Yazarlar Ulusal Kanser Enstitüsü Ulusal Sağlık yolun Enstitüleri bağımsızlık Ödülü (K99CA201603) kabul etmiş oluyorsunuz.

Bu protokol için kullanılan yenidoğan sıçan cardiomyocytes 2 bayat Sprague-Dawley fareler kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi Brigham ve kadın Hastanesi tarafından onaylanmış bir iyi kurulmuş yordamı56 takip dan izole edildi.
1. Bioprinter araçları
<ol>
	<li>(Örneğin, 27 G, 1 inç) daha küçük bir künt iğne çekirdek çift katmanlı, konsantrik mikrosıvısal yazdırma kafasını oluşturmak için kılıf (örneğin, 18 G, ½ inç) daha büyük bir künt iğne merkezi haline ekle; çekirdek iğne hafif çıkıntılı emin olun (~ 1 mm) dış kabuk (şekil 1A) daha uzun. Ama uygun boyutlarda gerekli mesafe tutucular geçici iç/dış iğne ucu ve konsantrik hizalama yardımcı olmak için varil iki taraf arasında gözükeceksin Eğer hizalama genellikle el ile ayarlanır. Varil epoksi yapıştırıcı ile kavşak mühür ve hizalama çubukları uygun olduğunda uç taraftan kaldırın.</li>
	<li>Başka bir iğne (23 G) Merkezi iğne ters yönde varil ekleyin.  Sonra dış iğne varil tarafında bir delik oluşturmak ve sızdırmazlık epoksi yapıştırıcı ile ardından deliğe boyutu eşleşen bir metal konektörünü takın.</li>
	<li>Alıcılar için bir çift kanallı şırınga pompa enjeksiyon bioink ve çapraz çözüm için kafasının tek tek, iki PVC borular bağlayın. Ekstruder poly(methyl methacrylate) (PMMA) yapılan bir plastik tutucu kullanarak bir bioprinter başkanı üzerine monte. Not: Bioprinter seçimi kullanılabilirliğine bağlıdır. Bizim durumumuzda, başarıyla bu kurulum birkaç piyasada bulunan bioprinters üzerinde test ettik. Ancak, bir x-y-z motorlu sahne sahiptir herhangi bir bioprinter bu mikrosıvısal yazdırma kafasını bütünleştirilmesi ilke olarak, etkinleştirmeniz gerekir.</li>
</ol>
2. Bioprinting Microfibrous vasküler yatağın
<ol>
	<li>Aljinat (4 w/v%, düşük viskozite), jelatin methacryloyl (GelMA, 1-2 w/v%)57,58ve photoinitiator Irgacure 2959 karışımı kullanarak bioink yapmak (0.2 - 0.5 wt.%) 25 mM 2-[4-(2-hydroxyethyl) piperazin-1-yl içinde çözünmüş] etan sülfonik asit (HEPES tampon, pH 7,4) içeren 10 vol.% fetal sığır serum (FBS).</li>
	<li>10 vol.% FBS crosslinking taşıyıcı sıvı olarak içeren HEPES tampon yapmak a eriyik 0,3 M CaCl2 .</li>
	<li>Bioprinting, hemen önce insan göbek damar endotel hücrelerden (HUVECs) tedavi 0,05 w/v% tripsin tarafından 5-10dk için kullanarak şişeler ayırmak ve bioink 5-10 × 106 hücre/mL bir konsantrasyon, hücrelerde resuspend. Süspansiyon homojen dağılımı sağlamak için yavaş yavaş 5-10 kat pipette.</li>
	<li>5 µL/mL aynı akış hızı bir çift kanallı şırınga pompa kullanarak bioink/crosslinking sıvı enjeksiyon başlatın. Akar onlar stabilize kadar 1 dakikaya kadar sürekli çalışmaya izin verilebilir. Daha sonra Yazdırma kafası hareket ifade hız yaklaşık 4 mm/s (şekil 1B) ile bioprinter kontrol ederek başlatın. Bu hızları iyi en iyi bioprinting emin olmak için her yeni ayarları ile ayarlama. Bioprinting işlemi genellikle oda sıcaklığında (21-25 ° C) yapılmış ama bu sıcaklık değişmiş olabilir. Bioprinting işleminin hızlı iyonik jelleşme aljinat bileşeni ve bir microfibrous İskele yapısı-İskele (şekil 1B) birikimi için izin vermelidir.</li>
	<li>İskele bioprinted sonra kimyasal jelleşme 20-30 s (şekil 1C) için daha fazla photocrosslinking GelMA bileşeni, yaklaşık 5-10 mW/cm2 UV ışık (360-480 nm) tarafından elde.</li>
	<li>Bioprinting ve çapraz yavaşça iskele fosfat tamponlu tuz aşırı CaCl2kaldırmak için (PBS) ile yıkayın. Kültür HUVECs yüklü microfibrous iskele endotel hücre büyüme orta (EGM) 16 gün için bir kuluçka-37 ° C ve 5 vol.% CO2 orta ile en az 2 günde değişti. Bir mikroskop altında HUVECs türleri Morfoloji kültür dönemde izlemek.</li>
</ol>
3. bozukluklarına doku oluşturma
<ol>
	<li>HUVECs Lümen benzeri yapıları (şekil 1D) oluşturmak için iskele microfibers çevrelerine geçiş, iskele almak ve yavaşça bir hidrofobik yüzey (örneğin, polymethylsiloxane [PDMS] bir levha) bir yüzeye yerleştirin. Bir parça steril filtre kağıdı dikkatle kapiller Kuvvetleri ile iskele interstisyel uzaydan gelen tüm Orta kaldırmak için kullanın.</li>
	<li>Hemen bir damla (yaklaşık 20-40 µL) orta 1-10 × 106 hücre/mL İskele yapısı-İskele (şekil 1E) tüm interstisyel alanı sızmak iskele üstüne yoğunluğu, süspansiyon bir ikincil hücre türü (örneğin, cardiomyocytes) ekleyin. Bu tür bir yapılandırma bir kuluçka (37 ° C, 5 vol.% CO2, % 95 bağıl nem) 0.5 - hücreleri bireysel microfibers bağlı kalmak izin vermek için 2 h için kuluçkaya. Damlacık boyutu fark yok buharlaşma görülmektedir emin olmak için bir süre içinde izlemek.</li>
	<li>Yavaşça iskele istenen bozukluklarına doku kurdu kadar herhangi bir yapışık olmayan hücreleri ve kültür yapısı ilgili ortamda kaldırmak için PBS banyo sallayarak yıkayın.</li>
</ol>

Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.

