Name: selection-dependent and independent generation of crispr/cas9-mediated gene knockouts in mammalian cells
Uploaded: 2017-06-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 35 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells at JoVE.com

Yazarlar, deneysel yardım için Gissell Sanchez, Megan Lee ve Jason Estep&#39;i ve reaktifleri paylaşmak için Weifeng Gu ve Xuemei Chen&#39;i onaylamak istiyorlar.

1. İstenilen Silinme Çevresindeki Homoloji Bölgelerinin Belirlenmesi NOT: Yalnızca seçim temelli düzenleme kullanılıyorsa gereklidir. <ol><li> HDR şablonunda homoloji kolları olarak görev yapacak istenen silme yerinin her iki tarafında başlangıçta 1.5-2 kb olan iki bölge seçin ( Şekil 1A ). Klonlamayı kolaylaştırmak için her iki zincirde (GGTCTC) BsaI tanıma sitelerinden yoksun bölgeler belirleyin. BsaI siteleri kaçınılmazsa alternatif bir IIs kısıtlama enzimi (BsmBI, SapI, BbsI) kullanın ve alıcı plazmitteki karşılık gelen siteleri (pUC19-BsaI), direnç markörü verici plasmidini (pGolden-Neo veya pGolden-Hygro) değiştirin ve Homoloji kolu PCR ürünü çıkıntıları. </li></ol> 2. Cas9-sgRNA Ekspresyon Plazmidlerinin Üretimi <ol><li> Mutajenez için hedef alan (lar) ı tanımlayın. Tek kesimli, seçime bağlı olmayan yöntem için, bir non-fu olasılığını artırmak için 5 &#39;yakınlık kodlama eksonlarını hedefleyinNasyonal mutasyon. İki kesimli yöntem için, gerektiği kadar geni kapsayan iki site seçin. NOT: Deneyimlerimize göre 53 kb&#39;ye kadar olan silinmeler verimli bir şekilde oluşturulmuştur. </li><li> Hedeflenen bölge diziliminin 200 ila 300 bp&#39;lik değerini crispr.mit.edu tasarım aracına girin. Seçim temelli klonlama için, silme lokusuna yakın olan 200-300 bp&#39;lik tanımlanmış homoloji bölgelerini kullanın ( Şekil 1A ). Faaliyet bölgelerindeki farklılıkları açıklamak ve aynı potansiyel dışı etkileri paylaşmayan bağımsız klonları izole etmek için hedef bölgeye göre en üst sıralarda yer alan sgRNA&#39;lardan 2-3&#39;ünü seçin. </li><li> İfade plazmidine yerleştirilmek üzere uygun çıkıntılar ile duplekslenmiş oligonükleotitleri tasarlamak için, biten PAM dizisini (NGG) atlayın ve bir 5&#39;-CACC çıkıntısı takiben bir üst üste oligonoza bitişik ekleyin. Alt iplikçiği oligo için, ters tamamlanmış hedef dizisine bir 5&#39;-AAAC çıkıntı ekleyin, bunu takiben 3&#39;-C, ilAşağıda lustrated: <img alt="Sıra 1" src="/files/ftp_upload/55903/55903seq01.jpg" /></li><li> SgRNA&#39;lara karşılık gelen sentetik oligonükleotitleri, Zhang laboratuvar protokolü 29&#39;da tarif edildiği gibi Golden Gate klonlama 28&#39;i kullanarak pSpCas9 (BB) plasmidine yerleştirin. </li></ol> Homolojiye Yönelik Tamir Şablonu Plazmidlerinin Üretilmesi NOT: Yalnızca seçim temelli düzenleme kullanılıyorsa gereklidir. Homoloji yönelimli onarım şablonu plazmid, iki sgRNA hedef alanının hemen dışındaki genomu tamamlayan iki bölge tarafından çevrelenmiş bir ilaç direnci kasetinden oluşur ( Şekil 1B ). <ol><li> Adım 1.1&#39;de tanımlanan daha geniş homoloji bölgelerinden, homoloji kolları olarak görev yapmak üzere tasarlanmış Cas9 kesim bölgelerinden 800-1000 bp 26 en fazla 5-10 bp uzaklıkta olanı seçin ( Şekil 1A ). SgRNA&#39;yı içermediğinden emin olunHedef bölge ve PAM&#39;sini homoloji kollarında kullanır, çünkü şablon plazmitinin CRISPR / Cas9 bölünmesine neden olur. Homoloji kolları dahili BsaI siteleri içeriyorsa, alternatif sgRNA siteleri kullanın. </li><li> PCR, homolog bölgenin herhangi bir ucunda BsaI bölgelerini (GGTCTC) ve benzersiz çıkıntıları tanıtan ilave 5 &#39;sekansı olan ileri ve geri primerleri kullanarak üreticinin talimatlarına göre yüksek doğrulukta bir DNA polimerazı kullanarak genomik DNA&#39;dan homoloji kollarını yükseltmektedir. Çıkıntılar, aşağıda açıklandığı gibi ( Şekil 1B ) doğru montaj sırasını ve yönünü üretmek için doğru dizileri içermelidir: Sol homoloji kolu FP çıkıntısı: 5 &#39;GGGTCTCA GGCC Sol homoloji kolu RP çıkıntısı: 5 &#39;GGGTCTCT CACG Doğru homoloji kolu FP çıkıntısı: 5 &#39;GGGTCTCA GTCC Doğru homoloji kolu RP çıkıntısı: 5 &#39;GGGTCTCT CCAC </li><li> Uygun olan amplifık için homoloji kollarını kontrol edinİleriye ilerlemeden önce jel elektroforezi yoluyla verin. </li><li> Sağ ve sol homoloji kol bölgelerini direnç kaseti ile Golden Gate klonlama 28 ile bir HDR şablon plasmidine birleştirin. LoxP ile çevrili direnç kasetleri (loxP-PGK-Neo-pA-loxP veya loxP-PGK-Hyg-pA-loxP) kaynağı olarak pGolden-Neo veya pGolden-Hygro plazmidlerini 30 kullanın. Çoklu klonlama bölgesinde BsaI siteleri bulunan bir pUC19-BsaI, alıcı vektör olarak BSAI bölgelerini başka yerlerde elimine eden değiştirilmiş bir pUC19 kullanın (istek üzerine temin edilebilir). Üç ekleme ve vektör için 1: 1: 1: 1 oranını kullanın. <ol><li> Aşağıdaki reaksiyon karışımını 30 hazırlayın: <table><tbody><tr><td> Doğru homoloji kolu PCR ürünü </td><td> 0.06 pmol (30-40ng) </td></tr><tr><td> Sol homoloji kolu PCR ürünü </td><td> 0.06 pmol (30-40ng) </td></tr><tr><td> PGolden-Neo plasmid (100 ng / ml) </td><td> 1 &amp;181. L </td></tr><tr><td> PUC19-BsaI plasmid (100 ng / ml) </td><td> 1 uL </td></tr><tr><td> 2x T7 DNA ligaz tamponu </td><td> 5 uL </td></tr><tr><td> BsaI (10 U / uL) </td><td> 0,75 μL </td></tr><tr><td> T7 DNA ligazı (3000 U / uL) </td><td> 0.25 uL </td></tr><tr><td> Su </td><td> 10 μL&#39;ye kadar </td></tr></tbody></table></li><li> Aşağıdaki termal çevrimci parametrelerini kullanın: 5 dakika boyunca 37 ° C, 5 dakika için 20 ° C. 30 döngü için tekrarlayın. </li><li> Geriye kalan doğrusallaştırılmış DNA&#39;yı sindirmek için üreticinin talimatlarına göre klonlama ürününe bir eksonükleaz verin. </li><li> Reaksiyon karışımını hücrelerle verilen protokole göre yetkili bir E. coli suşuna, ampisilin içeren kaplarda plaka haline getirin. </li></ol></li><li> Doğru şablon düzeneğiyle klonları tanımlamak için, bakteri uygulamak(Tamamı eklemenin güvenilir şekilde büyütülmesi için çok büyük olabilmesi nedeniyle) birleştirilen ekin homoloji kolu alt bölümlerini büyütmek için al koloni PCR. Kenar altındaki plazmid dizisine bir primer tavlama ve direnç kasetinin kenarına tamamlayıcı ikinci bir primer kullanın ( Şekil 1B , sıra hem Neo hem de Hygro eklerinde ortaktır), yaklaşık 200 bp daha uzun bir montaja bağlı ürünü üretir Içerilen homoloji kolu: PUC19-Bsal-Left: 5 &#39;GGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAG Direnç-Sol: 5 &#39;AAAAGCGCCTCCCCTACCC PUC19-BsaI-Sağ: 5 &#39;GCTATTACGCCAGCTGGCGAAA Direnç-Sağ: 5 &#39;AAGACAATAGCAGGCATGCTGGG <ol><li> Steril kürdan ile bakteri kolonileri seçin ve 20 μL su bakterileri askıya al. 95 ° C&#39;de 15 dakika ısıtın ve bir masa santrifüjünde 5 dakika süreyle maksimum hızda aşağı doğru döndürün. Hemen buzda bekletin. </li><li> Aşağıdaki PCR karışımını hazırlayın 31 &lt;/ Sup&gt;: <table><tbody><tr><td> Seyreltik koloni şablonu </td><td> 1.25 μL </td></tr><tr><td> 10x Taq reaksiyon tamponu </td><td> 1.25 μL </td></tr><tr><td> 20 mM dNTP&#39;ler </td><td> 0.25 uL </td></tr><tr><td> 10 uM İleri primer </td><td> 0.25 uL </td></tr><tr><td> 10 uM Geri astar </td><td> 0.25 uL </td></tr><tr><td> Taq Polimeraz </td><td> 0.25 uL </td></tr><tr><td> Su </td><td> 9 uL </td></tr></tbody></table></li><li> Aşağıdaki termal siklör parametrelerini kullanın: 30 saniye süreyle 95 ° C, (95 ° C 30 saniye, 30 saniye için 61 ° C, 1 dakika / kb için 72 ° C) 25 devir için tekrarlayın, 72 ° C&#39;de 2 dakika boyunca tekrarlayın. </li><li> Agaroz jel elektroforezi ile doğru amplikon boyutu için PCR ürününü kontrol edin. </li><li> İsteğe bağlı olarak, doğru ekleme boyutu ve sırası ile bireysel kolonilerden miniprep plazmid DNAE homoloji kol bölgeleri yukarıda adı geçen amplifikasyon primerleri ile Sanger dizilişiyle. </li></ol></li></ol> 4. CRISPR