Yazarlar hiçbir onayları var.

In Vitro Uygulama Sistemi 1. TTFields - Taban Plakası ve Bulaşık Bakım <ol><li> musluk suyu altında yemekleri ve bulaşık kapaklarını durulayın. Daha sonra, iyonu giderilmiş su ve hava kuru yüzü aşağı ile yıkayın. </li><li> bir kemoterapötik ajan / madde, önceki deneyde tabaklara eklenmiş ise,% 5 açık bir deterjan çözeltisi ile her bir çanak dolgu ve bir gece bekletin. <ol><li> İyice çanak içindeki deterjan izlerini önlemek için akan musluk suyu altında bulaşıkları yıkayın. bulaşıkları yıkayın ve bulaşık aşağı deiyonize su ve hava kuru yüzüyle kapsar. </li></ol></li><li> sterilizasyon torbaları içine kendi kapakları ile temiz ve kuru yemekleri yerleştirin. Yemekler yüz aşağı ile kapatın ve bir otoklavda çanta yerleştirin. 121 ° C&#39;den daha yüksek bir sıcaklıkta, 30 dakika süreyle otoklavlanmaktadır. </li><li> kısmen otoklav kapağını açın, bir kurutma programı ile otoklav ayarlayın ve 30 dakika boyunca yemekler kurutun. </li><li> Hafif% 70 etanol ile ıslatılmış bir bezle taban plakası silin. </li> &lt;/ Ol&gt; 2. Deney Kurulumu NOT: Bu protokolde kullanılan tüm ekipman ve malzemeler Malzeme Listesinde açıklanmıştır. Steril koşullar muhafaza ederken tüm adımlar aşağıda bir laminar akış kabini içinde yapılmalıdır. <ol><li> Bölüm 1 &#39;de tarif edildiği gibi, temiz ve steril TTFields yemekleri ve kapakları hazırlayın hafifçe% 70 etanol ile ıslatılmış bir bez ile taban plakası silin. </li><li> tabağına hafifçe bastırarak ve taban plakası üzerinde üç pimin üzerine bulaşık kilitleri ağız kadar yaklaşık 5 mm saat yönünde çevirerek taban plakası üzerine kapaklı TTFields yemekler takın. Her bir tabağın tabanına steril bir 22 mm lamel (işlenmiş plastik veya cam) yerleştirin. </li><li> tam büyüme ortamında hücre süspansiyonu (U-87 MG ve F98 için Dulbecco&#39;nun modifiye edilmiş Eagle ortamı hazırlamak; RPMI A2780 ve OVCAR-3, tarif edildiği gibi ilave Malzemeler Listesi). NOT: ceII konsantrasyonu% 80-% 90 birleşen hücre büyümesi, deneyin sonuna kadar aşılmamalıdır, hücre tipleri ve deney süresine bağlıdır. DİKKAT: İnsan hücre hatları biyolojik bir tehlike temsil edebilir ve uygun güvenlik önlemleri ele alınmalıdır. </li><li> Her lamel merkezi bir damla olarak hücre süspansiyonu (iki katına çıkma süresi ile ilgili olarak, bir 72-st bir deney için 200 uL genellikle 5,000-20,000 hücre), 200 uL yerleştirin ve bulaşık kapaklı kapsamaktadır. </li><li> Hücreler uygun kadar bir CO2 inkübatör içinde 37 ° C&#39;de inkübe edilir; Bir gece boyunca inkübasyon bu aşamada mümkündür. </li><li> Bir 200- veya 1000-mcL pipet kullanarak menüden sıvıları aspire. </li><li> Yavaşça her yemeğin doldurmak için, tam büyüme ortamında 2 mL pipetle. pipet steril ucu kullanın ve usulca bazen slayt altında yakalandı hava kabarcıklarını çıkarmak için lamel kenarları hafifçe vurun. </li><li> Onların kapaklı yemekleri örtün ve onlara ins yerleştirmekTTFields Tedavinin başlangıcında kadar 37 ° C&#39;de bir CO2 inkübatör ide. </li></ol> 3. TTFields Başvurusu <ol><li> Bir soğutma CO2 inkübatöründe bağlı TTFields yemekler ile taban plakaları aktarın. Not: nitro TTFields uygulama ısı üretecek olarak; Dolayısıyla, bir buzdolabında inkübatör yemeklerin ısınma telafi etmek gereklidir. Daha yüksek TTFields yoğunluklar daha fazla ısı üretecek ve daha düşük inkübatör ortam sıcaklıkları (Tablo 1 e bakınız) gerektirecektir. TTFields uygulama için kuluçka sıcaklığı 18-30 ° C aralığında olduğu zaman klinik olarak önemli TTFields yoğunlukları elde edilir. </li><li> taban plakasına düz kablo, dişi konektör bağlayın. üzerinde TTFields jeneratör açın. </li><li> In vitro uygulama sistemi yazılımında TTFields başlatın ve deney ayarlarını seçin. <ol><li> Yeni bir deneme tanımlayın. exp adını yazıneriment ve bilgisayar ekranında yazılım kullanıcı arayüzünde deney sahibi. Her bir tabak ya da taban plakası için olan frekans ve hedef sıcaklığa ayarlayın. </li></ol></li><li> yazılımını kullanarak TTFields uygulamasını başlatın. </li><li> Tüm yemekler düzgün bağlandığından emin olun ve monitörde açık mavi görüntülenir. Bir tabak kırmızı çerçeve ile çember ise (düzgün bağlı olmadığı anlamına gelir), hafifçe bastırın ve kontakları tamir edilinceye kadar ileri geri yavaşça döndürün ve çanak açık mavi görünür. </li><li> En fazla 24 saat çalışan vitro uygulama sisteminde TTFields bırakın. </li><li> Deney son noktaya ulaşırsa, yazılımda SON DENEY düğmesine tıklayarak denemeyi durdurup, 5. Değilse adım PAUSE deney tıklayın geçin. </li><li> taban plakasından düz kablo konnektörü ayırın. Laminer akış kabinine inkübatör yemekleri ile taban plakasını sökün. </li><li> Tüm çanak orta değiştirinHer 24 saatte bir yıkayın ve taban plakasını buzdolabında bulunan inkübatöre geri gönderin. Yassı kabloyu kullanarak taban plakasını jeneratöre bağlayın. CONTINUE düğmesine tıklayarak denemeye devam edin. </li></ol> 4. Kontrol Örnekleri Not: TTFields uygulaması hariç, kontrol hücrelerini TTFields ile işlem gören hücrelere benzer koşullarda büyütün. <ol><li> Aynı süspansiyonlu ve TTFields ile muamele edilmiş numunelerin kaplanması için kullanılan benzer bir yüzey üzerindeki