genellikle çok ince losyonlu ipuçları jam beri engellemektedir yüksek işlem hacmi tarama. Önceden biçimlendirilmiş iskele potansiyel olarak hücre kültürü, biomaterial imalat işlemleri ancak çoğu iskele bazlı ürünler elde edilebilir aynı derecede hacim materyalleri ile nispeten daha düşük işlem hacmi14ayrı.
Bazı geçerli 3D kültür yöntemleri eksikliklerin üstesinden gelmek için bir kapalı ve kullanıcı-dostça microcryogel dizi çip15imal etmek bir microfabrication-cryogelation entegre teknoloji geliştirdi. Bu protokol için jelatin Biyouyumlu, parçalanabilir, düşük maliyetli, ve daha fazla değişiklik hücre eki için gereklidir gibi microcryogel imalat tekniği örneklemek için seçilir. Doğal veya sentetik kaynaklarının diğer polimerler için imalat, uygulamaya bağlı olarak da kullanılabilir. Bu teknoloji ile kontrol edilebilir boyut, şekil ve düzen ile minyatür ve yüksek derecede elastik microcryogels imal. Çeşitli hücre türleri ile yüklendiğinde, 3D microtissues çeşitli uygulamalar için oluşmuş. Bu benzersiz özellikler sonra enjeksiyon vivo içinde Gelişmiş tedavi edici etkileri için istenen injectability, hücre koruması ve site yönettiği saklama sağlar. Sadece öyle değil, microcryogels daha fazla ortak labaratuar donanımları ve yüksek üretilen iş hücre kültürü çok yönlü uyuşturucu tarama ve diğer hücresel deneyleri için gerçekleştirmek için aletleri ile uyumlu 3D microtissue dizileri oluşturmak için işleme. Burada, microcryogels ve tedavi sonrası kendi bireysel 3D microtissues veya 3D microtissue diziler için iki önemli uygulamaları, hücre tedavisi ve uyuşturucu taraması, sırasıyla10,15 olarak imalat süreci ayrıntılı .

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="803">
	<tbody>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:199px;">Gelatin</td>
			<td style="width:211px;">sigma</td>
			<td style="width:111px;">G7041</td>
			<td style="width:283px;">All other reagents were purchased from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) unless otherwise indicated.</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:199px;">Glutaraldehyde&#160;</td>
			<td style="width:211px;">J&#38;K</td>
			<td style="width:111px;">902042</td>
			<td style="width:283px;">Used as crosslinker in preparation of material.</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:199px;">Glass cover slip (24X50mm)</td>
			<td style="width:211px;">CITOGLASS, China</td>
			<td style="width:111px;">10212450C</td>
			<td style="width:283px;">To scrape prcursor solution onto microstencils array chips.</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:199px;">Sodium&#160;borohydride, NaBH4</td>
			<td style="width:211px;">Beijing Chemical Works</td>
			<td style="width:111px;">116-8</td>
			<td style="width:283px;">To wash remaining glutaraldehyde away after gelation.</td>
		</tr>
		<tr height="53">
			<td height="53" style="height:53px;width:199px;">Vacuum jar</td>
			<td style="width:211px;">asperts, China</td>
			<td style="width:111px;">VC8130</td>
			<td style="width:283px;">To preserve microgels under vacuum.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:199px;">Polymethylmethacrylate (PMMA) sheets&#160;</td>
			<td style="width:211px;">Sunjin Electronics Co., Ltd, China</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:283px;">Ordinary PMMA sheets.</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:199px;">Rayjet laser system</td>
			<td style="width:211px;">Rayjet, Australia</td>
			<td style="width:111px;">Rayjet 50 C30</td>
			<td style="width:283px;">To engrave PMMA sheets to form wells.</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:199px;">Plasma Cleaner</td>
			<td style="width:211px;">Mycro Technologies, USA</td>
			<td style="width:111px;">PDC-32G</td>
			<td style="width:283px;">To make PMMA hyphophilic.</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:199px;">Lyophilizer</td>
			<td style="width:211px;">Boyikang, China</td>
			<td style="width:111px;">SC21CL</td>
			<td style="width:283px;">To lyophilize materials.</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:199px;">Trypan Blue solution (0.4%)</td>
			<td style="width:211px;">Zhongkekeao, China</td>
			<td style="width:111px;">DA0065</td>
			<td style="width:283px;">To dye microgels.</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:199px;">Doxorubicin hydrochloride</td>
			<td style="width:211px;">ENERGY CHEMICAL, China</td>
			<td style="width:111px;">A01E0801360010</td>
			<td style="width:283px;">To test drug resistance of cells in 2D or 3D microgel.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:199px;">Live/dead assay</td>
			<td style="width:211px;">Dojindo Molecular Technologies (Kumamoto, Japan)</td>
			<td style="width:111px;">CS01-10</td>
			<td style="width:283px;">To distinguish alive and dead cells.</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:199px;">Cell Titer-Blue</td>
			<td style="width:211px;">Promega (Wisconsin, USA).</td>
			<td style="width:111px;">G8080</td>
			<td style="width:283px;">To test cell viability.</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:199px;">Cell strainer</td>
			<td style="width:211px;">BD Biosciences, USA</td>
			<td style="width:111px;">352360</td>
			<td style="width:283px;">To collect microgels.</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:199px;">D-Luciferin</td>
			<td style="width:211px;">SYNCHEM (Germany)</td>
			<td style="width:111px;">s039</td>
			<td style="width:283px;">To tack cells.</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:199px;">Scanning electron microscope</td>
			<td style="width:211px;">FEI, USA</td>
			<td style="width:111px;">Quanta 200</td>
			<td style="width:283px;">To characterize microgel morphology.</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:199px;">&#160;Mechanical testing machine</td>
			<td style="width:211px;">Bose, USA</td>
			<td style="width:111px;">3230</td>
			<td style="width:283px;">To measure mechanical features.</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:199px;">Programmable syringe pump&#160;</td>
			<td style="width:211px;">World Precision Instruments, USA</td>
			<td style="width:111px;">ALADINI 1000</td>
			<td style="width:283px;">To test injactabiliy.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:199px;">Digital force gauge</td>
			<td style="width:211px;">HBO, Yueqing Haibao Instrument Co., Ltd., China</td>
			<td style="width:111px;">H-50&#160;</td>
			<td style="width:283px;">To test injactabiliy.</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:199px;">Ethylene oxide sterilization system</td>
			<td style="width:211px;">Anprolene, Anderson Sterilization, Inc., Haw River, NC</td>
			<td style="width:111px;">AN74i</td>
			<td style="width:283px;">To sterilize microgels with ethylene oxide gas.</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:199px;">Microplate reader</td>
			<td style="width:211px;">Molecular Devices,USA</td>
			<td style="width:111px;">M5</td>
			<td style="width:283px;">To measure fluorescence intensity in micro-array.</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:199px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:211px;">Nikon, Japan</td>
			<td style="width:111px;">A1Rsi</td>
			<td style="width:283px;">To observe cell distribution in 3D.</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:199px;">Xenogen&#160; Lumina II imaging system</td>
			<td style="width:211px;">Caliper Life Sciences, USA</td>
			<td style="width:111px;">IVIS</td>
			<td style="width:283px;">To track cell in animals.</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:27px;width:199px;">Liquid work stataion</td>
			<td style="width:211px;">Apricot design,USA</td>
			<td style="width:111px;">S-pipette</td>
			<td style="width:283px;">To load medium or cell suspension high-throuputly.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