İnşaat koaksiyel kafasının doğru başarılı mikrosıvısal bioprinting her iki bioink aynı anda teslim çekirdek ve kılıf itibaren crosslinking ajan için izin vermek için kritik bir adımdır. Bu protokol için bir örnek yazdırma kafasını 27 G iğne çekirdek ve bir 18 G iğne kabuk olarak kullanılarak oluşturulmuş olsa da, kolayca farklı boyutlarda iğne kullanarak kombinasyonları çeşitli için uzatılabilir. Ancak, akışı miktarında değişiklik her aşamasında teslim, iğne boyutlarda değişiklik hem bioink ve çapraz (kişi tarafından ayarlanabilen bir çift kanallı bir yerine iki şırınga pompa kullanarak) ve potansiyel olarak Ayrıca tarafından bioprinter sonucunda oluşan birikim hızı akış hızı daha fazla optimizasyonu gerektirir.
Geçerli protokol parametrelerinde (iğne boyutları, debi ve birikim hızı) kombinasyonu, yaklaşık 150 µm için denge orta55yılında sonra şişmeye ifade hemen sonra yaklaşık 120 µm büyüklüğündeki bioprinted microfibers yol açtı. Microfibers katmanlar arasında boşluk olduğu böyle bir boyutu bioprinted yapıları katman kalınlığı da kabaca eşittir. Bioprinted microfibers çapını tüm üç parametreleri54,63bir fonksiyondur; Yazdırma kafasının çekirdek iğne ve bioink akış hızı boyutunu olumlu ilişkili mısınız microfibers çapı ile kılıf iğne, Debi crosslinking Aracısı ve birikim hızı boyutunu olumsuz yönde korelasyon ise microfibers çapı ile. Yazdırma kafasının ve/veya motorlu sahne hareketi üzerinde kontrol microfibrous iskele rasgele yapıları54,55ifade için izin verecek.
Ayrıca, bioink formülasyonu bioprinting de profil değişebilir. Örneğin, aljinat ve GelMA miktarı biraz göre belirli uygulamaları modülasyonlu ve ek malzemeler polietilen glikol-tetraacrylate (PEGTA) bioprinted microfibers40mekaniği artıran gibi bioink içine karıştırmak mümkündür. UV crosslinking de daha fazla katıştırılmış endotel hücreleri54davranışını etkileyebilir bioprinted microfibers ortasına mekanik özelliklerini belirler. Bu protokol için rapor parametreleri HUVECs için optimize. Ancak, endotel hücreleri her farklı türü için crosslinking parametreleri yeniden microfibers oluşumunda Lümen elde etmek için optimize edilmiş olması gerekir ki, tahmin edilmektedir.
Orta hücre tipi bioprinted vasküler yatağın üzerine temel için iskele bir parça hidrofobik yüzey üzerine yerleştirin ve interstisyel alanda, scaffold çoğu orta kaldırıldığından emin olmak gereklidir. Bu hücre süspansiyon hemen infiltrasyonu microfibers yüzeyine bağlı hücre sayısını en üst düzeye çıkarma microfibrous yapıda damlacık serbest duran ve İskele tohum, ders sırasında şifreleme sağlar. Her ne kadar cardiomyocytes 5 × 106 hücre/mL, nispeten yüksek yoğunluğu geçerli protokolündeki miyokard doku oluşturmak için kullanılan, böyle yoğunluk keyfi olarak belirli doku türleriyle eşleştirmek üzere ayarlanabilir. Steril su doldurarak fark oksijen bir ortam sağlamak için önemlidir veya PBS (Yani, çevredeki kuyu veya PDMS levha çevreleyen alan), iskele çevresinde sağlanması tohum için orta az miktarda tohum döneminde buharlaşır değil.
Özetle, biz bozukluklarına dokulara uygun imalat için mikrosıvısal bioprinting detaylı bir protokol sağladı. Bu strateji, bir çekirdek-kılıf koaksiyel yazdırma kafasını bir hibrid bioink kılıf çekirdek ve crosslinking aracısından üzerinden eşzamanlı ekstrüzyon etkinleştirmek için kullanılır. Co-ekstrüzyon, üzerine bioink hemen bir katmanlı microfibrous iskele bioprinter hareketi tarafından programlanmış gibi şekillendirme kendi aljinat bileşeni için fiziksel crosslinking uğrar, kimyasal olarak tüm yapı ise photocrosslinked uzun vadeli istikrar sağlamak GelMA bileşeni için daha fazla. Endotel hücreleri bioprinting işlemi sırasında microfibers içinde kapsüllü çoğalırlar ve Lümen benzeri yapıları, iskele vasküler yatağa dönme varsayarak çevrelerine acilen yükseltmelidir. Orta hücre tipi tohum tarafından bir bozukluklarına doku yapısı daha sonra oluşturulabilir. Bu mikrosıvısal bioprinting strateji benzersizdir ve çeşitli doku tipleri gibi karaciğer, iskelet kas için elverişli bir konuma sahip genişletilebilir ve kanserlerin yanı sıra Miyokardiyum geçerli iletişim kuralı ' rasyonel istenen hücre tipleri birleşimi tarafından resimli ve bioprinted microfibrous İskele Kalıpları özel olarak tasarlanmış. Böyle bir yöntem ile üretilen bozukluklarına doku yapıları içinde vivo doku rejenerasyonu veya vitro doku modelleme için kullanılabilir.
Bu protokol için açıklanan mikrosıvısal bioprinting strateji ile ilgili bazı sınırlamaları vardır. İlk olarak, bioprinted microfibers çapını CaCl2 çözüm için verimli bir şekilde crosslink çekirdek aljinat bileşeninde hidrojel matris difüzyon engel nedeniyle birkaç yüz mikrometre sınırlıdır. Aşırı düşük fiziksel crosslinking yoğunluğu çok katmanlı yapısı kararsız hale getirir. İkinci olarak, fiziksel crosslinking Ajan CaCl2 çözüm daha kırılgan HUVECs, endotelyal progenitor hücreler gibi bazı endotel hücre türleri üzerinde olumsuz etkileri uygulamak. Endotel hücre tipleri daha geniş için böyle bir bioprinting yöntemini kullanarak fizibilite ek araştırmalar gerektirebilir. Üçüncü olarak, endotel hücreleri Lümen benzeri yapıları microfibers içinde oluşabilir iken, bu microfibers çekirdek perfüzyon etkinleştirmek için içi boş değildir. Bu nedenle, besin ve oksijen hala bioprinted iskele interstisyel alanda üzerinden olmak üzere sağlanmıştır. Kurban malzemeleri adaptasyon bioink64 photocrosslinkable bileşeni olarak teknoloji gelecekteki sürümlerinde bu sorunu çözebilir. Alternatif olarak, bioprinted içi boş microfibrous yapıları42,43,65,66,67,68 vasküler yatak olarak doğrudan perfüzyon bozukluklarına doku sağlamak için kullanılan oluşturur. Son, bioprinting klinik ölçekli dokuların hangi büyük olasılıkla yüksek işlem hacmi itibariyle genişletilmiş ölçek bioprinting ulaşmak için dizilmiş mikrosıvısal yazdırma kafalarını69 tasarımını dahil ederek ele alınabileceği zorlu, kalmış olabilir.

