Dr. Rachid Mazroui (Université Laval, Québec, Kanada) el yazması eleştirel okuma için teşekkür ederiz. Hücre görüntüleme birimi teknik yardım için araştırma merkezinin teşekkür ediyoruz. M.-É. Huot olan bir Junior 1 araştırma bilim adamı Fonds de Recherche du Québec-Santé (FRQ-S). Bu eser Kanada kurumları, Sağlık (sayı CIHR, paspas-286437 M.-É için hibe. araştırma tarafından desteklenmiştir Huot).

1. Puromycilation koşullar belirlenmesi Not: Bu teknik MRC-5 hücre adezyon işlemi 5 sırasında yerelleştirilmiş çeviri değerlendirmek için kullanılan yöntemi tanımlar. Puromycilation herhangi bir hücreyi yapılabilir gibi bu tedavi koşulları açısından puromisindir konsantrasyon ve istenen her hücre satırı için özdeş değil çünkü puromycilation koşulları kullanılmak üzere belirli hücre hatları için optimize etmek önemlidir kuluçka süresi. Bu koşullar nasıl tanımlandığını göstermek için üç örnek hücre hatları (Yani, HeLa, MRC-5 ve ha-7) için farklı kuluçka süreleri puromisindir konsantrasyonları artan ile tedavi edildi ( Resim 1).
<ol><li>Grow uygun 0.5 ml 24-şey plaka hücrelerde aynı sayıda kültür orta test önce 16 h tamamlayın. Tohum 30.000 MRC-5 hücre, 50.000 HeLa hücreleri veya iyi başına 50.000 ha-7 hücre. % 60-70 izdiham (şekil 1A) aşmasını önlemek emin olun.</li>
	<li>Puromisindir (0, 5, 10, 15, 20 ve 30 µg/mL) konsantrasyonları artan tam hücre kültür ortamının 1,5 mL ile hazırlamak 6 tüpleri. Önceden sıcak 37 ° C'de</li>
	<li>Puromisindir orta (hazırlanan adım 1.2), her toplama aktarmak için 0.5 mL her 6 yeni tüpler içine tüp ve sikloheksimit 50 µg/mL nihai bir konsantrasyon tüm 6 yeni tüpler için ekleyin. Önceden sıcak 37 ° C'de</li>
	<li>Orta 0.5 mL tam kültür ortamının (satır 1 ve 2) ile değiştirin. İçin üçüncü satır, 0.5 mL 50 µg/mL ile sikloheksimit ( şekil 1B) takıma tam kültür ortamının ekleyin. 
	Not: Sikloheksimit tedavi için protein puromycilation çeviri uzama engellemek için onun yetenek nedeniyle en iyi negatif kontrol olarak kurulmuştur. Puromisindir birleşme çeviri uzamasını gerektirdiği için sikloheksimit tedavi puromycilated protein sinyalleri 5 , 18 bir kaybına neden.</li>
	<li>15dk 37 ° C'de (%5 CO 2) için kuluçkaya.</li>
	<li>0,5 mL 0, 2.5, 5, 7.5, 10 ve 15 µg/mL, son konsantrasyonları sırasıyla A, B, C, D, E ve F. sütunlarda elde etmek için ikinci sırada 1.2. adımda hazırlanan puromisindir orta ekleyin Aynı zamanda, üçüncü sıradaki ( şekil 1 c) sikloheksimit takıma orta (Adım 1.3) puromisindir 0.5 mL ekleyin.</li>
	<li>37 ° C'de (%5 CO 2) 5 min için kuluçkaya.</li>
	<li>0.0, 2.5, 5, 7.5, 10 ve 15 µg/mL ( şekil 1 c) son konsantrasyonları elde etmek için ilk satırı 1.2. adımda hazırlanan puromisindir Orta 0.5 mL ekleyin.</li>
	<li>37 ° C'de (%5 CO 2) 5 min için kuluçkaya.</li>
	<li>Yıkama her de fosfat tamponlu 1-3 1 mL olan satırları buz gibi 1 X serum fizyolojik (PBS) 5 dk sonra eklenmesi için ilk satır (iki kez yıkama) kuyu puromisindir, dan. 1 X Laemmli arabelleği 75 µL ekleyin (%4 Sodyum Lauryl Sülfat (SDS), % 4 2-mercaptoethanol, 0.120 M Tris HCl pH 6.8, %0,004 bromophenol mavi ve % 10 gliserol) bütün hücreli lysates her koşul için elde etmek için.</li>
	<li>Çalıştır % 10 SDS-polyacrylamide Jel Elektroforez (SDS-sayfa) puromisindir birleşme değerlendirmek için 1/3 hazır örnekleri kullanarak.
	<ol><li>Belirleme birincil antikor kuluçka arabellek (%2 sığır serum albumin (BSA)), 430 mM NaCl, 10 mM Tris pH 7,4 ve %0.01 1:25,000 oranında sulandırılmış bir anti-puromisindir antikor (12 D 10) kullanarak Western blot analizi tarafından puromisindir şirketleşme düzeyi Sodyum azid). 
		Not: Resim 2 örnek olarak temsili Resim 1. adımda açıklandığı gibi yapılan farklı hücre satırı özleri karşılık gelen gösterilir.</li>
	</ol></li></ol> 2. Cellulo içinde Çeviri görselleştirme lokalize Not: Burada açıklanan tekniği SICs MRC-5 hücrelerdeki içinde yerelleştirilmiş çeviri sırasında yapışma işlemi 5 değerlendirmek için kullanıldı. MRC-5 hücreleri burada kullanılmasına rağmen diğer hücre hatları 2.1. adımda açıklanan aynı metodolojisi ile kullanılabilir.
<ol><li>Hücre hazırlık.
	<ol><li>Ayırmak MRC-5 hücrelerin % 0.25 tripsin/2.21 mM ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) Hank kullanarak &#39; s dengeli tuz çözüm (HBSS). Santrifüjü (200 x g de 5 dk) 15 mL konik santrifüj tüpü içinde tarafından hücreleri cips ve onları Dulbecco içinde askıya &#39; s sayım odası ile sayım sonra % 10 fetal sığır serum (FBS) 40.000 hücre/mL, ile takıma modifiye kartal orta (DMEM).</li>
		<li>Süspansiyon korumak için bir tüp rotator 20 dk için kullanarak nazik döndürme altında 37 ° C'de askıya alınan hücreler kuluçkaya. 
		Not: Bu odak yapışma kompleksleri tam ayrılma için izin vermek için kritik bir adımdır.</li>
		<li>Askıya alınmış MRC-5 (40.000 hücre/mL) hücrelerde iki 35-mm cam alt tabak tabak 2 mL. İlk 35-mm cam alt çanak puromycilation tahlil için kullanın (bkz. Adım 2.1.5) ve ikinci bir negatif kontrol kullanın (bkz. Adım 2.1.6).</li>
		<li>Hücreleri hücre adezyon ve SIC oluşumu için izin vermek 55 dk. 37 ° C'de (%5 CO 2) tutmak.</li>
		<li>Ekle puromisindir orta önceden tanımlanmış 1 bölümünde konsantrasyon kullanarak 35-mm cam alt yemekleri (tahlil). MRC-5 hücreleri tedavi etmek için 10 µg/mL puromisindir 37 ° C'de (%5 CO 2) 5 min için kullanın.</li>
		<li>Bir negatif kontrol sikloheksimit ikinci 35-mm cam alt çanak 40dakika hücreleri onları önceden 50 µg/mL sikloheksimit ( şekil 2B) ile tedavi etmek için tohum sonra ekleyin. Sonra sikloheksimit ek olarak sonra 15 dk ekleyin puromisindir aynı konsantrasyonu kuluçka bu kez adım 2.1.5 (Örneğin, kullanım 10 µg/mL puromisindir 37 ° c (%5 CO 2) MRC-5 için 5 min için) gibi orta.</li>
		<li>Yıkama her plakalı iki kez buz gibi 2 mL 1 X PBS hücreleri ile ve 1 mL (1 X PBS içinde seyreltilmiş) % 4 formaldehit 15 dakika oda sıcaklığında (RT) düzeltin. 
		Dikkat: Paraformaldehyde kesinlikle kimyasal bir mahallede kullanılmalıdır.</li>
	</ol></li> <li>Immunostaining.
	<ol><li>Pimlerle yapılan fiksasyon ardından paraformaldehyde, yıkama ile üç kez 2 mL 1 X PBS ve PBS-TritonX-100 (% 0.5) 500 µL içinde 20 dk RT hücreleri permeabilize az için kuluçkaya.</li>
		<li>Spesifik olmayan antikor bağlama önlemek için 500 µL PBS ile örnek blok &#8211; BSA (% 1) için dik, 20 dk</li>
		<li>PBS-Tween20 (% 0,1) 2 mL ile üç kez yıkayın ve 1 X PBS RT. 1 h için anti-puromisindir antikor (12 D 10) seyreltilmiş 1:12,500 300 µL ile kuluçkaya</li>
		<li>Yıkama PBS-Tween20 (% 0,1) 2 mL ile 3 kez ve anti-fare IgG Birleşik bir fluorophore 300 µL ile kuluçkaya (burada, 488 nm) puromycilated polipeptitler görselleştirmek için PBS ve phalloidin Birleşik ile seyreltilmiş başka bir fluorophore için (burada, 555 nm) F-aktin görselleştirmek için. Dik, 1 h için kuluçkaya</li>
		<li>Yıkama PBS-Tween20 (% 0,1) 2 mL ile üç kez ve daha sonra 5 1 µg/mL ile 4 takıma min için RT, içinde 300 µL PBS-Tween20 (% 0,1), kuluçkaya &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).</li>
		<li>2 mL PBS-Tween20 (% 0,1) ile üç kez yıkayın ve 2 mL 1 X PBS ile yıkayın. Hücreleri örnek 2 mL 1 X PBS resim alma sırasında tutarak kurumasını önlemek.</li>
	</ol></li></ol> 3. İmmünfloresan resim alma Not: aşağıdaki metodoloji-ebilmek var olmak kullanılmış ile piyasada bulunan herhangi bir confocal görüntüleme sistemi.
Miktar için dinamik alanı en üst düzeye çıkarmak için <ol><li>belirleme uygun ayarları için her fluorophore. 
	Not: Temsilcisi miktar yalnızca piksel doygunluk kaçınılması ve sinyal eşik düzgün ayarlanır elde edilebilir. Bu ayarları, dikkatle lazer gücü, yüksek voltaj, ayarlayarak elde kazanç, ve ofset.
	<ol><li>Ayarlama yakınlaştırma faktörü (5 X) ve piksel boyutunu optimize etmek için piksel (512 x 512). 
		Not: Bu Nyquist teoremi göre optik çözünürlük, en azından 2,3 - kat daha küçük olmalıdır.</li>
		<li>İnceden inceye gözden geçirmek hız (12,5-20 µs/piksel) azaltmak ve yukarıda belirtilen ayarlara göre sinyal-gürültü oranı artırmak için (2 - 3 kez) ortalama kullanın.</li>
	</ol></li> <li>El ile uygun üst belirlemek ve odak uçaklar en uygun adım boyu (0.4 µm/dilim) ile z ekseni boyunca alt. 
	Not: Adım boyutu uçak 2.3 tarafından bölünmüş Aksiyel çözünürlük Nyquist teoremi göre belirlenir. Genellikle 20-25 katmanları yapışık hücreleri tüm hücre derinliği karşılamak gereklidir.</li>
	<li>Tüm bir tek hücre bir 60 X Apo planı yağı daldırma hedefi (1,42 sayısal diyafram) ile confocal bir görüntüsünü elde.</li>
</ol> 4. İmmünfloresan görüntü miktar <ol><li>zenginleştirme belirlenmesi.
	<ol><li>ImageJ yazılım (freeware http://fiji.sc kullanılabilir) kullanarak alınan hücre veri dosyasından faiz z-uçak katmanına karşılık gelen bir görüntüyü açmak.</li>