3d microtissues for injectable regenerative therapy and high-throughput drug screening

Geleneksel 2D hücre kültürü 3D hücre kültürü için yükseltmek için biz microfabrication macroporous microscale cryogels (microcryogels), 3D microtissues oluşturmak için hücre tipleri çeşitli ile yüklenen üretmek için cryogelation teknolojisi ile entegre etmiş. Burada, biz çok yönlü 3D microtissues ve rejeneratif terapi ve ilaç tarama uygulamaları imal etmek protokol mevcut. Boyut ve şekil kontrol edilebilir microcryogels hasat çip dışı enjekte edilebilir rejeneratif tedavi için tek tek hücre yüklü taşıyıcıları olarak veya daha fazla monte üstünde-küçük parça içine 3D microtissue diziler yüksek üretilen iş için olmak bir dizi yonga üzerinde fabrikasyon uyuşturucu tarama. Bu microscale cryogels yüksek elastik yapısı nedeniyle, 3D microtissues minimal invaziv hücre tedavisi için büyük injectability enjeksiyon sırasında mekanik kesme kuvvetlerinden hücreleri koruyarak sergi. Bu gelişmiş hücre hayatta kalma ve fare uzuv iskemi modelinde tedavi etkisi sağlar. Bu arada, derleme bir standart 384-multi-iyi biçimde 3D microtissue dizilerin ortak laboratuvar olanakları ve donanımları, yüksek-den geçerek uyuşturucu bu çok yönlü 3D hücre kültür platformda eleme etkinleştirme kolaylaştırır.