Doku Mühendisliği hedeflerini değiştirmek, geri yükleme veya bu yaralı veya hastalıklı insan vücudu1,2,3,4, sık sık istenen hücre tipleri, biyoaktif molekülleri5,6ve Biyomalzeme7,8,9,10bir birleşimi yoluyla çoğaltmak için kullanılan işlev doku yerine oluşturmak için. Daha yakın zamanlarda, doku Mühendisliği teknolojilerini de giderek ilaç geliştirme, değiştirme geleneksel aşırı Basitleştirilmiş düzlemsel hücre kültürleri11,12,13,14,15,16,17,18,19gibi uygulamalar için in vivo karşılıkları önemli işlevlerini taklit vitro doku ve organ modelleri oluşturmak için kabul edilmiş. Her iki durumda, yetenek karmaşık mikro mimarisi ve insan dokuların hiyerarşik yapısını özetlemek için mühendislik doku10işlevselliğini etkinleştirme önemlidir ve vaskülarizasyon alan20,21,22,23en büyük zorluklardan biri sunar beri özellikle, vasküler bir ağ mühendislik dokuların entegre etmek talebi yollarıdır.
Bugüne kadar çeşitli yaklaşımlar geliştirilmiştir bu konuda başarı8değişik derecelerde ile mühendislik doku yapıları içine damar yapıları oluşturmak için bir girişim. Örneğin, kendinden montajlı endotel hücrelerinin mikrovasküler ağlar24üretimi için izin verir; Teslimat anjiogenik büyüme faktörlerinin sürekli neovaskülarizasyon25,26neden olmaktadır; Vasküler progenitör hücrelerin kullanın ve endotel hücre büyümesi ve derleme24,27perisitlerden kolaylaştırır; İskele özelliklerini tasarlama vaskülarizasyon28,29hassas modülasyon sağlar; ve vasküler katman30uygun manipülasyon için hücre sayfası teknolojisi sağlar. Yine de, bu stratejileri kez kan damarlarının bir mühendislik doku yapısı ve böylece sınırlı tekrarlanabilirlik içinde rasgele dağıtıma giden damarlara, kayma desenlendirme denetleme yeteneğine bağışlamak değil. Son birkaç yıl içinde bioprinting Teknolojileri karmaşık doku desenleri yüksek sadakat ve tekrarlanabilirlik bir otomatik veya yarı otomatik şekilde31,32,33yatırma benzersiz onların çok yönlülüğü nedeniyle böyle bir sorun çözüm doğru etkinleştirmenin bir sınıf olarak ortaya çıkmıştır. Kurban bioprinting34,35,36,37,38, katıştırılmış bioprinting39,40,41ve var içi boş yapı bioprinting/biofabrication42,43,44,45,46,47,48,49,50,51,52,53 tüm vasküler veya bozukluklarına doku oluşturma fizibilite gösterdi.
Alternatif olarak, microfibrous iskele imal etmek bir mikrosıvısal bioprinting strateji son zamanlarda geliştirilmiştir, nerede bir hibrid bioink aljinat beste ve jelatin methacryloyl (GelMA) eş merkezli bir yazdırma kafası ve Kalsiyum klorür (CaCl2) çözüm çekirdek aracılığıyla teslim edildi yazdırma kafasını54,55dış kılıf akış gerçekleştirildiği. Co-ekstrüzyon sonraki photocrosslinking çok katmanlı microfibrous iskele kalıcı istikrar sağlanmış iken mikrofiber oluşumu, etkinleştirmek için hemen fiziksel polietilenin aljinat bileşeni için izin iki akış. Not, endotel hücreleri bioprinted microfibers içinde kapsüllü çoğalırlar ve vasküler yatağın54,55taklit Lümen benzeri yapıları varsayarak microfibers çevrelerine karşı geçirmek için bulunamadı. Bu bioprinted endothelialized vasküler yatak daha sonra ile doldurulur ikincil hücre tipleri daha fazla bozukluklarına doku55oluşturmak için istenen. Bu iletişim kuralı böylece bozukluklarına dokuları doku Mühendisliği ve organoid modelleme potansiyel uygulamalar için uygun imalat sağlar konsantrik meme tasarım tarafından etkin böyle bir stratejinin mikrosıvısal bioprinting detaylı bir yordam sağlar.