		<li>Çizgi çizme aracını kullanarak çizgi çizin (araç çubuğu &#8594; düz) nerede miktar isteniyorsa hücre bölgelerinde aracılığıyla. Üzerinde çift tıklatarak çizgi genişliğini değiştirmek &#34; düz; &#34; yoğunluk değerleri (8 şekil 3 ' de ayarla) çizginin genişliğini üzerinden ortalama olarak. 
		Not: Daha ince bir çizgi sinyal örtüşme farklı yapılardan önlemek için tercih edilir.</li>
		Yolun doğru şekilde ayarladıktan sonra <li>profil kararlı eksen boyunca sinyal yoğunluğu (menü çubuğu &#8594; analiz &#8594; arsa profil). 
		Not: Seçili z-uçak bölümü için hattı boyunca sinyal yoğunluğu (özel fluorophore) seçilen kanalın her piksel için karşılık gelen bir profili gösteren yeni bir pencere açılacaktır.
		<ol><li>Tekrar işlem için kullanılan fluorophore karşılık gelen her kanal (Yani, bir miktar için 488, 568 ve 405 için bir tane). 
			Not: Sinyal yoğunluk değeri her zaman çizilmiş çizgiyi yönünü takip sıralanır.</li>
		</ol></li> <li>Gri ölçekli sayısal değerler seçili z-uçak katman quantifications için karşılık gelen profil her piksel için elde etmek için profil verileri kopyalayın (Görüntü penceresinin menü çubuğundan &#8594; kopya) ve herhangi bir elektronik tablo yazılımı yapıştırın.</li>
		Confocal elde edilen görüntünün her z-uçak bölüm ve miktar istendiği nerede her kanal için <li>Yinele adımları 4.1.1-4.1.4. 
		Not: Farklı z-uçak katmanları miktar toplam değeri her z-uçak katman hattı boyunca her pikselin hesaplayarak sinyal özel zenginleştirme genel bir değerlendirmesini elde etmek için havuza alınmış. Çizilen çizgi ortalama değerlerde dahil her z-uçak katman aynı ise bu tür havuz sadece elde edilebilir.</li>
		<li>Farklı kanalları çok sayıda Katmanlar ile bütün hücreli miktar için alternatif bir yöntem, StackprofileData olarak adlandırılan makroyu kullanmak (bkz. Ek dosya). 
		Not: Bu makro https://imagej.nih.gov/ij/macros/StackProfileData.txt serbestçe erişilebilir ve aşağıdaki gibi kullanılabilir: <ol><li>makro bir metin dosyasına yapıştırın ve bunu kaydedin</li>
			<li>Hücre confocal katmanları içerir görüntü dosyasını açın.</li>
			<li>Bir çizgi çizin, 4.1.2. adımda açıklandığı gibi makro almak için yeni bir pencere açın (menü çubuğu &#8594; eklentileri &#8594; makroları &#8594; çalıştırmak), StackprofileData makro karşılık gelen önceden kaydettiğiniz metin dosyasını seçin ve tıklatın &#34; açık. &#34; 
			Not: makro ithalat, yeni bir pencere adlı &#34; sonuçları &#34;-ecek açık ve tüm miktar kararlı eksen boyunca her z-uçak katmanı için listelenen ve resim dosyalarında mevcut kanal.</li>
			<li>Her kanal için veri kopyala (menü çubuğu &#8594; düzenleme &#8594; kopya) sinyal quantifications karşılık gelen grafik profili temsil elde etmek için. Herhangi bir elektronik tablo yazılımı yapıştırın. Her kanal boyunca her z-uçak katmanı için yolun her piksel için toplam değerini hesaplamak. Grafik şekil 3 ' te sunulan benzer oluşturmak için bu değerleri kullanın.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Sinyal belirlenmiş hücresel alanda veya birim miktar.
	<ol><li>ImageJ yazılımı ile belgili tanımlık imge eğe açık.</li>
		<li>Çizmek geometrik form işlevini kullanarak ilgi alanı belirtmek için bir alan (araç çubuğu &#8594; &#34; dikdörtgen, &#34; &#34; oval, &#34; veya &#34; çokgen &#34;). 
		Not: Çizilmiş forma karşılık gelen alan için miktar değeri belirlenecektir.</li>
		<li>Herhangi bir arka plan sinyal önlemek için eşik düzeyi ayarlamak (menü çubuğu &#8594; görüntü ayarı &#8594; eşik); piksel yoğunluklarda çubuk grafik formunda temsil etmek için yeni bir pencere açılacaktır. Kaydırıcıyı kullanarak miktar piksellerindeki içerme/dışlama üzere değerleri değiştirin. Kırmızı renkte piksel miktar dahil olarak, hücre dışında kalan kırmızı pikseller ortadan kaldıran bir eşik seçin.</li>
		<li>Arka plan sinyal olmadan seçili alanı içinde piksel sinyal ölçmek için ölçü parametrelerini tanımlamak (menü çubuğu &#8594; analiz &#8594; ayarla ölçümleri) ve kontrol etmek emin olun &#34; Eşik sınırı &#34; ve &#34; entegre yoğunluk &#34; kutuları.</li>
		<li>Seçili alan için sayısal değerleri ölçmek (menü çubuğu &#8594; analiz &#8594; ölçü birimi). 
		Not: Sinyal şiddeti miktar-ecek sunulmak altında yeni bir pencerede &#34; IntDen &#34; ürün ortalama gri değerleri ve seçili alanı içinde piksel sayısını temsil eden kimlik.</li>
		<li>Çizmek geometrik formu kullanarak hücrenin tamamını içeren bir alanı (araç çubuğu &#8594; &#34; dikdörtgen, &#34; &#34; oval, &#34; veya &#34; çokgen &#34;) ve toplam sinyal için karşılık gelen bir değer elde etmek için adımlar 4.2.3-4.2.5 ile devam edin. İlgi alanı içinde sinyal yüzde elde etmek için tüm sinyal üzerinde seçili alanı içinde sinyal oranını hesaplamak.</li>
		<li>Miktar her z-uçak için hücre hacmi elde etmek için Yinele adımları 4.2.2-4.2.6. Geometrik formu gerektiği gibi uyum.</li>
		<li>Kopyala/Yapıştır üzerinden elde edilen veriler &#34; sonuçları &#34; windows için grafik tasvir ve ortalama bir değer bulmak için bir elektronik tabloya her z-uçak katmanı için.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Yan, X., Hoek, T. A., Vale, R. D., Tanenbaum, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+Translation+of+Single+mRNA+Molecules+In+Vivo.">Dynamics of Translation of Single mRNA Molecules In Vivo.</a> Cell. 165, 976-989 (2016).</li><li>Morisaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+quantification+of+single+RNA+translation+dynamics+in+living+cells.">Real-time quantification of single RNA translation dynamics in living cells.</a> Science. 352, 1425-1429 (2016).</li><li>Wu, B., Eliscovich, C., Yoon, Y. J., Singer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translation+dynamics+of+single+mRNAs+in+live+cells+and+neurons.">Translation dynamics of single mRNAs in live cells and neurons.</a> Science. 352, 1430-1435 (2016).</li><li>Halstead, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRICK:+A+Single-Molecule+Method+for+Imaging+the+First+Round+of+Translation+in+Living+Cells+and+Animals.">TRICK: A Single-Molecule Method for Imaging the First Round of Translation in Living Cells and Animals.</a> Methods Enzymol. 572, 123-157 (2016).</li><li>Bergeman, J., Caillier, A., Houle, F., Gagne, L. M., Huot, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+translation+regulates+cell+adhesion+and+transendothelial+migration.">Localized translation regulates cell adhesion and transendothelial migration.</a> J Cell Sci. 129, 4105-4117 (2016).</li><li>El Fatimy, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+the+Fragile+X+Mental+Retardation+Protein+in+a+Highly+Ordered+Neuronal+RiboNucleoParticles+Population:+A+Link+between+Stalled+Polyribosomes+and+RNA+Granules.">Tracking the Fragile X Mental Retardation Protein in a Highly Ordered Neuronal RiboNucleoParticles Population: A Link between Stalled Polyribosomes and RNA Granules.</a> PLoS Genet. 12, e1006192 (2016).</li><li>Adjibade, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sorafenib,+a+multikinase+inhibitor,+induces+formation+of+stress+granules+in+hepatocarcinoma+cells.">Sorafenib, a multikinase inhibitor, induces formation of stress granules in hepatocarcinoma cells.</a> Oncotarget. 6, 43927-43943 (2015).</li><li>Paronetto, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sam68+regulates+translation+of+target+mRNAs+in+male+germ+cells,+necessary+for+mouse+spermatogenesis.">Sam68 regulates translation of target mRNAs in male germ cells, necessary for mouse spermatogenesis.</a> J Cell Biol. 185, 235-249 (2009).</li><li>Schmidt, E. K., Clavarino, G., Ceppi, M., Pierre, P. S. U. n. S. E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SUnSET,+a+nonradioactive+method+to+monitor+protein+synthesis.">SUnSET, a nonradioactive method to monitor protein synthesis.</a> Nat Methods. 6, 275-277 (2009).</li><li>Azzam, M. E., Algranati, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+puromycin+action:+fate+of+ribosomes+after+release+of+nascent+protein+chains+from+polysomes.">Mechanism of puromycin action: fate of ribosomes after release of nascent protein chains from polysomes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 70, 3866-3869 (1973).</li><li>Goodman, C. A., Hornberger, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+protein+synthesis+with+SUnSET:+a+valid+alternative+to+traditional+techniques.">Measuring protein synthesis with SUnSET: a valid alternative to traditional techniques.</a> Exerc Sport Sci Rev. 41, 107-115 (2013).