Microcryogels 3D microtissue oluşumu için malzemelerin ve üretim.
Bu protokole göre microcryogels microcryogel diziler ve bireysel microcryogels veya form 3D microtissues fabrikasyon ve rejeneratif terapi ve ilaç (şekil 1) tarama, sırasıyla uygulandı. Microstencil dizi cips PMMA fabrikasyon olarak micromolds microcryogel dizi patates kızartması için uygulandı. Değişken geometrik tasarımları microstencil dizi küçük parça için hazırlanmış. Bir temsilci 45 mm x 14 mm microstencil dizi çip gerçekleştirdiği çeşitli şekiller (Yani, daire, elips, üçgen ve yonca) ve bir daire şeklinde microstencil dizi çip farklı boyutları ile örnek olarak seçtik (çapı = 100, 200, 400 ve 800 µ m). micromolds dizi yongaları üzerinde görünürlüğünü artırmak için ışık epi-aydınlatma görüntüleri (şekil 2A, B) gözlendi. Dizi cips--dan hasat Microcryogels istenilen şekil ve boyutta (şekil 2C, D) sergilenmektedir. Böyle microcryogels istenen geometrik özellikleri ile büyük olasılıkla belirli mimarileri yerli dokuların taklit farklı hücresel birimler oluşturmak için şablon olarak uygulanabilir. Hasat GMs (jelatin microcryogels) önceden tanımlı şekil ve boyutlarda (şekil 3A) vardı. SEM gözlem microcryogels birbirine macroporous yapıları gözenek boyutu 30-80 µm (3B rakam) aralığında olan yer gösterdi.
HMSCs yüklenen microtissues geliştirilmiş iskemik uzuv kurtarma için gelişmiş injectability
Programlanabilir şırınga pompa kullanarak bir dijital kuvvet ölçer14ile entegre, GM injectability kantitatif değerlendirildi. 1 mL/dk akış hızında GMs mL başına 1.000 microcryogels yoğunluğu ile 10 N20 (şekil 3F) klinik olarak kabul edilebilir kuvvet daha alt N 6 altında enjekte edildi. GMs tarafından etkin hücre koruma dayanarak, hMSCs GMs içinde yüksek canlılık vardı ve büyük proliferatif kapasite enjeksiyon sırasında kültür (şekil 3 H) 5 gün sonra saklanır.
Fare uzuv iskemi modeli enjekte edilebilir hMSC yüklenen microtissues tedavi edici etkinliğini değerlendirmek için seçildi. İskemik ekstremitelerin fizyolojik durum 28 gün sonra cerrahi (şekil 4A) incelenmiştir. Hiçbir uzuv kurtarma sham veya GMs kontrol grubunda gözlendi. 105 boş hücreye tedavi grubunda, % 50 toplam ayak amputasyon, % 25 kısmi ayak amputasyon ve % 25 kısmi ekstremite amputasyonu 7 gün içinde % 80'i uzuv kaybı ve 28 gün sonra % 20 toplam ayak amputasyon sonuçlanan gözlendi. Buna ek olarak, microtissues tedavi 105 hMSCs ile geliştirilmiş uzuv hurda (% 75) elde % 25 fareler kendiliğinden ayak amputasyon 28 gün sonra. 106 hMSCs, gösterdi sadece çoğu önceki çalışmalarda kullanılan en düşük etkili hücre numarası oldu pozitif kontrol21seçilmiş. 4 farelerin sadece 2 bacak hurda gösterdi, ancak tüm küçük nekroz vardı.
Kan perfüzyon izlenmeli ve indocyanine yeşil (ICG), FDA onaylı Anjiyografik kontrast Ajan yardım değerlendirildi. Sonuç floresan sinyallerini microtissue tedavi edilen farelerde ve 106 ücretsiz hMSCs tedavi fareler, ortaya gösterdi. Orada hiçbir belirgin Floresans sinyal sahte veya GM grubu iskemik hindlimbs güne kadar 28 (4B rakam).
Bu sonuçlar daha fazla 3D hMSCs microtissue destekli terapi hücre tabanlı terapide fare modeli için en az etkili doz defa temsil eden CLI tedavi için üstün tedavi edici etkileri elde doğruladı.
Yüksek-den geçerek uyuşturucu sitotoksisite tarama 3D microtissue dizi yonga üzerinde
Üstünde-küçük parça hücre kültürü için kullanıma hazır 3D microcryogel dizi kolayca microcryogels PMMA yonga üzerinde lyophilization sonra istinat ve Biyouyumlu Yapışkan bantlar (Resim 1 ile ilgili iyi dizi çip ile birleştirerek tarafından fabrikasyon ve şekil 5A). Hücre içinde alt dizi yonga üzerinde immobilize 3D microcryogel kültürlü ise bu iki parçalı hücre kültür dizide en iyi dizi çip için kültür orta, uyuşturucu çözümleri ve tahlil kimyasalları, su depoları olarak görev yaptı. Yapışkan bantlar arasında üst ve alt dizi çip üretimi bu nedenle ilaç keşfi için kullanışlı bir araç sağlayan 384 bireysel Wells yüksek üretilen iş 3D hücre kültürü (şekil 5B) için izin.
İletişim kuralında açıklandığı gibi 3D microtissue dizi doğrudan hücre microcryogels rezervuarlar için orta eklemeden önce tohum tarafından kuruldu. RFP etiketli NIH-3T3 hücreleri kullanarak, hücreleri microcryogels (şekil 5C, D) 3D Mimarlık içinde çoklu katmanlar ile aynı şekilde dağıtılmıştır gösterdi. SEM görüntüleri hücreleri sıkıca gözenekleri duvarlara yapıştırılır ve hatta uzun filopodia boyunca veya microcryogels (5E rakam) macropores bitişik duvarları arasında sergilenen gösterdi.
O zaman bu 3D microtissue dizi yüksek üretilen iş ilaç iki kanser hücre satır ve iki bileşikleri kullanarak test için uygulama fizibilite gösterdik. Sigara küçük hücreli akciğer kanseri hücreleri (ncı-H460) IMMLG-8439 ile yeni bir tümör önleyici tedavi edildi iken Hepatosellüler karsinom hücre (HepG2) doksorubisin ile tedavi edildi. Beş, dokuz ayrı konsantrasyonları her ilaç için altı bitişik wells olarak çoğaltır, % 0,1 DMSO kültür ortamı olarak negatif kontrol içinde ile yönetilen. Sitotoksisite tahlil benzer şekilde geleneksel 2D çok iyi levha kültürlü hücreleri yapıldı. Kuluçka 24 saat sonra hücre canlılığı tahlil uyuşturucu yanıt-e doğru 2D ve 3D hücre değerlendirmek için kullanıldı. Normalleştirilmiş hücre canlılık oranları farklı ilaç konsantrasyonları kullanarak uyuşturucu yanıt eğrileri çizildi ve IC50 sonra bu eğrileri hesaplanan. Daha yüksek bir IC50 değeri hücreleri daha ilaca dirençli olduğunu gösteriyor. Hücreleri 2D 3D microtissue diziyi kültürlü ne zaman şekil 5F ve 5I, biz önemli bir artış ilaç direnci gözlenen. Doksorubisin IC50 HepG2 hücrelere karşı 18.239 göre 165.959 µM ulaştı nM üzerinde 2B; IC50, IMMLG-8439 ncı-H460 hücreleri üzerinde benzer şekilde 331.894 için yükseltilmiş sadece 1.294 gerektiren süre nM 3D nM 2D üzerinde. Böyle gözlem raporları artan ilaç direnci ile uyum içinde 3D kültüründe 2D kültür diğer araştırmacılar22,23tarafından bitmişti.