<table width="1270">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:467px;height:21px;">Alginic acid sodium salt from brown algae</td>
			<td style="width:160px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:163px;">A0682</td>
			<td style="width:480px;">BioReagent, plant cell culture tested, low viscosity, powder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:467px;height:21px;">Gelatin type A from porcine skin</td>
			<td style="width:160px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:163px;">G2500</td>
			<td>Gel strength 300</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:467px;height:42px;">Irgacure 2959 (2-Hydroxy-4&#39;-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone)</td>
			<td style="width:160px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:163px;">410896</td>
			<td>98%</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:467px;height:21px;">HEPES buffer</td>
			<td style="width:160px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:163px;">H0887</td>
			<td>1 M, pH 7.0-7.6, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:467px;height:42px;">Fetal bovine serum&#160;</td>
			<td style="width:160px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:163px;">10438026</td>
			<td>Qualified, heat-inactivated, USDA-approved regions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:467px;height:21px;">Calcium chloride dihydrate</td>
			<td style="width:160px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:163px;">C5080</td>
			<td>BioXtra, &#8805;99.0%</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:467px;height:42px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:160px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:163px;">10010023</td>
			<td>pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:467px;height:21px;">Human umbilical vein endothelial cells</td>
			<td style="width:160px;">Angio-Proteomie</td>
			<td style="width:163px;">cAP-0001</td>
			<td>Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:467px;height:21px;">GFP-expressing human umbilical vein endothelial cells</td>
			<td style="width:160px;">Angio-Proteomie</td>
			<td style="width:163px;">cAP-0001GFP</td>
			<td>GFP-Expressing Human Umbilical Vein Endothelial Cells (GFPHUVECs)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:467px;height:21px;">Endothelial cell growth medium</td>
			<td style="width:160px;">Lonza</td>
			<td style="width:163px;">CC-3162</td>
			<td>EGM-2 BulletKit</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:467px;height:42px;">Dulbecco&#8217;s Modified Eagle Medium&#160;</td>
			<td style="width:160px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:163px;">12430054</td>
			<td>High glucose, HEPES</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="width:467px;height:42px;">Sylgard 184 silicone elastomer kit</td>
			<td style="width:160px;">Ellsworth Adhesives</td>
			<td style="width:163px;">184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td>
			<td>Clear 0.5 kg Kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="width:467px;height:21px;">UV curing lamp system</td>
			<td style="width:160px;">Excelitas Technologies</td>
			<td style="width:163px;">OmniCure S2000</td>
			<td>Spot UV Light Curing System with Intelligent UV Sensor</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

microfluidic bioprinting for engineering vascularized tissues and organoids

Bozukluklarına doku mühendislik yapıları ve organoids tarihsel zorlu olmuştur. Burada bir iskele ile çok katmanlı hidrojel microfibers titreşimli görüntüyü oluşturmak için mikrosıvısal bioprinting dayalı bir roman yöntemi açıklanmaktadır. Pürüzsüz elde etmek için bioprinting, çekirdek akışı ve kılıf akış tarafından taşınan crosslinking çözüm kalıptan çekilmiş bir bileşik bioink formülasyonu içeren bir çekirdek-kılıf mikrosıvısal yazdırma kafasını tasarlanmış ve bioprinter monte. Jelatin methacryloyl (GelMA) aljinat ile karıştırma tarafından varlığı anlık iyonik crosslinking uğrar bir polisakkarit seçin divalent iyonları, kalıcı istikrar elde etmek için GelMA bileşen ikincil bir photocrosslinking tarafından takip, bir microfibrous iskele bu bioprinting strateji kullanarak elde edilebilir. Önemlisi, bioprinted microfibers içinde kapsüllü endotel hücreleri damarlara kültür boyunca 16 gün benzeyen Lümen benzeri yapılar oluşturabilir. Endothelialized microfibrous iskele daha fazla vasküler yatak microfibers interstisyel uzaya ikincil hücre türünün sonraki tohumlama yoluyla bozukluklarına bir doku oluşturmak için kullanılabilir. Mikrosıvısal bioprinting uygun Mühendisliği, yüksek sadakat bozukluklarına dokuların Genelleştirilmiş bir strateji sağlar.