</li><li>David, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+translation+visualized+by+ribosome-bound+nascent+chain+puromycylation.">Nuclear translation visualized by ribosome-bound nascent chain puromycylation.</a> J Cell Biol. 197, 45-57 (2012).</li><li>Fallini, C., Bassell, G. J., Rossoll, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+muscular+atrophy:+the+role+of+SMN+in+axonal+mRNA+regulation.">Spinal muscular atrophy: the role of SMN in axonal mRNA regulation.</a> Brain Res. 1462, 81-92 (2012).</li><li>Costa-Mattioli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+of+hippocampal+synaptic+plasticity+and+memory+by+the+eIF2alpha+kinase+GCN2.">Translational control of hippocampal synaptic plasticity and memory by the eIF2alpha kinase GCN2.</a> Nature. 436, 1166-1173 (2005).</li><li>Costa-Mattioli, M., Sossin, W. S., Klann, E., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+of+long-lasting+synaptic+plasticity+and+memory.">Translational control of long-lasting synaptic plasticity and memory.</a> Neuron. 61, 10-26 (2009).</li><li>Du, T. G., Schmid, M., Jansen, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+cells+move+messages:+the+biological+functions+of+mRNA+localization.">Why cells move messages: the biological functions of mRNA localization.</a> Semin Cell Dev Biol. 18, 171-177 (2007).</li><li>Ephrussi, A., St Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+is+believing:+the+bicoid+morphogen+gradient+matures.">Seeing is believing: the bicoid morphogen gradient matures.</a> Cell. 116, 143-152 (2004).</li><li>Mardakheh, F. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+Analysis+of+mRNA,+Translation,+and+Protein+Localization:+Local+Translation+Is+a+Key+Regulator+of+Cell+Protrusions.">Global Analysis of mRNA, Translation, and Protein Localization: Local Translation Is a Key Regulator of Cell Protrusions.</a> Dev Cell. 35, 344-357 (2015).</li><li>Lacsina, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Premature+translational+termination+products+are+rapidly+degraded+substrates+for+MHC+class+I+presentation.">Premature translational termination products are rapidly degraded substrates for MHC class I presentation.</a> PLoS One. 7, e51968 (2012).</li><li>Schneider-Poetsch, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+eukaryotic+translation+elongation+by+cycloheximide+and+lactimidomycin.">Inhibition of eukaryotic translation elongation by cycloheximide and lactimidomycin.</a> Nat Chem Biol. 6, 209-217 (2010).</li><li>Jacobs, J. P., Jones, C. M., Baille, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+a+human+diploid+cell+designated+MRC-5.">Characteristics of a human diploid cell designated MRC-5.</a> Nature. 227, 168-170 (1970).</li><li>Gandin, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polysome+fractionation+and+analysis+of+mammalian+translatomes+on+a+genome-wide+scale.">Polysome fractionation and analysis of mammalian translatomes on a genome-wide scale.</a> J Vis Exp. (87), (2014).</li></ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Son teknolojik gelişmeler mekanizmaları translasyonel upregulation ilgili daha iyi bir anlayış ya da nöronal gelişim, uyuşturucu karşılığı ve metastaz gibi biyolojik süreçleri içinde belirli mRNA'ların baskı için izin vermiş. Burada açıklanan düşük maliyetli metodoloji nasıl RNA bağlanıcı proteinler hücre adezyon, geçiş ve işgali gibi metastatik işlemleri düzenleyen çalışma hücrelerdeki görüntülenmeyecektir çeviri olayları sağlar.
De novo protein çeviri değerlendirmek için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir rağmen aynı strateji elongating polipeptid değiştirilmiş amino asitler ile algılanabilir bir yan öğesini içerir, paylaşıyorlar. Bu yöntemlerden ilk 35S radiolabeled arginin birleşme yeni çevrilmiş protein içine kullanır. Belirli koşullar altında çevirinin genel oranları karşılaştırmak için verimli olmasına rağmen radiolabeled amino asitler bu yöntem çoğu araştırma ekipleri için zevksiz kullanır. Bu nedenle, roman geliştirme yöntemleri günbatımı gibi radyoaktif olmayan etiketleri kullanarak tıklayın-BT veya hile yaklaşım sunulan yeni fırsatları değerlendirmek ve in vivo çeviri olayları gözlemlemek. Her ne kadar ustaca, bu yöntemlerin çoğu sadece çeviri olayları takip değerlendirmesi için ilaç tedavisi veya belirli bir eksojen cDNA kullanarak belirli hücresel olaylar belirli hedefleri, deneyler zaten tanımlanmış hedeflere sınırlama oluşturmak izin . Bu değerlendirilmek için tek bir exogenously ifade mRNA hedef translasyonel düzenlenmesi için sağlayan dolabı yaklaşım4için doğrudur. Endojen mRNA'ların translasyonel aktivasyonu doğrulamak için sağlar, "Click-IT" yöntemi en az kuluçka süresi AHA birleşme için çok uzun en akut çeviri mekanizmaları için kabul edilen en az 1 s13, olsa da.
Son derece çok yönlü ve kurulumu kolay olmakla birlikte, burada açıklanan yöntemi kritik adımlar Protokolü'nün ilk aşamasında uyulması gerektirir. Temsilcisi sonuçlarında gösterilen, farklı hücre hatları sadece durum MRC-5 hücreleri5,21gibi görünüyor gibi her hücre kültürünü metabolizma hızı nedeniyle olabilir farklı puromisindir birleşme Kinetik olacaktır. Gerçekten de, Sigara dönüştürülmüş hücreler HeLa proliferatif değildir ve bu nedenle, protein toplu yenileme dönüştürülmüş hücrelerinde daha az daha güçlü. Bu iletişim kuralı kullanıldığında dikkate alınmalıdır. Buna göre protokol ilk bölümünü yöntemi geri kalanı için önemlidir. Dikkatle puromisindir konsantrasyonu ve kuluçka uzunluğunu belirleme deneme sırasında meydana gelen çeviri daha iyi bir değerlendirme için izin verir. Yukarıda belirtildiği gibi tedavi puromisindir aşırı miktarda küçük puromycilated polipeptitler oranını artırır ve kolayca normalde meydana gelen yanlış yorumlanmasına yol açabilecek proteolizis teşvik etmek gibi görünüyor translasyonel olaylar19 . Daha kısa bir kuluçka süresi puromisindir yoğun gerektirir, ancak kural olarak uzun kuluçka süresi daha az puromisindir, gereklidir. Konsantrasyon/saat belirli deneysel sınırlamalar için adapte edilebilir.
Burada sunulan yöntemleri son derece uyumlu ve kolayca uygulanan tedavi veya biyolojik göre değiştirilebilir işlem okudu. Miktar yöntemi hücresel olaylar son derece bilgilendirici görüntüler sunarken puromisindir birleşme hızlı değerlendirilmesi çeviri Kinetik değişimler zaman, kısa bir süre içinde sağlar. Her ne kadar güçlü, bu yöntemler dikkate alınması gereken bazı kısıtlamalara sahiptir. Puromisindir aktif olarak çevrilen tüm mRNA'ların yeni sentezlenmiş protein içine dahil edilecek. Bu nedenle, burada açıklanan puromycilation yöntemi belirli hedefleri (Yani, tek mRNA) çalışmaya uygun olmayabilir, ama tek bir hücre veya bir hücre nüfus içindeki translasyonel etkinliği genel bir bakış elde etmek idealdir. Yukarıda belirtildiği gibi aşırı puromisindir büyük sakıncaları vardır ve puromisindir dozlarda ve tedavi süreleri dikkatli bir şekilde tanımlanmasını, iletişim kuralı olarak önerilen. Gerçekten de, Şekil 2' de gösterildiği gibi aşırı puromisindir durumu lider hatalı hücre altı yerelleştirme veri için hücre içinde daha hızlı diffüz daha küçük puromycilated polipeptitler oluşumuna neden olur. Ayrıca, artan proteolizis aşırı puromisindir tedavi19, tam bir sinyal kaybına neden bir etkisi sonra oluştuğu bilinmektedir.
Olabildiğince kesin olmamakla birlikte tıklayın-BT veya hile yöntemleri, burada önerilen yaklaşım son derece erişilebilir ve çeviri Kinetik genel değişiklikleri hızlı bir değerlendirme sağlar. Diğer yöntemler daha iyi özel uygulamalar için uygun olsa bile, puromisindir birleşme deneyleri ek bir denetim olarak gerçekleştirilebilir. Gerçekten de, belirli bir mRNA hedef belirli bir durumda etkilenen tek kişi olduğunu göstermek deneme ihtiyacı varsa, bu çeviri genel bir artış neden olduğu değil göstermek gereklidir. Bu nedenle, negatif puromisindir birleşme bu dava için kanıt sağlayabilir. Ayrıca, bu yöntem de genel çeviri yapılan gözlem için uygundur. Bu nedenle, bir çeviri baskı mekanizması, stres granül oluşumu9, olduğu gibi göstermek için veya sikloheksimit tedavi translasyonel karmaşık ayırma başlangıç aşamasında kullanılan etkili bir şekilde engelliyorsa doğrulamak için kullanılabilir uzama22. 2.3 ve 2.4 bölümlerinde açıklandığı miktar yöntemleri puromisindir boyama üzerinde odaklanan deneyler ile ilgili olsa da, onlar compartmentalized boyama fluorophores türleri kullanarak herhangi bir türü için uygulanabilir, söz önemlidir. Gerçekten de, bu miktar yöntemler bir molekül veya protein hücresel dağılımını ölçmek için kullanılabilir ve hatta bir hedef belirli bir hücre altı yerde lokalizasyonu doğrulamak için.

