Yazarlar, Ulusal Bilim Vakfı aracılığıyla Malzeme Araştırma Bilimi ve Mühendisliği Merkezi parçası olarak finanse, Johns Hopkins, yüzey analizi laboratuvarı kullanımı kabul etmiş sayılırsınız. LED IGERT stajyer ve Ulusal Bilim Vakfı Lisansüstü Üyesi. Bu araştırma, kısmen, Ulusal Sağlık Enstitüsü, hibe U54CA143868 tarafından desteklenen oldu.

1. Micropatterned Damga Fabrikasyon Standart Fotolitografi <ol><li> Etanol ile yeni bir silikon yonga hava akışı ile durulayın ve kurulayın. Gofret ele almak ve tüm süreç boyunca yüzey hasarları önlemek için forseps kullanın. </li><li> Lak spin ve SU-2025 negatif fotorezist gofret yüzeyini kaplayan gofret aktarın. Paslanmaz çeliğin en az% 80 gofret örtün. 3000rpm 30 saniye takip 600rpm az 10 saniye süreyle Spin kat. Fotorezist fotosensitivite nedeniyle, bu noktadan itibaren oda ışıkları kapatın. </li><li> 95 ° C&#39;de 3 dakika boyunca &quot;yumuşak fırında&quot; sıcak levha kaplamalı silikon gofret fotorezist aktarın. Sıcak levha çıkar ve 1 dakika soğumasını bekleyin. </li><li> Fotorezist kaplı silikon gofret üstüne istenilen desen prefabriklerin maske koyun ve 20 saniye için ultraviyole (UV) ışınları (350-450 nm) maruz bırakmayın. </li><li> Sıcak levha &quot;sabit fırında&quot; için 110 ° C 6 dakika Transfer silikon gofret. </li><li> Işıkları açın ve sıcak plaka gofret kaldırmak. Farklı desenleri bu noktada görünür olmalıdır. </li><li> SU-8 fotorezist geliştirici ile silikon gofret dikkatlice yıkayın. 3 geliştirici çözümü ile çalkalama sonra, etanol ile yıkayın. Herhangi bir beyaz kalıntı varsa, paslanmaz çeliğin geliştirici çözümü ile durulayın tekrar, ya da sadece batığın gofret geliştirici çözüm ve 2 dakika süreyle yıkayın etanol ile tekrar devam edebilir. Su ve kuru hava ile yıkayın. </li><li> Mix polidimetilsiloksan (PDMS) 10:1 ağırlık oranı elastomer çözüm ve sertleştirici. Hava kabarcıklarını çıkarmak için 5 dakika için 900 RPM santrifüjleyin. </li><li> Place Petri kabındaki gofret desenli PDMS ve silikon yonga üzerine dökün. Birkaç dakika için mevcut kabarcıkları, desicator yer ve vakum varsa kabarcıkları kayboluncaya kadar. </li><li> Tamamlayıcı bir elastomerik damgası oluşturmak için oda sıcaklığında (RT) bir gecede kurtulun. PDMS tamamen 60 ° C&#39;de 30 dakika fırında, yerde 12 saat, sonra tedavi değil ise. </li><li> Dikkatle silikon gofret PDMS çıkarın. Istediğiniz boyuta damga kesmek için bıçak kenar kullanın. 15 dakika boyunca etanol içinde sonikasyon. Gofret yeni elastomerik pullar oluşturmak için birden fazla kez kullanılabilir. </li></ol> 2. HA Micropatterning <ol><li> Plazma temiz bir cam, 5 dakika boyunca slaytlar. 5 dakika boyunca oda ve vakum tüm slaytlara yerleştirin. Sonra odasına girmek için düşük oksijen akışına izin verir. 5 dakika boyunca plazma temizleyici açın. Plazma temizleyici ve forseps kullanarak bir Petri kabındaki yerden çıkarın. </li><li> Plazma temizlik sırasında, 15 dakika boyunca etanol PDMS pulları sonikasyon. </li><li> 15 ml santrifüj tüpüne% 95 v / v etanol 3-aminopropyltrimethoxysilane (APTMS) taze% 3 v / v çözüm hazırlayın. Tepki silanolle formu RT az 5 dakika izin ver. </li><li> Yeri PDMS damga dönmeye coater Chuck desen ve kapak yüzeyi desenli APTMS çözüm. 30 saniye için 3500 Spincoat. PDMS damga, sadece iki tarafın damga yüzeyine dokunmayın. </li><li> Desenli yan bir ucunu aşağı bakacak şekilde set mühür ve 1 dakika için cam yüzeyi ile temas halinde tamamen yavaşça PDMS basarak kayma: Transfer plazma APTMS çözüm cam yüzeyler temizlenmelidir. </li><li> PDMS hafifçe damga çıkarın ve buzlu cam slayt RT 30 dakika boyunca inkübe izin. Desenli yüzeyler etanol ve kuru hava ile durulayın. Sonikasyon PDMS aşırı APTMS kaldırmak için 15 dakika boyunca damgası. </li><li> 115 1 saat fırında veya sıcak plaka üzerinde Isı yüzeyler ° C Etanol ile çalkalayın ve kuru hava ile. </li><li> [Metoksi (polyethyleneoxy) propil] toluende trimethoxysilane - taze polietilen glikol (PEG) silan% 20 v / v 2 çözüm hazırlayın. Bu desen çevreleyen yapışkan olmayan bir bölge olarak hizmet verecek. </li><li> 75 az 45 dakika boyunca bir bardak PEG-silan çözüm Petri kabı ve inkübe Transfer buzlu cam slayt ° C sıcak bir plaka. Toluen, su ve hava ile kuru ile durulayın. </li><li> Biyolojik güvenlik kabini UV antiseptik ışınlama kullanarak 1 saat süreyle sterilize edin. Biyolojik güvenlik kabini kısırlık korumak için bu noktadan devam edin. </li><li> Sulu steril HA çözeltisi hazırlayın. 