bileşenlerinin kültürlenmiş hücrelere transferi <ol><li> Transfeksiyondan önce: 37 ° C&#39;de ve% 5 C02&#39;de% 10 FBS ile takviye edilmiş DMEM ortamında T-REx293 hücrelerini kültürleyin. </li><li> 6-kuyucuklu plakalara hücreleri plaklayın ve yaklaşık% 70 konfluansa kadar büyür. Transfekte edilmemiş bir kontrol için bir kuyu ekleyin. </li><li> Ticari bir transfeksiyon protokolü kullanarak 2.5 ug toplam plazmid ile transfekte hücreler. Buna paralel olarak, transfekte edilmemiş kontrolü muhafaza edin. NOT: Transfeksiyon yöntemi ve verimliliği hücre tipine göre değişir. Deneyden önce sistem için uygun transfeksiyon yöntemini belirleyin. <ol><li> Hücrelerin seçimle transfekte edilmesi için 0.75 μg Cas9-sgRNA 1 (sol kesim), 0.75 μg Cas9-sgRNA 2 (sağ kesim) ve 1.0 μg homolog rekombinasyon şablonu kullanın. </li><li> Transfecti içinSeçim yapılmadan hücrelerin açık olmasını istiyorsanız, 2.5 μg Cas9-sgRNA plazmid kullanın. </li></ol></li></ol> 5. İlaç Seçimi <ol><li> Transfeksiyondan 48 saat sonra hücreleri uygun ilaçla tedavi edin (Neomisin / Hygromycin). Transfekte edilmemiş kontrol hücresindeki tüm hücreler ölünceye kadar seçim yapın (genellikle Neo için 3-5 gün, Hygro için 7-14 gün). NOT: T-REx293 hücreleri için Neomisin ve Hygromycin için sırasıyla 500 μg / mL ve 10 μg / mL konsantrasyonları kullanın. Diğer hücre türleri için etkin konsantrasyonu belirlemek için transfekte edilmemiş hücreler üzerinde ilacın önceden titrasyonunun yapılması yararlı olabilir. </li></ol> 6. Klon Popülasyonlarının İzolasyonu <ol><li> Seçildikten sonra orijinal kuyudaki hücreleri% 100 konfluansa kadar büyütün. Kuyu başına 0.33 hücre yoğunluğunda 96 oyuklu plakalara hücreler tohumlandı. NOT: Üç 96 yuvalı plakanın tohumlanması, birden fazla doğru klonun izolasyonunu sağlamak için iyi bir başlangıç ​​noktasıdır, ancak daha fazla ya da daha azına ihtiyaç duyulabilir.SgRNA ve HDR verimliliklerine son verir. </li><li> Koloniler gözle görünene kadar, 2-4 hafta süreyle kolonilere dikkat edin. Steril bir pipet ucu ile görünür koloniler seçin ve tek katmanlı büyümeyi teşvik etmek için yeni kuyularda yeniden sıkıştırın. Süspansiyon hücrelerini kullanırken, tek koloni kuyularının daha büyük bir kısmını sağlamak için daha düşük ekim yoğunlukları kullanılabilir. </li></ol> 7. Tarama Adayları <ol><li> Seçim kullanmadan adayları tarama: nokta leke <ol><li> Bireysel klonları% 50-100 konfluansa yükseltin. Kuyu içinde pipetleme yaparak hücrelerin tek katmanını çıkarın. </li><li> Temiz bir mikrosantrifüj tüpüne 100 uL&#39;lik toplam hacmden 90 μL&#39;ye bölün. 5 dakika boyunca 6000 rpm&#39;de aşağı döndürün, ortamı alın ve 1 x Lysis Tamponu veya 1x SDS yükleme tamponu (5x: 250 mM Tris-Cl pH 6.8,% 8 SDS,% 0.1 bromofenol mavisi,% 40&#39;lık 10 uL&#39;lik hücre pelletini lize edin. Gliserol, 100 mM DTT). Wel&#39;de hücrelerin geri kalanına 90 uL yeni medya ekleyinYayılmaya devam edeceğim. </li><li> Bir nokta oluşturmak için kuru nitroselüloz zar üzerine 1 μL hücre lizatı pipetleyin. Her örneği iki ayrı zar üzerinde iki kez lekeleyerek iki aynı örnek örneği oluşturun. </li><li> TBST (Tris Tamponlu Tuz +% 0.01 Tween 20: 8 g NaCl, 0.2 g KCI, 3 g Tris baz, 1 L damıtılmış suya kadar, pH 7.4) içinde% 5 sütteki membranları oda sıcaklığında 1 saat bloke edin Sallama, burada ve prosedür boyunca). </li><li> Bir membranda hedef proteine ​​karşı birincil antikor ve bir kontrol proteini için birincil antikor (tubulin, GAPDH veya değişmesi beklenmeyen diğer proteinler) kullanılarak leke. TBST +% 5 sütte önerilen primer antikor seyreltmesini (ELAVL1 için 0.2 μg / mL ve bu durumda Pum2 için 0.1 μg / mL) kullanın. 1 saat oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> TBST ile 3 kez 15 dakika yıkayın. </li><li> Her membranı T&#39;de uygun HRP ile konjüge edilmiş sekonder antikorla inkübe edinBST + oda sıcaklığında 1 saat boyunca% 5 süt. </li><li> TBST ile 3 kez 15 dakika yıkayın. </li><li> Üreticinin talimatlarını izleyerek kemilüminesan substrat çözeltisi uygulayın (Malzeme Tablosuna bakın) ve blotlanmış membranı bir dijital kemilüminesans görüntüleyicide görüntüleyin. </li><li> Uygun yazılım kullanarak hedef ve kontrol proteinleri için nokta yoğunluklarını nicelleştirin. </li><li> Düşük kontrol protein sinyali ile adayları yok edin ve geri kalan adaylar için protein yoğunluklarını kontrol etmek için hedefin arka plandan çıkarılmış oranlarını hesaplayın. Geçiş için en düşük oranlara sahip adayları seçin ve batı leke ile daha fazla doğrulama yapın. </li></ol></li><li> Seçim kullanılarak tarama adayları: koloni PCR <ol><li> Bir DNA hazırlama kiti kullanarak hücre lizatı toplayın (Bkz. Malzeme Tablosu ). <ol><li> Tek tek kolonileri yeni bir 96 kuyucukta çoğaltın ve% 100 konfluene kadar büyür. </li><li> Bir grup klondan ortam çıkarın,Kitten 30 μL ekstraksiyon tamponu içindeki hücreleri tekrar süspansiyon haline getirin. Temiz bir 1.5 mL&#39;lik mikrosantrifüj tüpüne aktarın. </li><li> Çözeltiyi 96 ° C&#39;ye 15 dakika ısıtın ve oda sıcaklığına soğumasını bekleyin. </li><li> Kitten 30 μL Stabilizasyon tamponu ekleyin. İyice karıştırın. </li></ol></li><li> Yabani tip ve monoelale / bialelik mutant hatlarını koloni PCR ile tanımlayın. <ol><li> Direnç kasetinin başarılı veya başarısız entegrasyonuna dayalı olarak homoloji kollarının etrafındaki bölgeleri büyütmek için iki ayrı PCR primeri seti (hedeflenen lokusun sol ve sağ tarafı için) tasarlayın ( Şekil 2C ). Her iki tarafta, homoloji kolunun dışında tavlanmış ortak bir primer (kırmızı) kullanın. Vahşi tipli alleli test etmek için homoloji bölgesini (mavi) kapsayan endojen diziyi tamamlayan karşılık gelen eşleştirilmiş bir primerle kullanın. Takılan direnç kasetini tamamlayan başka bir çift astar kullanın (bkz. Bölümlerdeki primerler2.3), arzu edilen mutasyonu test etmek için. </li><li> (Önerilir) Başlangıçtaki seçilmiş toplu hücre popülasyonundan hücre lisatı kullanılarak primer setlerini doğrulayın, çünkü hem WT hem de mutant allellerin bir karışımını içerecektir ( Şekil 2D ). </li><li> Aşağıdaki reaksiyon karışımını hazırlayın: <table><tbody><tr><td> Hücre lisatı </td><td> 0.5 uL </td></tr><tr><td> 10x KOD tampon </td><td> 1.25 μL </td></tr><tr><td> 25 mM MgS04 </td><td> 0,75 μL </td></tr><tr><td> 2 mM dNTP&#39;ler </td><td> 1.25 μL </td></tr><tr><td> 10 uM İleri primer </td><td> 0.375 uL </td></tr><tr><td> 10 uM Geri astar </td><td> 0.375 uL </td></tr><tr><td> KOD polimeraz </td><td> 0.25 uL </td></tr><tr><td> Su </td><td> 7,75 μL </td></tr></tbody></table></li><li> Aşağıdaki termal çevrimci koşullarını kullanın: 95 ° C&#39;de 2 dakika, (95 ° C&#39;de 20 saniye, Primer Tm&#39;de 10 saniye, 70 ° C&#39;de 20 s / kb) tekrarlama. </li><li> PCR ürününü agaroz jel elektroforezi ile görselleştirin. </li></ol></li><li> Tahmini entegrasyonun her iki tarafı için koloni PCR testini tekrarlayın. Silinmiş bölge için entegrasyonun varlığını ve içsel sıra ürününü göstermeyen adayları seçin ve genişletin. </li><li> Pozitif adayları western blot ve / veya RT-qPCR ile doğrulayın. </li></ol></li></ol> 8. Sırayla Sıralama Genomik Mutasyonunu Doğrulayın <ol><li> Genomik DNA&#39;yı mutant hücre çizgilerinden fenol kloroform ekstraksiyonu ile izole edin 31 . </li><li> PCR, her ucuna BsaI kısıtlama siteleri ekleyen 5 &#39;çıkıntılı primerler kullanılarak sgRNA hedef bölgesini çoğaltılır. NOT: HDR ile düzenlenmiş klonlar için, her iki allel de aynı olabilir, PCR ürünü doğrudan dizilenebilir. </li><li> Golden Gate klonlama ile güçlendirilmiş bölgeyi pUC19-BsaI&#39;ye klonlayın. </li><li> Reaksiyon karışımı, yetkili bir E. coli suşuna dönüştürülür. </li><li> 6-10 bireysel koloniden plazmid DNA&#39;yı miniiprep edin ve Sanger dizilemesi ile klonlanmış bölgeyi dizinleyin. </li></ol>