Farklı hücresel işlevler tarafından çeviri Yönetmeliği yeni araçlar ve mRNA çeviri ve düzenlenmiş protein sentezi1,2 hücre altı lokalizasyonu belirlemek için yöntemler geliştirmek için birçok araştırma ekipleri yol açtı ,3,4. Bu son teknolojik gelişmeleri içeren çeviri upregulation veya belirli mRNA'ların baskı nöronal gelişim, uyuşturucu karşılığı ve metastaz5 gibi biyolojik süreçler sırasında mekanizmaları gelişmiş bir anlayış için izin ver ,6,7,8. Ancak, bu yöntemlerin çoğu pahalı veya tehlikeli Kimyasalları ve çoğu laboratuvarları kullanılabilir olmayabilir belirli donanımları gerektirir. Bu nedenle, özellikle bu olası sorunları aşmak için çeviri olaylar hızlı değerlendirmesi için izin vermek için uygun maliyetli bir yöntem geliştirilmiştir. Bu yöntem belirli hücresel süreçler sırasında ortaya çıkan akut translasyonel modülasyon algılar ve ayrıca confocal mikroskobu kullanarak Çeviri Yerelleştirme için sağlar.
Yöntem tanımlamak burada yerelleştirilmiş çeviri Yayilim başlatma merkezleri (SIC)5denilen hücre altı bölmeleri içinde izlemek için kullanılmıştır. SICs yeni doğmakta olan yapışma kompleksleri üzerine yerelleştirilmiş numaralı seribaşı hücrelerde bulunan geçici yapılar vardır. SICs ve yapışma kompleksler farklı olmakla birlikte, onların kaderi yakından bağlantılıdır. Gerçekten de, SICs giderek odak yapışma karmaşık olgunlaşma bir yapışma siteye yapışma başlangıç aşamasında ortadan olduğu bilinmektedir. Bulduk RNA bağlanıcı proteinler özellikle mRNA çeviri (Örneğin, Sam68, FMRP ve G3BP1) kontrol etmek için bilinen ve RNA'ların bunlar içinde zenginleştirilmiş poliadenile yapıları5. Burada açıklanan yöntemleri kullanarak, SIC ilişkili mRNA çeviri bir denetim noktası olanak verecek şekilde davranır düzenlenmesi hücre adezyon birleştirilecek hücreler seribaşı gösterdi. Bu yöntemi, puromisindir birleşme göre yüzey çeviri tahlil (SunSET) algılama adapte bir sürüm düşünülebilir. Aslında sigara radioactively etiketli bir amino asit kullanarak küresel protein sentezi oranları ölçmek için geliştirilmiş, protein puromycilation de novo protein sentezi9görselleştirmek için etkili bir yol sunar. Bu yöntem puromisindir, çeviri erken zinciri fesih ribozom10üzerinden engeller bir antibiyotik iç davranışını kullanır. Gerçekten de, puromisindir yapısal olarak tyrosyl-tRNA, peptid zincirleri bir peptit bağı oluşumu ile elongating içine şirketler için sağlar benzerdir. Ancak, puromisindir bağlama büyüyen bir peptit zincirine yeni bir peptit bağı puromisindir tRNA içinde bulunan hydrolysable ester bağı yerine hydrolysable Amid bağı olduğundan sonraki aminoasil tRNA ile oluşturulmaktadır engeller. Böylece, erken sürümü ile aktif olarak çevrilmiş mRNA9,11' e,12 karşılık gelen çok sayıda kesilmiş puromycilated polipeptitler polipeptitler elongating içine puromisindir birleşmesiyle sonuçları .
Bu yöntemi kullanarak, kısa sürede dul içinde aktif çeviri değerlendirmek mümkün (Örneğin, 5 min) hücresel yapışma antibiyotik ile 5 dk süre takviye hücrelerde puromisindir karşı spesifik bir antikor kullanarak sırasında hücre adezyon sırasında farklı zaman noktalarda5işlem. Çok özel antikorlar karşı puromycilated yan yönettiği bu tahlil duyarlığını güvenmektedir. Puromycilated polipeptid immünfloresan tespiti de confocal görüntüleme sistemleri kullanarak büyük bir hassasiyetle sayısal yeni çevrilmiş mRNA genel hücre altı yeniden bölümlenir sağlar.
Bu nedenle, bu yöntem çok sayıda translasyonel düzenleyici mekanizmaları nöronal granülasyon6,13,14, gibi süreçleri dahil eğitim laboratuvarları için ilgili bir seçenek sunar 15, morphogen mRNA Yerelleştirme ve çeviri sırasında geliştirme16,17. Ayrıca hızlı biyolojik olaylarda, hücre göç, yapışma veya işgal gibi veya sadece translasyonel değişiklikleri5, neden ilaç tedavileri değerlendirmek için yerelleştirilmiş veya bölümlere çeviri eğitimi için de uygun olduğu 7 , 18. genel olarak, bu yöntem, hızlı, hassas ve düşük maliyetli bir şekilde yerelleştirilmiş veya kontrollü çeviri olaylar görselleştirme için sağlar.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>wisent</td>
			<td>319-005-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsine</td>
			<td>wisent</td>
			<td>325-043 EL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>12483020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puroycin antibody 12D10</td>
			<td>EMD millipore</td>
			<td>MABE343</td>
			<td>western blot dilution 1:25000 
			Immunofluoresence dilution 1:10000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody</td>
			<td>cell signaling technology</td>
			<td>7076</td>
			<td>western blot dilution 1:8000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western Lightning Plus-ECL</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td>NEL104001EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse IgG (H+L), F(ab&#39;)2 Fragment (Alexa Fluor 488 Conjugate)</td>
			<td>cell signaling technology</td>
			<td>4408</td>
			<td>immunofluoresecence dilution 1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CF568 Phalloidin</td>
			<td>biotium</td>
			<td>00044</td>
			<td>immunofluoresecence dilution 1:400</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cyclohexmide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1988-1G</td>
			<td>50&#181;g/ml final concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI (4&#39;,6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D1306</td>
			<td>final concentration 1&#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>bio-Basic</td>
			<td>PJ593</td>
			<td>2.5&#181;g/ml to 10&#181;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ibidi &#181;-Dish 35 mm, high, ibiTreat</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>81156</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MRC-5 cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HeLa cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Huh-7 cells</td>
			<td colspan="2">from Dr. Mazroui (Universit&#233; Laval)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fv1000</td>
			<td>olympus</td>
			<td></td>
			<td>confocal imaging system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>http://fiji.sc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (Phosphate BuffeRed Saline)</td>
			<td>bio-Basic</td>
			<td>PD8117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde 37% Solution</td>
			<td>bio-Basic</td>
			<td>C5300-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>bio-Basic</td>
			<td>TB0198</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP9702-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween20</td>
			<td>Fisher Bioreagents</td>
			<td>BP337-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitative immunofluorescence to measure global localized translation