plaka kontrol numuneleri. </li><li> Kontrol kaplarını 37 ° C&#39;de CO 2 inkübatörüne yerleştirin. </li><li> Ortamı, her 24 saatte bir TTFields ile işlenmiş çanak ortam koşullarıyla eşleştirmek için bulaşıkları değiştirin. </li></ol> 5. Deney Bitir <ol><li> DENEME SONU&#39;ya tıkladıktan sonra, yazılımın sistemdeki tüm kayıtları almasını ve kayıtları bilgisayara kaydetmesini bekleyin. </li><li> Sıcaklık, akım ve direnç günlüğünü görmek için RAPORLAR düğmesini kullanın fher bir taban plakasının Iles yemekler deney planına göre tedavi edildi doğrulamak için. NOT: Tüm raporlar ve günlükleri deney bittikten sonra bilgisayara kaydedilir ve herhangi bir zamanda gözden geçirilebilir. </li><li> TTFields jeneratör kapatın. </li><li> taban plakasından düz kablosunu ve inkübatör çıkarın. </li><li> aşağı bir seramik tabak çıkarmak için, Altlığından kilidini saat yönünün yemeğin açmak için. </li><li> Laminer akış kabinine bulaşıkları alın ve aseptik lamelleri çıkarın. Daha fazla kontrol ve değerlendirme için taze ortam ya da fosfat-tamponlu salin (PBS) içeren Petri kapları steril aktarın. </li></ol> TTFields Etkisinin Değerlendirilmesi 6. NOT: TTFields&#39; etkileri çeşitli şekillerde belirlenebilir. muamele edilmemiş kontrol hücrelerine muamele edilmiştir karşılaştırmak için aşağıdaki yöntemlerden bir veya daha fazlası kullanılır: <ol><li> Hücre sayımı<ol><li> Her bir lamel içeren çanak orta / PBS çıkarın. </li><li> Bir CO2 inkübatör içinde 37 ° C&#39;de (hücre lamel yüzeyinden ayırmak başlayana dek, yani) her bir tabağa, 0.5 mL% 0.25 tripsin / EDTA ilave ve 10 dakika inkübe edilir. </li><li> tripsin nötralize yavaşça yukarı ve aşağı pipetleme hücrelerin yeniden askıya almak için, tam büyüme ortamında 0.5 mL ekleyin. </li><li> Düşük hücre konsantrasyonları sayma ile uyumlu olan herhangi bir standart hücre sayımı tekniği kullanarak hücreleri sayın (yani, yaklaşık 20,000 hücre / mL) eklenmiştir. </li></ol></li><li> kolojenık incelemesi <ol><li> yeni, steril Petri kutularına ya da taze tam büyüme ortamında 2 mL içeren 6 oyuklu plakalar üzerine Her bir tabaktan alınan hücre benzer sayıda (tabak başına 100-500 hücre) Plate. </li><li> ~ 50 hücre oluşur müteşekkil kolonilerinin (her bir hücre hattı özelliklerine bağlı olarak) 1-3 hafta boyunca 37 ° C&#39;de bir CO2 inkübatör içinde inkübe edin. hücreyi değerlendirinIşık mikroskobu ile koloni başına sayısı. </li><li> Ortamı çıkarın ve PBS ile yıkayın. </li><li> PBS çıkarın ve buz soğukluğunda metanol (1 mL) ilave edilir. 10 dakika veya daha uzun bir süre -20 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> metanol çıkarın. </li><li> Kristal viyole çözeltisi (% 0.1 a / su içinde% 25 h / h metanol içerisinde v) ilave edilir ve 20 dakika inkübe edilir. DİKKAT: Kristal viyole potansiyel bir kanserojen olduğu; kristal mor ile çalışırken eldiven kullanın. </li><li> , Kristal viyole kaldırma deiyonize su ile 3 kez yıkanır ve hava ile kurutulur. </li><li> Her bir tabağın içinde oluşturulmuş kolonileri sayın. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Kirson, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternating+electric+fields+arrest+cell+proliferation+in+animal+tumor+models+and+human+brain+tumors.">Alternating electric fields arrest cell proliferation in animal tumor models and human brain tumors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (24), 10152-10157 (2007).</li><li>Kirson, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+cancer+cell+replication+by+alternating+electric+fields.">Disruption of cancer cell replication by alternating electric fields.</a> Cancer Res. 64 (9), 3288-3295 (2004).</li><li>Gera, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+treating+fields+perturb+the+localization+of+septins+and+cause+aberrant+mitotic+exit.">Tumor treating fields perturb the localization of septins and cause aberrant mitotic exit.</a> PLoS One. 10 (5), (2015).</li><li>Giladi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+disruption+and+reduced+clonogenicity+of+pancreatic+cancer+cells+in+vitro+and+in+vivo+by+tumor+treating+fields.">Mitotic disruption and reduced clonogenicity of pancreatic cancer cells in vitro and in vivo by tumor treating fields.</a> Pancreatology. 14 (1), 54-63 (2014).</li><li>Giladi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitotic+Spindle+Disruption+by+Alternating+Electric+Fields+Leads+to+Improper+Chromosome+Segregation+and+Mitotic+Catastrophe+in+Cancer+Cells.">Mitotic Spindle Disruption by Alternating Electric Fields Leads to Improper Chromosome Segregation and Mitotic Catastrophe in Cancer Cells.</a> Sci Rep. 5, 18046 (2015).</li><li>Giladi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternating+electric+fields+(tumor-treating+fields+therapy)+can+improve+chemotherapy+treatment+efficacy+in+non-small+cell+lung+cancer+both+in+vitro+and+in+vivo.">Alternating electric fields (tumor-treating fields therapy) can improve chemotherapy treatment efficacy in non-small cell lung cancer both in vitro and in vivo.</a> Semin Oncol. 41, S35-S41 (2014).