<ol>
	<li>Carroll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+with+zinc-finger+nucleases.">Genome engineering with zinc-finger nucleases.</a> Genetics. 188 (4), 773-782 (2011).</li><li>Kim, Y. G., Cha, J., Chandrasegaran, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+restriction+enzymes:+zinc+finger+fusions+to+Fok+I+cleavage+domain.">Hybrid restriction enzymes: zinc finger fusions to Fok I cleavage domain.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (3), 1156-1160 (1996).</li><li>Bibikova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stimulation+of+homologous+recombination+through+targeted+cleavage+by+chimeric+nucleases.">Stimulation of homologous recombination through targeted cleavage by chimeric nucleases.</a> Mol Cell Biol. 21 (1), 289-297 (2001).</li><li>Bibikova, M., Golic, M., Golic, K. G., Carroll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+chromosomal+cleavage+and+mutagenesis+in+Drosophila+using+zinc-finger+nucleases.">Targeted chromosomal cleavage and mutagenesis in Drosophila using zinc-finger nucleases.</a> Genetics. 161 (3), 1169-1175 (2002).</li><li>Porteus, M. H., Cathomen, T., Weitzman, M. D., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+gene+targeting+mediated+by+adeno-associated+virus+and+DNA+double-strand+breaks.">Efficient gene targeting mediated by adeno-associated virus and DNA double-strand breaks.</a> Mol Cell Biol. 23 (10), 3558-3565 (2003).</li><li>Bogdanove, A. J., Voytas, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAL+effectors:+customizable+proteins+for+DNA+targeting.">TAL effectors: customizable proteins for DNA targeting.</a> Science. 333 (6051), 1843-1846 (2011).</li><li>Miller, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+TALE+nuclease+architecture+for+efficient+genome+editing.">A TALE nuclease architecture for efficient genome editing.</a> Nat Biotechnol. 29 (2), 143-148 (2011).</li><li>Moscou, M. J., Bogdanove, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+cipher+governs+DNA+recognition+by+TAL+effectors.">A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors.</a> Science. 326 (5959), 1501 (2009).</li><li>Christian, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+DNA+double-strand+breaks+with+TAL+effector+nucleases.">Targeting DNA double-strand breaks with TAL effector nucleases.</a> Genetics. 186 (2), 757-761 (2010).</li><li>Jiang, W., Marraffini, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR-Cas:+New+Tools+for+Genetic+Manipulations+from+Bacterial+Immunity+Systems.">CRISPR-Cas: New Tools for Genetic Manipulations from Bacterial Immunity Systems.</a> Annu Rev Microbiol. 69, 209-228 (2015).</li><li>Barrangou, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+provides+acquired+resistance+against+viruses+in+prokaryotes.">CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes.</a> Science. 315 (5819), 1709-1712 (2007).</li><li>Karginov, F. V., Hannon, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRISPR+system:+small+RNA-guided+defense+in+bacteria+and+archaea.">The CRISPR system: small RNA-guided defense in bacteria and archaea.</a> Mol Cell. 37 (1), 7-19 (2010).</li><li>Wiedenheft, B., Sternberg, S. H., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-guided+genetic+silencing+systems+in+bacteria+and+archaea.">RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archaea.</a> Nature. 482 (7385), 331-338 (2012).</li><li>Mojica, F. J., Diez-Villasenor, C., Garcia-Martinez, J., Soria, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intervening+sequences+of+regularly+spaced+prokaryotic+repeats+derive+from+foreign+genetic+elements.">Intervening sequences of regularly spaced prokaryotic repeats derive from foreign genetic elements.</a> J Mol Evol. 60 (2), 174-182 (2005).</li><li>Pourcel, C., Salvignol, G., Vergnaud, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+elements+in+Yersinia+pestis+acquire+new+repeats+by+preferential+uptake+of+bacteriophage+DNA,+and+provide+additional+tools+for+evolutionary+studies.">CRISPR elements in Yersinia pestis acquire new repeats by preferential uptake of bacteriophage DNA, and provide additional tools for evolutionary studies.</a> Microbiology. 151 (Pt 3), 653-663 (2005).</li><li>Brouns, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+CRISPR+RNAs+guide+antiviral+defense+in+prokaryotes.">Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes.</a> Science. 321 (5891), 960-964 (2008).</li><li>Deltcheva, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+RNA+maturation+by+trans-encoded+small+RNA+and+host+factor+RNase+III.">CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III.</a> Nature. 471 (7340), 602-607 (2011).</li><li>Garneau, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+CRISPR/Cas+bacterial+immune+system+cleaves+bacteriophage+and+plasmid+DNA.">The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA.</a> Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).</li><li>Marraffini, L. A., Sontheimer, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CRISPR+interference+limits+horizontal+gene+transfer+in+staphylococci+by+targeting+DNA.">CRISPR interference limits horizontal gene transfer in staphylococci by targeting DNA.</a> Science. 322 (5909), 1843-1845 (2008).</li><li>Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P., Siksnys, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cas9-crRNA+ribonucleoprotein+complex+mediates+specific+DNA+cleavage+for+adaptive+immunity+in+bacteria.">Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (39), E2579-E2586 (2012).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>Davis, A. J., Chen, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+double+strand+break+repair+via+non-homologous+end-joining.">DNA double strand break repair via non-homologous end-joining.</a> Transl Cancer Res. 2 (3), 130-143 (2013).</li><li>Guirouilh-Barbat, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+the+KU80+pathway+on+NHEJ-induced+genome+rearrangements+in+mammalian+cells.">Impact of the KU80 pathway on NHEJ-induced genome rearrangements in mammalian cells.</a> Mol Cell. 14 (5), 611-623 (2004).</li><li>Moore, J. K., Haber, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+cycle+and+genetic+requirements+of+two+pathways+of+nonhomologous+end-joining+repair+of+double-strand+breaks+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Cell cycle and genetic requirements of two pathways of nonhomologous end-joining repair of double-strand breaks in Saccharomyces cerevisiae.</a> Mol Cell Biol. 16 (5), 2164-2173 (1996).</li><li>Liang, F., Han, M., Romanienko, P. J., Jasin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homology-directed+repair+is+a+major+double-strand+break+repair+pathway+in+mammalian+cells.">Homology-directed repair is a major double-strand break repair pathway in mammalian cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (9), 5172-5177 (1998).</li><li>Gratz, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+specific+and+efficient+CRISPR/Cas9-catalyzed+homology-directed+repair+in+Drosophila.">Highly specific and efficient CRISPR/Cas9-catalyzed homology-directed repair in Drosophila.</a> Genetics. 196 (4), 961-971 (2014).</li><li>Cong, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+genome+engineering+using+CRISPR/Cas+systems.">Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems.</a> Science. 339 (6121), 819-823 (2013).</li><li>Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+one+pot,+one+step,+precision+cloning+method+with+high+throughput+capability.">A one pot, one step, precision cloning method with high throughput capability.</a> PLoS One. 3 (11), e3647 (2008).</li><li>Ran, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+using+the+CRISPR-Cas9+system.">Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system.</a> Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).</li><li>Luo, Y., Lin, L., Bolund, L., Sorensen, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+construction+of+rAAV-based+gene+targeting+vectors+by+Golden+Gate+cloning.">Efficient construction of rAAV-based gene targeting vectors by Golden Gate cloning.</a> Biotechniques. 56 (5), 263-268 (2014).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning: a laboratory manual. , (2012).</li><li>Lin, S., Staahl, B. T., Alla, R. K., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+homology-directed+human+genome+engineering+by+controlled+timing+of+CRISPR/Cas9+delivery.">Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery.</a> Elife. 3, e04766 (2014).</li><li>Kim, S., Kim, D., Cho, S. W., Kim, J., Kim, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+RNA-guided+genome+editing+in+human+cells+via+delivery+of+purified+Cas9+ribonucleoproteins.">Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins.</a> Genome Res. 24 (6), 1012-1019 (2014).</li></ol>