MRNA çeviri düzenleyen mekanizmalar mikrop çizgi geliştirme, hücre farklılaşma ve organogenesis, gibi çeşitli biyolojik süreçlerin yanı sıra birden çok hastalıklar söz konusu. Çok sayıda yayın inandırıcı belirli mekanizmaları sıkıca mRNA çeviri düzenleyici göstermiştir. Çeviri kaynaklı protein ifade Yönetmeliği artan ilgi çalışma ve de novo protein sentezi cellulo içindetakip roman yöntemleri gelişmesine neden olmuştur. Ancak, bu yöntemlerin çoğu pahalı yapım onları ve kez okudu olabilir mRNA hedef sayısını sınırlama, karmaşıktır. Bu makale yalnızca temel reaktifler ve ölçmek ve herhangi bir hücre satırında çeşitli koşullarda oluşan değişiklikleri mRNA çeviri görselleştirmek için bir confocal floresan görüntüleme sistemi gerektirir bir yöntem öneriyor. Bu yöntem son zamanlarda zaman böylece biyolojik çeşitli sırasında kısa bir süre için de novo çeviri görselleştirme imkanı sunan, kısa bir süre içinde yapışık hücreleri hücre altı yapıları yerelleştirilmiş çevirisini göstermek için kullanılan işlemler veya değişiklik translasyonel faaliyet belirli uyaranlara yanıt olarak doğrulanması.