İlaç direnci ile karşılaştırıldığında 3D microenvironment karmaşıklığı içinde bu tür artış atfedilenDüzlemsel yapılandırma 2D kültür. SEM görüntüleri HepG2 hücreleri pulcuklarının macropores microcryogel içinde yüzeylerin dekorasyon olarak toplanan saptandı. Bu hücreler sıkıca kümelenir ve tür gelişmiş hücre-hücre etkileşim ilaç direnci HepG222bir kaynak olabilir. Ayrıca onlar hala bazı yapışma sağlar (şekil 5G, H) matris muhafaza gibi bu hücre kümeleri serbestçe askıya alınmış pulcuklarının değildi nota ilginç. Diğer taraftan, epitel-Mezenkimal-geçiş (EMT) küçük akciğer kanser hücrelerini ncı-H460, 3D microcryogels kültürlü ne zaman meydana gelmiştir spekülasyonlar. NCJ-H460 hücreleri gibi HepG2 Kümeleme yerine fibroblastlar (şekil 5J, K) gibi yayılmış. Bu nedenle, biz ilaç direnci artış bir geçiş epitel ncı-H460 hücrelerinin bir sonucu bir daha Malign devlet18,19,20,21,22 olabilir ileri sürüldü ,23.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55982/55982fig1.jpg"> 
Resim 1 : 3D Microtissue imalat ve uygulama rejeneratif terapi ve ilaç tarama şematik. Kısaca, boyut ve şekil kontrol edilebilir microcryogel çip bir dizi PMMA çipte jelatin cryogelation tarafından fabrikasyon. Microcryogel cips hasat çip dışı olarak tek tek microcryogels olabilir ve daha fazla, bireysel microcryogels hücreleri ile otomatik olarak yüklenen ve kültürlü enjekte edilebilir rejeneratif terapi için 3D microtissues oluşturmak için olabilir. Başka bir microcryogel fiş bir rezervuar dizi küçük parça ile birleştirin ve sonra daha fazla, hücreler ve kültür 3D microtissue diziler yüksek üretilen iş uyuşturucu tarama için yüklemek için bir uygulamadır. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55982/55982fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55982/55982fig2.jpg"> 
Resim 2:Microstencil dizi yongaları. (A, B) Fotoğrafları içeren iki PMMA microstencil fiş önünüze microwells (Yani, daire, elips, üçgen ve yonca) farklı şekillerde ve farklı boyutları ile dairesel şekli ile (çapı: 100, 200, 400 ve 800 µm), sırasıyla(a) ve iki karşılık gelen microcryogel dizi yongaları (B). (C, D) İki microcryogels dizi cips--dan hasat bireysel microcryogels mikroskobik görüntülerini. Ölçek çubuğu 500 µm =. Bu rakam izni başvurusu14ile değiştirildi. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55982/55982fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55982/55982fig3.jpg"> 
Şekil 3 : 3D enjekte edilebilir Microtissues karakterizasyonu. (A)fotoğraflarını hasat microcryogels. (B) elektron test (SEM) görüntüleri birbirine bağlı gösterilen microcryogels ve macroporous yapıları tarama. (C, D) Floresans mikroskobik ve 3D canlı/ölü ve rodamine tarafından lekeli hMSCs dolu microtissues confocal görüntülerini yeniden phalloidin. (E) miktar hMSCs özdevinimli ve farklı ilk yükleme yoğunlukları ile nükleer silahların yayılmasına karşı GMs içinde. (F) gerçek zamanlı enjeksiyon kuvvet ölçüm eğrileri 1.000 üçlü iğne için GMs 1 mL % 15 (wt/vol) jelatin çözeltisi 1 mL/dk enjeksiyon oranı (1000-1-%15) içinde. (G) canlı/ölü hMSCs yüklenen microtissues enjeksiyon öncesi ve sonrası enjeksiyon canlılığı tahlil hücre. HMSCs (H) yayılması GMs sonrası enjeksiyon kültür 1, 3 ve 5 gün sonra yüklendi (n = 3). * p &#60; gün 1 karşılaştırıldığında 0,05, tek yönlü ANOVA. Veri ± SEM demek olarak sunulan Bu rakam izni başvuru11ile değiştirildi. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55982/55982fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55982/55982fig4.jpg"> 
Şekil 4:angiogenez iskemik Hindlimbs 3D enjekte edilebilir Microtissues ile tedavi olarak gelişmiş ve gelişmiş kurtarma. (A)temsilcisi fotoğraflarını sham (n = 4), boş microcryogels (n = 4), ücretsiz hMSCs (105) (n = 8), hMSCs (105)-yüklü microtissues (n = 8) ve ücretsiz hMSCs (106) (n = 4) 0, 3, 7 ve 28 gün sonra tedavi. (B) floresan görüntüleri elde edilen 100 s ICG enjeksiyon 28 gün sonra. Bu rakam izni başvuru11ile değiştirildi. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55982/55982fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55982/55982fig5.jpg"> 
Şekil 5 : 3D Microtissue dizi yüksek üretilen iş uyuşturucu taraması. (A)384-multi-da format sonra derleme ve (B) resazurin hücre canlılığı tahlil dizisinin gerçekleştirilen dizide 3D microtissue fotoğrafı. (C) RFP-3T3 hücreleri microcryogel sonrası tohum içinde (ölçek çubuğu 200 µm =). (D) hücreleri homojen dağılımı microcryogel içinde çoklu katmanlar halinde betimleyen boyama çekirdeği 3D inşası. (E) tarama elektron test görüntü kapsamlı macroporous üzerinde yayılan RFP 3T3 hücre duvarlarının microcryogels içinde (ölçek çubuğu 20 µm =). (F) doksorubisin HepG2 hücreleri ve (ben) IMMLG-8439 ncı-H460 üzerinde hücreleri gösterilen 3D microtissue dizideki hali sitotoksisite testi IC50 2D karşılıkları karşılaştırma arttı. Veri ± SD (G) küçük pulcuklarının microcryogel HepG2 hücrelerinin demek gibi gösterilir (ölçek çubuğu = 100 µm), (hyıldızlar) microcryogel duvardaki kısmi bağlılık ile (ölçek çubuğu 20 µm =). (J) ncı-H460 hücreleri yapıştırılır ve yaymak-microcryogel içinde (ölçek çubuğu = 100 µm). (K) ncı-H460 sergileri fibr hücrelerioblastic morfolojisi (ölçek çubuğu 20 µm =). Bu rakam izni başvuru9ile değiştirildi. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55982/55982fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about 3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening at JoVE.com