Yazarlar, rekabet eden mali çıkarlarının olmadığını beyan ettiler.

CRISPR / Cas9 sistemi, diğer geçici manipülasyon yöntemlerine daha tutarlı bir alternatif sağlayan stabil genomik modifikasyonların verimli bir şekilde oluşturulmasına izin vermiştir. Burada, memeli hücre hatlarında CRISPR / Cas9 gen nakavtın hızlı tanımlanması için iki yöntem sunduk. Her iki yöntem de çok az hücresel malzeme gerektirir, bu nedenle test, klonal kültüre ait erken safhalarda yapılabilir, zamandan ve reaktiflerden tasarruf edilebilir. Her iki yöntemin verimliliğini artırmak için verimliliklerin sekansa ve genomik bölgeye bağlı olarak değiştiği için, birden fazla sgRNA test etmenizi öneririz. Buna ek olarak, çoklu sgRNA&#39;ları kullanmak, hedef dışı genlerin mutasyonları sonucunda belirgin olmayan fenotipleri tespit ederek hedef dışı etkileri belirlemede yararlıdır. Etkili transfeksiyon ve Cas9 bölünmesi nakavt üretme şansını büyük oranda artıracaktır. Alternatif olarak, hücrelerin doğrudan ticari kaynaklı sgRNA / Cas9 ribonükleoprotein kompleksleri 32 ,33 protokolü hızlandırabilir ve hedef dışı etkileri azaltabilir. Nokta lekeler, NHEJ&#39;ye bağlı küçük genomik değişikliklerin neden olduğu protein knockouts&#39;u değerlendirmek için uygundur. Yalnızca tek bir sgRNA / Cas9 yapısı gerekli olduğu için, bu yaklaşım boş satırların elde edilmesinde en hızlı olabilir ve blot prosedürü taramayı hızlandırarak ek aşamaları atlar. Normalleştirilmiş immünoblot protein sinyali, başarılı validasyonun güvenilir bir öngördürücüsüdür ( Şekil 2B ). Bu protokol, minimal genomik perturbasyonu olan nakavtların üretimi için idealdir. Alternatif olarak, bu tarama yöntemi, transgenik proteinler veya protein etiketleri gibi protein ekleme veya modifikasyon için problama için uyarlanabilir. Bununla birlikte, bu tarama yöntemi, çapraz reaktivite, nokta lekelerinde yüksek arka plana yol açtığından, ilgi proteinine karşı yüksek özgüllüğe sahip bir antikor gerektirir. Bu yöntem doğal olarak mutasyonlar hedefleme ile sınırlıdırProtein kodlama bölgeleri, nihai çıktı bir protein ürününün varlığına / yokluğuna bağlıdır. NHEJ&#39;in neden olduğu mutasyonların, yapısal olarak aktif, kısmi veya dominant negatif fonksiyona sahip bir protein veya tespit antikor epitopundan yoksun fonksiyonel bir protein de dahil olmak üzere çeşitli protein sonuçlarına yol açabileceğini de not etmek önemlidir. Bu sorunları en aza indirgemek için, tamamen fonksiyonel olmayan bir protein üretme şansını artırmak için mümkün olduğunca erken kodlama bölgesine Cas9 kesilmesini hedeflemek faydalıdır. Buna ek olarak, Cas9 makineleri için daha az erişilebilir olan genomik bölgelerin hedeflenmesi seçimin yokluğunda düşük silinme verimi üretebilir. Son olarak, seçici bir dezavantaj veren nakavtlar, benzer nedenlerle bu yöntemle elde edilmesi güç olabilir. Homologya yönelik tamir mekanizmalarını CRISPR / Cas9 bölünmesi ile birlikte kullanmak, her iki la da içerebilen çok daha büyük ve daha spesifik genomik manipülasyonlar sağlarRge ölçeğinde delesyonlar (iki sgRNA bölünmesiyle tanımlanır) ve eklemeler. İki bölünme olayı ve kesin onarım işlemi yapılması gerektiğinden, bir ilaç direnci işaretleyicisinin entegrasyonu, bu yöntemi kullanarak önemli ölçüde nakavt verilerini artırır. Nokta leke tespiti de kullanılabilirken, koloni PCR ile tarama, bu kadar büyük genomik dalgalanmalarla doğru entegrasyon / nakavt adalarını doğru bir şekilde tespit etmek için daha genel olarak uygulanabilir. Dahası, PCR ile test, kusurlu ve eksik tamamlayıcılara sahip klonların tanımlanmasına olanak tanır ve HDR sürecinin kendisinin kapsamı ve doğası hakkında fikir verebilir. Buna ek olarak, tanıtılan markör, en az 34 bp&#39;lik bir silme izi (loxP bölgesi) bırakarak ve seçim işaretleyicisinin gelecekte tekrar kullanılmasına izin verilerek, daha sonra çıkarılabilir (geçici Cre ifadesi veya zar geçirgen formdaki ilâveten) kaldırılabilir. Bu yaklaşımın esnekliği birden çok direnç belirteçinin kullanılması ile artmakta ve birden fazla cumu üretmek mümkün olmaktadırLatif protein nakavtları. Bu yöntemi uygularken, ürünün yokluğunun, örneğin beklenen transkriptin RT-qPCR&#39;si ile daha da doğrulanması önemlidir. Bu ekran antikordan bağımsız olabileceğinden, bu yöntem güçlü bir antikor olmaksızın protein knockout&#39;larına kolayca uygulanabilir ve protein kodlayıcı genlere düşmeyen değişiklikleri tespit edebilir.