Doğru bir şekilde puromisindir birleşme kullanarak çeviri olayları gözlemlemek için her farklı puromisindir birleşme Kinetik (şekil 1)9,11 gösterir çünkü her hücre satırı için en uygun koşulları belirlemek için önemlidir ,12,18. Bu nedenle, puromisindir birleşme doğrulamak için istenen hücre kültürünü puromisindir konsantrasyonları artan standartlaştırılmış bir spektrum ile tedavi etmek gerekli olduğunu (1.0, 2.5, 5.0, 7.5, 10,0 ve 15,0 µg/mL) farklı süreler (5 ve 10 dk) için. Yerelleştirilmiş çeviri veya ilaç tedavisi için erken bir tepki değerlendirmek için bir kısa kuluçka zamanı tercih (Örneğin, daha az 5 dk), gibi doğrudan belirli bir tedavi aşağıdaki translasyonel olayları doğrudan değerlendirme için sağlar. İdeal olarak, puromisindir sinyal kolayca detectable olmalı ama aynı zamanda doygunluk noktasına (Şekil 2) kaçınmalısınız. 5.0-7,5 µg/mL puromisindir ha-7 için önerilmektedir, ancak Şekil 2 ' de (sol kapı aynası) gösterildiği gibi bir kabul edilebilir puromisindir 7,5-10,0 µg/mL MRC-5 ve HeLa, bölgedir. Bu yöntem tamamen inisiyasyon şu anda tüm translasyonel uzama inhibe değil ama yeni synthetized polipeptid zincirleri çeviri sırasında akut algılamak için etiketlemek için hedeftir çünkü deneysel parametreleri duruma getirilmesi önemlidir Çeviri değişimler. Protokol ilk bu aşamada ihmal edilen, gibi aşırı puromisindir durumu olmamalı ve genişletilmiş tedavi süresi önemli istenmeyen sonuçlara neden. Şekil 2 ' de (doğru panelleri) gibi yüksek puromisindir konsantrasyon ile 10 min için tedavi hücreleri çoğunlukla daha küçük puromycilated polipeptitler (Örneğin, ha-7, 7.5 µg/mL veya daha fazla 10 dk) oluşturur. Bu küçük polipeptitler daha hızlı hücre altı yerelleştirme doğru bir şekilde değerlendirilmesi ile etkileşebilir hücredeki yaygın. Başka bir sorundur bu artan proteolizis aşırı puromisindir tedavi19oluşur. Bu sonuç düşük sinyal şiddeti 10 ya da 15 µg/mL puromisindir huzurunda gösterdi 10 min için tedavi MRC-5 ve HeLa hücreleri gözlendi. Bu olayların her ikisi de yanıltıcı ise artmış Difüzyon Çeviri Yerelleştirme, doğru görselleştirme engellediğinden puromisindir kaynaklı bozulması büyük ölçüde azaltır, ancak puromisindir birleşme ayirt tarafından değerlendirilir algılama hassasiyeti. Bu istenmeyen sonuçları kolayca düzgün en iyi deneysel koşullar, tanımlayarak protokolü1 bölümünde açıklandığı gibi kaçınılmalıdır.
Puromisindir birleşme görüntülenmesi sırasında ayrıca uygun denetimleri gerçekleştirmek önemlidir. Şekil 3Aiçinde gösterildiği gibi puromisindir birleşme verimli bir şekilde 50 µg/mL sikloheksimit, çeviri uzama20 ve böylece puromisindir birleşme etkisizleştirmek için bilinen bir bileşik toplama tarafından bloke edilebilir. Bu davranış sikloheksimit tedavi verimli bir şekilde puromisindir birleşme yapisan MRC-5 hücrelerde karşılık gelen sinyal çoğunu engelledi gösteren şekil 3B, gösterilir. Gerçekten de, puromycilated peptidler sadece puromisindir ile tedavi hücrelerdeki görüntülenmeyecektir ise de aynı boyama koşullar altında sikloheksimit ile tedavi edilen hücreleri sinyali zayıf algılanır. Bu peptit transferaz etkinlik5 engelleme yeteneği ve sikloheksimit puromisindir birleşme5 engelleme, olabildiğince verimli olduğu gösterilmiştir gibi alternatif olarak, başka bir antibiyotik (anisomycin) de bir negatif kontrol kullanılabilir ,18
İmmünfloresan resim alma, puromycilated polipeptitler yeni synthetized proteinler (şekil 4) karşılık gelen genel lokalizasyonu değerlendirmek mümkündür. Görüntü katmanlarının farklı hücre uçak değerlendirilmek için hücre altı bölmeleri sinyal şiddeti sağlayan yapışık hücreleri içinde farklı derinliklerde seçilir. Bu nedenle, yerelleştirilmiş puromycilation reaksiyon (şekil 4A), orta (şekil 4B) hücrenin veya (şekil 4 c) hücrenin üstüne hücreyi alt karşılaştırmak mümkündür. SICs biraz doğmakta olan ve maturating yapışma yapıları yer alan, hücrenin ortasında çoğunlukla gözlenir. Beklendiği gibi yoğun puromycilation SICs, mRNA çeviri için bu hücre altı yapıları izole olduğunu düşündüren algılanır. Daha önce de belirtildiği gibi istenen bir eksen boyunca sinyal şiddeti karşılaştırmak mümkündür. Alınan görüntüleri gri tonlamalı resimdeki kırmızı görünür doymuş piksel dahil etmezseniz bu karşılaştırma yalnızca mümkündür (üstten ikinci panelleri) elde yazılımı çalışan mikroskop kullanarak. Bu görüntüleri miktar ve belirlenmiş bir eksen boyunca piksel yoğunluğu analizini ImageJ yazılımı içine alınabilir. Pixel miktar grafik olarak temsil edilebilir (orta Masası göreli piksel yoğunluğu belirlenen konumlarda eksen boyunca göstermek için). Üst panelleri INSERT daha yakından bakmak SIC-aktin sınırları (kırmızılı) ve bu yapılar (alt bölüm) içinde zenginleştirilmiş son derece aktif çeviri olaylara karşılık gelen yapı yeşil sinyal gösterir. Bu miktar yöntemi bu yapılar içinde meydana gelen toplam çeviri tam yüzdesini belirlemek için en iyi yolu olmasa da, bu hızlı sinyal şiddeti değerlendirilmesi için izin vererek görsel olarak bilgilendirici ve iyi bir yaklaşım hücre boyunca sinyal dağıtım.
Bütün hücre boyunca sinyal nicel bir dağılım elde etmek için başka bir yöntemi kullanılmalıdır. Şekil 5' te gösterildiği gibi önemli adımlar confocal görüntü dosyaları oluşturma her z-uçak için sayısal gerek ilgi alanları belirtmek için biridir. Bu atama ImageJ içinde bulunan farklı bir çizim aracı kullanılarak elde edilebilir. Bu yöntemi kullanarak, tek bir alana veya birden çok alanı, daha sonra karşılaştırıldığında, düşülen, veya bile derlenmiş ölçmek mümkündür. Ana zorluklar vardır: (i) bul optimum görüntüleme koşulları önlemek piksel doygunluk ve arka plan sinyal, elde edilen sinyal nicel değeri yanlış, ve kurmak (II) en uygun eşik kalibrasyonu ImageJ içinde. Bu koşulların her ikisi de en iyi olduğu varsayılırsa, bu miktar hala gerçekleştirmek kolay kalan son derece tekrarlanabilir yöntemidir. Resim alma önce dikkatle z-uçak miktar için seçili hücrenin alt ve üst sınırlarını belirlemek önemlidir. Şekil 4' de olması durumunda, alt bölümde genellikle SIC/hücre vücut sinyal oranı azaltabilir fani Floresans kirletici içeren amacı, çözünürlük sınırının karşılık gelir. Daha önce bahsedilen, SICs söz konusu olursa yapışma site oluşumu ve olgunlaşma; Bu nedenle, SIC yapıları biraz yapışma kompleksleri, fani floresan en alt katmanlardan hariç yeni şekillendirme yukarıda yer alır. Böylece, SIC bağlı puromycilation sinyal açıkça obs mi ise alt bölümlerde görünür zorErve SIC/hücre vücut artış oranı açıklayan orta bölümünde sinyal için alt veya üst uçaklar karşılaştırıldığında orta bölgesinde.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55909/55909fig1.jpg"> 
Şekil 1. 1 bölümünde açıklanan puromisindir tedavi optimizasyonu deneysel gösterimi. (A) bir 24-iyi temsil deneme (Adım 1.1) için sağlanan hücre. (B) adım 1 ve 2 24-şey plaka ve sikloheksimit (CHX) üçüncü satırında 50 µg/mL nihai bir konsantrasyon için her şey için ek satırlarda orta değiştirmek gösterilen 1.4 şematik gösterimi. (C) şematik gösterim ikinci ve üçüncü satır (Adım 1.6) puromisindir tedavisinde adım 1.4 sonra 15 dak. (D) şematik gösterim (Adım 1.8) ilk satırda puromisindir tedavinin 5 dk sonra adım 1.6. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55909/55909fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55909/55909fig2.jpg"> 
Şekil 2. Puromisindir birleşme için optimal koşullar belirlenmesi. Bütün hücre Western blot analizi ayıklamak (A)MRC-5, ha-7 (B) ve (C) HeLa hücreleri, inkübe puromisindir konsantrasyonları artan (0, 2.5, 5, 7.5, 10 ve 15 µg/mL) bir süre 5 dk (sol kapı aynası) veya 10 dk (sağ için paneller). Puromycilated peptidler bir antikor puromisindir karşı kullanarak tespit edildi. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55909/55909fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55909/55909fig3.jpg"> 
Şekil 3. Sikloheksimit kullanarak puromycilation inhibisyonu. (A) sikloheksimit etkisi 5-dk puromycilation tahlil üzerinde gösterilen Western blot. Birleşme verimliliği MRC-5, ha-7 ve sahte (PBS 1 X) veya sikloheksimit tedavi aşağıdaki HeLa hücreleri. (B) Confocal görüntü sikloheksimit etkisini puromisindir birleşme üzerinde gösterilen. MRC-5 hücreleri PBS (sahte) veya sikloheksimit 15 dakika ile önceden tedavi ve 10 µg/mL ile puromisindir + PBS 1 X (sol panelde) takıma veya 10 µg/mL puromisindir + 50 µg/mL sikloheksimit (doğru kapı aynası) 5 dk. Puromycilated proteinler için algılandı bir antikor puromisindir (yeşil) karşı kullanıyor. F-aktin phalloidin (kırmızı) kullanarak algılandı ve çekirdek DAPI (mavi) ile lekeli. Ekler sağda beyaz kutu bir 2.5 x büyütme düzeyini karşılık gelir. Barlar 10 mikron =. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55909/55909fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55909/55909fig4.jpg"> 
Şekil 4. Miktar SICs yapisan MRC-5 hücrelerdeki translasyonel faaliyete. (A-C) Yapisan MRC-5 hücre temsilcisi confocal Resim 5 min için 10 µg/mL puromisindir ile tedavi. Sunulan görüntüleri alt (A), orta (B)ve hücrenin üst (C) bölümleri karşılık gelir. Üst panelleri bir antikor puromisindir (yeşil) karşı kullanarak tespit puromycilated proteinler göster. F-aktin phalloidin (kırmızı) kullanarak algılandı ve çekirdek DAPI (mavi) ile lekeli. Ekler sağda beyaz kutu bir 2 x büyütme düzeyini karşılık gelir. Barlar 10 mikron =. Orta kapı aynası kırmızı renkte doymuş piksel yokluğu göster. Alt panelleri grafik puromycilated protein zenginleştirme yapisan bir MRC-5 hücre puromisindir (yeşil), F-aktin sinyal şiddeti karşılaştırarak (kırmızı) gösterir ve DAPI (mavi) hücre eksen boyunca beyaz okla gösterilen. (D-F) Sunulan görüntüleri karşılık 4.4 x büyütme ekleme (A-C) sunulan SICs. Miktar SIC sınır gösterir (kırmızı tepeler: aktin), yanı sıra SICs içinde yerelleştirilmiş çeviri (yeşil tepeler: puromisindir) en düşük (D), (E), orta ve hücrenin üst (F) bölgeler. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55909/55909fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55909/55909fig5.jpg"> 
Şekil 5. Bütün hücre sinyal miktar yapisan MRC-5 hücrelerdeki puromycilated proteinlerin. (A) alt z-uçak katmanı bir yapisan MRC-5 hücrenin farklı alanlarda içinde sinyal belirlenmesi. (Sol kapı aynası) Toplam hücresel sinyal bu z-uçak katman için karşılık gelen bir sayısal değer elde etmek için hücrenin bütünlüğü kapsayan seçim alanının (I). (Orta paneli) Çekirdek ve does değil sitoplazmik bölümü için karşılık gelen hücresel çevrenin SIC (II) içerir. (Doğru kapı aynası) Görsel olarak SICs (III) alan II tüm cep telefonu için elde edilen değer üzerinden alınan değeri çıkararak karşılık gelen alan (alan ben). Barlar 10 mikron =. (B) her alan için nicel piksel değerleri oranı (%) gösteren bir grafik tarafından takip alan seçimi (a), tasvir eden görüntü için sinyal SICs. bulundu listelenen tablo (C) farklı alanlarda orta z-uçak katmanı bir yapisan MRC-5 hücre içinde sinyal belirlenmesi. (Sol kapı aynası) Toplam hücresel sinyal bu z-uçak katman için karşılık gelen bir sayısal değer elde etmek için hücrenin bütünlüğü kapsayan seçim alanının (I). (Orta paneli) Çekirdek ve does değil sitoplazmik bölümü için karşılık gelen hücre alanının SIC (II) içerir. (Doğru kapı aynası) Görsel olarak SICs (III) için alan II tüm cep telefonu için elde edilen değer üzerinden alınan değeri çıkararak karşılık gelen alan (alan ben). (D) kantitatif piksel değerlerini her alan için görüntü oranı (%) gösteren bir grafik tarafından takip alan seçimi (C) olarak tasvir için SICs. bulunan sinyal listelenen tablo (E) farklı alanlarda bir yapisan MRC-5 hücre üst z-uçak tabakası içinde sinyal belirlenmesi. (Sol kapı aynası) Toplam hücre sinyal bu z-uçak katman için karşılık gelen bir sayısal değer elde etmek için hücrenin bütünlüğü kapsayan seçim alanının (I). (Orta Masası) çekirdeği ve does değil sitoplazmik bölümü için karşılık gelen hücre alan seçim SICs (II) içerir. (Doğru kapı aynası) Görsel olarak SICs (III) için alan II tüm cep telefonu için elde edilen değer üzerinden alınan değeri çıkararak karşılık gelen alan (alan ben). (F) kantitatif piksel değerlerini her alan için görüntü oranı (%) gösteren bir grafik tarafından takip alan seçiminde (E), tasvir için SICs. bulunan sinyal listelenen tablo (G) da dahil olmak üzere tüm yukarıda sunulan hücreden z-uçak katmanları için miktar değerleri, hesaplanan için z-uçak A sunulan (z = 1), C (z = 9) ve E (z = 19), hangi masada Kırmızı vurgulanır. (H) tüm hücre hacmi SICs içinde bulunan sinyal yüzdesi grafik gösterimi. <a href="//ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55909/55909fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation at JoVE.com

Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation

Bu el yazması görselleştirmek ve hücre altı bölmeleri olaylarda yerelleştirilmiş çeviri ölçmek için bir yöntem açıklanır. Bu el yazması önerilen yaklaşım temel confocal görüntüleme sistemi ve Kimyasalları gerektirir ve hızlı ve düşük maliyetlidir.

Nicel ayirt ölçmek küresel çeviri lokalize

The mechanisms regulating mRNA translation are involved in various biological processes, such as germ line development, cell differentiation, and ...

quantitative-immunofluorescence-to-measure-global-localized

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Biochemistry

9.8K Görüntüleme.  Université Laval. Bu el yazması görselleştirmek ve hücre altı bölmeleri olaylarda yerelleştirilmiş çeviri ölçmek için bir yöntem açıklanır. Bu el yazması önerilen yaklaşım temel confocal görüntüleme sistemi ve Kimyasalları gerektirir ve hızlı ve düşük maliyetlidir.

Video: Quantitative Immunofluorescence to Measure Global Localized Translation

Genome-wide Quantification of Translation in Budding Yeast by Ribosome Profiling

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription reflect changes in protein synthesis, but many exceptions have been observed. Recently, a technique called ribosome profiling (or Ribo-Seq) has emerged as a powerful method that allows identification, with high accuracy, which regions of mRNA are translated into proteins and quantification of translation at the genome-wide level. Here, we present a generalized protocol for genome-wide quantification of translation using Ribo-Seq in budding yeast. In addition, combining Ribo-Seq data with mRNA abundance measurements allows us to simultaneously quantify translation efficiency of thousands of mRNA transcripts in the same sample and compare changes in these parameters in response to experimental manipulations or in different physiological states. We describe a detailed protocol for generation of ribosome footprints using nuclease digestion, isolation of intact ribosome-footprint complexes via sucrose gradient fractionation, and preparation of DNA libraries for deep sequencing along with appropriate quality controls necessary to ensure accurate analysis of in vivo translation.

Translational regulation plays an important role in the control of protein abundance. Here, we describe a high-throughput method for quantitative analysis of translation in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae.

Genom çapında Quantification ribozom profil oluşturma tarafından mayası çeviri

Translation of mRNA into proteins is a complex process involving several layers of regulation. It is often assumed that changes in mRNA transcription ...

Biyokimya

Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and RNAs, are unique to the cells from which they are derived and can be used as indicators of disease. Several common enrichment protocols, including ultracentrifugation, yield exosomes laden with soluble protein contaminants. Specifically, we have found that the most abundant proteins within blood often co-purify with exosomes and can confound downstream proteomic studies, thwarting the identification of low abundance biomarker candidates. Of additional concern is irreproducibility of exosome protein quantification due to inconsistent representation of non-exosomal protein levels. The protocol detailed here was developed to remove non-exosomal proteins that co-purify along with exosomes, adding rigor to the exosome purification process. Five methods were compared using paired blood plasma and serum from five donors. Analysis using nanoparticle tracking analysis and micro bicinchoninic acid protein assay revealed that a combined protocol utilizing ultrafiltration and size exclusion chromatography yielded the optimal vesicle enrichment and soluble protein removal. Western blotting was used to verify that the expected abundant blood proteins, including albumin and apolipoproteins, were depleted.

Here, we present a protocol to purify exosomes from both plasma and serum with reduced co-purification of non-exosomal blood proteins. The optimized protocol includes ultrafiltration, protease treatment, and size exclusion chromatography. Enhanced purification of exosomes benefits downstream analyses, including more accurate quantification of vesicles and proteomic characterization.

Protein sindirimi, Ultrafiltrasyon ve boyutu dışlama Kromatografi insan kan plazması ve Serum Exosomes yalıtım en iyi duruma getirmek için

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation of protein synthesis is the key to cellular stress-response, and dysregulation is central to many disease states, such as cancer. For instance, although cellular stress leads to the inhibition of global translation by attenuating cap-dependent initiation, certain stress-response proteins are selectively translated in a cap-independent manner. Discreet RNA regulatory elements, such as cellular internal ribosome entry sites (IRESes), allow for the translation of these specific mRNAs. Identification of such mRNAs, and the characterization of their regulatory mechanisms, have been a key area in molecular biology. Toeprinting is a method for the study of RNA structure and function as it pertains to translation initiation. The goal of toeprinting is to assess the ability of in vitro transcribed RNA to form stable complexes with ribosomes under a variety of conditions, in order to determine which sequences, structural elements, or accessory factors are involved in ribosome binding&#8212;a pre-cursor for efficient translation initiation. Alongside other techniques, such as western analysis and polysome profiling, toeprinting allows for a robust characterization of mechanisms for the regulation of translation initiation.

Toeprinting aims to measure the ability of in vitro transcribed RNA to form translation initiation complexes with ribosomes under a variety of conditions. This protocol describes a method for toeprinting mammalian RNA and can be used to study both cap-dependent and IRES-driven translation.

Çeviri başlatma karmaşık oluşumu memeli mRNA'ların Toeprinting analizi

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

Use of Microscale Thermophoresis to Measure Protein-Lipid Interactions

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane trafficking, signal transduction and cytoskeletal remodeling. Classic tools for measuring such interactions include surface plasmon resonance (SPR) and isothermal titration calorimetry (ITC). While powerful tools, these approaches have setbacks. ITC requires large amounts of purified protein as well as lipids, which can be costly and difficult to produce. Furthermore, ITC as well as SPR are very time consuming, which could add significantly to the cost of performing these experiments. One way to bypass these restrictions is to use the relatively new technique of microscale thermophoresis (MST). MST is fast and cost effective using small amounts of sample to obtain a saturation curve for a given binding event. There currently are two types of MST systems available. One type of MST requires labeling with a fluorophore in the blue or red spectrum. The second system relies on the intrinsic fluorescence of aromatic amino acids in the UV range. Both systems detect the movement of molecules in response to localized induction of heat from an infrared laser. Each approach has its advantages and disadvantages. Label-free MST can use untagged native proteins; however, many analytes, including pharmaceuticals, fluoresce in the UV range, which can interfere with determination of accurate KD values. In comparison, labeled MST allows for a greater diversity of measurable pairwise interactions utilizing fluorescently labeled probes attached to ligands with measurable absorbances in the visible range as opposed to UV, limiting the potential for interfering signals from analytes.

Microscale thermophoresis obtains binding constants quickly at low material cost. Either labeled or label free microscale thermophoresis is commercially available; however, label free thermophoresis is not capable of the diversity of interaction measurements that can be performed using fluorescent labels. We provide a protocol for labeled thermophoresis measurements.

Protein-Lipid Etkileşimlerini Ölçmek için Mikro Ölçekli Termoforez Kullanımı

The ability to determine the binding affinity of lipids to proteins is an essential part of understanding protein-lipid interactions in membrane ...