3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening

Bu iletişim kuralı elastik 3D macroporous microcryogels imalatı microfabrication cryogelation teknolojisi ile entegre ederek açıklar. Hücrelerle yükleme üzerine, 3D microtissues, hangi rejeneratif terapi kolaylaştırmak için kolayca enjekte içinde vivo olabilir veya diziler vitro yüksek üretilen iş uyuşturucu tarama için içine monte oluşturulur.

Enjekte edilebilir rejeneratif terapi ve yüksek-den geçerek uyuşturucu tarama için 3D Microtissues

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous ...

3d-microtissues-for-injectable-regenerative-therapy-high-throughput

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.2K Görüntüleme.  Tsinghua University. Bu iletişim kuralı elastik 3D macroporous microcryogels imalatı microfabrication cryogelation teknolojisi ile entegre ederek açıklar. Hücrelerle yükleme üzerine, 3D microtissues, hangi rejeneratif terapi kolaylaştırmak için kolayca enjekte içinde vivo olabilir veya diziler vitro yüksek üretilen iş uyuşturucu tarama için içine monte oluşturulur.

Video: 3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening

Cell-based Calcium Assay for Medium to High Throughput Screening of TRP Channel Functions using FlexStation 3

The Molecular Devices' FlexStation 3 is a benchtop multi-mode microplate reader capable of automated fluorescence measurement in multi-well plates. It is ideal for medium- to high-throughput screens in academic settings. It has an integrated fluid transfer module equipped with a multi-channel pipetter and the machine reads one column at a time to monitor fluorescence changes of a variety of fluorescent reagents. For example, FlexStation 3 has been used to study the function of Ca2+-permeable ion channels and G-protein coupled receptors by measuring the changes of intracellular free Ca2+ levels. Transient receptor potential (TRP) channels are a large family of nonselective cation channels that play important roles in many physiological and pathophysiological functions. Most of the TRP channels are calcium permeable and induce calcium influx upon activation. In this video, we demonstrate the application of FlexStation 3 to study the pharmacological profile of the TRPA1 channel, a molecular sensor for numerous noxious stimuli. HEK293 cells transiently or stably expressing human TRPA1 channels, grown in 96-well plates, are loaded with a Ca2+-sensitive fluorescent dye, Fluo-4, and real-time fluorescence changes in these cells are measured before and during the application of a TRPA1 agonist using the FLEX mode of the FlexStation 3. The effect of a putative TRPA1 antagonist was also examined. Data are transferred from the SoftMax Pro software to construct concentration-response relationships of TRPA1 activators and inhibitors.

This video provides a detailed protocol for studying the pharmacological profile of human TRPA1 channels using FlexStation 3. The protocol covers details of cell preparation, dye loading and operation of the microplate reader, FlexStation 3.