Mikrosıvısal bioprinting strateji microfibrous iskele düşük viskozite bioinks54,55kullanarak doğrudan ekstrüzyon bioprinting için sağlar. Şekil 2'A, bir iskele 6 × 6 × 6 mm bir boyutu ile gösterildiği gibi3 içeren &#62; microfibers 30 kat bioprinted 10 dk içinde olabilir. CaCl2 aljinat bileşeniyle hemen iyonik polietilenin mükemmel yapısal bütünlüğü için üstten görünüm ve yan görünüm rakamlar 2B ve 2 Ciçinde gösterildiği gösterildiği gibi bioprinted microfibrous iskele uzun vadeli istikrar sağlamış GelMA bileşenin sonraki fiziksel photocrosslinking sırasında bioprinting işlemi sırasında izin. Bu durumda, protokol alanında belirtilen bioprinting koşullar altında elde microfibers biraz artış fazla mesai ile şişme çapı yaklaşık 100-150 µm vardı.
Bioink, iyonik crosslinking ve photocrosslinking mikrosıvısal ekstrüzyon bioprinting bir işlemi, kapsüllenmiş HUVECs canlılık önemli ölçüde etkilemedi. Hücreleri nispeten yüksek bir canlılık korumak olabilir &#62; bu yordamları (Şekil 2D) tamamlanmasından sonra % 80'i. Bildirilen önceki54,55, HUVECs yavaş yavaş çoğalırlar ve gün 0 (Şekil 2E) başlangıçta rasgele dağılımından microfibers gün 16 mesaj-bioprinting kültür (Şekil 2F) Lümen benzeri yapılar varsaymak microfibers çevrelerine için göç. HUVECs için gözlenen davranış iç arabirim uygulamalı eğilim endotel hücrelerinin yanı sıra besin ve oksijen daha microfibers içinde onların iç55,59çevreleyen yüksek durumu nedeniyle büyük olasılıkla oldu.
Microfibrous İskele de doku mühendisliği için tek başına platform olarak davranabilir. Miyokardiyum doku örnek olarak kullanarak, Yenidoğan fare cardiomyocytes bir bioprinted iskele 5 × 106 hücre/mL yoğunluğu, interstisyel alana tohumlari ve içinde Dulbecco'nın modifiye kartal orta (10 vol.% FBS takıma DMEM) kültürlü. Orta ilk 2-3 yenerek, cardiomyocytes yapmaya başlayana kadar gün her gün, sonra her 2-3 gün55,60,61,62tek ½ orta vardı aktarımının değiştirildi. Hücreleri spontan ve senkronize hücre kaynak ve İskele55yapılandırılmasına bağlı olarak 9-28 güne kadar dayak korumak olabilir. İskele üzerinde olgun cardiomyocytes da sarcomeric α-aktinin (şekil 3B) ve connexin-43 (şekil 3C) de dahil olmak üzere şekil 3' te, fonksiyonel kalp biyolojik confocal floresan görüntülerde resimli olarak güçlü ifade gösterdi.
Endotel hücreleri ve ikincil hücre tipi bir araya getiren bir bozukluklarına doku daha da inşa edilebilir. Yine, vasküler yatağın kültür kabaca 16 gün sonra bir bioprinted microfibrous iskele kurdu sonra Miyokardiyum örnek olarak kullanarak, Yenidoğan sıçan cardiomyocytes daha sonra iskele interstisyel uzaya numaralı seribaşı. Sonra kültür ve olgunlaşma ortak bir ortamda EGM:DMDM 1:1 birim rasyon oluşan, endothelialized bir miyokard doku spontan ve zaman uyumlu dayak55sergilenmesi oluşmuş. Albümdeki tek uçak confocal Floresan şekil 4 daha fazla hücre tipleri, esas olarak microfibers (şekil 4B) sınırları içinde mevcut HUVECs ve microfibers (şekil 4C) dış çevreleyen cardiomyocytes co-varlığı saptandı.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55957/55957fig1.jpg"> 
Resim 1 : Bozukluklarına doku oluşturmak için mikrosıvısal Bioprinting strateji oluşturur. 
(A) Kompozit bioink ve CaCl2Co-ekstrüzyon için çekirdek-kılıf koaksiyel yazdırma kafası tasarımı. (B-E) Bozukluklarına mendil üretim prosedürü gösterilen şemalar oluşturun. Bu rakam izni referans55ile değiştirildi. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55957/55957fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55957/55957fig2.jpg"> 
Resim 2 : Bioprinting Microfibrous vasküler yatağın. 
(A) bir bioprinted 30-katman microfibrous iskele gösterilen fotoğraf. (B, C) Üst ve yan bir bioprinted iskele gösterilen Filmler kez izlendi. (D) canlılık, bir bioprinted microfibrous iskele yüklü HUVECs. Yeşil ve kırmızı canlı ve ölü hücreler, sırasıyla gösterir. (E, F) Yeşil fuorescent protein (GFP) organizasyonu gösteren Floresans Filmler-HUVECs bioprinted microfibers 0 bir gün içinde ve gün 16 mesaj bioprinting, anılan sıraya göre. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55957/55957fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55957/55957fig3.jpg"> 
Şekil 3 : Cardiomyocytes Bioprinted Microfibrous iskele üzerinde sonraki büyüme. (A) çekirdek, (B) sarcomeric α-aktinin, (C) connexin-43 ve (D) superimposition gösteren Floresans filmler. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55957/55957fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55957/55957fig4.jpg"> 
Şekil 4 : İnşaat Endothelialized miyokard doku. (A) çekirdek, (B) GFP-HUVECs, (C) f-aktin hem HUVECs ve cardiomyocytes ve (D) superimposition gösteren Floresans filmler. D iç metin endothelialized miyokard doku bir alt-büyütme görüntüsünü gösterir. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55957/55957fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
Ek veri kümesi. Bir örnek G-code bioprinting 6 × 6 mm2 kare kafes bitişik microfibers arasındaki 220 µm Aralık ile dosya.

Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids at JoVE.com

Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

Biz nerede bir ikincil hücre tipi bozukluklarına doku ve organoids oluşturmak için bu microfibrous yapının interstisyel uzaya daha fazla numaralı seribaşı bir microfibrous vasküler yatağın mühendislik bir mikrosıvısal bioprinting strateji temel alan genel bir protokol sağlar.

Mikrosıvısal Bioprinting mühendisliği için doku ve Organoids skarların

Engineering vascularized tissue constructs and organoids has been historically challenging. Here we describe a novel method based on microfluidic ...

microfluidic-bioprinting-for-engineering-vascularized-tissues

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

15.6K Görüntüleme.  Harvard Medical School. Biz nerede bir ikincil hücre tipi bozukluklarına doku ve organoids oluşturmak için bu microfibrous yapının interstisyel uzaya daha fazla numaralı seribaşı bir microfibrous vasküler yatağın mühendislik bir mikrosıvısal bioprinting strateji temel alan genel bir protokol sağlar.