<html> Kararlı genetik değişiklikler, verimlilik ve süre bakımından değişken olabilen geçici hücresel pertürbasyon yöntemlerine göre bir avantaj sağlar. Genomik düzenleme, çinko parmak nükleazları 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , transkripsiyon aktivatörü benzeri efektör nükleazları (TALEN&#39;ler) 6 , 7 , 8 , 9 gibi hedefe spesifik nükleazların gelişimi nedeniyle son yıllarda giderek yaygınlaşmaktadır. Ve kümelenmiş, düzenli olarak aralıklı kısa palindromik tekrarlardan (CRISPR) türemiş RNA yönlendirmeli nükleazlar 10 . CRISPR / Cas9 düzenleme makineleri bakterilerin ve arkeaların viral enfeksiyonlara karşı savunmak için kullandıkları bağışıklık sisteminden adapte edilmiştirAss = &quot;xref&quot;&gt; 11 , 12 , 13 . Bu süreçte, işgalci viral dizinin kısa, 20-30 nt fragmanları, tekrar eden birimler 14 , 15 tarafından çevrelenen &quot;aralayıcılar&quot; olarak genomik bir lokasyona dahil edilir. Ardından transkripsiyon ve RNA işleme, bir aktive edici crRNA 17 (tracrRNA) ile efektör Cas9 endonükleazı birleştiren küçük CRISPR ilişkili RNA&#39;lar16 (crRNA&#39;lar) üretir. Dolayısıyla, crRNA&#39;lar Cas9 hedeflemesine özgüllük sağlar, kompleksi tamamlayıcı viral DNA dizilerini bölmeye yönlendirir ve diğer enfeksiyonları önler 18,19. Hedeflenen DNA&#39;daki herhangi bir &quot;protospacer&quot; sekans, kısa bir protospazere komşu motife (PAM) doğrudan 5 &#39;, S. pyogenes Cas9 durumunda ise NGG olduğu sürece, crRNA&#39;nın kaynağı olarak görev yapabilir <sUp class = &quot;xref&quot;&gt; 20. Ev sahibinin CRISPR lokusu içindeki boşluk yakınında PAM sekansının olmaması, benliğin kendisi ile ben olmayan arasındaki ayrımı yaparak, ev sahibinin hedeflenmesini engeller. Evrenselliği ve esnekliği nedeniyle, bu biyolojik sistem genomik düzenleme için güçlü bir şekilde adapte edilmiştir, böylelikle hemen hemen her PAM bitişik DNA sitesi hedeflenebilir. Bu sürümde, başka bir değişiklik, crRNA ve tracRNA&#39;yı Cas9 protein 21&#39;e yüklenen tek bir rehber RNA (sgRNA) bileşenine kaynaştırdı. Ökaryotik hücrelerde Cas9 ve bir sgRNA ekspresyonu üzerine Cas9 proteini, her iki DNA kolunu hedeflenen lokusta parçalamaktadır. Uygun homolog bir dizinin yokluğunda hücre bu kopuşu tipik olarak küçük delesyonlar veya nadiren eklemeler başlatan homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ) 22 , 23 , 24 aracılığıyla tespit eder. Bir açık hedefleme yaparkenOkuma çerçevesi, onarım muhtemelen işlevsel olmayan bir protein ürünü üreten bir translasyonel çerçeve kaymasına yol açar. Aksine, geniş homoloji bölgelerine sahip bir dışsal şablon ile sağlandığında, hücre homolog yöneltilmiş onarım 25 , 26 ile çift iplikçik kırılmasını sabitleyebilir. Bu yol, genomda daha büyük hassas silme, değiştirme veya eklemeye izin verir ve ölebilir seçim işaretleri 27&#39;nin eklenmesi ile birlikte. Burada, bu iki CRISPR / Cas9 yöntemlerinden biri ile nakavt hücre hatları üretmek için protokoller sunuyoruz ( Şekil 1A ). NHEJ yaklaşımı, tek bir sgRNA kesim bölgesini ve seçiciden bağımsız taramayı kullanır ve bu nedenle çok fazla ön hazırlık gerektirir. Bu yöntemi kullanırken, transkriptin 5 &#39;ucundaki eksonları tamamlayan ve en iyi nakavt üreten kılavuz RNA&#39;lar tasarlanmalıdır. Modifikattan beriBu durumda iyonların genoma küçük olması, nakavt klonlarının taranması, protein ürününün yüksek verimli bir şekilde değerlendirildiği nokta lekelerine dayanıyor. Bir örnek olarak ELAV benzeri 1 protein (ELAVL1) nakavt hatları neslini kullanırız. İkinci yaklaşım, homoloji yönelimli onarım (HDR) üzerine kuruludur ve onlarca kb silinmesine izin vererek ilgi geni veya bölgeyi kapsayan iki sgRNA kesim bölgesini kullanır. Yarılma bölgelerinin yanındaki iki homoloji bölgesine sahip bir plazmid, nakavt üretiminin verimliliğini arttıran seçilebilir bir direnç markeri tanıtan bir değiştirme şablonu ( Şekil 1B ) sağlar. Bu yöntem, uygun şekilde tasarlanmış homoloji kollarıyla gen modifikasyonlarını başlatmak için uyarlanabilir. Bu durumda, yeni bir DNA parçasının entegrasyonu PCR&#39;ye dayalı taramaya izin verir ( Şekil 1C ). Burada, örnek olarak Pumilio RNA bağlayıcı aile üyesi 2 (PUM2) nakavt hatları neslini kullanıyoruz.

<table><tbody><tr><td>Competent &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; cells</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>plasmid prep kit</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pSpCas9(BB) plasmid</td><td>Addgene</td><td>42230</td><td>Ran &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; 2013, cloning sgRNAs</td></tr><tr><td>BbsI enzyme</td><td>ThermoFisher</td><td>FD1014</td><td>Ran &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; 2013, cloning sgRNAs</td></tr><tr><td>T7 DNA ligase</td><td>NEB</td><td>M0318L</td><td>Ran &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; 2013, cloning sgRNAs</td></tr><tr><td>Tango Buffer</td><td>ThermoFisher</td><td>BY5</td><td>Ran &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; 2013, cloning sgRNAs</td></tr><tr><td>PlasmidSafe exonuclease</td><td>Epicentre</td><td>E3105K</td><td>Ran &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt; 2013, cloning sgRNAs</td></tr><tr><td>Q5 hot start high fidelity polymerase</td><td>NEB</td><td>M0494A</td><td>HA amplification</td></tr><tr><td>pUC19-BsaI</td><td></td><td></td><td>Modified pUC19 plasmid, mutated existing BsaI site and inserted two outward facing BsaI sites after BamHI/EcoRI digestion</td></tr><tr><td>pGolden-Neo</td><td>Addgene</td><td>51422</td><td>Resistance cassette</td></tr><tr><td>pGolden-Hygro</td><td>Addgene</td><td>51423</td><td>Resistance cassette</td></tr><tr><td>BsaI enzyme</td><td>NEB</td><td>R3535S</td><td>Homology arm contruction</td></tr><tr><td>T7 DNA ligase</td><td>NEB</td><td>M0318L</td><td></td></tr><tr><td>PlasmidSafe exonuclease</td><td>Epicentre</td><td>E3105K</td><td></td></tr><tr><td>Toothpicks</td><td></td><td></td><td>bacterial PCR</td></tr><tr><td>Taq polymerase</td><td></td><td></td><td>bacterial colony PCR</td></tr><tr><td>HEK293 human cells</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Corning</td><td>MT35010CV</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Strep (opt.)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>6 well plates</td><td>BioLite</td><td>12556004</td><td></td></tr><tr><td>TransIT-LTI Transfection Reagent</td><td>Mirus</td><td>MIR2300</td><td>for lipofection only</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>ThermoFisher</td><td>31985062</td><td>for lipofection only</td></tr><tr><td>G418 (Neomycin)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A1720-5G</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3274-250MG</td><td></td></tr><tr><td>96 well plates</td><td>ThermoFisher</td><td>12556008</td><td></td></tr><tr><td>Passive Lysis Buffer, 5x</td><td>Promega</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x SDS loading buffer</td><td></td><td></td><td>recipe decribed in protocol</td></tr><tr><td>Nitrocellulose Membrane</td><td>Bio-Rad</td><td>162-0115</td><td></td></tr><tr><td>TBST</td><td></td><td></td><td>recipe decribed in protocol</td></tr><tr><td>Dehydrated milk</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate</td><td>ThermoFisher</td><td>34075</td><td>for HRP-conjugated secondary antibodies</td></tr><tr><td>Extracta DNA prep for PCR</td><td>Quantabio</td><td>95091-025</td><td></td></tr><tr><td>KOD polymerase</td><td>Novagen</td><td>71316</td><td></td></tr></tbody></table>

selection-dependent and independent generation of crispr/cas9-mediated gene knockouts in mammalian cells

CRISPR / Cas9 genom mühendisliği sistemi, az çaba sarf ederek hassas genom düzenlemesine izin vererek biyolojiye devrim yarattı. Spesifikliği kazandıran tek bir rehber RNA (sgRNA) yardımıyla Cas9 proteini, her iki DNA zincirini hedeflenen lokusta parçalamaktadır. DNA kopması homolog olmayan bitiş katılma (NHEJ) veya homoloji yönelimli onarım (HDR) tetikleyebilir. HDR, daha büyük ve daha hassas pertürbasyonlara izin verirken, NHEJ, çerçeve kayması mutasyonlarına yol açan küçük delesyonlar veya eklemeler başlatabilir. Burada, çökertilmiş hücre hatlarının üretilmesi için protokolleri, kurulu CRISPR / Cas9 yöntemlerini downstream seçim / tarama için iki seçenek ile birleştirerek sunuyoruz. NHEJ yaklaşımı, tek bir sgRNA kesim bölgesini ve seleksiyondan bağımsız taramayı kullanır; burada, protein üretiminin nokta imünoblotuyla yüksek verimli bir şekilde değerlendirildiği yerdir. HDR yaklaşımı ilgi geni boyunca uzanan iki sgRNA kesim bölgesini kullanır. Sağlanan HDR şablonuyla birlikte bu yöntem silme gerçekleştirebilirEklenebilen seçilebilir direnç işaretleyicisinin yardımıyla, onlarca kb arasında değişir. Her bir yöntemin uygun uygulamaları ve avantajları tartışılmıştır.