Ubiquitin Chain Analysis by Parallel Reaction Monitoring

Assessment of the global profile of ubiquitin chain topologies within a proteome is of interest to answer a wide range of biological questions. The protocol outlined here takes advantage of the di-glycine (-GG) modification left after the tryptic digestion of ubiquitin incorporated in a chain. By quantifying these topology-characteristic peptides the relative abundance of each ubiquitin chain topology can be determined. The steps required to quantify these peptides by a parallel reaction monitoring experiment are reported taking into consideration the stabilization of ubiquitin chains. Preparation of heavy controls, cell lysis, and digestion are described along with the appropriate mass spectrometer setup and data analysis workflow. An example data set with perturbations in ubiquitin topology is presented, accompanied by examples of how optimization of the protocol can affect results. By following the steps outlined, a user will be able to perform a global assessment of the ubiquitin topology landscape within their biological context.

This method describes the assessment of global changes in ubiquitin chain topology. The assessment is performed by the application of a mass spectrometry-based targeted proteomics approach.

Paralel Reaksiyon İzleme ile Ubiquitin Zincir Analizi

Assessment of the global profile of ubiquitin chain topologies within a proteome is of interest to answer a wide range of biological questions. The ...

Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of PNKs can be quantified using direct or indirect approaches. Presented here is a direct, in vitro approach to measure PNK activity that relies on a fluorescently-labeled oligonucleotide substrate and polyacrylamide gel electrophoresis. This approach provides resolution of the phosphorylated products while avoiding the use of radiolabeled substrates. The protocol details how to set up the phosphorylation reaction, prepare and run large polyacrylamide gels, and quantify the reaction products. The most technically challenging part of this assay is pouring and running the large polyacrylamide gels; thus, important details to overcome common difficulties are provided. This protocol was optimized for Grc3, a PNK that assembles into an obligate pre-ribosomal RNA processing complex with its binding partner, the Las1 nuclease. However, this protocol can be adapted to measure the activity of other PNK enzymes. Moreover, this assay can also be modified to determine the effects of different components of the reaction, such as the nucleoside triphosphate, metal ions, and oligonucleotides.

This protocol describes a nonradioactive assay to measure kinase activity of polynucleotide kinases (PNKs) on small DNA and RNA substrates.

Küçük Nükleotit Substratlarının Polinükleotid Fosforilasyonunun Ölçülmesini Radyoaktif Olmayan Tsay

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of ...

Optical Tweezers to Study RNA-Protein Interactions in Translation Regulation

RNA adopts diverse structural folds, which are essential for its functions and thereby can impact diverse processes in the cell. In addition, the structure and function of an RNA can be modulated by various trans-acting factors, such as proteins, metabolites or other RNAs. Frameshifting RNA molecules, for instance, are regulatory RNAs located in coding regions, which direct translating ribosomes into an alternative open reading frame, and thereby act as gene switches. They may also adopt different folds after binding to proteins or other trans-factors. To dissect the role of RNA-binding proteins in translation and how they modulate RNA structure and stability, it is crucial to study the interplay and mechanical features of these RNA-protein complexes simultaneously.&#160;This work illustrates how to employ single-molecule-fluorescence-coupled optical tweezers to explore the conformational and thermodynamic landscape of RNA-protein complexes at a high resolution. As an example, the interaction of the SARS-CoV-2 programmed ribosomal frameshifting element with the trans-acting factor short isoform of zinc-finger antiviral protein is elaborated. In addition, fluorescence-labeled ribosomes were monitored using the confocal unit, which would ultimately enable the study of translation elongation. The fluorescence coupled OT assay can be widely applied to explore diverse RNA-protein complexes or trans-acting factors regulating translation and could facilitate studies of RNA-based gene regulation.

This protocol presents a complete experimental workflow for studying RNA-protein interactions using optical tweezers. Several possible experimental setups are outlined including the combination of optical tweezers with confocal microscopy.

Çeviri Yönetmeliğinde RNA-Protein Etkileşimlerini İncelemek için Optik Cımbız

RNA adopts diverse structural folds, which are essential for its functions and thereby can impact diverse processes in the cell. In addition, the ...

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance Energy transfer (FRET) to study membrane receptor dynamics in live cells using modern fluorescence labeling techniques. In dual-color FCCS, where the fluctuations in fluorescence intensity represent the dynamic &#34;fingerprint&#34; of the respective fluorescent biomolecule, we can probe co-diffusion or binding of the receptors. FRET, with its high sensitivity to molecular distances, serves as a well-known &#34;nanoruler&#34; to monitor intramolecular changes. Taken together, conformational changes and key parameters such as local receptor concentrations and mobility constants become accessible in cellular settings.
Quantitative fluorescence approaches are challenging in cells due to high noise levels and the vulnerability of the sample. Here we show how to perform this experiment, including the calibration steps using dual-color labeled &#946;2-adrenergic receptor (&#946;2AR) labeled with eGFP and SNAP-tag-TAMRA. A step-by-step data analysis procedure is provided using open-source software and templates that are easy to customize.
Our guideline enables researchers to unravel molecular interactions of biomolecules in live cells in situ with high reliability despite the limited signal-to-noise levels in live cell experiments. The operational window of FRET and particularly FCCS at low concentrations allows quantitative analysis at near-physiological conditions.

We present an experimental protocol and data analysis workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance Energy transfer (FRET) to study membrane receptor dynamics in live cells using modern fluorescence labeling techniques.

Canlı Hücrelerde Protein-Protein Etkileşimi ve Protein Dinamiklerini incelemek için Çift Renkli Floresan Çapraz Korelasyon Spektroskopisi

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance ...

Single-Molecule Imaging of EWS-FLI1 Condensates Assembling on DNA

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 (FET) family of fusion oncoproteins, is one of the most frequently involved fusion genes in Ewing sarcoma. These FET family fusion proteins typically harbor a low-complexity domain (LCD) of FET protein at their N-terminus and a DNA-binding domain (DBD) at their C-terminus. EWS-FLI1 has been confirmed to form biomolecular condensates at its target binding loci due to LCD-LCD and LCD-DBD interactions, and these condensates can recruit RNA polymerase II to enhance gene transcription. However, how these condensates are assembled at their binding sites remains unclear. Recently, a single-molecule biophysics method-DNA Curtains-was applied to visualize these assembling processes of EWS-FLI1 condensates. Here, the detailed experimental protocol and data analysis approaches are discussed for the application of DNA Curtains in studying the biomolecular condensates assembling on target DNA.

Here, we describe the use of the single-molecule imaging method, DNA Curtains, to study the biophysical mechanism of EWS-FLI1 condensates assembling on DNA.

DNA Üzerine Birleştirilen EWS-FLI1 Kondensatlarının Tek Moleküllü Görüntülenmesi

The fusion genes resulting from chromosomal translocation have been found in many solid tumors or leukemia. EWS-FLI1, which belongs to the FUS/EWS/TAF15 ...

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy (cryo-EM) Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method for structural biologists to determine high-resolution structures of a wide variety of macromolecules. Multiple software suites are available to new and expert users for image processing and structure calculation, which streamline the same basic workflow: movies acquired by the microscope detectors undergo correction for beam-induced motion and contrast transfer function (CTF) estimation. Next, particle images are selected and extracted from averaged movie frames for iterative 2D and 3D classification, followed by 3D reconstruction, refinement, and validation. Because various software packages employ different algorithms and require varying levels of expertise to operate, the 3D maps they generate often differ in quality and resolution. Thus, users regularly transfer data between a variety of programs for optimal results. This paper provides a guide for users to navigate a workflow across the popular software packages: cryoSPARC v3, RELION-3, and Scipion 3 to obtain a near-atomic resolution structure of the adeno-associated virus (AAV). We first detail an image processing pipeline with cryoSPARC v3, as its efficient algorithms and easy-to-use GUI allow users to quickly arrive at a 3D map. In the next step, we use PyEM and in-house scripts to convert and transfer particle coordinates from the best quality 3D reconstruction obtained in cryoSPARC v3 to RELION-3 and Scipion 3 and recalculate 3D maps. Finally, we outline steps for further refinement and validation of the resultant structures by integrating algorithms from RELION-3 and Scipion 3. In this article, we describe how to effectively utilize three processing platforms to create a single and robust workflow applicable to a variety of data sets for high-resolution structure determination.

A Robust Single-Particle Cryo-Electron Microscopy cryo-EM Processing Workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion

This article describes how to effectively utilize three cryo-EM processing platforms, i.e., cryoSPARC v3, RELION-3, and Scipion 3, to create a single and robust workflow applicable to a variety of single-particle data sets for high-resolution structure determination.

CryoSPARC, RELION ve Scipion ile Sağlam Tek Parçacıklı Kriyo-Elektron Mikroskobu (cryo-EM) İşleme İş Akışı

Recent advances in both instrumentation and image processing software have made single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) the preferred method ...