Video: Microfluidic Bioprinting for Engineering Vascularized Tissues and Organoids

Microfluidic Mixers for Studying Protein Folding

The process by which a protein folds into its native conformation is highly relevant to biology and human health yet still poorly understood. One reason for this is that folding takes place over a wide range of timescales, from nanoseconds to seconds or longer, depending on the protein1. Conventional stopped-flow mixers have allowed measurement of folding kinetics starting at about 1 ms. We have recently developed a microfluidic mixer that dilutes denaturant ~100-fold in ~8 &mu;s2. Unlike a stopped-flow mixer, this mixer operates in the laminar flow regime in which turbulence does not occur. The absence of turbulence allows precise numeric simulation of all flows within the mixer with excellent agreement to experiment3-4.
Laminar flow is achieved for Reynolds numbers Re &le;100. For aqueous solutions, this requires micron scale geometries. We use a hard substrate, such as silicon or fused silica, to make channels 5-10 &mu;m wide and 10 &mu;m deep (See Figure 1). The smallest dimensions, at the entrance to the mixing region, are on the order of 1 &mu;m in size. The chip is sealed with a thin glass or fused silica coverslip for optical access. Typical total linear flow rates are ~1 m/s, yielding Re~10, but the protein consumption is only ~0.5 nL/s or 1.8 &mu;L/hr. Protein concentration depends on the detection method: For tryptophan fluorescence the typical concentration is 100 &mu;M (for 1 Trp/protein) and for FRET the typical concentration is ~100 nM.
The folding process is initiated by rapid dilution of denaturant from 6 M to 0.06 M guanidine hydrochloride. The protein in high denaturant flows down a central channel and is met on either side at the mixing region by buffer without denaturant moving ~100 times faster (see Figure 2). This geometry causes rapid constriction of the protein flow into a narrow jet ~100 nm wide. Diffusion of the light denaturant molecules is very rapid, while diffusion of the heavy protein molecules is much slower, diffusing less than 1 &mu;m in 1 ms. The difference in diffusion constant of the denaturant and the protein results in rapid dilution of the denaturant from the protein stream, reducing the effective concentration of the denaturant around the protein. The protein jet flows at a constant rate down the observation channel and fluorescence of the protein during folding can be observed using a scanning confocal microscope5.

In this work we explain the fabrication and use of a microfluidic mixer capable of mixing two solutions in ~8 &mu;s. We also demonstrate the use of these mixers with spectroscopic detection using UV fluorescence and fluorescence resonance energy transfer (FRET).

Protein Katlama Öğrenmenin mikroakışkan Mikserler

The process by which a protein folds into its native conformation is highly relevant to biology and human health yet still poorly understood. One reason ...

Biyomühendislik

Microfluidic Fabrication of Polymeric and Biohybrid Fibers with Predesigned Size and Shape

A &#8220;sheath&#8221; fluid passing through a microfluidic channel at low Reynolds number can be directed around another &#8220;core&#8221; stream and used to dictate the shape as well as the diameter of a core stream.&#160;Grooves in the top and bottom of a microfluidic channel were designed to direct the sheath fluid and shape the core fluid.&#160;By matching the viscosity and hydrophilicity of the sheath and core fluids, the interfacial effects are minimized and complex fluid shapes can be formed.&#160;Controlling the relative flow rates of the sheath and core fluids determines the cross-sectional area of the core fluid.&#160;Fibers have been produced with sizes ranging from 300 nm to ~1 mm, and fiber cross-sections can be round, flat, square, or complex as in the case with double anchor fibers. Polymerization of the core fluid downstream from the shaping region solidifies the fibers.&#160;Photoinitiated click chemistries are well suited for rapid polymerization of the core fluid by irradiation with ultraviolet light.&#160;Fibers with a wide variety of shapes have been produced from a list of polymers including liquid crystals, poly(methylmethacrylate), thiol-ene and thiol-yne resins, polyethylene glycol, and hydrogel derivatives. Minimal shear during the shaping process and mild polymerization conditions also makes the fabrication process well suited for encapsulation of cells and other biological components.

Two adjacent fluids passing through a grooved microfluidic channel can be directed to form a sheath around a prepolymer core; thereby&#160;determining both shape and cross-section. Photoinitiated polymerization, such as thiol click chemistry, is well suited for rapidly solidifying the core fluid into a microfiber with predetermined size and shape.

Önceden Tasarlanmış Boyut ve Şekle Sahip Polimerik ve Biyohidred Elyafların Mikroakışkan İmalatı

A &#8220;sheath&#8221; fluid passing through a microfluidic channel at low Reynolds number can be directed around another &#8220;core&#8221; stream and ...

Electrospun Fibrous Scaffolds of Poly(glycerol-dodecanedioate) for Engineering Neural Tissues From Mouse Embryonic Stem Cells

For tissue engineering applications, the preparation of biodegradable and biocompatible scaffolds is the most desirable but challenging task. &#160;Among the various fabrication methods, electrospinning is the most attractive one due to its simplicity and versatility. Additionally, electrospun nanofibers mimic the size of natural extracellular matrix ensuring additional support for cell survival and growth. This study showed the viability of the fabrication of long fibers spanning a larger deposit area for a novel biodegradable and biocompatible polymer named&#160;poly(glycerol-dodecanoate) (PGD)1 by using a newly designed collector for electrospinning. PGD exhibits unique elastic properties with similar mechanical properties to nerve tissues, thus it is suitable for neural tissue engineering applications. The synthesis and fabrication set-up for making fibrous scaffolding materials was simple, highly reproducible, and inexpensive. In biocompatibility testing, cells derived from mouse embryonic stem cells could adhere to and grow on the electrospun PGD fibers. In summary, this protocol provided a versatile fabrication method for making PGD electrospun fibers to support the growth of mouse embryonic stem cell derived neural lineage cells.