ELAVL1 nakavt hatlarının üretilmesi için sağlam bir antikor mevcuttu, bu nedenle tek sgRNA&#39;lar ( Şekil 1A , solda) kullanılarak düzenleme, ardından nokta immünoblot uygulandı. Elde edilen klonlarda verimlilikleri karşılaştırmak ve hedef etkileri dışarıda bırakmak için bağımsız olarak üç sgRNA transfekte edildi. Hücre lizatlarını, iki nitroselüloz zar üzerine klonal popülasyondan toplayıp blotladıktan sonra lekeler hem ELAVL1 hem de PUM2 için (normalizasyon kontrolü olarak) araştırıldı ( Şekil 2A ). ELAVL1&#39;in PUM2 sinyaline nicelik oranı, izole edilmiş çizgiler arasında çok geniş,&gt; 10-4 kat bir aralık göstermiştir ( Şekil 2B ). Bu oranın bir seçim kriteri olarak kullanılmasıyla, ELAVL1 batı lekelerini kullanarak birkaç satır doğrulandı ( Şekil 3A ). Çoğu vakada, en düşük göreli ELAVL1 sinyali olan klonal popülasyonlar,(Bu miktarın tahmini gücünü teyit eden, nakavt olarak doğru olarak tanımlanmıştır (kontrol sinyalinde büyük farklılıklar olmasına rağmen, muhtemelen farklı sayıda toplanan hücre ortaya çıkmıştır). Tersine, ara orantılara sahip klonların çoğunun doğrulama üzerine ELAVL1 sinyali sergilendi, bu da potansiyel olarak monoelaleik silme olaylarını temsil etti. Bununla birlikte, oranların WT, monoalelik ve tam (bialelik) mutant havuzlarına genel katman vermesi gözlenmemiştir ve hatta ELAVL1 pozitif klonlar bile, muhtemelen klonal olarak ekspresyon değişkenliği nedeniyle geniş ve sürekli seviyeler arzetmiştir. Bu yöntemi kullanarak ELAVL1 nakavt üretiminin genel etkinliği, sgRNA&#39;lar arasında% 6 ila 36 arasında değişiyordu. Diğer gen hedefleri (PUM2 gibi) için, mevcut antikorların kalitesi, çapraz reaksiyondan yüksek zemin nedeniyle nokta leke ile aday klonların doğru taranmasını engellervity. Buna ek olarak, bazı genomik lokusları hedefleme verimliliği, kromatin erişilebilirliği nedeniyle önemli ölçüde düşük olabilir. Bu gibi durumlarda, verimliliği artırmak için seçime bağlı bir yöntem uygundur. PUM2&#39;nin erken ve geç kodlama bölgelerini hedefleyen iki sgRNA, 45 kb genomik DNA&#39;nın tükenmesi ve bir neomisin direnç kaseti ile yer değiştirilmesi için homolojiye yönelik tamir şablonu ile birlikte transfekte edildi ( Şekil 1A , sağ). Homoloji şablonunun montajı Şekil 1B&#39;de gösterilmiştir. PCR primerleri, direnç kasetinin başarılı veya başarısız entegrasyonuna ( Şekil 2C ) göre homoloji kollarının etrafındaki bölgelerin çoğaltılması için tasarlandı ve transfekte edilmemiş ve toplu seçilmiş hücreler üzerinde (sol panel) test edildi. Transformasyona uğramamış hücrelerde, beklendiği gibi, sadece seçilen hücreler hem amplikonları gösterdikleri halde, endojen duruma (üstteki) tekabül eden bir amplikon gözlenmiştirVahşi tip ve mutant alleller. Oluşan klonal adalardan hücre lizatları toplandı ve hem endojen dizi hem de direnç kaseti varlığı açısından tarandı. Aday nakavtlar, direnç kaseti amplikonunun varlığı ile tespit edildi ve bialelik silinmesi / entegrasyonu gösterildi ( Şekil 2D , yıldızlar). Monoallel eklemeli klonlar da gözlemlendi ve oldukça yaygıntı, çünkü bu popülasyonlar seçme sürecinde de ayakta kalabiliyorlardı. Bu klonlar hem endojen sekansın hem de direnç kasetinin varlığı ile endikedir. Birkaç örnekte, test edilen lokusdaki klonal vahşi tiplikler de gözlemlendi, homolojiye yönelik tamir şablonunun rastgele, sgRNA destekli genomik entegrasyonunun düşük bir frekansta gerçekleştiğini düşündürüyordu. Bielealik mutant hatlar batı lekesi ile daha da doğrulanmıştır ( Şekil 3B ). HDR prosedürünü kullanarak nakavt üretiminin toplam etkinliği 3% 3. <img alt="Şekil 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55903/55903fig1.jpg" /> Şekil 1: Memeli hücre çizgilerinde CRISPR aracılı knockouts üretmek için bir iş akışı. ( A ) CRISPR / Cas9 bölünmesi ve NHEJ (sol) veya HDR (sağ) tarafından üretilen genom düzenleme etkinlikleri. Cas9 bölünme yeri beyaz dikey çizgi ile gösterilir. ( B ) HDR şablon plazmidinin bileşenleri ve montajı. Golden Gate klonlamasında kullanılan BsaI gibi tip IIs kısıtlama enzimleri, asimetrik DNA dizisini tanır ve tanımlama sırasının dışında kademeli bir kesim bırakarak montaj için keyfi örtüşen bölümlerin tasarımını sağlar (resimde bulunur). Oklar, doğru plasmid montajını kontrol etmek için primer konumlarını belirtir. ( C ) İş Akışı: Transfeksiyondan sonra (ve uygulanabilirse ilaç seçimi), hücreler sınırlayıcı seyreltmelerde 96 oyuklu plakalara konur. Klon popülasyonlarıNokta immünoblot (seçilimden bağımsız, NHEJ) veya koloni PCR (seçime bağlı, HDR) ile taranır. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55903/55903fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55903/55903fig2.jpg" /> Şekil 2: Nokta lekeleri veya koloni PCR ile aday nakavt hatlarını tarama. ( A ) ELAVL1 antikoru (solda) ile izole edilmiş ELAVL1 hedef klonları ve ayrıca bir kontrol proteini Pum2 için bir antikor (sağda) ile nokta immünoblotu. Kontrol sinyali göstermeyen klonlar, muhtemelen düşük girdi protein miktarlarına bağlı olarak X ile işaretlenmiştir ve daha ileri analizlerden hariç tutulmuştur. Düşük ELAVL1 sinyali (çevreler) olan klonlar, adayları doğrulayan (yeşil) veya geçersizleştirilen (gri) batı lekeleri ile daha da test edildi. ( B ) KO c&#39;nin nicelendirilmesiNokta lekesinden yanılmalar. A&#39;da gösterilen nokta lekesinde protein sinyalini kontrol etmek için ELAVL1 oranları artan sırada. ( C ) Koloni PCR ile nakavt / sokma testi için primer tasarımı. Homoloji kolu bölgesinin (kırmızı) dışındaki genomik lokusu tamamlayan bir primer, endojen sekansı (mavi) tamamlayan bir primerle veya direnç kasetine (yeşil) eşleştirilir, düzenlenmemiş halin araştırılması veya silinme / yerleştirme olayı , sırasıyla. Ayrı primer çiftleri, entegrasyonun her iki tarafını test etmek için tasarlanmıştır. ( D ) Koloni PCR örnek agaroz jel endojen iç primerler (üst) ve primerler içinde nakavt (alt) kullanarak upstream entegrasyon kavşak uzanan primerler kullanılarak sonuçlanır. Primerler ilk önce hem ebeveyn T-REx293 hücrelerinde hem de seçilen toplu hücrelerde (soldaki) validasyona tabi tutulur. Bireysel aday klonları (ortada) ve WT, KO ve monoaleli silme (WT / KO) klonları için beklenen bant modelleri (sağda). Bielealik nakavt klonları gösterilirD bir yıldızla. Doğru amplifikasyon ürünleri siyah oklarla gösterilir. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55903/55903fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55903/55903fig3.jpg" /> Şekil 3: Knockout adaylarının Western blot ile validasyonu. ( A ) Nokta lekesi ile tanımlanan klonların bir alt kümesinin ELAVL1 (üstü) için Western leke. PUM2, aynı zar üzerinde bir yükleme kontrolü (alt) olarak bloke edildi. ( B ) koloni PCR ile tanımlanan klonların bir alt kümesinin PUM2 (üstü) için Western leke. GAPDH, bir yükleme kontrolü (alt) ile aynı zar üzerinde lekelenmiştir. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55903/55903fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells at JoVE.com

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

Somatik hücre dizilerini genetik olarak manipüle etme becerisindeki son gelişmeler, temel ve uygulamalı araştırmalar için büyük potansiyele sahiptir. Burada, CRISPR / Cas9&#39;un ürettiği nakavt üretimi ve seçilebilir işaretlerin kullanılıp kullanılmadığı memeli hücre hatlarında tarama için iki yaklaşım sunuyoruz.

Memeli Hücrelerinde CRISPR / Cas9 aracılı Gen Knockout&#39;larının Seçime Bağlı ve Bağımsız Üretimi

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

selection-dependent-independent-generation-crisprcas9-mediated-gene

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

12.4K Görüntüleme.  University of California, Riverside.  Somatik hücre dizilerini genetik olarak manipüle etme becerisindeki son gelişmeler, temel ve uygulamalı araştırmalar için büyük potansiyele sahiptir. Burada, CRISPR / Cas9'un ürettiği nakavt üretimi ve seçilebilir işaretlerin kullanılıp kullanılmadığı memeli hücre hatlarında tarama için iki yaklaşım sunuyoruz. 