</li><li>Voloshin, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternating+electric+fields+(TTFields)+in+combination+with+paclitaxel+are+therapeutically+effective+against+ovarian+cancer+cells+in+vitro+and+in+vivo.">Alternating electric fields (TTFields) in combination with paclitaxel are therapeutically effective against ovarian cancer cells in vitro and in vivo.</a> Int J Cancer. 139 (12), 2850-2858 (2016).</li><li>Pless, M., Droege, C., von Moos, R., Salzberg, M., Betticher &amp;amp, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+I/II+trial+of+Tumor+Treating+Fields+(TTFields)+therapy+in+combination+with+pemetrexed+for+advanced+non-small+cell+lung+cancer.">A phase I/II trial of Tumor Treating Fields (TTFields) therapy in combination with pemetrexed for advanced non-small cell lung cancer.</a> Lung Cancer. 81 (3), 445-450 (2013).</li><li>Stupp, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maintenance+therapy+with+tumor-treating+fields+plus+temozolomide+vs+temozolomide+alone+for+glioblastoma:+A+randomized+clinical+trial.">Maintenance therapy with tumor-treating fields plus temozolomide vs temozolomide alone for glioblastoma: A randomized clinical trial.</a> JAMA. 314 (23), 2535-2543 (2015).</li><li>Stupp, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NovoTTF-100A+versus+physician's+choice+chemotherapy+in+recurrent+glioblastoma:+a+randomised+phase+III+trial+of+a+novel+treatment+modality.">NovoTTF-100A versus physician's choice chemotherapy in recurrent glioblastoma: a randomised phase III trial of a novel treatment modality.</a> Eur J Cancer. 48 (14), 2192-2202 (2012).</li><li>Kanner, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post+Hoc+analyses+of+intention-to-treat+population+in+phase+III+comparison+of+NovoTTF-100A+system+versus+best+physician's+choice+chemotherapy.">Post Hoc analyses of intention-to-treat population in phase III comparison of NovoTTF-100A system versus best physician's choice chemotherapy.</a> Semin Oncol. 41, S25-S34 (2014).</li><li>Miranda, P. C., Mekonnen, A., Salvador, R., Basser &amp;amp, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predicting+the+electric+field+distribution+in+the+brain+for+the+treatment+of+glioblastoma.">Predicting the electric field distribution in the brain for the treatment of glioblastoma.</a> Phys Med Biol. 59 (15), 4137-4147 (2014).</li><li>Wong, E. T., Lok, E., Swanson &amp;amp, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Evidence-Based+Review+of+Alternating+Electric+Fields+Therapy+for+Malignant+Gliomas.">An Evidence-Based Review of Alternating Electric Fields Therapy for Malignant Gliomas.</a> Curr Treat Options Oncol. 16 (8), (2015).</li><li>Kim, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+effect+of+an+alternating+electric+field+on+cell+proliferation+and+synergistic+antimitotic+effect+in+combination+with+ionizing+radiation.">Biological effect of an alternating electric field on cell proliferation and synergistic antimitotic effect in combination with ionizing radiation.</a> Oncotarget. , (2016).</li><li>Kim, E. H., Song, H. S., Yoo, S. H., Yoon &amp;amp, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+treating+fields+inhibit+glioblastoma+cell+migration,+invasion+and+angiogenesis.">Tumor treating fields inhibit glioblastoma cell migration, invasion and angiogenesis.</a> Oncotarget. , (2016).</li><li>Pavesi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+a+3D+microfluidic+culture+platform+for+tumor-treating+field+application.">Engineering a 3D microfluidic culture platform for tumor-treating field application.</a> Sci Rep. 6, 26584 (2016).</li><li>Wong, E. T., Lok, E., Swanson &amp;amp, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+benefit+in+recurrent+glioblastoma+from+adjuvant+NovoTTF-100A+and+TCCC+after+temozolomide+and+bevacizumab+failure:+a+preliminary+observation.">Clinical benefit in recurrent glioblastoma from adjuvant NovoTTF-100A and TCCC after temozolomide and bevacizumab failure: a preliminary observation.</a> Cancer Med. , (2015).</li><li>Kirson, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotherapeutic+treatment+efficacy+and+sensitivity+are+increased+by+adjuvant+alternating+electric+fields+(TTFields).">Chemotherapeutic treatment efficacy and sensitivity are increased by adjuvant alternating electric fields (TTFields).</a> BMC Med Phys. 9, (2009).</li><li>Schneiderman, R. S., Shmueli, E., Kirson, E. D., Palti &amp;amp, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TTFields+alone+and+in+combination+with+chemotherapeutic+agents+effectively+reduce+the+viability+of+MDR+cell+sub-lines+that+over-express+ABC+transporters.">TTFields alone and in combination with chemotherapeutic agents effectively reduce the viability of MDR cell sub-lines that over-express ABC transporters.</a> BMC Cancer. 10, 229 (2010).</li><li>Connelly, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planning+TTFields+treatment+using+the+NovoTAL+system-clinical+case+series+beyond+the+use+of+MRI+contrast+enhancement.">Planning TTFields treatment using the NovoTAL system-clinical case series beyond the use of MRI contrast enhancement.</a> BMC Cancer. 16 (1), (2016).</li></ol>