Electrospun Fibrous Scaffolds of Polyglycerol-dodecanedioate for Engineering Neural Tissues From Mouse Embryonic Stem Cells

Synthesis and fabrication of electrospun long fibers spanning a larger deposit area via a newly designed collector from a novel biodegradable polymer named poly(glycerol-dodecanoate) (PGD) was reported. The fibers were able to support the growth of cells derived from mouse pluripotent stem cells.

Fare Embriyonik kök hücrelerden Mühendislik Sinir Dokular için Poli electrospun fibröz iskeleleri (gliserol-dodecanedioate)

For tissue engineering applications, the preparation of biodegradable and biocompatible scaffolds is the most desirable but challenging task. &#160;Among ...

Engineering Three-dimensional Epithelial Tissues Embedded within Extracellular Matrix

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, which is regulated by a variety of soluble and physical signals in the microenvironment. Described here is a method created to study the process of branching morphogenesis by forming engineered three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined shape and size that are completely embedded within an extracellular matrix (ECM). This method enables the formation of arrays of identical tissues and enables the control of a variety of environmental factors, including tissue geometry, spacing, and ECM composition. This method can also be combined with widely used techniques such as traction force microscopy (TFM) to gain more information about the interactions between cells and their surrounding ECM. The protocol can be used to investigate a variety of cell and tissue processes beyond branching morphogenesis, including cancer invasion.

This manuscript describes a soft lithography-based technique to engineer uniform arrays of three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined geometry surrounded by extracellular matrix. This method is amenable to a wide variety of cell types and experimental contexts and allows for high-throughput screening of identical replicates.

Ekstraselüler Matrix içinde Gömülü Mühendislik Üç boyutlu Epitel Dokular

The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, ...

Microfluidic Buffer Exchange for Interference-free Micro/Nanoparticle Cell Engineering

Engineering cells with active-ingredient-loaded micro/nanoparticles (NPs) is becoming an increasingly popular method to enhance native therapeutic properties, enable bio imaging and control cell phenotype. A critical yet inadequately addressed issue is the significant number of particles that remain unbound after cell labeling which cannot be readily removed by conventional centrifugation. This leads to an increase in bio imaging background noise and can impart transformative effects onto neighboring non-target cells. In this protocol, we present an inertial microfluidics-based buffer exchange strategy termed as Dean Flow Fractionation (DFF) to efficiently separate labeled cells from free NPs in a high throughput manner. The developed spiral microdevice facilitates continuous collection (&#62;90% cell recovery) of purified cells (THP-1 and MSCs) suspended in new buffer solution, while achieving &#62;95% depletion of unbound fluorescent dye or dye-loaded NPs (silica or PLGA). This single-step, size-based cell purification strategy enables high cell processing throughput (106 cells/min) and is highly useful for large-volume cell purification of micro/nanoparticle engineered cells to achieve interference-free clinical application.

This protocol describes the use of an inertial microfluidics-based buffer exchange strategy to purify micro/nanoparticle engineered cells with efficient depletion of unbound particles.

Parazit Mikro / Nanoparçacık Hücre Mühendisliği mikroakışkan Tampon Değişim

Engineering cells with active-ingredient-loaded micro/nanoparticles (NPs) is becoming an increasingly popular method to enhance native therapeutic ...

Automated Robotic Dispensing Technique for Surface Guidance and Bioprinting of Cells

This manuscript describes the introduction of cell guidance features followed by the direct delivery of cells to these features in a hydrogel bioink using an automated robotic dispensing system. The particular bioink was selected as it allows cells to sediment towards and sense the features. The dispensing system bioprints viable cells in hydrogel bioinks using a backpressure assisted print head. However, by replacing the print head with a sharpened stylus or scalpel, the dispensing system can also be employed to create topographical cues through surface etching. The stylus movement can be programmed in steps of 10 &#181;m in the X, Y and Z directions. The patterned grooves were able to orientate mesenchymal stem cells, influencing them to adopt an elongated morphology in alignment with the grooves&#39; direction. The patterning could be designed using plotting software in straight lines, concentric circles, and sinusoidal waves. In a subsequent procedure, fibroblasts and mesenchymal stem cells were suspended in a 2% gelatin bioink, for bioprinting in a backpressure driven extrusion printhead. The cell bearing bioink was then printed using the same programmed coordinates used for the etching. The bioprinted cells were able to sense and react to the etched features as demonstrated by their elongated orientation along the direction of the etched grooves.

This protocol describes a bioprinting methodology using an automated robotic depositing system that incorporates etched topographical guidance cues with the precision deposition of a cell bearing hydrogel bioink. The printed cells are directly delivered to the etched features and are able to sense and orientate with them.

Hücre Yüzey Rehberlik ve Bioprinting için Otomatik Robotik Dağıtım Tekniği

This manuscript describes the introduction of cell guidance features followed by the direct delivery of cells to these features in a hydrogel bioink using ...