FlexStation kullanarak 3 TRP Kanal İşlevleri Yüksek Verimli Tarama Orta Hücre tabanlı Kalsiyum Testi

The Molecular Devices' FlexStation 3 is a benchtop multi-mode microplate reader capable of automated fluorescence measurement in multi-well plates.  It is ...

Biyomühendislik

Candida albicans Biofilm Chip (CaBChip) for High-throughput Antifungal Drug Screening

Candida albicans remains the main etiological agent of candidiasis, which currently represents the fourth most common nosocomial bloodstream infection in US hospitals1. These opportunistic infections pose a growing threat for an increasing number of compromised individuals, and carry unacceptably high mortality rates. This is in part due to the limited arsenal of antifungal drugs, but also to the emergence of resistance against the most commonly used antifungal agents. Further complicating treatment is the fact that a majority of manifestations of candidiasis are associated with the formation of biofilms, and cells within these biofilms show increased levels of resistance to most clinically-used antifungal agents2. Here we describe the development of a high-density microarray that consists of C. albicans nano-biofilms, which we have named CaBChip3. Briefly, a robotic microarrayer is used to print yeast cells of C. albicans onto a solid substrate. During printing, the yeast cells are enclosed in a three dimensional matrix using a volume as low as 50 nL and immobilized on a glass substrate with a suitable coating. After initial printing, the slides are incubated at 37 &deg;C for 24 hours to allow for biofilm development. During this period the spots grow into fully developed "nano-biofilms" that display typical structural and phenotypic characteristics associated with mature C. albicans biofilms (i.e. morphological complexity, three dimensional architecture and drug resistance)4. Overall, the CaBChip is composed of ~750 equivalent and spatially distinct biofilms; with the additional advantage that multiple chips can be printed and processed simultaneously. Cell viability is estimated by measuring the fluorescent intensity of FUN1 metabolic stain using a microarray scanner. This fungal chip is ideally suited for use in true high-throughput screening for antifungal drug discovery. Compared to current standards (i.e. the 96-well microtiter plate model of biofilm formation5), the main advantages of the fungal biofilm chip are automation, miniaturization, savings in amount and cost of reagents and analyses time, as well as the elimination of labor intensive steps. We believe that such chip will significantly speed up the antifungal drug discovery process.

Candida albicans Biofilm Chip CaBChip for High-throughput Antifungal Drug Screening

We have developed a high-density microarray platform consisting of 3D nano-biofilms of C. albicans called CaBChip. The susceptibility profile of drugs tested on a CaBChip is comparable to the conventional 96-well plate model, suggesting that the fungal chip is ideally suited for true high-throughput screening of antifungal drugs.

Yüksek verim Antifungal İlaç Tarama Candida albicans Biyofilm Chip (Ca BChip)

Candida  albicans remains the main etiological agent of candidiasis, which  currently represents the fourth most common nosocomial bloodstream infection ...

Harmonic Nanoparticles for Regenerative Research

In this visualized experiment, protocol details are provided for in vitro labeling of human embryonic stem cells (hESC) with second harmonic generation nanoparticles (HNPs). The latter are a new family of probes recently introduced for labeling biological samples for multi-photon imaging. HNPs are capable of doubling the frequency of excitation light by the nonlinear optical process of second harmonic generation with no restriction on the excitation wavelength.
Multi-photon based methodologies for hESC differentiation into cardiac clusters (maintained as long term air-liquid cultures) are presented in detail. In particular, evidence on how to maximize the intense second harmonic (SH) emission of isolated HNPs during 3D monitoring of beating cardiac tissue in 3D is shown. The analysis of the resulting images to retrieve 3D displacement patterns is also detailed.

Protocol details are provided for in vitro labeling human embryonic stem cells with second harmonic generating nanoparticles. Methodologies for hESC investigation by multi-photon microscopy and their differentiation into cardiac clusters are also presented.

Rejeneratif Araştırma harmonik nanopartiküller

In this visualized experiment, protocol details are provided for in vitro labeling of human embryonic stem cells (hESC) with second harmonic generation ...

An Injectable and Drug-loaded Supramolecular Hydrogel for Local Catheter Injection into the Pig Heart

Regeneration of lost myocardium is an important goal for future therapies because of the increasing occurrence of chronic ischemic heart failure and the limited access to donor hearts. An example of a treatment to recover the function of the heart consists of the local delivery of drugs and bioactives from a hydrogel. In this paper a method is introduced to formulate and inject a drug-loaded hydrogel non-invasively and side-specific into the pig heart using a long, flexible catheter. The use of 3-D electromechanical mapping and injection via a catheter allows side-specific treatment of the myocardium. To provide a hydrogel compatible with this catheter, a supramolecular hydrogel is used because of the convenient switching from a gel to a solution state using environmental triggers. At basic pH this ureido-pyrimidinone modified poly(ethylene glycol) acts as a Newtonian fluid which can be easily injected, but at physiological pH the solution rapidly switches into a gel. These mild switching conditions allow for the incorporation of bioactive drugs and bioactive species, such as growth factors and exosomes as we present here in both in vitro and in vivo experiments. The in vitro experiments give an on forehand indication of the gel stability and drug release, which allows for tuning of the gel and release properties before the subsequent application in vivo. This combination allows for the optimal tuning of the gel to the used bioactive compounds and species, and the injection system.