Video: Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play in the functioning of cells and whole organisms. This cause has been tremendously aided by the recent introduction of the CRISPR/Cas9 system-a versatile tool that allows researchers to manipulate the genome and transcriptome in order to, among other things, knock out, knock down, or knock in genes in a targeted manner. For the purpose of knocking out a gene, CRISPR/Cas9-mediated double-strand breaks recruit the non-homologous end-joining DNA repair pathway to introduce the frameshift-causing insertion or deletion of nucleotides at the break site. However, an individual guide RNA may cause undesirable off-target effects, and to rule these out, the use of multiple guide RNAs is necessary. This multiplicity of targets also means that a high-volume screening of clones is required, which in turn begs the use of an efficient high-throughput technique to genotype the knockout clones. Current genotyping techniques either suffer from inherent limitations or incur high cost, hence rendering them unsuitable for high-throughput purposes. Here, we detail the protocol for using fluorescent PCR, which uses genomic DNA from crude cell lysate as a template, and then resolving the PCR fragments via capillary gel electrophoresis. This technique is accurate enough to differentiate one base-pair difference between fragments and hence is adequate in indicating the presence or absence of a frameshift in the coding sequence of the targeted gene. This precise knowledge effectively precludes the need for a confirmatory sequencing step and allows users to save time and cost in the process. Moreover, this technique has proven to be versatile in genotyping various mammalian cells of various tissue origins targeted by guide RNAs against numerous genes, as shown here and elsewhere.

The genotyping technique described here, which couples fluorescent polymerase chain reaction (PCR) to capillary gel electrophoresis, allows for high-throughput genotyping of nuclease-mediated knockout clones. It circumvents limitations faced by other genotyping techniques and is more cost effective than sequencing methods.

CRISPR genotipine bir Floresan PCR kılcal jel elektroforezi Tekniği / yüksek verimli bir Format Nakavt Mutants Cas9 aracılı

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

Genetik

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development of a customizable platform to rapidly generate gene modifications in a wide variety of organisms, including zebrafish. CRISPR-based genome editing uses a single guide RNA (sgRNA) to target a CRISPR-associated (Cas) endonuclease to a genomic DNA (gDNA) target of interest, where the Cas endonuclease generates a double-strand break (DSB). Repair of DSBs by error-prone mechanisms lead to insertions and/or deletions (indels). This can cause frameshift mutations that often introduce a premature stop codon within the coding sequence, thus creating a protein-null allele. CRISPR-based genome engineering requires only a few molecular components and is easily introduced into zebrafish embryos by microinjection. This protocol describes the methods used to generate CRISPR reagents for zebrafish microinjection and to identify fish exhibiting germline transmission of CRISPR-modified genes. These methods include in vitro transcription of sgRNAs, microinjection of CRISPR reagents, identification of indels induced at the target site using a PCR-based method called a heteroduplex mobility assay (HMA), and characterization of the indels using both a low throughput and a powerful next-generation sequencing (NGS)-based approach that can analyze multiple PCR products collected from heterozygous fish. This protocol is streamlined to minimize both the number of fish required and the types of equipment needed to perform the analyses. Furthermore, this protocol is designed to be amenable for use by laboratory personal of all levels of experience including undergraduates, enabling this powerful tool to be economically employed by any research group interested in performing CRISPR-based genomic modification in zebrafish.

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Targeted genome editing in the model system Danio rerio (zebrafish) has been greatly facilitated by the emergence of CRISPR-based approaches. Herein, we describe a streamlined, robust protocol for generation and identification of CRISPR-derived nonsense alleles that incorporates the heteroduplex mobility assay and identification of mutations using next-generation sequencing.

Verimli üretim ve Model sistem Danio rerio kimlik CRISPR/Cas9 tarafından oluşturulan Gene altını gizleme

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. Complete gene ablation in HSCs required the generation of knockout mice from which HSCs could be isolated, and gene ablation in primary human HSCs was not possible. Viral transduction could be used for knock-down approaches, but these suffered from variable efficacy. In general, genetic manipulation of human and mouse hematopoietic cells was hampered by low efficiencies and extensive time and cost commitments. Recently, CRISPR/Cas9 has dramatically expanded the ability to engineer the DNA of mammalian cells. However, the application of CRISPR/Cas9 to hematopoietic cells has been challenging, mainly due to their low transfection efficiencies, the toxicity of plasmid-based approaches and the slow turnaround time of virus-based protocols.
A rapid method to perform CRISPR/Cas9-mediated gene editing in murine and human hematopoietic stem and progenitor cells with knockout efficiencies of up to 90% is provided in this article. This approach utilizes a ribonucleoprotein (RNP) delivery strategy with a streamlined three-day workflow. The use of Cas9-sgRNA RNP allows for a hit-and-run approach, introducing no exogenous DNA sequences in the genome of edited cells and reducing off-target effects. The RNP-based method is fast and straightforward: it does not require cloning of sgRNAs, virus preparation or specific sgRNA chemical modification. With this protocol, scientists should be able to successfully generate knockouts of a gene of interest in primary hematopoietic cells within a week, including downtimes for oligonucleotide synthesis. This approach will allow a much broader group of users to adapt this protocol for their needs.

A protocol for fast CRISPR/Cas9-mediated gene disruption in mouse and human primary hematopoietic cells is described in this article. Cas9-sgRNA ribonucleoproteins are introduced via electroporation with sgRNAs generated through in vitro transcription and commercial Cas9. High editing efficiencies are achieved with limited time and financial cost.

Fare ve insan hematopoetik progenitör hücre tarafından CRISPR/Cas9 yüksek verimli Gene bozulma

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Genome Editing in Mammalian Cell Lines using CRISPR-Cas

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been successfully repurposed for genome engineering in many different living organisms. Most commonly, the wildtype CRISPR associated 9 (Cas9) or Cas12a endonuclease is used to cleave specific sites in the genome, after which the DNA double-stranded break is repaired via the non-homologous end joining (NHEJ) pathway or the homology-directed repair (HDR) pathway depending on whether a donor template is absent or present respectively. To date, CRISPR systems from different bacterial species have been shown to be capable of performing genome editing in mammalian cells. However, despite the apparent simplicity of the technology, multiple design parameters need to be considered, which often leave users perplexed about how best to carry out their genome editing experiments. Here, we describe a complete workflow from experimental design to identification of cell clones that carry desired DNA modifications, with the goal of facilitating successful execution of genome editing experiments in mammalian cell lines. We highlight key considerations for users to take note of, including the choice of CRISPR system, the spacer length, and the design of a single-stranded oligodeoxynucleotide (ssODN) donor template. We envision that this workflow will be useful for gene knockout studies, disease modeling efforts, or the generation of reporter cell lines.

CRISPR-Cas is a powerful technology to engineer the complex genomes of plants and animals. Here, we detail a protocol to efficiently edit the human genome using different Cas endonucleases. We highlight important considerations and design parameters to optimize editing efficiency.

Memeli hücre CRISPR-Cas kullanarak satırları genom düzenleme

The clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) system functions naturally in bacterial adaptive immunity, but has been ...

Pooled CRISPR-Based Genetic Screens in Mammalian Cells

Genome editing using the CRISPR-Cas system has vastly advanced the ability to precisely edit the genomes of various organisms. In the context of mammalian cells, this technology represents a novel means to perform genome-wide genetic screens for functional genomics studies. Libraries of guide RNAs (sgRNA) targeting all open reading frames permit the facile generation of thousands of genetic perturbations in a single pool of cells that can be screened for specific phenotypes to implicate gene function and cellular processes in an unbiased and systematic way. CRISPR-Cas screens provide researchers with a simple, efficient, and inexpensive method to uncover the genetic blueprints for cellular phenotypes. Furthermore, differential analysis of screens performed in various cell lines and from different cancer types can identify genes that are contextually essential in tumor cells, revealing potential targets for specific anticancer therapies. Performing genome-wide screens in human cells can be daunting, as this involves the handling of tens of millions of cells and requires analysis of large sets of data. The details of these screens, such as cell line characterization, CRISPR library considerations, and understanding the limitations and capabilities of CRISPR technology during analysis, are often overlooked. Provided here is a detailed protocol for the successful performance of pooled genome-wide CRISPR-Cas9 based screens.

CRISPR-Cas9 technology provides an efficient method to precisely edit the mammalian genome in any cell type and represents a novel means to perform genome-wide genetic screens. A detailed protocol discussing the steps required for the successful performance of pooled genome-wide CRISPR-Cas9 screens is provided here.

Memeli Hücrelerinde Havuzlu CRISPR Tabanlı Genetik Ekranlar

Genome editing using the CRISPR-Cas system has vastly advanced the ability to precisely edit the genomes of various organisms. In the context of mammalian ...