The Arteriovenous (AV) Loop in a Small Animal Model to Study Angiogenesis and Vascularized Tissue Engineering

A functional blood vessel network is a prerequisite for the survival and growth of almost all tissues and organs in the human body. Moreover, in pathological situations such as cancer, vascularization plays a leading role in disease progression. Consequently, there is a strong need for a standardized and well-characterized in vivo model in order to elucidate the mechanisms of neovascularization and develop different vascularization approaches for tissue engineering and regenerative medicine.
We describe a microsurgical approach for a small animal model for induction of a vascular axis consisting of a vein and artery that are anastomosed to an arteriovenous (AV) loop. The AV loop is transferred to an enclosed implantation chamber to create an isolated microenvironment in vivo, which is connected to the living organism only by means of the vascular axis. Using 3D imaging (MRI, micro-CT) and immunohistology, the growing vasculature can be visualized over time. By implanting different cells, growth factors and matrices, their function in blood vessel network formation can be analyzed without any disturbing influences from the surroundings in a well controllable environment. 
In addition to angiogenesis and antiangiogenesis studies, the AV loop model is also perfectly suited for engineering vascularized tissues. After a certain prevascularization time, the generated tissues can be transplanted into the defect site and microsurgically connected to the local vessels, thereby ensuring immediate blood supply and integration of the engineered tissue. By varying the matrices, cells, growth factors and chamber architecture, it is possible to generate various tissues, which can then be tailored to the individual patient's needs.

The Arteriovenous AV Loop in a Small Animal Model to Study Angiogenesis and Vascularized Tissue Engineering

We describe a microsurgical approach for the generation of an arteriovenous (AV) loop as a model for analyzing vascularization in vivo in an isolated and well-characterized environment. This model is not only useful for the investigation of angiogenesis, but is also optimally suited for engineering axially vascularized and transplantable tissues.

Bir Küçük Hayvan Modelinde Arteriovenöz (AV) Döngü Anjiogenez ve Vaskülarize Doku Mühendisliği Eğitim için

A functional blood vessel network is a prerequisite for the survival and growth of almost all tissues and organs in the human body. Moreover, in ...

Bioprinting of Cartilage and Skin Tissue Analogs Utilizing a Novel Passive Mixing Unit Technique for Bioink Precellularization

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both cartilage and skin analogs were fabricated after bioink pre-cellularization utilizing a novel passive mixing unit technique. This technique was developed with the aim to simplify the steps involved in the mixing of a cell suspension into a highly viscous bioink. The resolution of filaments deposited through bioprinting necessitates the assurance of uniformity in cell distribution prior to printing to avoid the deposition of regions without cells or retention of large cell clumps that can clog the needle. We demonstrate the ability to rapidly blend a cell suspension with a bioink prior to bioprinting of both cartilage and skin analogs. Both tissue analogs could be cultured for up to 4 weeks. Histological analysis demonstrated both cell viability and deposition of tissue specific extracellular matrix (ECM) markers such as glycosaminoglycans (GAGs) and collagen I respectively.

Cartilage and skin analogs were bioprinted using a nanocellulose-alginate based bioink. The bioinks were cellularized prior to printing via a single step passive mixing unit. The constructs were demonstrated to be uniformly cellularized, have high viability, and exhibit favorable markers of differentiation.

Bioprinting kıkırdak ve cilt doku analogları bir roman pasif birimi teknik Bioink Precellularization için karıştırma kullanmak

Bioprinting is a powerful technique for the rapid and reproducible fabrication of constructs for tissue engineering applications. In this study, both ...

Two Methods for Decellularization of Plant Tissues for Tissue Engineering Applications

The autologous, synthetic, and animal-derived grafts currently used as scaffolds for tissue replacement have limitations due to low availability, poor biocompatibility, and cost. Plant tissues have favorable characteristics that make them uniquely suited for use as scaffolds, such as high surface area, excellent water transport and retention, interconnected porosity, preexisting vascular networks, and a wide range of mechanical properties. Two successful methods of plant decellularization for tissue engineering applications are described here. The first method is based on detergent baths to remove cellular matter, which is similar to previously established methods used to clear mammalian tissues. The second is a detergent-free method adapted from a protocol that isolates leaf vasculature and involves the use of a heated bleach and salt bath to clear the leaves and stems. Both methods yield scaffolds with comparable mechanical properties and low cellular metabolic impact, thus allowing the user to select the protocol which better suits their intended application.

Here we present, and contrast two protocols used to decellularize plant tissues: a detergent-based approach and a detergent-free approach. Both methods leave behind the extracellular matrix of the plant tissues used, which can then be utilized as scaffolds for tissue engineering applications.

Doku mühendisliği uygulamaları için bitki dokuların Decellularization için iki yöntem

The autologous, synthetic, and animal-derived grafts currently used as scaffolds for tissue replacement have limitations due to low availability, poor ...

Microfluidic Model to Mimic Initial Event of Neovascularization

Neovascularization is usually initialized from an existing normal vasculature and the biomechanical microenvironment of endothelial cells (ECs) in the initial stage varies dramatically from the following process of neovascularization. Although there are plenty of models to simulate different stages of neovascularization, an in vitro 3D model that capitulates the initial process of neovascularization under the corresponding stimulations of normal vasculature microenvironments is still lacking. Here, we reconstructed an in vitro 3D model that mimics the initial event of neovascularization (MIEN). The MIEN model contains a microfluidic sprouting chip and an automatic control, highly efficient circulation system. A functional, perfusable microchannel coated with endothelium was formed and the process of sprouting was simulated in the microfluidic sprouting chip. The initially physiological microenvironment of neovascularization was recapitulated with the microfluidic control system, by which ECs would be exposed to high luminal shear stress, physiological transendothelial flow, and various vascular endothelial growth factor (VEGF) distributions simultaneously. The MIEN model can be readily applied to the study of neovascularization mechanism and holds a potential promise as a low-cost platform for drug screening and toxicology applications.

Here, we provide a microfluidic chip and an automatically controlled, highly efficient circulation microfluidic system that recapitulates the initial microenvironment of neovascularization, allowing endothelial cells (ECs) to be stimulated by high luminal shear stress, physiological level of transendothelial flow, and various vascular endothelial growth factor (VEGF) distribution simultaneously.

Neovaskülarizasyonun İlk Olayını Taklit Etmek için Mikroakışkan Model

Neovascularization is usually initialized from an existing normal vasculature and the biomechanical microenvironment of endothelial cells (ECs) in the ...