Supramolecular hydrogelators based on ureido-pyrimidinones allow full control over the macroscopic gel properties and the sol&#8211;gel switching behavior using pH. Here, we present a protocol for formulating and injecting such a supramolecular hydrogelator via a catheter delivery system for local delivery directly in relevant areas in the pig heart.

Domuz Kalbe Yerel Kateter Enjeksiyon için bir Enjekte ve İlaç yüklü Supramoleküler Hidrojel

Regeneration of lost myocardium is an important goal for future therapies because of the increasing occurrence of chronic ischemic heart failure and the ...

A Rapid and Quantitative Fluorimetric Method for Protein-Targeting Small Molecule Drug Screening

We demonstrate a new drug screening method for determining the binding affinity of small drug molecules to a target protein by forming fluorescent gold nanoclusters (Au NCs) within the drug-loaded protein, based on the differential fluorescence signal emitted by the Au NCs. Albumin proteins such as human serum albumin (HSA) and bovine serum albumin (BSA) are selected as the model proteins. Four small molecular drugs (e.g., ibuprofen, warfarin, phenytoin, and sulfanilamide) of different binding affinities to the albumin proteins are tested. It was found that the formation rate of fluorescent Au NCs inside the drug loaded albumin protein under denaturing conditions (i.e., 60 &#176;C or in the presence of urea) is slower than that formed in the pristine protein (without drugs). Moreover, the fluorescent intensity of the as-formed NCs is found to be inversely correlated to the binding affinities of these drugs to the albumin proteins. Particularly, the higher the drug-protein binding affinity, the slower the rate of Au NCs formation, and thus a lower fluorescence intensity of the resultant Au NCs is observed. The fluorescence intensity of the resultant Au NCs therefore provides a simple measure of the relative binding strength of different drugs tested. This method is also extendable to measure the specific drug-protein binding constant (KD) by simply varying the drug content preloaded in the protein at a fixed protein concentration. The measured results match well with the values obtained using other prestige but more complicated methods.

A protocol for small molecular drug screening based on in-situ synthesis of ultrasmall fluorescent gold nanoclusters (Au NCs) using drug-loaded protein as template is presented. This method is simple to determine the binding affinity of drugs to a target protein by a visible fluorescent signal emitted from the protein-templated Au NCs.

Protein-Hedefleme Küçük Molekül İlaç Tarama için hızlı ve Nicel florimetrik Yöntemi

We demonstrate a new drug screening method for determining the binding affinity of small drug molecules to a target protein by forming fluorescent gold ...

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet high-throughput, method to perform single-cell culture experiments. Here, we report a microfluidic chip-based strategy for high-efficiency single-cell isolation (~77%) and demonstrate its capability of performing long-term single-cell culture (up to 7 d) and cellular heterogeneity analysis using clonogenic assay. These applications were demonstrated with KT98 mouse neural stem cells, and A549 and MDA-MB-435 human cancer cells. High single-cell isolation efficiency and long-term culture capability are achieved by using different sizes of microwells on the top and bottom of the microfluidic channel. The small microwell array is designed for precisely isolating single-cells, and the large microwell array is used for single-cell clonal culture in the microfluidic chip. This microfluidic platform constitutes an attractive approach for single-cell culture applications, due to its flexibility of adjustable cell culture spaces for different culture strategies, without decreasing isolation efficiency.

Here, we present a protocol for isolating and culturing single cells with a microfluidic platform, which utilizes a new microwell design concept to allow for high-efficiency single cell isolation and long-term clonal culture.

Yüksek verim Tek hücreli İzolasyonu ve Kültür mikroakışkan Platformu

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

Micropatterning and Assembly of 3D Microvessels

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass based substrates, and hydrogel-based tube formation assays. These assays, while informative, do not recapitulate lumen geometry, proper extracellular matrix, and multi-cellular proximity, which play key roles in modulating vascular function. This manuscript describes an injection molding method to generate engineered vessels with diameters on the order of 100 &#181;m. Microvessels are fabricated by seeding endothelial cells in a microfluidic channel embedded within a native type I collagen hydrogel. By incorporating parenchymal cells within the collagen matrix prior to channel formation, specific tissue microenvironments can be modeled and studied. Additional modulations of hydrodynamic properties and media composition allow for control of complex vascular function within the desired microenvironment. This platform allows for the study of perivascular cell recruitment, blood-endothelium interactions, flow response, and tissue-microvascular interactions. Engineered microvessels offer the ability to isolate the influence from individual components of a vascular niche and precisely control its chemical, mechanical, and biological properties to study vascular biology in both health and disease.

This manuscript presents an injection molding method to engineer microvessels that recapitulate physiological properties of endothelium. The microfluidic-based process creates patent 3D vascular networks with tailorable conditions, such as flow, cellular composition, geometry, and biochemical gradients. The fabrication process and examples of potential applications are described.

Micropatterning ve 3D mikrodamarlar Meclisi

In vitro platforms to study endothelial cells and vascular biology are largely limited to 2D endothelial cell culture, flow chambers with polymer or glass ...