A Protocol for Multiple Gene Knockout in Mouse Small Intestinal Organoids Using a CRISPR-concatemer

CRISPR/Cas9 technology has greatly improved the feasibility and speed of loss-of-function studies that are essential in understanding gene function. In higher eukaryotes, paralogous genes can mask a potential phenotype by compensating the loss of a gene, thus limiting the information that can be obtained from genetic studies relying on single gene knockouts. We have developed a novel, rapid cloning method for guide RNA (gRNA) concatemers in order to create multi-gene knockouts following a single round of transfection in mouse small intestinal organoids. Our strategy allows for the concatemerization of up to four individual gRNAs into a single vector by performing a single Golden Gate shuffling reaction with annealed gRNA oligos and a pre-designed retroviral vector. This allows either the simultaneous knockout of up to four different genes, or increased knockout efficiency following the targeting of one gene by multiple gRNAs. In this protocol, we show in detail how to efficiently clone multiple gRNAs into the retroviral CRISPR-concatemer vector and how to achieve highly efficient electroporation in intestinal organoids. As an example, we show that simultaneous knockout of two pairs of genes encoding negative regulators of the Wnt signaling pathway (Axin1/2 and Rnf43/Znrf3) renders intestinal organoids resistant to the withdrawal of key growth factors.

This protocol describes the steps for cloning multiple single guide RNAs into one guide RNA concatemer vector, which is of particular use in creating multi-gene knockouts using CRISPR/Cas9 technology. The generation of double knockouts in intestinal organoids is shown as a possible application of this method.

Bir CRISPR-konkantör kullanarak Fare Küçük Bağırsak Organoidleri Üzerinde Birden Fazla Gen Kıyamet Protokolü

CRISPR/Cas9 technology has greatly improved the feasibility and speed of loss-of-function studies that are essential in understanding gene function. In ...

Biyomühendislik

Construction of CRISPR Plasmids and Detection of Knockout Efficiency in Mammalian Cells through a Dual Luciferase Reporter System

Although highly efficient, modification of a genomic site by the CRISPR enzyme requires the generation of a sgRNA unique to the target site(s) beforehand. This work describes the key steps leading to the construction of efficient sgRNA vectors using a strategy that allows the efficient detection of the positive colonies by PCR prior to DNA sequencing. Since efficient genome editing using the CRISPR system requires a highly efficient sgRNA, a preselection of candidate sgRNA targets is necessary to save time and effort. A dual luciferase reporter system has been developed to evaluate knockout efficiency by examining double-strand break repair via single strand annealing. Here, we use this reporter system to pick up the preferred xCas9/sgRNA target from candidate sgRNA vectors for specific gene editing. The protocol outlined will provide a preferred sgRNA/CRISPR enzyme vector in 10 days (starting with appropriately designed oligonucleotides).

Here, we present a protocol describing a streamlined method for the efficient generation of plasmids expressing both the CRISPR enzyme and associated single guide RNA (sgRNAs). Co-transfection of mammalian cells with this sgRNA/CRISPR vector and a dual luciferase reporter vector that examines double-strand break repair allows evaluation of knockout efficiency.

CRISPR Plazmidlerinin Yapımı ve Çift Luciferase Muhabir Sistemi Ile Memeli Hücrelerinde Nakavt Etkinliğinin Saptanması

Although highly efficient, modification of a genomic site by the CRISPR enzyme requires the generation of a sgRNA unique to the target site(s) beforehand. ...

Generation of Genomic Deletions in Mammalian Cell Lines via CRISPR/Cas9

The prokaryotic clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system may be re-purposed for site-specific eukaryotic genome engineering. CRISPR/Cas9 is an inexpensive, facile, and efficient genome editing tool that allows genetic perturbation of genes and genetic elements. Here we present a simple methodology for CRISPR design, cloning, and delivery for the production of genomic deletions. In addition, we describe techniques for deletion, identification, and characterization. This strategy relies on cellular delivery of a pair of chimeric single guide RNAs (sgRNAs) to create two double strand breaks (DSBs) at a locus in order to delete the intervening DNA segment by non-homologous end joining (NHEJ) repair. Deletions have potential advantages as compared to single-site small indels given the efficiency of biallelic modification, ease of rapid identification by PCR, predictability of loss-of-function, and utility for the study of non-coding elements. This approach can be used for efficient loss-of-function studies of genes and genetic elements in mammalian cell lines.

CRISPR/Cas9 is a robust system to produce disruption of genes and genetic elements. Here we describe a protocol for the efficient creation of genomic deletions in mammalian cell lines using CRISPR/Cas9.

CRISPR / Cas9 üzerinden Memeli Hücre Hatlarında Genomik Delesyonlar Üretimi

The prokaryotic clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) 9 system may be re-purposed for site-specific ...

Biyoloji

Electroporation-Based CRISPR-Cas9-Mediated Gene Knockout in THP-1 Cells and Single-Cell Clone Isolation

The human acute monocytic leukemia (AML) THP-1 cell line is widely used as a model to study the functions of human monocyte-derived macrophages, including their interplay with significant human pathogens such as the human immunodeficiency virus (HIV). Compared to other immortalized cell lines of myeloid origin, THP-1 cells retain many intact inflammatory signaling pathways and display phenotypic characteristics that more closely resemble those of primary monocytes, including the ability to differentiate into macrophages when treated with phorbol-12-myristate 13-acetate (PMA). The use of CRISPR-Cas9 technology to engineer THP-1 cells through targeted gene knockout (KO) provides a powerful approach to better characterize immune-related mechanisms, including virus-host interactions. This article describes a protocol for efficient CRISPR-Cas9-based engineering using electroporation to deliver pre-assembled Cas9:sgRNA ribonucleoproteins into the cell nucleus. Using multiple sgRNAs targeting the same locus at slightly different positions results in the deletion of large DNA fragments, thereby increasing editing efficiency, as assessed by the T7 endonuclease I assay. CRISPR-Cas9-mediated editing at the genetic level was validated by Sanger sequencing followed by Inference of CRISPR Edits (ICE) analysis. Protein depletion was confirmed by immunoblotting coupled with a functional assay. Using this protocol, up to 100% indels in the targeted locus and a decrease of over 95% in protein expression were achieved. The high editing efficiency makes it convenient to isolate single-cell clones by limiting dilution.

The THP-1 cell line is widely used as a model to investigate the functions of human monocytes/macrophages across various biology-related research areas. This article describes a protocol for efficient CRISPR-Cas9-based engineering and single-cell clone isolation, enabling the production of robust and reproducible phenotypic data.

THP-1 Hücrelerinde Elektroporasyon Tabanlı CRISPR-Cas9 Aracılı Gen Nakavt ve Tek Hücreli Klon İzolasyonu

The human acute monocytic leukemia (AML) THP-1 cell line is widely used as a model to study the functions of human monocyte-derived macrophages, including ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

CRISPR-Cas9 Mediated Gene Deletion in Human Pluripotent Stem Cells Cultured Under Feeder-Free Conditions

The CRISPR-Cas9 system for genome editing has revolutionized gene function studies in mammalian cells, including stem cells. However, the practical application of this technique, particularly in pluripotent stem cells, presents certain challenges, such as being time- and labor-intensive and having low editing efficiency. Here, we describe the generation of a CRISPR-mediated gene knockout in a human embryonic stem cell (hESC) line stably expressing sgRNAs for the L2HGDH gene, using a highly efficient and stable lentiviral-mediated gene delivery system. The sgRNAs targeting exon 1 of the L2HGDH gene were chemically synthesized and cloned into the lentiCRISPR v2-puro vector, which combines the constitutive expression of sgRNAs with Cas9 in a highly efficient single-vector system to achieve higher lentiviral titers for hESC infection and stable selection using puromycin. Puromycin-selected cells were further expanded, and single-cell clones were obtained using the limited dilution method. The single clones were expanded, and several homozygous knockout clones for the L2HGDH gene were obtained, as confirmed by a 100% reduction in L2HGDH expression using Western blot analysis. Furthermore, using MSBSP-PCR, the CRISPR mutation site was mapped upstream of the PAM recognition sequence of Cas9 in the selected homozygous clones. Sanger sequencing was performed to analyze the exact insertions/deletions, and functional characterization of the clones was conducted. This method produced a significantly higher percentage of homozygous deletions compared to previously reported non-viral gene delivery methods. Although this report focuses on the L2HGDH gene, this robust and cost-effective approach can be used to create homozygous knockouts for other genes in pluripotent stem cells for gene function studies.

<meta charset="utf8"></head><body>Besleyicisiz Koşullar Altında Kültürlenen İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinde CRISPR-Cas9 Aracılı Gen Delesyonuna

The presented method describes the generation of a CRISPR-mediated gene knockout in the human embryonic stem cell (hESC) line H9, which stably expresses sgRNAs targeting the L2HGDH gene using a highly efficient lentiviral-mediated gene delivery system.

Besleyicisiz Koşullar Altında Kültürlenen İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinde CRISPR-Cas9 Aracılı Gen Delesyonuna

The CRISPR-Cas9 system for genome editing has revolutionized gene function studies in mammalian cells, including stem cells. However, the practical ...

Memeli Hücrelerinde CRISPR / Cas9 aracılı Gen Knockout'larının Seçime Bağlı ve Bağımsız Üretimi

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler