DS ve MSK, kısmen hibe AI053531 (NIAID, NIH) tarafından desteklendi; SS ve PSC hibe N00014-14-1-0792 (ONR) tarafından desteklendi.

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Her bir PIP varyantı, düşük konsantrasyonlarda olsalar da, organel membran 1&#39;in eşsiz bir fiziksel bileşimi ve fonksiyonel özgünlüğünün tesis edilmesine katkıda bulundukları belirli organellerin sitosolik yüzeyi üzerinde bulunur. PIPs en önemli kullanım alanlarından biri, belirli bir hücre içi lokalizasyonu ve / veya aktivasyonunu 6, 7 gerektiren protein sayıda için belirli bir yerleştirme platformu gibidir. Hücresel fizyoloji ve hastalıktaki rolleri nedeniyle, protein-PIP etkileşimlerini in vitro fizyolojik olarak ilgili bağlamda inceleme kabiliyeti önemlidir. Burada tarif edilen tahlil biçimi, bir fosfolipidlerin bir karışımının mevcudiyetinde bir sıvı lipid çift tabakası bağlamında protein-PIP etkileşimlerini kutup başı grubunun normal sunumu ile ve doğal uzunluktaki yağlı asil zincirleriyle göz önüne almasına izin verir. Bu test, kombinasyondaAlgılama sistemi olarak pH modülasyonu ve bir mikroakışkan platformda ayarlanmış bir model membran sistemi olan SLB&#39;ler, diğer membran bağlama teknikleriyle karşılaştırıldığında benzersiz avantajlar sağlar. Her şeyden önce, mikro-akışkan bir platform, kullanılan protein ve lipid (; 1.0 mm2 SLB yüzey alanı 40 nL, toplam kanal hacmi) için hem düşük hacim gereksinimlerini malzeme tasarrufu sağlar. Yine iki boyutlu membran akışkanlığını (≥1.0 um2 / s) 28 38 tutulurken Buna ek olarak, fizyolojik olarak ilgili lipit kompozisyonları kullanılabilmektedir. Algılama sistemi, sadece protein-membran etkileşimlerini değil aynı zamanda iyon, küçük molekül, peptit-membran etkileşimlerini test etmeye izin veren ITC, SPR ve dağılma ile kuvartz kristal mikro dengesine kıyasla gelişmiş sinyal / parazit oranı sağlar (QCM-D) Kuyu 19 , 20 , 39 , </40 yaş üstü Ayrıca, pH duyarlı flüoresans probu oldukça kararlıdır ve deneysel koşullar altında test edilmiş 19 , 20 , 41&#39;de fotobakamsız değildir. Bu platformun bir diğer avantajı, membran yüzeylerini görsel olarak gözlemleme yeteneğidir. Belirli etkileşimler, sırasıyla fotoblokaj sonrası flüoresans iyileştirme (FRAP) yoluyla doğrudan görselleştirilebilen ve / veya test edilebilen, lipit mikro alanı oluşumunu indükleyebilir ve / veya membran akışkanlığını etkileyebilir 42 . Burada tarif edilen tahlil, flüoresans mikroskopunun ötesinde herhangi bir pahalı enstrümantasyon gerektirmez. Son olarak ve en önemlisi, ligand / reseptör işaretlemesinin yokluğunda membran etkileşimlerinin değerlendirilmesi PIP-on-a-chip testini geleneksel yöntemler üzerinde tercih edilen yöntem haline getirir. Her ne kadar PIP-on-a-chip testi güçlü bir teknik olsa da, periferik membran proteinleri farklı olabilirKatyonik ve anyonik kalıntıların genel bileşimi ve bağlanma bölgesi içindeki / çevresindeki dağılımı bazı zorluklar yaratır. Bazı proteinlerin pek çok temel kalıntıdan oluşan PIP bağlama alanları bulunurken diğerlerinde sadece birkaçı vardır. Bu nedenle, bağlanma sahasındaki H + / OH - oranı farklı olacak ve bağlanma üzerine yerel pH&#39;daki değişikliğin büyüklüğü de aynı olacaktır. Etkileşimin stoikiometrisi ve PIP-bağlanmasının diğer lipidler ile etkileşimler yoluyla stabilize edilip edilmediği durumu daha da karmaşık hale getirmektedir. Buna göre, bir proteinin, özellikle büyük bir protein için pI, beklenen flüoresans değişiminin tek göstergesi olmayabilir. Bazı protein-PIP etkileşimleri büyük floresan değişiklikleri ile sonuçlanırken, geri kalanlar küçük floresans değişikliklerine neden olabilir. İkinci durumda, sinyalin gürültü oranını arttırmak için en az iki eylem yapılabilir: 1) proteinlerin sayısını artırmak için çift katman üzerinde daha büyük PIP seviyeleri kullanmak rYüzeye çıkar, yani işe alınan OH - iyonlarının sayısını ve söndürülmüş o SRB-POPE moleküllerinin sayısını arttırmak; 2) sinyal / gürültü oranını arttırmak için o SRB-POPE düzeylerini arttırma. Mevcut platform, periferik membran proteinlerinin incelenmesi için birçok avantaj sağladığı halde, transmembran proteinlerin çalışılması için bazı zorluklara sahiptir. SLB-cam destek yakınlığı nedeniyle (su tabakası, lipid kompozisyonuna bağlı olarak yaklaşık 1-2 nm&#39;dir), transmembran protein-cam desteği etkileşimi, protein denatürasyonunu teşvik edebilir, fonksiyon kaybına yol açabilir ve immobilizasyon 34 , 43 , 44 , 45 . Daha katı olsalar da, cam destek maddesinin polimer yastığı sağlamak üzere yüzey modifikasyonu veya lipopolim dahil olmak üzere bu zorlukların üstesinden gelmek için çeşitli yaklaşımlar geliştirilmiştirSLB-cam destek mesafesini 34 , 46 , 47 , 48 arttırmak için çift katman içinde r dişler (örneğin PEG ile birleştirilmiş lipitler). Yüksek kaliteli SLB&#39;ler oluşturmak, çip üzerinde PIP testinin en kritik yönüdür ( Şekil 8A ). Yenilenebilirliği sağlamak için temiz lamelleri ve taze SUV&#39;ları kullanmanız önerilir. Nedeniyle, örneğin, PI (4,5) P2 gibi anyonik lipidler, varlığına bağlı olarak, SUV olumsuz SUV yırtılma etkinliğini düşürür, yüklü membran akışkanlığını (Şekil 8B) etkilemektedir. Bu nedenle, SUV çözeltisinin pH ayarlaması, PI (4,5) P 2 kafa grubu fosfatlarının protonlanması için önemlidir ve kırılma verimliliğini artırmak için cam ile elektrostatik iticili azaltmaktadır 49 , 50 . Anyonik l içermeyen SUV&#39;lerIpids, herhangi bir pH ayarlaması gerektirmez. İlaveten, cam örtücü yüzey hala SLB oluşumu için gerekli hidrofilik ise, SUV&#39;ler oksijen plazma muamelesinden ve bağlandıktan hemen sonra kanallara enjekte edilmelidir. SLB kalitesinin yanı sıra toz parçacıkları da bir başka meseleyi temsil etmektedir. Cihaz üretme işlemi sırasında kanallar arasında sıkışan bir toz parçacığı kanal füzyonuna neden olurken, bir kanal içine sıkışan bir toz parçacığı SLB&#39;ye zarar verebilir ve / veya solüsyon akış hızını düşürebilir ( Şekil 8C, 8D ). Tozları gidermek için çalışma alanı periyodik olarak temizlenmelidir. Benzer şekilde, herhangi bir adımda bir hava kabarcığının bir kanala maruz kalmasından kaçınılmalıdır, aksi takdirde SLB&#39;ye geri döndürülemez hasar verecektir ( Şekil 8E ). PIP-on-a-chip deneyi planlanırken dikkate alınması gereken bir başka parametre, protein saklama tamponudur. Yüksek konsantrasyonlarda kullanıldığında, tek tek bileşenler (Stabilize edici ajanlar, indirgeyici ajanlar, tuzlar, antimikrobiyal maddeler, kenetleme reaktifleri vs. ) floresan ve / veya SLB bütünlüğünü etkileyebilir. Bu nedenle, depolama tamponunun etkisini test etmek için titre edilmelidir. Bir etki gözlemleniyorsa, floresandaki bir kaymayı önlemek için protein titrilmeden önce SLB&#39;ler depolama tamponu koşullarına dengelenmelidir. Bu, pH modülasyonuna dayalı bir deney olduğunu göz önüne alındığında, mümkünse, saflaştırılmış protein, tampon uyumsuzluğunun neden olduğu flüoresan sürüklenmesini en aza indirgemek için, çalışan tampon maddesi (bu durumda, pH 7.0&#39;da 20 mM HEPES) ile aynı tamponlama bileşenini içermelidir. Sonuç olarak, pH modülasyon testinin protein-PIP etkileşimlerini araştırmak için başarıyla kullanılabileceğini gösterdik. PIP&#39;lere ağırlık verilmesine rağmen bu platform, fosfatidilser gibi diğer fizyolojik olarak alakalı lipidleri içeren daha kompleks membranlarla etkileşimleri test etmek için kullanılabilirNe, fosfatidiletanolamin, fosfatidik asit ve kolestrol, diğerleri arasında 28 , 39 , 42 , 51 . Hücresel proteinlerin ötesinde, bu tahlil platformu insan patojenlerine bakanlar için faydalı olabilir. Örneğin, virüsler ve bakteriler tarafından kodlanan proteinlerin hücresel membranlarla ve bazıları özellikle PIP&#39;ler 52 , 53 , 54 , 55 , 56 ile etkileşime girdiği gösterilmiştir. Buna göre, PIP-on-a-chip testi, protein-PIP etkileşimlerinin küçük moleküllü inhibitörlerini keşfetmek ve karakterize etmek için bir araç sağlayabilir.

Sayısız etkileşimler ve biyokimyasal işlemler iki boyutlu sıvı zar yüzeylerinde gerçekleşir. Ökaryotik hücrelerdeki zarla kapalı organeller, sadece biyokimyasal süreçlerde ve bunlarla ilişkili proteomda değil aynı zamanda lipit kompozisyonlarında da eşsizdir. Fosfolipidlerin olağan dışı bir sınıfı fosfoinositidlerdir (PIP&#39;ler). Hücresel lipidomun sadece% 1&#39;ini oluşturmalarına rağmen, bunlar 1 , 2 , 3 , 4 diğerleri arasında sinyal iletiminde, otofajiyede ve zar ticaretinde çok önemli bir rol oynamaktadır. Hücresel PIP kinazlar tarafından inositol baş grubunun dinamik fosforilasyonu yedi PIP mono- ana grupları, bis- veya tris-fosforile 5 yol açar. Ek olarak, PIP&#39;ler membranların subselüler kimliğini tanımlar ve bir veya daha fazla fosfoin içeren protein / enzimler için özel membran yerleştirme siteleri olarak görev yaparlarÖrneğin Pleckstrin Homolojisi (PH), Phox Homoloji (PX) ve epsin N-terminal Homolojisi (ENTH) 6 , 7 . En çok çalışılan PIP bağlayıcı bölgeleri biri, özellikle yüksek nanomolar düşük mikromolar afinite 8 içinde fosfatidilinositol 4,5-bisfosfat (PI (4,5) P2) ile etkileşime giren fosfolipaz C (PLC) -δ1 PH olan , 9 , 10 , 11 . Bu etkileşimlerin mekanizması, termodinamiği ve özgüllüğünü incelemek için çeşitli nitel ve nicel in vitro yöntemler geliştirilmiş ve kullanılmıştır. En sık kullanılan PIP bağlanma deneyleri arasında, yüzey plazmon rezonansı (SPR), izotermal kalorimetre (ITC), nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopisi, lipozom flotasyonu / sedimentasyon testi ve lipid lekeleri (Yağ-lekeleri / PIP-şeritleri)12 , 13 . Bunlar yaygın olarak kullanılsa da, hepsinin dezavantajları var. Örneğin, SPR, ITC ve NMR, büyük numuneler, pahalı aletler ve / veya eğitilmiş personel 12 , 13 gerektirir . Antikor bazlı lipid lekeleri gibi bazı tahlil formatları, suda çözünür PIP&#39;leri kullanır ve onları fizyolojik olmayan bir şekilde 12 , 14 , 15 , 16 olarak sunar . Buna ek olarak, lipid blotlar güvenilir miktarı edilemez ve sık sık yanlış pozitif / negatif gözlem 12, 17, 18 ile sonuçlanmıştır. Bu zorlukların üstesinden gelmek ve mevcut takım setini geliştirmek için am bağlamında desteklenen bir lipid katmanına (SLB) dayalı yeni bir etiketsiz yöntem geliştirildi<html> Protein-PIP etkileşimlerinin çalışmasına başarıyla uygulanan bir mikroakışkan platform ( Şekil 1 ) 19 . Protein-PIP etkileşimlerini saptamak için kullanılan strateji pH modülasyon algılamaya dayanmaktadır. Bu, fosfatidiletanolamin lipid başı grubu 20&#39;ye direkt olarak konjuge edilmiş orto- Sulforhodamin B ( o SRB) içeren pH&#39;ye duyarlı bir boya içerir. O SRB-POPE probu (Şekil 2A), düşük pH değerinde yüksek floresan ve% 7.5 mol PI (4,5) P2 ihtiva eden SLBS (Şekil 5B) içinde yaklaşık 6.7 bir pKa&#39;ya sahip yüksek bir pH değerinde söndürülür. PLC δ1 PH nedeniyle PI (4,5) P2 (Şekil 5A) karşı yüksek özgüllük 21, 22 için yaygın olarak protein PIP bağlama yöntemleri doğrulamak için kullanılmıştır&quot;&gt; 23 , 24 , 25. Dolayısıyla, PLC-δ1 PH alanının PIP-on-a-chip analizi yoluyla PI (4,5) P 2&#39;ye yapıştığını test etmek için kullanılabileceğini düşünüyoruz PH etki alanı yapısı Bu çalışmada kullanılan bir net pozitif yüke (pl 8.4) sahiptir ve bu nedenle, OH çeken -. iyonları - PI (4,5) P2 ihtiva eden SLBS bağlanma üzerine iyonları (Şekil 5C), PH, OH getirir bu da ara yüzey potansiyel modüle ve o SRB-Pope (Şekil 5C) 26. PH konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak, floresan söndürülür (Şekil 6A) protonasyon durumunu değiştirir zar yüzeyi. Son olarak, normalleştirilmiş verileri PH-PI (4,5) P2 etkileşimi (Şekil 6B, 6C). afinitesini belirlemek için bir bağlanma izoterm uyacak &lt;/ P&gt; Bu çalışmada, mikroakışkan bir platformda PIP içeren SLB&#39;lere proteinin bağlanmasını gerçekleştirmek için ayrıntılı bir protokol sağlanmıştır. Bu protokol, okuyucuyu, mikroakışkan cihaz ve vezikül hazırlamadan SLB oluşumuna ve protein bağlamaya monte etmekten alıyor. Buna ek olarak, veri analizi için tarifi PLC δ1 PH-PI (4,5) P2 etkileşimi sağlanır için afinite bilgileri elde etmek.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1638">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:363px;">Coverslip</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td style="width:123px;"></td>
			<td style="width:997px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glass Coverslips: Rectangles</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-544B</td>
			<td>22 x 40 x 0.16 - 0.19 mm, No. 1 1/2; Borosilicate Glass</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">7X Cleaning Solution</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>976670</td>
			<td>Detergent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PYREX Crystallizing Dish</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3140-190</td>
			<td>Borosilicate glass dish with a flat bottom; Diameter x Height (190 x 100 mm); Distributor: VWR (89090-700)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sentry Xpress 2.0</td>
			<td>Paragon Industries</td>
			<td>SC-2</td>
			<td>Kiln</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PDMS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td>Dow Corning&#160;</td>
			<td>4019862</td>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS); Distributor: Ellsworth Adhesives</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PYREX Desiccator</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89134-402</td>
			<td>Vacuum Rated</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Biopsy punch</td>
			<td>Harris</td>
			<td>15110-10</td>
			<td style="width:997px;">Harris Uni-Core; 1.0 mm diameter; Miltex Biopsy Punch with Plunger (Cat. No. 15110-10) can be used as an alternative</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Device</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:997px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Plasma Cleaning System</td>
			<td>PlasmaEtch</td>
			<td>PE25-JW</td>
			<td>2-stage Direct Drive Oil Vacuum Pump, O2 service (Krytox Charged)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Digital Hot Plate</td>
			<td>Benchmark</td>
			<td>H3760-H</td>
			<td>Purchased through Denville Scientific (Cat. No. 1005640)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Frosted Micro Slides</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48312-003</td>
			<td>Frosted, Selected, and Precleaned; Made of Swiss Glass; Thickness: 1 mm; Dimensions: 75 x 25 mm; GR 144</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mold</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AutoCAD</td>
			<td>Autodesk</td>
			<td>v.2016</td>
			<td>Drafting software for the photomask design</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Photomask</td>
			<td>CAD/Art Services</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Design with black background and clear features was printed at 20k dpi resolution on a transparent mask (5 x 7 in) by CAD/Art Services</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Silicone Wafers</td>
			<td>University Wafer</td>
			<td>1575</td>
			<td>Prime Grade, Single Side Polished; 100 mm (4 inch) Diameter; 525 um Thickness</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SU-8 50</td>
			<td>MicroChem Corp.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Negative Tone Photoresist; Penn State Nanofabrication Facility Property</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SU-8 Developer</td>
			<td>MicroChem Corp.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Penn State Nanofabrication Facility Property</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SUV</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850457C</td>
			<td>POPC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-&#945;-phosphatidylinositol-4-phosphate</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840045X</td>
			<td>PI4P</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-&#945;-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate&#160;</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>840046X</td>
			<td>PI(4,5)P2</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850757C</td>
			<td>POPE; Required for the synthesis of oSRB-POPE</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lissamine Rhodamine B Sulfonyl Chloride (mixed isomers)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>L-20</td>
			<td>Required for the synthesis of oSRB-POPE</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pH Sensitive Fluorescent Lipid Probe (oSRB-POPE)</td>
			<td>In-house</td>
			<td>N/A</td>
			<td>In-house Synthesis (Huang D. et al. 2013)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glass Scintillation Vial</td>
			<td>VWR</td>
			<td>66022-065</td>
			<td>20 mL volume capacity</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Aquasonic 250D</td>
			<td>VWR</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Ultrasonic Water Bath</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nuclepore Track-Etched Membranes</td>
			<td>Whatman</td>
			<td>110605</td>
			<td>Polycarbonate Membrane; Diameter: 25 mm; Pore Size: 0.1 um; Distributor: Sigma-Aldrich</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chloroform</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CX1054-6</td>
			<td>HPLC grade</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">LIPEX Extruder</td>
			<td>Transferra Nanosciences</td>
			<td>T.001</td>
			<td>LIPEX 10 mL Thermobarrel Extruder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Viscotek 802 DLS</td>
			<td>Malvern Instruments</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Dynamic Light Scattering; Penn State X-Ray Crystallography Facility Property</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Data Analysis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">GraphPad Prism</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td>v.6</td>
			<td>Curve-fitting software for data analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Axiovert 200M Epifluorescence Microscope</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Microscope</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AxioCam MRm Camera</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Camera</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">X-Cite 120</td>
			<td>Excelitas Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Light Source</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Alexa 568 Filter Set</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Ex/Em 576/603 nm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AxioVision LE64 v.4.9.1.0 Software</td>
			<td>Carl Zeiss Microscopy</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Image Processing Software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Other</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10034-132</td>
			<td>200 uL pipette tips; Thin and smooth tip for applying the protein solution into the microfluidic channel</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>53509-070</td>
			<td>10 uL pipette tips; Thin and smooth tip for applying the vesicle solution into the microfluidic channel</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Orion Star A321 pH meter</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>STARA3210</td>
			<td>pH meter</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Orion micro pH probe</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>8220BNWP</td>
			<td>micro pH probe</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">N-(2-Hydroxyethyl)-Piperazine-N&#39;-(2-Ethanesulfonic Acid)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>VWRB30487</td>
			<td>HEPES, Free Acid</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Chloride</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BDH8014-2.5KGR</td>
			<td>NaCl</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tubing</td>
			<td>Allied Wire &#38; Cable</td>
			<td>TFT-200-24 N</td>
			<td>Internal Diameter: 0.020-0.026 inches (0.051-0.066 cm); Wall Thickness: 0.010 inches (0.025 cm); Flexible Polytetrafluoroethylene Thin-Wall Tubing; Natural Color</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nitrogen Gas - Industrial</td>
			<td>Praxair</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Local Provider</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Oxygen Gas - Industrial</td>
			<td>Praxair</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Local Provider</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Liquid Nitrogen</td>
			<td>Praxair</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Local Provider</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pip-on-a-chip: a label-free study of protein-phosphoinositide interactions

Çok sayıda hücresel protein, temel hücre proseslerini etkilemek için membran yüzeyleriyle etkileşir. Bu etkileşimler, spesifik subselüler lokalizasyon ve / veya aktivasyonu sağlamak için, fosfoinositidler (PIPs) durumunda olduğu gibi bir zar içerisinde spesifik bir lipid bileşenine yönlendirilebilir. PIP&#39;ler ve hücresel PIP bağlanma alanları, hücresel fizyolojideki rollerini daha iyi anlamak için kapsamlı olarak incelenmiştir. Protein-PIP etkileşimlerini incelemek için bir araç olarak desteklenen lipid bilayerlere (SLB&#39;ler) bir pH modülasyon testi uyguladık. Bu çalışmalarda, pH&#39;ye duyarlı orto- Sülohodamin B konjuge fosfatidiletanolamin, protein-PIP etkileşimlerini saptamak için kullanılmıştır. Bir proteinin bir PIP içeren membran yüzeyine bağlanmasının ardından ara yüzey potansiyeli, probun proton durumunu değiştirerek modüle edilir ( yani , yerel pH&#39;daki değişim). PH modülasyon tahlilinin başarılı bir şekilde kullanılmasına ilişkin bir vaka çalışması, fosfolipaz C delta1 PleckstrHomoloji (PLC-δ1 PH) etki alanı ve bir örnek olarak fosfatidilinositol 4,5-bisfosfat (PI (4,5) P2) etkileşim içinde. Bu etkileşim için görünür çözülme sabiti ( Kd , app ) , diğerleri tarafından elde edilen Kd , app değerlerine benzer olarak 0.39 ± 0.05 μM idi. Daha önce gözlemlendiği gibi, PLC-δ1 PH alanı, PI (4,5) P 2 spesifiktir, fosfatidilinositol 4-fosfata karşı daha zayıf bağlar ve saf fosfatidilkolin SLB&#39;ye bağlanma göstermez. PIP-on-a-chip testi, düşük örnek hacmi ve ligand / reseptör işaretleme gereksinimleri olmaksızın, geleneksel ve düşük PIP bağlanma deneyleri karşısında avantajlıdır, yüksek ve düşük afiniteli membran etkileşimlerini hem küçük hem de Büyük moleküller ve geliştirilmiş sinyal / gürültü oranı. Buna göre, çip üzerinde PIP&#39;in kullanılması, çok çeşitli membran etkileşim mekanizmalarının aydınlatılmasını kolaylaştıracaktır. Dahası, bu yöntem muhtemelenProteinlerin membranlarla etkileşime geçme kapasitesini modüle eden terapötiklerin belirlenmesinde sed.

Bir PIP-on-a-chip mikrocihazda içinde (4,5) P2 etkileşimi (Şekil 1), PLC-δ1 PH-PI çalışma pH modülasyon deneyi kullanılmıştır. Ayrıntılı bir protokol aracılığıyla, mikroakışkan aygıt bileşenlerini hazırlamak ve bir araya getirmek, küçük tek katmanlı vezikülleri (SUV&#39;ler) yapmak ( Şekil 2 ), bir aygıt içinde SLB&#39;ler oluşturma ( Şekil 3 ) ve PIP içeren SLB&#39;lere protein bağlanmasını test ettik. Tipik bir SLB bağlama deneyinin akış şeması Şekil 4&#39;te gösterilmektedir. PH, modülasyon deneyi ilkesi, örnek olarak bağlayıcı PH-PI (4,5) P2 kullanılarak Şekil 5&#39;te gösterilmektedir. Bu çalışmadan elde edilen sonuçlar, PH PI (4,5) P2 ihtiva eden SLBS bağlandığım göstermiştir. Daha spesifik olarak, bağlandıktan sonra, yerel pH&#39;ın daha temel hale geldiğini gözlemledik. Bu<html> Lokal pH değişimi SLB&#39;ler içinde bulunan o SRB-POPE floresan probu tarafından algılanır ve ardından buna göre söndürülür ( Şekil 6A , 6C ). Söndürme, konsantrasyona bağlı ve doyurulabilirdi, bu nedenle verileri bir Langmuir izoterma uydurmak, 0.39 ± 0.05 uM&#39;lik bir Kd , app verdi ( Şekil 6B , 6D ). PH yana PI (4,5) P2 doğru seçiciliği gösterdi (Şekil 6B) bir POPC (zitteriyonik lipit) doğru gözlendi bağlanması ve zayıf (= Kd, uygulama 1.02 ± 0.20 uM) PI4P içeren SLBS için bağlayıcı. Floresan verilerin nasıl işlendiğini göstermek için örnek bir hesaplama dahildir ( Şekil 7 ). Şekil 8&#39;de , SLB&#39;lerin ve mikro kanalların kalitesinin belirlenmesinde görsel ipuçları sağlamak için mikrokanal görüntü serileri sunulmuştur. _content &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="Şekil 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55869/55869fig1.jpg" /> Şekil 1: protein-PIP etkileşimlerini incelemek için çip üzerinde mikropluidik bir cihaz. ( A ) Mikroakışkan cihaz, 8 giriş ve 8 çıkışlı 8 mikrokanal içerir. Kanalları bu görüntüde görünür kılmak için renkli solüsyonlar akıtıldı. Cihazın genişliği (x) 2.0 cm, yüksekliği (y) 0.5 cm, uzunluğu 3.0 cm&#39;dir (z). ( B ) Mikro kanalların zemini camdır, duvarlar ve tavanlar ise polidimetilsiloksandan (PDMS) oluşur. Her mikrokanalın genişliği 100 μm, yüksekliği 40 μm ve uzunluğu 1 cm&#39;dir. İki bitişik mikro kanal arasındaki boşluk 40 μm&#39;dir. Desteklenen lipit çift tabakalar (SLB) cam yüzeyin üstünde oluşturulmuştur. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55869/55869fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> </a&gt; <img alt="şekil 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55869/55869fig2.jpg" /> Şekil 2. Küçük unilamellar vezikül (SUV) hazırlama ve kalite kontrol çalışmaları. ( A ) veziküllerin yapımında kullanılan lipid bileşenleri: orto -Sulforhodamin B-POPE ( o SRB-POPE), L-a-fosfatidilinositol-4-fosfat (PI4P), L-a-fosfatidilinositol-4,5-bisfosfat PI (4,5) P2) ve 1-palmitoil-2-oleoil -sn-glisero-3-fosfokolin (POPC) vb. ( B ) Lipit vezikül türleri: SUV, büyük unilamellar vezikül (LUV), dev tek tabakalı vezikül (GUV) ve multilamellar vesikül (MLV). SUV&#39;lar, SLB&#39;lerin hazırlanması için en uygun 34 . ( C ) Dinamik ışık saçılımı (DLS), lipid sonrası eksipiyesin veziküllerin boyutunu teyit eder (0.1 μm filtre ile). 53.9 nm hidrodinamik yarıçapı (Rh), m<html> Vezikül büyüklüğü dağılımının ean ~ 100 nm&#39;dir. Sonuçlar (4,5) P2-içeren SUV PI ölçümü temsil etmektedir. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55869/55869fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55869/55869fig3.jpg" /> Şekil 3: Bir cam desteğinde SLB oluşumu. ( A ) Arzu edilen lipit kompozisyonu içeren veziküller hazırlanır ve daha sonra mikro kanallar vasıtasıyla akıtılır. Vesiküller cam yüzeyine adsorbe edilir ve deforme olur. Kritik bir yüzey kaplaması sağlandığında, veziküller SLB&#39;leri oluşturmak için kendiliğinden kopar. Referanslar 35 , 36&#39;dan uyarlanmıştır. ( B ) 10X&#39;lik bir hedefin altındaki bir cihaz içindeki SLB&#39;ler gösterilir. Alexa 568 filtre seti (uyarılma / emisyon 576/603 nm&#39;de) kullanılır.Ource.jove.com/files/ftp_upload/55869/55869fig3large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bu figürde daha büyük bir sürümünü görmek için lütfen buraya tıklayınız. <img alt="Şekil 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55869/55869fig4.jpg" /> Şekil 4: Tipik bir SLB bağlama deneyinin akış şeması. Mikroakışkan cihaz parçaları, PDMS blok ve temizlenmiş lamelleri desenli yani hem hidrofilik hem de daha sonra monte edilmiş yüzeyleri yapmak için oksijen plazma ile muamele edilmiştir. SUV&#39;ler, SLB&#39;leri oluşturmak için mikro kanallardan akar. Fazla vesiküller çıkarılır ve SLB&#39;ler, bir çalışan tampon çözeltisi akıtılarak deneysel koşullara dengelenir. Daha sonra, protein seyreltileri mikro kanallar boyunca akıtılır. Son olarak, floresan yoğunluğu verileri analiz edilir, normalleştirilir ve protein konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak çizilir. Normalize edilmiş veriler, belirgin bir ayrışma sabiti ( Kd , app ) va çıkarmak için bir işleve uygundurlue. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55869/55869fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55869/55869fig5.jpg" /> Şekil 5: pH modülasyonuna dayalı algılamanın ilkeleri. Ile kompleks PLC-δ1 PH alanının (A) X-ışını kristal yapısı PI (4,5) P2 baş grubu inositol 1,4,5-trifosfat (Atışı (1,4,5) P3) (PDB Kimliği: 1MAI) 37 . (B) O SRB-POPE sonda yüksek, düşük pH floresan ve% 7.5 mol PI, pH, titrasyon eğrisinin belirtildiği gibi SLBS ihtiva eden (4,5) P2 içinde 6.7 bir pKa değerine sahip yüksek bir pH değerinde söndürülür. ( C ) Bu çalışmada kullanılan PH alanı, 8.4 izoelektrik noktasına (pI) sahip olduğundan, deney pH&#39;ında (7.0) protein pozitif yüklüdür. Bir net pozitif c taşımakHarge, protein OH - iyonları çekiyor. PH PI bağlandığında (4,5) p SLBS ihtiva eden 2, bu OH getirir - membran yüzeyine iyonları, ara yüzey potansiyel da o SRB-POPE protonasyon durumunu değiştirdiği modüle ve floresans olduğu PH alan konsantrasyona bağlı bir tarzda söndürülür. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55869/55869fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55869/55869fig6v2.jpg" /> Şekil 6: PLC-δ1 pH-modülasyonu yoluyla gözlemlenen PH-membran bağlanması. ( A ) Belirtilen konsantrasyonlarda PH alanını eklemeden önce ve sonra mikrokanalların görünümü. (B), POPC, PI4P doğru afiniteler karşılaştırılması, ve PI (4,5) P2 ihtiva eden SLBS. PH etki alanı bağlama<html> % 7.5 mol PI (4,5) P2 ihtiva eden SLBS Kd, 0.39 ± 0.05 uM uygulamayı vermiştir. Daha zayıf bağlanma,% 7.5 mol PI4P içeren SLB&#39;ye ( Kd , 1.02 ± 0.20 uM uygulaması ) bakıldı ve saf POPC SLB&#39;ler için bağlanma gözlenmedi. Hata çubukları SEM&#39;i gösterir (n = 3). (* P = 0,0396) bağlama PI4P ve PI (4,5) P2 arasındaki afinitelerinin mukayese etmek için kullanılmıştır -test t İki kuyruklu. ( C ) POPC, PI4P ve PI (4,5) P 2 bağlanma deneyleri için piksel olarak uzaklığın bir fonksiyonu olarak, mikrokanallar arasındaki çizgi taramasından gelen floresan yoğunlukları çizilmiştir. (D) Normalize ve POPC, PI4P ve PI ortalaması (4,5) P2 bağlanma verileri PLC δ1 PH konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak çizilmiştir ve daha sonra, uygulamayı Kd&#39;yi ayıklamak için bir Langmuir izotermine seçimdir. Ayrıntılar için 8.4. Adımdaki denkleme bakın.&quot;Target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız. <img alt="Şekil 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55869/55869fig7.jpg" /> Şekil 7: Veri işleme için örnek hesaplama. ( A ) Protein titrasyon çizgisinden önceki (siyah) ve sonra (kırmızı protein) protein kanalı ve protein kanalı için tarama verisi (burada floresans yoğunluğu verileri piksel cinsinden uzaklığın bir fonksiyonu olarak sunulmaktadır). Gölgeli alanlar, hesaplamalar için veri çıkarmak için kullanılan bölgeleri temsil eder. Temel floresans yoğunluğu verileri her kanaldan önce ve sonra çıkarılır. ( B ) Veriler, protein titrasyonundan önce ve sonra, boş ve protein kanalları için çıkarılır. Ortalamalar, taban çizgisi ve bir kanal floresans verileri dahilinde alınır. Bazal çıkarma işleminden sonra, flüoresan verileri boş kanala normalize edilmiştir. Ayrıntılar için 8.3. Adımdaki denkleme bakın. <a<html> Href = &quot;https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55869/55869fig7large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görmek için lütfen tıklayınız. <img alt="Şekil 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55869/55869fig8.jpg" /> Şekil 8: SLB&#39;lerin ve mikro kanalların bütünlüğünü değerlendirmek. ( A ) Yüksek kaliteli SLB&#39;leri ve mikro kanalları gösteren bir resim. ( B ) Eksik füzyon. ( C ) Füzyon mikrokanalları. ( D ) Bir mikro kanal içinde sıkışan toz parçacığı. ( E ) Mikro kanallar içine sıkışan hava kabarcığı. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55869/55869fig8large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> Ek Dosya 1: Pattern_Design.dwgBoş &quot;&gt; Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Watch this Scientific Journal Video about PIP-on-a-chip: A Label-free Study of Protein-phosphoinositide Interactions at JoVE.com

PIP-on-a-chip: A Label-free Study of Protein-phosphoinositide Interactions

Burada, pH modülasyonuna dayalı etiketsiz bir yöntem kullanarak protein-fosfoinositid etkileşimlerini incelemek için bir mikroakışkan platform bağlamında desteklenen bir lipid çift katmanı sunmaktayız.

PIP-on-a-chip: Protein-fosfoinositid Etkileşimlerinin Etiketsiz Bir Çalışması

Numerous cellular proteins interact with membrane surfaces to affect essential cellular processes. These interactions can be directed towards a specific ...

pip-on-chip-label-free-study-protein-phosphoinositide

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

9.4K Görüntüleme.  The Pennsylvania State University.  Burada, pH modülasyonuna dayalı etiketsiz bir yöntem kullanarak protein-fosfoinositid etkileşimlerini incelemek için bir mikroakışkan platform bağlamında desteklenen bir lipid çift katmanı sunmaktayız. 

Video: PIP-on-a-chip: A Label-free Study of Protein-phosphoinositide Interactions

Micropatterned Surfaces to Study Hyaluronic Acid Interactions with Cancer Cells

Cancer invasion and progression involves a motile cell phenotype, which is under complex regulation by growth factors/cytokines and extracellular matrix (ECM) components within the tumor microenvironment. Hyaluronic acid (HA) is one stromal ECM component that is known to facilitate tumor progression by enhancing invasion, growth, and angiogenesis1. Interaction of HA with its cell surface receptor CD44 induces signaling events that promote tumor cell growth, survival, and migration, thereby increasing metastatic spread2-3. HA is an anionic, nonsulfated glycosaminoglycan composed of repeating units of D-glucuronic acid and D-N-acetylglucosamine. Due to the presence of carboxyl and hydroxyl groups on repeating disaccharide units, native HA is largely hydrophilic and amenable to chemical modifications that introduce sulfate groups for photoreative immobilization 4-5. Previous studies involving the immobilizations of HA onto surfaces utilize the bioresistant behavior of HA and its sulfated derivative to control cell adhesion onto surfaces6-7. In these studies cell adhesion preferentially occurs on non-HA patterned regions.
To analyze cellular interactions with exogenous HA, we have developed patterned functionalized surfaces that enable a controllable study and high-resolution visualization of cancer cell interactions with HA. We utilized microcontact printing (uCP) to define discrete patterned regions of HA on glass surfaces. A "tethering" approach that applies carbodiimide linking chemistry to immobilize HA was used 8. Glass surfaces were microcontact printed with an aminosilane and reacted with a HA solution of optimized ratios of EDC and NHS to enable HA immobilization in patterned arrays. Incorporating carbodiimide chemistry with mCP enabled the immobilization of HA to defined regions, creating surfaces suitable for in vitro applications. Both colon cancer cells and breast cancer cells implicitly interacted with the HA micropatterned surfaces. Cancer cell adhesion occurred within 24 hours with proliferation by 48 hours. Using HA micropatterned surfaces, we demonstrated that cancer cell adhesion occurs through the HA receptor CD44. Furthermore, HA patterned surfaces were compatible with scanning electron microscopy (SEM) and allowed high resolution imaging of cancer cell adhesive protrusions and spreading on HA patterns to analyze cancer cell motility on exogenous HA.

A novel approach that allows the high-resolution analysis of cancer cell interactions with exogenous hyaluronic acid (HA) is described. Patterned surfaces are fabricated by combining carbodiimide chemistry and microcontact printing.

Micropatterned Yüzeyler Kanser Hücreleri ile Hyaluronik Asit Etkileşimleri Eğitim

Cancer invasion and progression involves a motile cell phenotype, which is under complex regulation by growth factors/cytokines and extracellular matrix ...

Biyomühendislik

Endothelialized Microfluidics for Studying Microvascular Interactions in Hematologic Diseases

Advances in microfabrication techniques have enabled the production of inexpensive and reproducible microfluidic systems for conducting biological and biochemical experiments at the micro- and nanoscales 1,2. In addition, microfluidics have also been specifically used to quantitatively analyze hematologic and microvascular processes, because of their ability to easily control the dynamic fluidic environment and biological conditions3-6. As such, researchers have more recently used microfluidic systems to study blood cell deformability, blood cell aggregation, microvascular blood flow, and blood cell-endothelial cell interactions6-13.However, these microfluidic systems either did not include cultured endothelial cells or were larger than the sizescale relevant to microvascular pathologic processes. A microfluidic platform with cultured endothelial cells that accurately recapitulates the cellular, physical, and hemodynamic environment of the microcirculation is needed to further our understanding of the underlying biophysical pathophysiology of hematologic diseases that involve the microvasculature.
Here, we report a method to create an "endothelialized" in vitro model of the microvasculature, using a simple, single mask microfabrication process in conjunction with standard endothelial cell culture techniques, to study pathologic biophysical microvascular interactions that occur in hematologic disease. This "microvasculature-on-a-chip" provides the researcher with a robust assay that tightly controls biological as well as biophysical conditions and is operated using a standard syringe pump and brightfield/fluorescence microscopy. Parameters such as microcirculatory hemodynamic conditions, endothelial cell type, blood cell type(s) and concentration(s), drug/inhibitory concentration etc., can all be easily controlled. As such, our microsystem provides a method to quantitatively investigate disease processes in which microvascular flow is impaired due to alterations in cell adhesion, aggregation, and deformability, a capability unavailable with existing assays.

A method to culture an endothelial cell monolayer throughout the entire inner 3D surface of a microfluidic device with microvascular-sized channels (&lt;30 &mu;m) is described. This in vitro microvasculature model enables the study of biophysical interactions between blood cells, endothelial cells, and soluble factors in hematologic diseases.

Hematolojik Hastalıklarında Mikrovasküler Etkileşimleri Öğrenmenin Endothelialized Mikroakiskan

Advances in  microfabrication techniques have enabled the production of inexpensive and  reproducible microfluidic systems for conducting biological and ...

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, currently available routine methods require processing steps and alter sample integrity. Raman spectroscopy is a fast method that enables the measurement of biological samples without the need for further processing steps. This laser-based technology detects the inelastic scattering of monochromatic light.6 As every chemical vibration is assigned to a specific Raman band (wavenumber in cm-1), each biological sample features a typical spectral pattern due to their inherent biochemical composition.7-9 Within Raman spectra, the peak intensities correlate with the amount of the present molecular bonds.1 Similarities and differences of the spectral data sets can be detected by employing a multivariate analysis (e.g. principal component analysis (PCA)).10
Here, we perform Raman spectroscopy of living cells and native tissues. Cells are either seeded on glass bottom dishes or kept in suspension under normal cell culture conditions (37 &deg;C, 5% CO2) before measurement. Native tissues are dissected and stored in phosphate buffered saline (PBS) at 4 &deg;C prior measurements. Depending on our experimental set up, we then either focused on the cell nucleus or extracellular matrix (ECM) proteins such as elastin and collagen. For all studies, a minimum of 30 cells or 30 random points of interest within the ECM are measured. Data processing steps included background subtraction and normalization.

Raman spectroscopy is a suitable technique for the non-contact, label-free analysis of living cells, tissue-engineered constructs and native tissues. Source-specific spectral fingerprints can be generated and analyzed using multivariate analysis.

Raman Spektroskopisi kullanarak Hücreler ve Ekstrasellüler Matriks Temassız, Etiket ücretsiz izleme

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Correlative Microscopy for 3D Structural Analysis of Dynamic Interactions

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, direct visualization of individual viral complexes in their host cellular environment with cryoET is challenging2, due to the infrequent and dynamic nature of viral entry, particularly in the case of HIV-1. While time-lapse live-cell imaging has yielded a great deal of information about many aspects of the life cycle of HIV-13-7, the resolution afforded by live-cell microscopy is limited (~ 200 nm). Our work was aimed at developing a correlation method that permits direct visualization of early events of HIV-1 infection by combining live-cell fluorescent light microscopy, cryo-fluorescent microscopy, and cryoET. In this manner, live-cell and cryo-fluorescent signals can be used to accurately guide the sampling in cryoET. Furthermore, structural information obtained from cryoET can be complemented with the dynamic functional data gained through live-cell imaging of fluorescent labeled target.
In this video article, we provide detailed methods and protocols for structural investigation of HIV-1 and host-cell interactions using 3D correlative high-speed live-cell imaging and high-resolution cryoET structural analysis. HeLa cells infected with HIV-1 particles were characterized first by confocal live-cell microscopy, and the region containing the same viral particle was then analyzed by cryo-electron tomography for 3D structural details. The correlation between two sets of imaging data, optical imaging and electron imaging, was achieved using a home-built cryo-fluorescence light microscopy stage. The approach detailed here will be valuable, not only for study of virus-host cell interactions, but also for broader applications in cell biology, such as cell signaling, membrane receptor trafficking, and many other dynamic cellular processes.

We describe a correlative microscopy method that combines high-speed 3D live-cell fluorescent light microscopy and high-resolution cryo-electron tomography. We demonstrate the capability of the correlative method by imaging dynamic, small HIV-1 particles interacting with host HeLa cells.

Dinamik Etkileşimler 3D Yapısal Analiz için karşılıklı Mikroskopi

Cryo-electron tomography (cryoET) allows 3D visualization of cellular structures at molecular resolution in a close-to-physiological state1. However, ...

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced birth defects and many later studies afterwards proved the opposite. Today several harmful xenobiotics like nicotine, heroin, methadone or drugs as well as environmental pollutants were described to overcome this barrier. With the growing use of nanotechnology, the placenta is likely to come into contact with novel nanoparticles either accidentally through exposure or intentionally in the case of potential nanomedical applications. Data from animal experiments cannot be extrapolated to humans because the placenta is the most species-specific mammalian organ 1. Therefore, the ex vivo dual recirculating human placental perfusion, developed by Panigel et al. in 1967 2 and continuously modified by Schneider et al. in 1972 3, can serve as an excellent model to study the transfer of xenobiotics or particles.
Here, we focus on the ex vivo dual recirculating human placental perfusion protocol and its further development to acquire reproducible results.
The placentae were obtained after informed consent of the mothers from uncomplicated term pregnancies undergoing caesarean delivery. The fetal and maternal vessels of an intact cotyledon were cannulated and perfused at least for five hours. As a model particle fluorescently labelled polystyrene particles with sizes of 80 and 500 nm in diameter were added to the maternal circuit. The 80 nm particles were able to cross the placental barrier and provide a perfect example for a substance which is transferred across the placenta to the fetus while the 500 nm particles were retained in the placental tissue or maternal circuit. The ex vivo human placental perfusion model is one of few models providing reliable information about the transport behavior of xenobiotics at an important tissue barrier which delivers predictive and clinical relevant data.

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

The ex vivo dual recirculating human placental perfusion model can be used to investigate the transfer of xenobiotics and nanoparticles across the human placenta. In this video protocol we describe the equipment and techniques required for a successful execution of a placenta perfusion.

Plasenta karşısında Ksenobiyotik ve Nanomalzemelerin Ulaştırma Hızı belirlenmesi kullanarak<em&gt; Ex vivo</em&gt; İnsan Plasental Perfüzyon Modeli

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced ...

Use of Label-free Optical Biosensors to Detect Modulation of Potassium Channels by G-protein Coupled Receptors

Ion channels control the electrical properties of neurons and other excitable cell types by selectively allowing ions to flow through the plasma membrane1. To regulate neuronal excitability, the biophysical properties of ion channels are modified by signaling proteins and molecules, which often bind to the channels themselves to form a heteromeric channel complex2,3. Traditional assays examining the interaction between channels and regulatory proteins require exogenous labels that can potentially alter the protein&#39;s behavior and decrease the physiological relevance of the target, while providing little information on the time course of interactions in living cells. Optical biosensors, such as the X-BODY Biosciences BIND Scanner system, use a novel label-free technology, resonance wavelength grating (RWG) optical biosensors, to detect changes in resonant reflected light near the biosensor. This assay allows the detection of the relative change in mass within the bottom portion of living cells adherent to the biosensor surface resulting from ligand induced changes in cell adhesion and spreading, toxicity, proliferation, and changes in protein-protein interactions near the plasma membrane. RWG optical biosensors have been used to detect changes in mass near the plasma membrane of cells following activation of G protein-coupled receptors (GPCRs), receptor tyrosine kinases, and other cell surface receptors. Ligand-induced changes in ion channel-protein interactions can also be studied using this assay. In this paper, we will describe the experimental procedure used to detect the modulation of Slack-B sodium-activated potassium (KNa) channels by GPCRs.

Optical biosensor techniques can detect changes in mass near the plasma membrane in living cells and allow one to follow cellular responses in both individual cells and populations of cells. This protocol will describe detection of the modulation of potassium channels by G-protein coupled receptors in intact cells using this approach.

G-protein bağlı reseptörler ile Potasyum kanallarının modülasyonunu Algılama Label içermeyen optik Biyosensör kullanımı

Ion channels control the electrical properties of neurons and other excitable cell types by selectively allowing ions to flow through the plasma ...

A Microfluidic-based Electrochemical Biochip for Label-free DNA Hybridization Analysis

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration of pre-processing steps. Utilizing these devices towards the analysis of DNA hybridization events is important because it offers a technology for real time assessment of biomarkers at the point-of-care for various diseases. However, when the device footprint decreases the dominance of various physical phenomena increases. These phenomena influence the fabrication precision and operation reliability of the device. Therefore, there is a great need to accurately fabricate and operate these devices in a reproducible manner in order to improve the overall performance. Here, we describe the protocols and the methods used for the fabrication and the operation of a microfluidic-based electrochemical biochip for accurate analysis of DNA hybridization events. The biochip is composed of two parts: a microfluidic chip with three parallel micro-channels made of polydimethylsiloxane (PDMS), and a 3 x 3 arrayed electrochemical micro-chip. The DNA hybridization events are detected using electrochemical impedance spectroscopy (EIS) analysis. The EIS analysis enables monitoring variations of the properties of the electrochemical system that are dominant at these length scales. With the ability to monitor changes of both charge transfer and diffusional resistance with the biosensor, we demonstrate the selectivity to complementary ssDNA targets, a calculated detection limit of 3.8 nM, and a 13% cross-reactivity with other non-complementary ssDNA following 20 min&#160;of incubation. This methodology can improve the performance of miniaturized devices by elucidating on the behavior of diffusion at the micro-scale regime and by enabling the study of DNA hybridization events.

We present a microfluidic-based electrochemical biochip for DNA hybridization detection. Following ssDNA probe functionalization, the specificity, sensitivity, and detection limit are studied with complementary and non-complementary ssDNA targets. Results illustrate the influence of the DNA hybridization events on the electrochemical system, with a detection limit of 3.8 nM.

Etiket-serbest DNA Hibridizasyon Analiz için mikroakışkan tabanlı Elektrokimyasal Biochip

Miniaturization of analytical benchtop procedures into the micro-scale provides significant advantages in regards to reaction time, cost, and integration ...

A Label-free Technique for the Spatio-temporal Imaging of Single Cell Secretions

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning of such signaling can lead to many disorders. To understand cell-to-cell signaling, it is essential to study the spatial and temporal nature of the secreted molecules from the cell without disturbing the local environment. Various assays have been developed to study protein secretion, however, these methods are typically based on fluorescent probes which disrupt the relevant signaling pathways. To overcome this limitation, a label-free technique is required.
In this paper, we describe the fabrication and application of a label-free localized surface plasmon resonance imaging (LSPRi) technology capable of detecting protein secretions from a single cell. The plasmonic nanostructures are lithographically patterned onto a standard glass coverslip and can be excited using visible light on commercially available light microscopes. Only a small fraction of the coverslip is covered by the nanostructures and hence this technique is well suited for combining common techniques such as fluorescence and bright-field imaging.
A multidisciplinary approach is used in this protocol which incorporates sensor nanofabrication and subsequent biofunctionalization, binding kinetics characterization of ligand and analyte, the integration of the chip and live cells, and the analysis of the measured signal. As a whole, this technology enables a general label-free approach towards mapping cellular secretions and correlating them with the responses of nearby cells.

Inter-cellular communication is critical for controlling various physiological activities within and outside the cell. This paper describes a protocol for measuring the spatio-temporal nature of single cell secretions. To achieve this, a multidisciplinary approach is used which integrates label-free nanoplasmonic sensing with live cell imaging.

Tek Hücre Salgıları uzay-zamansal Görüntüleme için bir etiket içermeyen Tekniği

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning ...

Label-free Single Molecule Detection Using Microtoroid Optical Resonators

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental studies on the behavior of molecules. Single molecule detection techniques commonly utilize labels such as fluorescent tags or quantum dots, however, labels are not always available, increase cost and complexity, and can perturb the events being studied. Optical resonators have emerged as a promising means to detect single molecules without the use of labels. Currently the smallest particle detected by a non-plasmonically-enhanced bare optical resonator system in solution is a 25 nm polystyrene sphere1. We have developed a technique known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that can surpass this limit and achieve label-free single molecule detection in aqueous solution2. As signal strength scales with particle volume, our work represents a &#62; 100x improvement in the signal to noise ratio (SNR) over the current state of the art. Here the procedures behind FLOWER are presented in an effort to increase its usage in the field.

We have developed a label-free biosensing system based on optical resonator technology known as Frequency Locking Optical Whispering Evanescent Resonator (FLOWER) that is capable of detecting single molecules in solution. Here the procedures behind this work are described and presented.

Microtoroid Optik Rezonatörler Kullanarak Etiket serbest Tek Molekül Algılama

Detecting small concentrations of molecules down to the single molecule limit has impact on areas such as early detection of disease, and fundamental ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions. While these studies have been informative about general cell signaling mechanisms, they neglect important cellular cues received from the structural and mechanical properties of the local microenvironment and extracellular matrix (ECM). To understand how cells interact within a physiological ECM, it is important to study them in the context of 3 dimensional assays. Cell migration, cell differentiation, and cell proliferation are only a few processes that have been shown to be impacted by local changes in the mechanical properties of a 3-dimensional ECM. Collagen I, a core fibrillar component of the ECM, is more than a simple structural element of a tissue. Under normal conditions, mechanical cues from the collagen network direct morphogenesis and maintain cellular structures. In diseased microenvironments, such as the tumor microenvironment, the collagen network is often dramatically remodeled, demonstrating altered composition, enhanced deposition and altered fiber organization. In breast cancer, the degree of fiber alignment is important, as an increase in aligned fibers perpendicular to the tumor boundary has been correlated to poorer patient prognosis1. Aligned collagen matrices result in increased dissemination of tumor cells via persistent migration2,3. The following is a simple protocol for embedding cells within a 3-dimensional, fibrillar collagen hydrogel. This protocol is readily adaptable to many platforms, and can reproducibly generate both aligned and random collagen matrices for investigation of cell migration, cell division, and other cellular processes in a tunable, 3-dimensional, physiological microenvironment.

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Collagen is a core component of the ECM, and provides essential cues for several cellular processes ranging from migration to differentiation and proliferation. Provided here is a protocol for embedding cells within 3D collagen hydrogels, and a more advanced technique for generating randomized or aligned collagen matrices using PDMS microchannels.

3D Etkileşimleri Çalışmaları 3D Kollajen jeller ve Mikrokanallarda Hazırlanması<em&gt; İn Vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...