Use of High-Throughput Automated Microbioreactor System for Production of Model IgG1 in CHO Cells

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of experimental conditions while minimizing potential process variability. Applications of this approach include: clone screening, temperature and pH shifts,&#160;media and supplement optimization. Furthermore, the small reactor volumes are conducive to large Design of Experiments that investigate a wide range of conditions. This allows upstream processes to be significantly optimized before scale-up where experimentation is more limited in scope due to time and economic constraints. Automated microscale bioreactor systems offer various advantages over traditional small scale cell culture units, such as shake flasks or spinner flasks. However, during pilot scale process development&#160;significant care must be taken to ensure that these advantages are realized. When run with care, the system can enable high level automation, can be programmed to run DOE&#39;s with a higher number of variables&#160;and can reduce sampling time when integrated with a nutrient analyzer or cell counter. Integration of the expert-derived heuristics presented here, with current automated microscale bioreactor experiments can minimize common pitfalls that hinder meaningful results. In the extreme, failure to adhere to the principles laid out here can lead to equipment damage that requires expensive repairs. Furthermore, the microbioreactor systems have small culture volumes&#160;making characterization of cell culture conditions difficult. The number and amount of samples taken in-process in batch mode culture is limited as operating volumes cannot fall below 10 mL. This method will discuss the benefits and drawbacks of microscale bioreactor systems.

A detailed protocol for the concurrent operation of 48 parallel cell cultures under varied conditions in a microbioreactor system is presented. Cell culture process, harvest and subsequent antibody titer analysis are described.

Yüksek üretilen iş kullanımı otomatik Microbioreactor sistemi modeli Igg1 CHO hücrelerdeki imalatı için

Automated microscale bioreactors (15 mL) can be a useful tool for cell culture engineers. They facilitate the simultaneous execution of a wide variety of ...

Biosensor-based High Throughput Biopanning and Bioinformatics Analysis Strategy for the Global Validation of Drug-protein Interactions

Receptors and enzyme proteins are important biomolecules that act as binding targets for bioactive small molecules. Thus, the rapid and global validation of the drug-protein interactions is highly desirable for not only understanding the molecular mechanisms underlying therapeutic efficacy but also for assessing drug characteristics, such as adsorption, distribution, metabolism, excretion, and toxicity (ADMET) for clinical use. Here, we present a biosensor-based high throughput strategy for the biopanning of T7 phage-displayed short peptides that can be easily displayed on the phage capsid. Subsequent analysis of the amino acid sequences of peptides containing short segments, as &#34;broken relics&#34;, of the drug-binding sites using bioinformatics programs in receptor ligand contact (RELIC) suite, is also shown. By applying this method to two clinically approved drugs, an anti-tumor irinotecan, and an anti-flu oseltamivir, the detailed process for collecting the drug-recognizing peptide sequences and highlighting the drug-binding sites of the target proteins are explained in this paper. The strategy described herein can be applied for any small molecules of interest.

This study aimed to present a strategy for identifying drug-peptide interactions. The strategy involves the biopanning of drug-recognizing short peptides based on a quartz-crystal microbalance (QCM) biosensor, followed by bioinformatics analysis for quantitatively assessing the information obtained for the drug recognition and annotation of the drug-binding sites on proteins.

İlaç-protein Etkileşimlerinin Küresel Doğrulanması için Biyosensör Tabanlı Yüksek Verimli Biyopanning ve Biyoinformatik Analiz Stratejisi

Receptors and enzyme proteins are important biomolecules that act as binding targets for bioactive small molecules. Thus, the rapid and global validation ...

Injectable Supramolecular Polymer-Nanoparticle Hydrogels for Cell and Drug Delivery Applications

These methods describe how to formulate injectable, supramolecular polymer-nanoparticle (PNP) hydrogels for&#160;use as biomaterials. PNP hydrogels are composed of two components: hydrophobically modified cellulose as the network polymer and self-assembled core-shell nanoparticles that act as non-covalent cross linkers through dynamic, multivalent interactions. These methods describe both the formation of these self-assembled nanoparticles through nanoprecipitation as well as the formulation and mixing of the two components to form hydrogels with tunable mechanical properties. The use of dynamic light scattering (DLS) and rheology to characterize the quality of the synthesized materials is also detailed. Finally, the utility of these hydrogels for drug delivery, biopharmaceutical stabilization, and cell encapsulation and delivery is demonstrated through in vitro experiments to characterize&#160;drug release, thermal stability, and cell settling and viability. Due to its biocompatibility, injectability, and mild gel formation conditions, this hydrogel system is a readily tunable platform suitable for a range of biomedical applications.

This protocol describes the synthesis and formulation of injectable, supramolecular polymer-nanoparticle (PNP) hydrogel biomaterials. Applications of these materials for drug delivery, biopharmaceutical stabilization, and cell encapsulation and delivery are demonstrated.

Hücre ve İlaç Dağıtım Uygulamaları için Enjekte Edilebilir Supramoleküler Polimer-Nanopartikül Hidrojelleri

These methods describe how to formulate injectable, supramolecular polymer-nanoparticle (PNP) hydrogels for&#160;use as biomaterials. PNP hydrogels are ...