1-Etil-3-(3-Gaz sistemlerinde) carbodiimide (EDC), 10mM N-hydroxysuccinimide, 5mM 50μg / ml flöresein etiketli HA </li><li> Steril koşullar HA çözüm buzlu cam yüzeye uygulayın ve ışıktan korunmalıdır. Desenli yüzeylerde 16-24 saat boyunca rahatsız olmalıdır. </li><li> HA kapalı aspire çözüm, bol suyla yıkayın fosfat tamponlu salin (PBS), ve 1 saat süreyle PBS (BSA)% 1 sığır serum albümini ile yüzeyini kaplayacak. Yüzeyi hücre kültürü için hazırdır. </li></ol> 3. HA Micropatterned Yüzeylerde Hücre Kültürü <ol><li> Expand MDA-MB-231 üreticinin talimatlarına göre insan meme kanseri hücreleri ve LS174T kolorektal karsinom hücreleri. </li><li> 0.4 ve 1x10 arasındaki yoğunlukları ile kanser hücrelerinin Tohum tek hücre süspansiyonları <sup&gt; 6 kanser hücrelerinin 18,75 cm 2 cam yüzey alanı başına ve HA üzerine yüzeyler immobilize. % 5 CO 2 ile korunur ortamlarda nemlendirilmiş inkübatör (37 ° C) inkübe edin. Hücre adezyon 24 saat içinde ortaya çıkar ve ters ışık mikroskobu kullanılarak görülebilir </li><li> Hücre kültürü yüzeyleri standart inkübatör koşullarında 5 gün kadar muhafaza edilebilir. Her gün medya değiştirin. Hücre morfolojisi ve büyüme ters ışık mikroskobu kullanılarak görülebilir. Ek hücre deneyleri HA yüzeye yanıtları analiz etmek için uygulanabilir. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar: Kovalent APTMS buzlu cam slaytlara HA hareketsiz kullanılan carbodiimide kimya Şekil 1A gösterilmiştir. EDC HA karboksil grupları ile reaksiyona girer amin-reaktif ara oluşturmak için sıfır uzunlukta bir çapraz bağlanma ajandır. Bu ara hidroliz duyarlı olarak, NHS carbodiimide reaksiyon verimi artırmak için eklenir. HA çözüm APTMS micropatterns, HA ATPMS, orta ve primer amin arasında istikrarlı bir amid bağı formları ile etkileşim. HA desenli yüzeyinin bir örnek gösterilmiştir (Şekil 1B-C) bir floresan mikroskop ve bir ImageJ floresan analizi kullanarak HA desenli immobilizasyon göstermek görüntülendi. HA micropatterned yüzeyler expgenous HA ile kanser hücre etkileşimleri çalışma sağlar. Her ikisi de MDA-MB-231 insan meme ve LS174t insan kolon kanseri hücre dizilerinde tercihen HA micropatterned bölgeleri (Şekil 2) için uygun. Taramalı elektron mikroskobu kullanılarak yüksek çözünürlüklü görüntüleme HA hareketsiz yüzeyler (Şekil 3) ile kültür hücreleri etkileşimlerini analiz etmek için kullanılabilir. <img src="/files/ftp_upload/2413/2413fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1 HA micropatterned yüzeyler anlatan HA fonksiyonel yüzeyler geliştirme (A) Şematik, (B) floresein floresan (yeşil) etiketli HA micropatterned yüzey. (C) 3D piksel dağılım haritası ayrık HA desen gösteren ImageJ yazılımı kullanarak. Ölçek çubuğu = 100μm. Elsevier izin 9 - Modifiye. <img src="/files/ftp_upload/2413/2413fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2 HA micropatterned yüzeylerde Kanser hücre adezyon. Kolon (A) ve meme Her ikisi de (B) karsinom tercihen 24 saat kültür ile HA yamaları üzerine yapıştırılır. Elsevier izin 9 - Modifiye. <img src="/files/ftp_upload/2413/2413fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3 HA ile Kanser hücrelerinin etkileşimi. (A), kolon kanseri hücrelerinin HA yüzeylerde düşük büyütme (solda) ve yüksek büyütmede (sağ, sol tarafta kareler) gösterilen (A) kültürlü elektron mikroskobu görüntüleri, meme kanseri hücrelerinin Tarama ve (B) gösterilen HA yüzeylerinin kültüre düşük büyütme (solda) ve yüksek büyütmede (sağ, sol tarafta kareler).

<ol>
	<li>Toole, B. P., Wight, T. N., Tammi, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronan-cell+interactions+in+cancer+and+vascular+disease.">Hyaluronan-cell interactions in cancer and vascular disease.</a> Journal of Biological Chemistry. 277, 4593-4596 (2002).</li><li>Hamilton, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hyaluronan+Receptors+CD44+and+Rhamm+(CD168)+Form+Complexes+with+ERK1,2+That+Sustain+High+Basal+Motility+in+Breast+Cancer+Cells.">The Hyaluronan Receptors CD44 and Rhamm (CD168) Form Complexes with ERK1,2 That Sustain High Basal Motility in Breast Cancer Cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 282, 16667-16680 (2007).</li><li>G&#246;tte, M., Yip, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparanase,+Hyaluronan,+and+CD44+in+Cancers:+A+Breast+Carcinoma+Perspective.">Heparanase, Hyaluronan, and CD44 in Cancers: A Breast Carcinoma Perspective.</a> Cancer Research. 66, 10233-10237 (2006).</li><li>Lord, M. S., Pasqui, D., Barbucci, R., Milthorpe, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+adsorption+on+derivatives+of+hyaluronic+acid+and+subsequent+cellular+response.">Protein adsorption on derivatives of hyaluronic acid and subsequent cellular response.</a> Journal of Biomedical Materials Research. Part A 91, 635-646 (2009).</li><li>Barbucci, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modification+of+hyaluronic+acid+by+sulphate+groups+insertion+to+obtain+a+heparin-like+molecule.">Modification of hyaluronic acid by sulphate groups insertion to obtain a heparin-like molecule.</a> Gazz. Chim. Ital. 125, 169-180 (1995).</li><li>Morra, M., Cassinelli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-fouling+properties+of+polysaccharide-coated+surfaces.">Non-fouling properties of polysaccharide-coated surfaces.</a> Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition. 10, 1107-1124 (1999).</li><li>Khademhosseini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Layer-by-layer+deposition+of+hyaluronic+acid+and+poly-L-lysine+for+patterned+cell+co-cultures.">Layer-by-layer deposition of hyaluronic acid and poly-L-lysine for patterned cell co-cultures.</a> Biomaterials. 25, 3583-3592 (2004).</li><li>Ibrahim, S., Joddar, B., Craps, M., Ramamurthi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+surface-tethered+model+to+assess+size-specific+effects+of+hyaluronan+(HA)+on+endothelial+cells.">A surface-tethered model to assess size-specific effects of hyaluronan (HA) on endothelial cells.</a> Biomaterials. 28, 825-835 (2007).</li><li>Dickinson, L. E., Ho, C. C., Wang, G. M., Stebe, K. J., Gerecht, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+surfaces+for+high-resolution+analysis+of+cancer+cell+interactions+on+exogenous+hyaluronic+acid.">Functional surfaces for high-resolution analysis of cancer cell interactions on exogenous hyaluronic acid.</a> Biomaterials. 31, 5472-5478 (2010).</li><li>Gao, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronan+oligosaccharides+promote+excisional+wound+healing+through+enhanced+angiogenesis.">Hyaluronan oligosaccharides promote excisional wound healing through enhanced angiogenesis.</a> Matrix Biology. 29, 107-116 (2010).</li><li>Slevin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronan-mediated+angiogenesis+in+vascular+disease:+Uncovering+RHAMM+and+CD44+receptor+signaling+pathways.">Hyaluronan-mediated angiogenesis in vascular disease: Uncovering RHAMM and CD44 receptor signaling pathways.</a> Matrix Biology. 26, 58-68 (2007).</li></ol>

Izni ile çoğaltılabilir video şematik figür; Copyright Wiley-VCH Verlag GmbH &amp; Co. KGaA. Dickinson LE, Kusuma S, Gerecht S. biyomateryalleri kullanılarak embriyonik kök hücrelerinin farklılaşması niş Yeniden. Macromol. Biosci. 2010; Oct 21. [Epub ahead of print].

Ekzojen HA HA micropatterning yöntemi ile hücre etkileşimleri çalışma sağlar. HA 1 kanserinin ilerlemesini önemli bir rol oynadığı bilinmektedir ancak iki boyutlu HA desenli yüzeyler üzerinde kanser hücrelerinin etkileşimi araştıran sınırlı sayıda çalışma yapılmış ve yapılmaktadır . Ekzojen HA micropatterns denetlenebilir bir çalışmada, kanser hücre adezyon, büyüme, göç ve yüksek çözünürlüklü görselleştirme sağlar ve kanser daha fazla temellerini aydınlatmak olabilir. Carbodiimide kimya ve microcontact baskı birleştirerek, kanser hücre etkileşimleri çalışmak için farklı HA desenleri ile yüzeyler geliştirdiler. Bu yöntem sürekli desenli yüzeyler de dahil olmak üzere hücre kültürü ve analiz teknikleri ile uyumlu izin verir, ama immunofluorescent boyama ile sınırlı değil, taramalı elektron mikroskobu, inhibisyon, göç, vb. Ayrıca, fotolitografik teknikleri, özel uygulamalar için immobilizasyon HA kontrol, istenen herhangi bir desen kolay mikroimalat izin verir. Örneğin, doğrusal bir dizi doğrusal çizgili PDMS pulları imalatı HA hareketsiz ve desenli HA boyunca hücre göçü analiz yararlı olabilir. HA ile kanser hücre etkileşimleri aydınlatmak için öncelikle bu yöntemi kullanılmıştır olmasına rağmen, bu tekniğin diğer hücre tipleri ile etkileşimleri çalışmak için geçerlidir. Ayrıca, bu yöntem HA moleküllerin geniş bir yelpazede hareketsiz kullanılabilir. Immobilize HA 800 kDa moleküler ağırlığı ile floresan etiketlenir. Ancak, HA, 2000 yılından itibaren boyut aralıkları - 25000 yinelenen disakkarit üniteleri ve hücresel yanıt HA molekül ağırlığı 10-11 bağımlı olarak kanıtlanmıştır . Bu protokol, bu nedenle, ekzojen HA hücre yanıtını araştırmak için moleküler ağırlıkları değişen HA hareketsiz uygulanabilir.

<table><tbody><tr><td>SU-2025 photoresist</td><td>MicroChem Corp.</td><td>Y111069</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 developer</td><td>MicroChem Corp.</td><td>Y020100</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-aminopropyltrimethoxysilane (APTMS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>281778</td><td></td></tr><tr><td>2- [methoxy(polyethyleneoxy) propyl] trimethoxysilane (Peg-silane)</td><td>Gelest Inc.</td><td>SIM6492.7</td><td></td></tr><tr><td>1-Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>22980</td><td></td></tr><tr><td>N-hydroxysuccinimide (NHS)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>24500</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescein labeled hyaluronic acid (FL-HA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1177</td><td>Reconstitute with 10ml of DI water </td></tr><tr><td>MDA-MB-231 breast carcinoma cells</td><td>ATCC</td><td>HTB-26</td><td></td></tr><tr><td>LS174t colon carcinoma cells</td><td>ATCC</td><td>Cl-188</td><td></td></tr></tbody></table>

micropatterned surfaces to study hyaluronic acid interactions with cancer cells

Kanser işgali ve ilerlemesi tümör mikroçevresinin içinde büyüme faktörleri / sitokinler ve hücre dışı matriks (ECM) bileşenleri karmaşık düzenleme altında bir hareketli hücre fenotipi içerir. Hyaluronik asit (HA), artırılması işgali, büyüme ve anjiyogenez 1 tümör ilerlemesini kolaylaştırmak için bilinen bir stromal ECM bileşeni . Etkileşim HA hücre yüzey reseptörü CD44, tümör hücre büyümesini, hayatta kalma ve göç teşvik olaylar böylece metastatik yayılmasını 2-3 artan sinyalizasyon neden olur. HA, D-glukuronik asit ve DN-asetilglukozamin birimleri tekrar oluşan bir anyonik, nonsulfated glikozaminoglikan. Tekrarlayan disakkarit ünitelerinde karboksil ve hidroksil grupları, varlığı nedeniyle doğal HA büyük ölçüde hidrofilik ve sülfat photoreative immobilizasyon 4-5 grupları tanıtmak kimyasal değişiklikler için uygun. Önceki çalışmalar yüzeyler üzerine HA immobilizations içeren 6-7 yüzeylerinden hücre yapışmasını kontrol etmek HA bioresistant davranış ve sülfatlanmış türevi kullanmaktadır. Tercihen bu çalışmalar hücre adezyon-HA olmayan desenli bölgelerde oluşur. Ekzojen HA ile hücresel etkileşimleri analiz etmek, kontrol edilebilir bir çalışma ve HA ile kanser hücre etkileşimleri yüksek çözünürlüklü görselleştirme sağlayan desenli Fonksiyonlu yüzeyler geliştirdiler. Biz cam yüzeyler üzerinde HA ayrık desenli bölgeleri tanımlamak için kullanılan microcontact baskı (UCP). HA hareketsiz carbodiimide bağlayan kimya uygulanan &quot;bağlama&quot; yaklaşımı 8 kullanıldı. Cam yüzeyler microcontact aminosilane ile basıldı ve EDC ve NHS desenli dizileri HA immobilizasyon sağlamak için optimize edilmiş oranları HA çözüm tepki gösterdi. Carbodiimide kimya MCP ile ekleme in vitro uygulamaları için uygun yüzeyler oluşturmak, tanımlanmış bölgelere HA immobilizasyon etkin. Her iki kolon kanseri hücreleri ve meme kanseri hücrelerinin dolaylı HA micropatterned yüzeyler ile etkileşim. Kanser hücre adezyon proliferasyonu ile 24 saat içinde 48 saat oluştu. HA micropatterned yüzeyler kullanarak, kanser hücre adezyon HA reseptörü CD44 üzerinden gerçekleşir gösterdi. Ayrıca, HA desenli yüzeyler, tarama elektron mikroskobu (SEM) ve kanser hücresi yapışkan çıkıntılar izin verilen yüksek çözünürlüklü görüntüleme ve kanser hücre hareketi analiz etmek için ekzojen HA HA desen yayılan ile uyumlu idi.

Watch this Scientific Journal Video about Micropatterned Surfaces to Study Hyaluronic Acid Interactions with Cancer Cells at JoVE.com

Micropatterned Surfaces to Study Hyaluronic Acid Interactions with Cancer Cells

Eksojen hyaluronik asit (HA) ile yüksek çözünürlüklü kanser hücre etkileşimleri analiz olanak sağlayan yeni bir yaklaşım açıklanmıştır. Desenli yüzeyleri carbodiimide kimya ve microcontact baskı birleştirerek imal edilir.

Micropatterned Yüzeyler Kanser Hücreleri ile Hyaluronik Asit Etkileşimleri Eğitim

Cancer invasion and progression involves a motile cell phenotype, which is under complex regulation by growth factors/cytokines and extracellular matrix ...

micropatterned-surfaces-to-study-hyaluronic-acid-interactions-with

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Bioengineering

15.0K Görüntüleme.  Johns Hopkins University. Eksojen hyaluronik asit (HA) ile yüksek çözünürlüklü kanser hücre etkileşimleri analiz olanak sağlayan yeni bir yaklaşım açıklanmıştır. Desenli yüzeyleri carbodiimide kimya ve microcontact baskı birleştirerek imal edilir.

Video: Micropatterned Surfaces to Study Hyaluronic Acid Interactions with Cancer Cells

Improved Visualization and Quantitative Analysis of Drug Effects Using Micropatterned Cells

To date, most HCA (High Content Analysis) studies are carried out with adherent cell lines grown on a homogenous substrate in tissue-culture treated micro-plates. Under these conditions, cells spread and divide in all directions resulting in an inherent variability in cell shape, morphology and behavior. The high cell-to-cell variance of the overall population impedes the success of HCA, especially for drug development. The ability of micropatterns to normalize the shape and internal polarity of every individual cell provides a tremendous opportunity for solving this critical bottleneck 1-2.
To facilitate access and use of the micropatterning technology, CYTOO has developed a range of ready to use micropatterns, available in coverslip and microwell formats. In this video article, we provide detailed protocols of all the procedures from cell seeding on CYTOOchip micropatterns, drug treatment, fixation and staining to automated acquisition, automated image processing and final data analysis. With this example, we illustrate how micropatterns can facilitate cell-based assays. Alterations of the cell cytoskeleton are difficult to quantify in cells cultured on homogenous substrates, but culturing cells on micropatterns results in a reproducible organization of the actin meshwork due to systematic positioning of the cell adhesion contacts in every cell. Such normalization of the intracellular architecture allows quantification of even small effects on the actin cytoskeleton as demonstrated in these set of protocols using blebbistatin, an inhibitor of the actin-myosin interaction.

Adhesive micropatterns that normalize cellular architecture can be used to increase sensitivity in the detection of drug effects, improve reproducibility and simplify automated image acquisition and analysis. Such technology will benefit drug/siRNA screening assays, performed on conventional cell culture supports and consequently suffering from excessive cell-to-cell variability.

İlaç Etkisi Micropatterned Hücreler Geliştirilmiş Görselleştirme ve Kantitatif Analiz

To date, most HCA (High Content Analysis) studies are carried out with adherent cell lines grown on a homogenous substrate in tissue-culture treated ...

Biyomühendislik

Characterization of Cell Membrane Extensions and Studying Their Roles in Cancer Cell Adhesion Dynamics

The cell membrane&#39;s extension repertoire modulates various malignant behaviors of cancer cells, including their adhesive and migratory potentials. The ability to accurately classify and quantify cell extensions and measure the effect on a cell&#39;s adhesive capacity is critical to determining how cell-signaling events impact cancer cell behavior and aggressiveness. Here, we describe the in vitro design and use of a cell extension quantification method in conjunction with an adhesion capacity assay in an established in vitro model for adrenocortical carcinoma (ACC). Specifically, we test the effects of DKK3, a putative tumor suppressor and a pro-differentiation factor, on the membrane extension phenotype of the ACC cell line, SW-13. We propose these assays to provide relatively simple, reliable, and easily interpretable metrics to measures these characteristics under various experimental conditions.

This study demonstrates the utility and ease of quantitative cell membrane extension measurement and its correlation to adhesive capacity of cells. As a representative example, we show here that Dickkopf-related protein 3 (DKK3) promotes increased lobopodia formation and cell adhesiveness in adrenocortical carcinoma cells in vitro.

Hücre zarının uzantıları ve rolleri kanser hücre adezyon dinamikleri eğitim karakterizasyonu

The cell membrane&#39;s extension repertoire modulates various malignant behaviors of cancer cells, including their adhesive and migratory potentials. The ...

Kanser Araştırmaları

Analysis of Cancer Cell Invasion and Anti-metastatic Drug Screening Using Hydrogel Micro-chamber Array (HMCA)-based Plates

Cancer metastasis is known to cause 90% of cancer lethality. Metastasis is a multistage process which initiates with the penetration/invasion of tumor cells into neighboring tissue. Thus, invasion is a crucial step in metastasis, making the invasion process research and development of anti-metastatic drugs, highly significant. To address this demand, there is a need to develop 3D in vitro models which imitate the architecture of solid tumors and their microenvironment most closely to in vivo state on one hand, but at the same time be reproducible, robust and suitable for high yield and high content measurements. Currently, most invasion assays lean on sophisticated microfluidic technologies which are adequate for research but not for high volume drug screening. Other assays using plate-based devices with isolated individual spheroids in each well are material consuming and have low sample size per condition. The goal of the current protocol is to provide a simple and reproducible biomimetic 3D cell-based system for the analysis of invasion capacity in large populations of tumor spheroids. We developed a 3D model for invasion assay based on HMCA imaging plate for the research of tumor invasion and anti-metastatic drug discovery. This device enables the production of numerous uniform spheroids per well (high sample size per condition) surrounded by ECM components, while continuously and simultaneously observing and measuring the spheroids at single-element resolution for medium throughput screening of anti-metastatic drugs. This platform is presented here by the production of HeLa and MCF7 spheroids for exemplifying single cell and collective invasion. We compare the influence of the ECM component hyaluronic acid (HA) on the invasive capacity of collagen surrounding HeLa spheroids. Finally, we introduce Fisetin (invasion inhibitor) to HeLa spheroids and nitric oxide (NO) (invasion activator) to MCF7 spheroids. The results are analyzed by in-house software which enables semi-automatic, simple and fast analysis which facilitates multi-parameter examination.

Analysis of Cancer Cell Invasion and Anti-metastatic Drug Screening Using Hydrogel Micro-chamber Array HMCA-based Plates

A HMCA-based imaging plate is presented for invasion assay performance. This plate facilitates the formation of three-dimensional (3D) tumor spheroids and the measurement of cancer cell invasion into the extracellular matrix (ECM). The invasion assay quantification is achieved by semi-automatic analysis.

Kanser hücre işgali ve Anti-metastatik uyuşturucu kullanarak hidrojel mikro-odası dizi (HMCA) eleme Analizi-tabak dayalı

Cancer metastasis is known to cause 90% of cancer lethality. Metastasis is a multistage process which initiates with the penetration/invasion of tumor ...

Ligand Nano-cluster Arrays in a Supported Lipid Bilayer

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological studies. In the past years, it has become increasingly clear that living cells respond, not only to the biochemical nature of the molecules presented to them but also to the way these molecules are presented. Creating protein micro-patterns is therefore now standard in many biology laboratories; nano-patterns are also more accessible. However, in the context of cell-cell interactions, there is a need to pattern not only proteins but also lipid bilayers. Such dual proteo-lipidic patterning has so far not been easily accessible. We offer a facile technique to create protein nano-dots supported on glass and propose a method to backfill the inter-dot space with a supported lipid bilayer (SLB). From photo-bleaching of tracer fluorescent lipids included in the SLB, we demonstrate that the bilayer exhibits considerable in-plane fluidity. Functionalizing the protein dots with fluorescent groups allows us to image them and to show that they are ordered in a regular hexagonal lattice. The typical dot size is about 800 nm and the spacing demonstrated here is 2 microns. These substrates are expected to serve as useful platforms for cell adhesion, migration and mechano-sensing studies.

We present a protocol to functionalize glass with nanometric protein patches surrounded by a fluid lipid bilayer. These substrates are compatible with advanced optical microscopy and are expected to serve as platform for cell adhesion and migration studies.

Bir Desteklenen lipit iki tabakalı içinde Ligand Nano küme Diziler

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological ...

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of methodological options for addressing molecular interactions in cells have been developed, but most of these methods suffer from being rather indirect and therefore hardly quantitative. On the contrary, a few high-end quantitative approaches were introduced, which however are difficult to extend to high throughput. To combine high throughput capabilities with the possibility to extract quantitative information, we recently developed a new concept for identifying protein-protein interactions (Schwarzenbacher et al., 2008). Here, we describe a detailed protocol for the design and the construction of this system which allows for analyzing interactions between a fluorophore-labeled protein ("prey") and a membrane protein ("bait") in-vivo. Cells are plated on micropatterned surfaces functionalized with antibodies against the bait exoplasmic domain. Bait-prey interactions are assayed via the redistribution of the fluorescent prey. The method is characterized by high sensitivity down to the level of single molecules, the capability to detect weak interactions, and high throughput capability, making it applicable as screening tool.

In-vivo Detection of Protein-protein Interactions on Micro-patterned Surfaces

This video shows experiments with subsequent analysis of protein-protein interactions by the use of micro-patterned surfaces. The approach offers the possibility to detect protein interactions in living cells and combines high throughput capabilities with the possibility to extract quantitative information.

Mikro desenli Yüzeyler, protein-protein etkileşimleri-vivo Algılama

Unraveling the interaction network of molecules in-vivo is key to understanding the mechanisms that regulate cell function and metabolism. A multitude of ...

Biyoloji

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly controlled, high-throughput engineered system for measuring the impact of arrayed biochemical signals on cell differentiation. Recent efforts using cell microarrays have demonstrated their utility for combinatorial studies in which many microenvironmental factors are presented in parallel. However, these efforts have focused primarily on investigating the effects of biochemical cues on cell responses. Here, we present a cell microarray platform with tunable material properties for evaluating both cell differentiation by immunofluorescence and biomechanical cell&#8211;substrate interactions by traction force microscopy. To do so, we have developed two different formats utilizing polyacrylamide hydrogels of varying Young&#39;s modulus fabricated on either microscope slides or glass-bottom Petri dishes. We provide best practices and troubleshooting for the fabrication of microarrays on these hydrogel substrates, the subsequent cell culture on microarrays, and the acquisition of data. This platform is well-suited for use in investigations of biological processes for which both biochemical (e.g., extracellular matrix composition) and biophysical (e.g., substrate stiffness) cues may play significant, intersecting roles.

Cell differentiation is regulated by a host of microenvironmental factors, including both matrix composition and substrate material properties. We describe here a technique utilizing cell microarrays in conjunction with traction force microscopy to evaluate both cell differentiation and biomechanical cell&#8211;substrate interactions as a function of microenvironmental context.

Hücre farklılaşması ve Çekiş Kuvvetleri Korelatif Analizi için Yüksek verim Hücre Mikroarray Platformu

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

Dendrimer-based Uneven Nanopatterns to Locally Control Surface Adhesiveness: A Method to Direct Chondrogenic Differentiation

Cellular adhesion and differentiation is conditioned by the nanoscale disposition of the extracellular matrix (ECM) components, with local concentrations having a major effect. Here we present a method to obtain large-scale uneven nanopatterns of arginine-glycine-aspartic acid (RGD)-functionalized dendrimers that permit the nanoscale control of local RGD surface density. Nanopatterns are formed by surface adsorption of dendrimers from solutions at different initial concentrations and are characterized by water contact angle (CA), X-ray photoelectron spectroscopy (XPS), and scanning probe microscopy techniques such as scanning tunneling microscopy (STM) and atomic force microscopy (AFM). The local surface density of RGD is measured using AFM images by means of probability contour maps of minimum interparticle distances and then correlated with cell adhesion response and differentiation. The nanopatterning method presented here is a simple procedure that can be scaled up in a straightforward manner to large surface areas. It is thus fully compatible with cell culture protocols and can be applied to other ligands that exert concentration-dependent effects on cells.

A method to obtain dendrimer-based uneven nanopatterns that permit the nanoscale control of local arginine-glycine-aspartic acid (RGD) surface density is described and applied for the study of cell adhesion and chondrogenic differentiation.

Düzensiz Nanopatterns Dendrimer tabanlı yerel olarak kumanda yüzeyi Adhesiveness için: Chondrogenic farklılaşma yönlendirmek için bir yöntem

Cellular adhesion and differentiation is conditioned by the nanoscale disposition of the extracellular matrix (ECM) components, with local concentrations ...

Evaluation of the Interplay Between the Complement Protein C1q and Hyaluronic Acid in Promoting Cell Adhesion

It has been increasingly demonstrated that the tumor microenvironment plays an active role in neoplasia growth and metastasis. Through different pathways, tumor cells can efficiently recruit stromal, immune and endothelial cells by secreting stimulatory factors, chemokines and cytokines. In turn, these cells can alter the signaling properties of the microenvironment by releasing growth-promoting signals, metabolites and extracellular matrix components to sustain high proliferation and metastatic competence. In this context, we identify that the complement component C1q, highly expressed locally by a range of human malignant tumors, upon interacting with the extracellular matrix hyaluronic acid, strongly affects the behavior of primary cells isolated from human tumor specimens. Here, we describe&#160;a method to test how C1q bound to hyaluronic acid (HA) impacts tumor cell adhesion, underlying the fact that the biological properties of key components of the extracellular matrix (in this case HA) can be shaped by bioactive signals toward tumor progression.

The complement component C1q is a pro-inflammatory molecule highly expressed in the tissue microenvironment that can interact with the extracellular matrix. Here, we describe&#160;a method to test how C1q bound to hyaluronic acid impacts cell adhesion.

Hücre yapışma teşvik içinde tamamlayıcı protein C1q ve Hyalüronik asit arasındaki Interplay değerlendirilmesi

It has been increasingly demonstrated that the tumor microenvironment plays an active role in neoplasia growth and metastasis. Through different pathways, ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Control of Cell Adhesion using Hydrogel Patterning Techniques for Applications in Traction Force Microscopy

Traction force microscopy (TFM) is the main method used in mechanobiology to measure cell forces. Commonly this is being used for cells adhering to flat soft substrates that deform under cell traction (2D-TFM). TFM relies on the use of linear elastic materials, such as polydimethylsiloxane (PDMS) or polyacrylamide (PA). For 2D-TFM on PA, the difficulty in achieving high throughput results mainly from the large variability of cell shapes and tractions, calling for standardization. We present a protocol to rapidly and efficiently fabricate micropatterned PA hydrogels for 2D-TFM studies. The micropatterns are first created by maskless photolithography using near-UV light where extracellular matrix proteins bind only to the micropatterned regions, while the rest of the surface remains non-adhesive for cells. The micropatterning of extracellular matrix proteins is due to the presence of active aldehyde groups, resulting in adhesive regions of different shapes to accommodate either single cells or groups of cells. For TFM measurements, we use PA hydrogels of different elasticity by varying the amounts of acrylamide and bis-acrylamide and tracking the displacement of embedded fluorescent beads to reconstruct cell traction fields with regularized Fourier Transform Traction Cytometry (FTTC).
To further achieve precise recording of cell forces, we describe the use of a controlled dose of patterned light to release cell tractions in defined regions for single cells or groups of cells. We call this method local UV illumination traction force microscopy (LUVI-TFM). With enzymatic treatment, all cells are detached from the sample simultaneously, whereas with LUVI-TFM traction forces of cells in different regions of the sample can be recorded in sequence. We demonstrate the applicability of this protocol (i) to study cell traction forces as a function of controlled adhesion to the substrate, and (ii) to achieve a greater number of experimental observations from the same sample.

Near-UV lithography and traction force microscopy are combined to measure cellular forces on micropatterned hydrogels. The targeted light-induced release of single cells enables a high number of measurements on the same sample.

Çekiş Kuvveti Mikroskopisinde Uygulamalar için Hidrojel Desenleme Teknikleri Kullanılarak Hücre Yapışıklıklarının Kontrolü

Traction force microscopy (TFM) is the main method used in mechanobiology to measure cell forces. Commonly this is being used for cells adhering to flat ...

Pattern Generation for Micropattern Traction Microscopy

Micropattern traction microscopy allows control of the shape of single cells and cell clusters. Furthermore, the ability to pattern at the micrometer length scale allows the use of these patterned contact zones for the measurement of traction forces, as each micropatterned dot allows for the formation of a single focal adhesion that then deforms the soft, underlying hydrogel. This approach has been used for a wide range of cell types, including endothelial cells, smooth muscle cells, fibroblasts, platelets, and epithelial cells. 
This review describes the evolution of techniques that allow the printing of extracellular matrix proteins onto polyacrylamide hydrogels in a regular array of dots of prespecified size and spacing. As micrometer-scale patterns are difficult to directly print onto soft substrates, patterns are first generated on rigid glass coverslips that are then used to transfer the pattern to the hydrogel during gelation. First, the original microcontact printing approach to generate arrays of small dots on the coverslip is described. A second step that removes most of the pattern to leave islands of small dots is required to control the shapes of cells and cell clusters on such arrays of patterned dots. 
Next, an evolution of this approach that allows for the generation of islands of dots using a single subtractive patterning step is described. This approach is greatly simplified for the user but has the disadvantage of a decreased lifetime for the master mold needed to make the patterns. Finally, the computational approaches that have been developed for the analysis of images of displaced dots and subsequent cell-generated traction fields are described, and updated versions of these analysis packages are provided.

We describe improvements to a standard method for measuring cellular traction forces, based on microcontact printing with a single subtractive patterning step of dot arrays of extracellular matrix proteins on soft hydrogels. This method allows for simpler and more consistent fabrication of island patterns, essential for controlling cell cluster shape.

Mikrodesen Traksiyon Mikroskobu için Desen Oluşturma

Micropattern traction microscopy allows control of the shape of single cells and cell clusters. Furthermore, the ability to pattern at the micrometer ...