Porat Yaara, Giladi Moshe, Schneiderman S. Rosa, Blat Roni, Shteingauz Anna Zeevi einav, Munster Mijal, Voloshin Tali, Kaynan Noa Tal Orna ve Kirson D. Eilon D Novocure Ltd, İsrail de çalışanların ödenir. Weinberg Uri Novocure GmbH, Luzern ücretli çalışanın. Yoram Palti Novocure Ltd, NY bir ortağıdır.

TTFields düzgün ayarlanmış alternatif elektrik alanları, 1, 2, 8, 9, 10, 17 sürekli bir uygulamaya dayalı yükselen bir anti-tümör yöntemidir. Anti-tümör etkinliğini maksimize tedavi yöntemleri için istenen bir sonuçtur. Böylece, kanserli hücre büyümesi inhibisyonu her ek yüzde &quot;mücadele&quot; hastalar için uzun süreli klinik sonuç üzerinde önemli bir etkiye sahip olabilir. Bu, TTFields uygulamanın gerekli olan sürekli doğası ve elde edilen toplam etki göstermektedir. Maksimize TTFields uygulama çeşitli yollarla elde edilebilir: (1) elektrik alan yoğunluğu 1, 7, artan (2) uzatma tedavi süresi 5, (3) en etkili combinati bulma18 , 19 ve (4) en iyi frekansı tanımlayan diğer tedavi modaliteleri ile birlikte 1 , 2 , 4 , 6 , 7 . Tümör sahasında elektrik alan şiddetinin en üst düzeye çıkarılması, dizilerin konumunu hasta cildi üzerinde optimize etmek suretiyle sağlanır; Bu, hastanın 20 bireysel anatomisine dayanılarak maksimal alan yoğunluğunun tümöre verilmesini sağlar. Uzun süreli tedavi süresi çoğunlukla hastanın tedaviye uyumluluğuna (günde en az 18 saat) dayanıyor. Diğer terapilerle doğru kombinasyonun bulunması ve optimal frekansın belirlenmesi, TTFields tedavi sonuçlan için geçerli bir belirteç bulunmadığından şu anda in vitro sonuçlar üzerine kuruludur. Bu çalışmada, deneysel pTTFields in vitro uygulama sistemini kullanarak kanserli hücre çizgileri için optimal TTField frekansını belirlemek için gereken rolü. Burada açıklanan yöntemler, diğer kanser tedavi yöntemlerinin ( örn., Kemoterapi ajanları veya ışınlama) TTField&#39;larla kombinasyonunun taranması ve her bir spesifik kombine tedavi için TTFields uygulaması için en uygun frekansı belirlemek için potansiyel olarak kullanılabilir. Daha önceki yayınlar doğrultusunda, burada gösterilen sonuçlar, hem gliom hücreleri hem de yumurtalık kanseri hücrelerinin tedavisinde en uygun sıklığın 200 kHz 1 , 7 olduğunu ortaya koymaktadır. Bu çalışmada, klonojenik potensiyeli azaltmak için en uygun TTFields frekansının, maksimum sitotoksik etkiye yol açan frekansla ilişkili olduğunu ilk kez gösterdik. Bu çalışmada TTField&#39;lerin ( yani sitotoksik ve klonojenik) etkilerini ölçmek için kullanılan yöntemlerTedavi sonuçlarını değerlendirmek için olası birçok standart son nokta testinden sadece iki tanesidir. İlave tedavi sonuç testleri şunları içerir: (1) hücre içi yapıların görüntülenmesi için hücrelerin üzerine mikroskop uygulanan lamelleri sabitleme, lekelenme ve monte etme; (2) TTFields bulaşıklarının kendisinden veya lamelin yeni bir atılabilir tabak içine aktarılmasından sonra, protein ve RNA özütlerinin deneylerini gerçekleştirmek; Ve (3) akış sitometrisi analizi için lekelenmiş hücrelerin tripsinizasyonunu içerir. Dikkatli bir deney planlaması, TTFields&#39;in verilmesinden sonraki tedavi sonuçlarını etkiler. Kilit adımlar arasında, deney boyunca hücre çoğalmasının, hassas hücre hatlarına uygulandığında çok yüksek yoğunluklar gerekli testler için çok az sayıda hücre belirleyecek şekilde aşırı büyüme ve uygun elektrik alan yoğunluğuna yol açmamasını sağlamayı içerir. En uygun frekans. Tersine, TTFields çok düşük yoğunluklarda uygulanırDaha az duyarlı hücre çizgileri üzerinde, doğal değişimler tarafından maskelenebilen küçük etkilere yol açacaktır. İşlem kayıtları, sıcaklık kararlılığı, elektrik akımları ve deney boyunca her yemeğin direnci ile ilgili değerli bilgiler için incelenmelidir. Tedavi başlangıcındaki hatalı tabakların değiştirilmesi ve arzu edilen tedavi parametrelerini karşılamayan bir tabaktan alınan verilerin hariç tutulması, tekrarlar arasındaki değişkenliği en aza indirecektir. Özetle, TTFields, 8,9,10 klinik ortamlarda etkinlik ve güvenlik gösterdiği ortaya çıkan bir antikanser tedavi modalitesidir. Burada açıklanan protokolleri kullanarak bir in vitro ortamda TTField&#39;ları test etmek, klinik ortamda TTFields tedavi parametrelerinin optimizasyonuna izin verebilir ve alttaki etki mekanizması konusundaki anlayışımızı genişletebilir.

Tümör tedavisi Sahası (TTFields) glioblastoma multiforme ve potansiyel olarak diğer kanser türlerinin tedavisi için bir anti-mitotik yöntemidir. Alanları tümör, 1, 2 bölgeye elektrik alanları sırayla değişen, düşük yoğunlukta sürekli uygulanması (1-3 V / cm), ara frekans (100-500 kHz) ile teslim edilmiştir. In vitro ve in vivo olarak TTFields uygulaması çeşitli kanser hücre kuşaklarının büyümesini ve çeşitli hayvan tümör modellerinde, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 tümör ilerlemesini önleyen gösterilmiştir. glioblastoma ve küçük hücreli olmayan akciğer kanseri dahil olmak üzere katı tümörler, hastalarda pilot klinik çalışmalarda ve daha büyük randomize çalışmalar, demonst sahipSürekli TTFields uygulamasının emniyetini ve etkinliğini 8 , 9 , 10 olarak derecelendirdi. TTFields&#39;in etkinliği şu şekilde bulundu: (1) frekansa bağlı, spesifik optimal frekanslar, farklı kökenden 1 , 2 , 4 , 5 , 6 , 7 kaynaklı hücre hatlarının hücre sayımlarında en fazla azalmaya neden olur; (2) yaklaşık 1 V / cm&#39;de aktivite için minimum bir eşik ve 1 , 2 , 7 , 11 daha güçlü yüksek yoğunluklarla , elektrik alan yoğunluğuna bağlı; (3) tedavi süresi daha uzun olduğunda artmış 5 ; Ve (4) 2 yönlü TTFields her otonom için dikey olarak uygulandığında daha yüksekTek bir yönden uygulanan elektrik alanlarına kıyasla 1 . Yukarıdaki bulgulara dayanarak, TTFields, tümör yatağındaki elektrik alan şiddetini en üst düzeye çıkarmak için hastanın cildinde lokalize olan 2 set dönüştürücü diziyi kullanarak uzun süreler boyunca hastalara uygulanabilir 12,13. TTField&#39;lerin kanserli hücreler üzerindeki etkilerini in vitro olarak incelemek şu anda belirli bir tümör türüne uygulanacak en uygun frekansı belirlemenin tek yolunu sağlamaktadır. Optimum frekansı test etmek için, 100-500 kHz aralığında farklı frekansların ve hücre kültürüne 3 V / cm karekök kareye (RMS) kadar şiddet uygulamanın yapılmasına izin veren bir cihaz gerekir. TTFields uygulaması ısı üretirken, uygulama sistemi sıcaklık üzerindeki sıkı kontrolü sürdürürken aşırı sıcaklığı dağıtma yeteneğini gerektirir. Birkaç cihaz dahaE, hücre kültürlerine 1 , 2 , 5 , 14 , 15 , 16 TTFields uygulamasına izin vermek için yıllar boyunca geliştirildi. Bütün bu cihazlarda, elektrot yüzeyinde elektron değişimi ve zehirli metal iyonlarının ortam 1 içine salınması gibi iletken elektrotların kullanılmasına ilişkin uyarıları önlemek için kullanılan elektrotlar izole edildi. Test edilen çeşitli TTFields uygulama sistemleri arasındaki temel fark, 2 , 14 , 15 , 16 nolu izolatör ince bir film ile yalıtılmış metal tellerden yapılmış ya da yüksek dielektrik sabitli bir materyal ile ( örn. Kurşun magnezyum niobat-kurşun titanatE (PMN-PT)) 6 . İzoleli tel elektrotlar, TTFields uygulaması için nispeten basit ve uygun maliyetli bir çözüm sunarken, genellikle 1 V / cm eşiğin üzerindeki efektif elektrik alan şiddetlerini elde etmek için gerekli olan yüksek voltaj ve hücre kaplaması için mevcut olan yüzey ile sınırlıdır, Çünkü elektrotlar arasındaki mesafe nispeten azdır. Yüksek dielektrik sabit bir malzeme kullanılarak izole edilmiş elektrotlara dayanan sistemler özel tasarım ve imalat kabiliyetleri gerektirir, ancak yüksek voltaj gerektirmezler ve elektrotlar arasında hücre büyümesi için daha büyük bir alan sunabilirler. Bu çalışmada kullanılan TTFields in vitro uygulama sistemi, yüksek dielektrik sabit seramikten ( yani, PMN-PT) oluşan bir Petri kabı (TTFields çanak, bkz. Şekil 1 ) olan çekirdek birimi olan ikinci sistem sınıfına aittir. İki çift elektrod, dış duvar üzerinde dikey olarak basılmaktadır2 doğrultudan elektrik alanlarının uygulanmasına izin vermek için bir TTFields tabakının ls&#39;si. Elektrotlar, 50-500 kHz frekans aralığında TTField uygulamasına izin veren bir sinüzoidal dalga formu üreteci ve bir yükselticiye bağlanır. Aşırı ısıyı dağıtmak için, TTFields bulaşıkları bir buzdolabında inkübatöre konur; orta sıcaklık kontrolü, çanak sıcaklığının sabit izlenmesi ve sistem tarafından uygulanan voltaja yapılan ayarlamalar kullanılarak gerçekleştirilir. Uygulamada, kuluçka makinesini daha düşük bir sıcaklığa ayarlamak, çanak içindeki hedef sıcaklığa ulaşılana kadar sistem voltajı arttırdığı için daha yüksek elektrik alan şiddetine yol açacaktır. Çanak içindeki sıcaklık ile inkübatör sıcaklığı arasındaki fark, sıcaklık gradyanlarına bağlı olarak biraz buharlaşmaya neden olabilir; Dolayısıyla, yeterli büyüme koşullarını korumak için kültür ortamının her 24 saatte değiştirilmesi gerekiyor. Aşağıdaki protokolTTField frekanslarının kanserli hücrelere uygulanmasını optimize etmek için deneysel prosedürü açıklar, böylece hücre sayımında azami bir azalma ve hayatta kalan hücrelerin koloni oluşturmak için potansiyelinde bir azalma sağlanır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>inovitro system and software</td>
			<td>Novocure</td>
			<td>ITG1000 and IBP1000</td>
			<td>Each unit contains 1 TTFields generator, 1 base plate, 8 TTFields dishes with covers and 1 flat cable.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilization bags</td>
			<td>Westfield medical</td>
			<td>24882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic cover slides</td>
			<td>Thermo Scientific (NUNC)</td>
			<td>174977</td>
			<td>Pre treated and sterilized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cover slides</td>
			<td>Thermo Scientific (Menzel-Gl&#228;ser)</td>
			<td>CB00220RA1</td>
			<td>Sterilize if necessary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium</td>
			<td>Biological Industries (Israel)</td>
			<td>01-055-1A</td>
			<td>Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI 1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21875-034</td>
			<td>Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Biological Industries (Israel)</td>
			<td>04-007-1A</td>
			<td>Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Glutamine 200mM (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25030-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep (10000 U/mL Penicillin, 10000 &#181;g/mL Streptomycin)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Pyruvate solution 100 mM&#160;</td>
			<td>Biological Industries (Israel)</td>
			<td>03-042-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes buffer 1M</td>
			<td>Biological Industries (Israel)</td>
			<td>03-025-1B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insuline solution from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10516-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.25% Trypsin/EDTA</td>
			<td>Biological Industries (Israel)</td>
			<td>03-050-1B</td>
			<td>Warm in 37 &#176;C water bath before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>1.06009.2511</td>
			<td>Cool to -20 &#176;C in the freezer before use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Crystal violet</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>120M1445</td>
			<td>Harmful. Prepare 0.1% w/v crystal violet solution in 25% Methanol 75% water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light detergent</td>
			<td>Alcononx</td>
			<td>242985</td>
			<td>Prepare 5% solution in water, or according to manufacurer&#39;s instrutions.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Biological Industries (Israel)</td>
			<td>02-023-1A</td>
			<td>Without calcium and magnesium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>A2780</td>
			<td>ECACC</td>
			<td>93112519</td>
			<td>Grow in RPMI 1640 supplemented with FBS (10%), pen/strep (100 U/mL / 100 &#181;g/Ml), sodium pyruvate (1 mM) and Hepes buffer (12mM).&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F98</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-2397</td>
			<td>Grow in&#160; Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium supplemented with FBS (10%), pen/strep (100 U/mL / 100 &#181;g/Ml), sodium pyruvate(1 mM) and glutamine (2mM).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ovcar-3</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-161</td>
			<td>Grow in RPMI 1640 supplemented with FBS (20%), pen/strep&#160; (100 U/mL / 100 &#181;g/Ml), sodium pyruvate (1 mM), Hepes buffer (12 mM) and insuline (10 &#181;g/mL).&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U-87 MG</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-14</td>
			<td>Grow in&#160; Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium supplemented with FBS (10%), pen/strep (100 U/mL / 100 &#181;g/Ml), sodium pyruvate(1 mM) and glutamine (2mM).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>refrigirated CO2 incubator</td>
			<td>CARON</td>
			<td>7404-10-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow cabinet</td>
			<td>ADS Laminair</td>
			<td>Bio12 and VSM12</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determining the optimal inhibitory frequency for cancerous cells using tumor treating fields (ttfields)

Tümör alanları (TTFields) tedavisi, birkaç yüz kHz arasındaki bir frekans aralığında elektrik alanları sırayla değişen düşük yoğunluğunun sürekli, invazif olmayan bir uygulama (1-3 V / cm) ile teslim etkili bir tedavi şekli vardır. Doku kültüründe TTFields çalışma yüksek bir dielektrik sabiti (ɛ&gt; 5.000) ile seramik Petri kapları frekansları ve yoğunlukları değişen elektrik alanlarının uygulama sağlar nitro uygulama sistemi, TTFields kullanılarak gerçekleştirilir. Seramik Petri kapları altındaki lamelleri kaplama Kanserli hücre hatları, hücre sayımı ve klonojenik tahlilleri gibi tedavi sonuç testleri, kolaylaştırmak için çeşitli frekanslarda iki ortogonal yönde teslim TTFields tabi tutulur. Bu raporda sunulan sonuçlar hücre sayımı ve klonojenik tahlilleri ile ilgili olarak TTFields optimal frekans bilgilerini yumurtalık ve glioma hücreleri için, 200 kHz olduğunu göstermektedir.

<html> Farklı frekanslar tararken TTFields uygulamasının sonuçlan, hücre sayımları, kolorimetrik deneyler, klonojenik testler ve özel bir yüksek duvar TTFields içine yerleştirilmiş bir Boyden odasını kullanarak istilacı hücrelerin sayısındaki değişiklikler üzerine yapılan incelemeler gibi farklı tahlillere dayanılarak nicelendirilebilir Hücre kültürü çanağı. Önceden belirlenmiş hücre çoğaltma sürelerine dayanan dikkatli deney planlaması, hücrelerin tedavi süresi boyunca maksimum sayıda mitotik olaya ulaşmasına ve dolayısıyla tedavi sonuçlarının en üst düzeye çıkarılmasına olanak tanır. Şekil 2, A2780&#39;in ( yani insan yumurtalık kanseri hücreleri; Şekil 2A ) 7 ve F-98&#39;in ( yani, sıçan glioma hücreleri; örn., Sıçan glioma hücreleri) ortalama bir hücre sayımı ( yani hücre sayısı) ve klonojenik tahlil için tipik bir frekans tarama sonucu göstermektedir.&quot;&gt; Şekil 2B) 1 (iki yönlü TTFields ile muamele frekans aralığı: 100-500 kHz, RMS: 1.7 V / cm ve kuluçka ısısı:. 18 ° C), sonuçlar, tüm hücre sayılarında belirgin bir azalma frekansları uygulanan (çoklu karşılaştırma ile tek yönlü ANOVA) test edilen tüm hücre hatları için 200 kHz maksimum azalma. klonojenik potansiyeli yüksek azalmasına yol açan uygun frekans hem A2780 ve F98 hücreleri (Şekil 2B ve C) için aynıydı ., hücre sayısı ve her bir frekansta klonojenik etkisi arasında Pearson korelasyon katsayısı 0.967 (p = 0.002) ve sırasıyla A2780 ve F98 için 0.755 (p = 0.083) idi. Şekil 3, OVCAR-3 için ortalama hücre sayımı için bir frekans tarama sonucu gösterir (diğer bir deyişle, insan yumurtalık kanser hücrelerinin, Şekil 3A) ve U-87 MG (yani insan glioma hücreleri, Şekil 3B) hücreleri, farklı yoğunluklarda TTFields iki yön ile muamele edilmiş (RMS: 1.7, 1.3 ve 1.0 U / cm aralıklarında ve kuluçka ısısı: 18 ° C, 24 ° C ve 28 ° C) göstermektedir. , Hücrelere etki eden tedavi zaman elde edilen sonuçlar ile karşılaştırıldığında, nispeten küçük: sonuç yine 1.3 V / cm &#39;TTFields ile muamele (24 ° C inkübatör sıcaklığı) sonra OVCAR-3 hücre sayımında önemli bir azalma ise olduğunu göstermektedir 1.7 V / cm (kuluçka sıcaklığı: 18 ° C). U 87 mg, hücreler, 1.0 V / cm &#39;TTFields ile muamele (kuluçka sıcaklığı: 28 ° C) de 1.7 V / cm ile tedavi edildiğinde hücre sayısının azaltılmasında da benzer bir eğilim gösteren, ama etkisi daha düşük yoğunluklarda anlamlı değildi . <img alt="Şekil 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55820/55820fig1.jpg" /> Figüre, 1. TTFields yemekler taban plakası ünitesi üzerine yüklenmiş ve düz TTFields kontrol kablosuna bağlanmıştır. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55820/55820fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.</a> <img alt="şekil 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55820/55820fig2.jpg" /> Şekil 2. (A), A2780 ve (B) F98 hücreleri için uygun TTFields önleyici frekansının belirlenmesi için frekans tarar. Hücreler, farklı frekanslar TTFields (1.7 V / cm ve 100-500 kHz) ile 72 saat boyunca muamele edilmiştir. TTFields tedavisinin etkisi hücre sayısını ve clonogenic testler kullanılarak tahmin edilmiştir. Ok uygun sıklığını gösterir. Sonuçlar, test edilen her bir frekans için en az 6 tekrar göre ± SD ortalamasını temsil etmektedir. (C) clonogenic s temsili görüntüleri<html> Çeşitli frekanslarda TTFields tedaviden sonra A2780 hücreleri urvival. <a href="https://ecsource-jove-com.remotexs.ntu.edu.sg/files/ftp_upload/55820/55820fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.</a> <img alt="Şekil 3," class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55820/55820fig3.jpg" /> Şekil 3. (A), OVCAR-3 ve (B) için en uygun TTFields önleyici frekansının belirlenmesi için frekans taraması U 87 mg hücreleri. Hücreler, farklı frekanslarda (100-500 kHz) ve yoğunluk TTFields ile 72 saat süre ile muamele edilmiştir (OVCAR-3: 1.3 ve 1.7 V / cm; U-87 MG: 1.0 ve 1.7 V / cm). TTFields tedavisinin etkisi, hücre sayımı kullanılarak tahmin edilmiştir. Ok uygun sıklığını gösterir. Sonuçlar, test edilen her bir frekansta en az 6 tekrar göre ± SD ortalamasını temsil etmektedir.Pg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> İnkübatör ortam sıcaklığı </td><td> Beklenen TTFields yoğunlukları </td></tr><tr><td> (° C) </td><td> (V / cm RMS) </td></tr><tr><td> 18 </td><td> 1.62 </td></tr><tr><td> 19 </td><td> 1.55 </td></tr><tr><td> 20 </td><td> 1.48 </td></tr><tr><td> 21 </td><td> 1.41 </td></tr><tr><td> 22 </td><td> 1.33 </td></tr><tr><td> 23 </td><td> 1.26 </td></tr><tr><td> 24 </td><td> 1.19 </td></tr><tr><td> 25 </td><td> 1.12 </td></tr><tr><td> 26 </td><td> 1.04 </td></tr><tr><td> 27 </td><td> 0.97 </td></tr><tr><td> 28 </td><td> 0.9 </td></tr><tr><td> 29 </td><td> 0,83 </td></tr><tr> &lt;td&gt; 30 </td><td> 0.76 </td></tr></tbody></table> Tablo 1. İnkübatör ortam sıcaklığı ve beklenen TTFields TTFields kabındaki yoğunlukları.

Watch this Scientific Journal Video about Determining the Optimal Inhibitory Frequency for Cancerous Cells Using Tumor Treating Fields TTFields at JoVE.com

Determining the Optimal Inhibitory Frequency for Cancerous Cells Using Tumor Treating Fields TTFields

Tümör Muamele Alanları (TTFields), düşük yoğunluklu, ara frekanslı, alternasyonlu elektrik alanlarının kesintisiz, noninvaziv uygulamasıyla verilen etkili bir anti-tümör tedavi modudur. TT, bir TTFields in vitro uygulama sistemi kullanarak hücre dizilerine uygulama yapmayı, hücre sayımlarında en fazla düşüşe yol açan en uygun frekansın saptanmasına izin verir.

Fields Tedavisi Tümör kullanma Kanserli Hücreleri için optimum inhibitör Frekans (TTFields) Belirlenmesi

Tumor Treating Fields (TTFields) are an effective treatment modality delivered via the continuous, noninvasive application of low-intensity (1-3 V/cm), ...

determining-optimal-inhibitory-frequency-for-cancerous-cells-using

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Determining the Optimal Inhibitory Frequency for Cancerous Cells Using Tumor Treating Fields (TTFields)

14.8K Görüntüleme.  Novocure Ltd., Haifa, Israel.  Tümör Muamele Alanları (TTFields), düşük yoğunluklu, ara frekanslı, alternasyonlu elektrik alanlarının kesintisiz, noninvaziv uygulamasıyla verilen etkili bir anti-tümör tedavi modudur. TT, bir TTFields in vitro uygulama sistemi kullanarak hücre dizilerine uygulama yapmayı, hücre sayımlarında en fazla düşüşe yol açan en uygun frekansın saptanmasına izin verir. 

Video: Determining the Optimal Inhibitory Frequency for Cancerous Cells Using Tumor Treating Fields TTFields

Capture and Release of Viable Circulating Tumor Cells from Blood

We demonstrate a method for size based capture of viable circulating tumor cell (CTC) from whole blood, along with the release of these cells from chip for downstream analysis and/or culture. The strategy employs the use of a novel Parylene C membrane slot pore microfilter to capture CTC and a coating of poly (N-iso-propylacrylamide) (PIPAAm) for thermoresponsive viable release of the captured CTC. The capture of live cells is enabled by leveraging the design of a slot pore geometry with specific dimensions to reduce the shear stress typically associated with the filtration process. While the microfilter exhibits a high capture efficiency, the release of these cells is non-trivial. Typically, only a small percentage of cells are released when techniques such as reverse flow or cell scraping are used. The strong adhesion of these epithelial cancer cells to the Parylene C membrane is attributable to non-specific electrostatic interaction. To counteract this effect, we employed the use of PIPAAm coating and exploited its thermal responsive interfacial properties to release the cells from the filter. Blood is first filtered at room temperature. Below 32 &#176;C, PIPAAm is hydrophilic. Thereafter, the filter is placed in either culture media or a buffer maintained at 37 &#176;C, which results in the PIPAAm turning hydrophobic, and subsequently releasing the electrostatically bound cells.

A protocol to utilize a poly(N-iso-propylacrylamide) (PIPAAm) coated microfilter for effective capture and thermoresponsive release of viable circulating tumor cells (CTC) is presented. This method allows capture of CTC from patients&#39; blood and subsequent release of viable CTC for downstream off-chip culture, analyses and characterization.

Yakalama ve Kan gelen Canlı Sirkülasyon Tümör Hücrelerinin Yayın

We demonstrate a method for size based capture of viable circulating tumor cell (CTC) from whole blood, along with the release of these cells from chip ...

Kanser Araştırmaları

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the context of a whole organism. Sophisticated techniques to generate genetic mosaics facilitate induction of visually marked, genetically defined clones surrounded by normal tissue. The clones can be analyzed through diverse molecular, cellular and omics approaches. This study describes how to generate fluorescently labeled clonal tumors of varying malignancy in the eye/antennal imaginal discs (EAD) of Drosophila larvae using the Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. It describes procedures how to recover the mosaic EAD and brain from the larvae and how to process them for simultaneous imaging of fluorescent transgenic reporters and antibody staining. To facilitate molecular characterization of the mosaic tissue, we describe a protocol for isolation of total RNA from the EAD. The dissection procedure is suitable to recover EAD and brains from any larval stage. The fixation and staining protocol for imaginal discs works with a number of transgenic reporters and antibodies that recognize Drosophila proteins. The protocol for RNA isolation can be applied to various larval organs, whole larvae, and adult flies. Total RNA can be used for profiling of gene expression changes using candidate or genome-wide approaches. Finally, we detail a method for quantifying invasiveness of the clonal tumors. Although this method has limited use, its underlying concept is broadly applicable to other quantitative studies where cognitive bias must be avoided.

The Drosophila Imaginal Disc Tumor Model: Visualization and Quantification of Gene Expression and Tumor Invasiveness Using Genetic Mosaics

This protocol demonstrates how to generate fluorescently marked, genetically defined clonal tumors in the Drosophila eye/antennal imaginal discs (EAD). It describes how to dissect the EAD and brain from the third instar larvae and how to process them to visualize and quantify gene expression changes and tumor invasiveness.

<em&gt; Drosophila</em&gt; Hayali Disk Tümör Modeli: Genetik Mozaikler kullanma Gen İfade ve Tümör invazivliğinin Görselleştirme ve

Drosophila melanogaster has emerged as a powerful experimental system for functional and mechanistic studies of tumor development and progression in the ...

Characterization of Tumor Cells Using a Medical Wire for Capturing Circulating Tumor Cells: A 3D Approach Based on Immunofluorescence and DNA FISH

Circulating tumor cells (CTCs) are associated with poor survival in metastatic cancer. Their identification, phenotyping, and genotyping could lead to a better understanding of tumor heterogeneity and thus facilitate the selection of patients for personalized treatment. However, this is hampered because of the rarity of CTCs. We present an innovative approach for sampling a high volume of the patient blood and obtaining information about presence, phenotype, and gene translocation of CTCs. The method combines immunofluorescence staining and DNA fluorescent-in-situ-hybridization (DNA FISH) and is based on a functionalized medical wire. This wire is an innovative device that permits the in vivo isolation of CTCs from a large volume of peripheral blood. The blood volume screened by a 30-min administration of the wire is approximately 1.5-3 L. To demonstrate the feasibility of this approach, epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) expression and the chromosomal translocation of the ALK gene were determined in non-small-cell lung cancer (NSCLC) cell lines captured by the functionalized wire and stained with an immuno-DNA FISH approach. Our main challenge was to perform the assay on a 3D structure, the functionalized wire, and to determine immuno-phenotype and FISH signals on this support using a conventional fluorescence microscope. The results obtained indicate that catching CTCs and analyzing their phenotype and chromosomal rearrangement could potentially represent a new companion diagnostic approach and provide an innovative strategy for improving personalized cancer treatments.

We present a new approach to characterize tumor cells. We combined immunofluorescence with DNA fluorescent-in-situ-hybridization to evaluate cells captured by a functionalized medical wire capable of in vivo enriching CTCs directly from patient blood.

Tümör hücrelerinin tümör hücreleri dolaşan yakalamak için tıbbi bir tel kullanarak karakterizasyonu: 3D bir yaklaşım tabanlı ayirt ve DNA balık

Circulating tumor cells (CTCs) are associated with poor survival in metastatic cancer. Their identification, phenotyping, and genotyping could lead to a ...

Modeling Osteosarcoma Using Li-Fraumeni Syndrome Patient-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Li-Fraumeni syndrome (LFS) is an autosomal dominant hereditary cancer disorder. Patients with LFS are predisposed to a various type of tumors, including osteosarcoma--one of the most frequent primary non-hematologic malignancies in the childhood and adolescence. Therefore, LFS provides an ideal model to study this malignancy. Taking advantage of iPSC methodologies, LFS-associated osteosarcoma can be successfully modeled by differentiating LFS patient iPSCs to mesenchymal stem cells (MSCs), and then to osteoblasts--the cells of origin for osteosarcomas. These LFS osteoblasts recapitulate oncogenic properties of osteosarcoma, providing an attractive model system for delineating the pathogenesis of osteosarcoma. This manuscript demonstrates a protocol for the generation of iPSCs from LFS patient fibroblasts, differentiation of iPSCs to MSCs, differentiation of MSCs to osteoblasts, and in vivo tumorigenesis using LFS osteoblasts. This iPSC disease model can be extended to identify potential biomarkers or therapeutic targets for LFS-associated osteosarcoma.

Here, we present a protocol for the generation of induced pluripotent Stem Cells (iPSCs) from Li-Fraumeni Syndrome (LFS) patient derived fibroblasts, differentiation of iPSCs via mesenchymal stem cells (MSCs) to osteoblasts, and modeling in vivo tumorigenesis using LFS patient-derived osteoblasts.

Li-Fraumeni sendromu hasta kaynaklı indüklenmiş Pluripotent kök hücreler kullanılarak osteosarkom modelleme

Li-Fraumeni syndrome (LFS) is an autosomal dominant hereditary cancer disorder. Patients with LFS are predisposed to a various type of tumors, including ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as tumors. Because digital polymerase chain reactions (PCR) enable the precise quantification of DNA copy number variants, they are becoming an essential tool for detecting rare genetic variations, such as drug-resistant mutations. It is expected that molecular diagnoses using digital PCR (dPCR) will be available in clinical practice in the near future; thus, how to efficiently conduct dPCR with human genetic material is a hot topic. Here, we introduce a method to detect Adenomatous polyposis coli (APC) somatic mosaicism using dPCR with the chip-in-a-tube format, which allows eight dPCR reactions to be simultaneously conducted. Care should be taken when filling and sealing the reaction mixture on the chips. This article demonstrates how to avoid the over- and underestimation of positive partitions. Furthermore, we present a simple procedure for collecting the dPCR product from the partitions on the chips, which can then be used to confirm the specific amplification. We hope that this methods report will help promote the dPCR with the chip-in-a-tube method in genetic research.

Digital polymerase chain reaction (PCR) is a useful tool for the high-sensitivity detection of single nucleotide variants and DNA copy number variants. Here, we demonstrate key considerations for measuring rare variants in the human genome using digital PCR with the chip-in-a-tube format.

Dijital polimeraz zincir reaksiyonu tahlil için tüp içinde çip biçimini kullanarak bir sporadik ailesel Adenomatous poliposis hastada genetik varyasyon

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

The Clinical Application of Tumor Treating Fields Therapy in Glioblastoma

Glioblastoma is the most common and lethal form of brain cancer, with a median survival of 15 months after diagnosis and a 5 year survival rate of only 5% with current standard of care. Tumors often recur within 9 months following initial surgery, radiation and chemotherapy, at which point treatment options become limited. This highlights the pressing need for the development of better therapeutics to prolong survival and increase the quality of life for these patients.
Tumor Treating Fields (TTFields) therapy was developed to take advantage of the effect of low frequency alternating electrical fields on cells for cancer therapy. TTFields have been demonstrated to disrupt cells during mitosis and slow tumor growth. There is also growing evidence that they act through stimulating immune responses within exposed tumors. The advantages of TTFields therapy include its noninvasive approach and increased quality of life compared to other treatment modalities such as cytotoxic chemotherapies. The Food and Drug Administration approved TTFields therapy for the treatment of recurrent glioblastoma in 2011 and for newly diagnosed glioblastoma in 2015. We report on the effects of TTFields during mitosis, the results of electric fields modeling, and proper transducer array placement. Our protocol outlines the clinical application of TTFields on a patient post-surgery, using the second-generation device.

Glioblastoma is the most common and aggressive primary brain malignancy in adults, with most tumors recurring after initial treatment. Tumor Treating Fields (TTFields) therapy is the newest treatment modality for glioblastoma. Here, we describe the proper application of TTFields-transducer arrays on patients and discuss theory and aspects of treatment.

Glioblastoma içinde alanları terapi tedavi tümör klinik uygulama

Glioblastoma is the most common and lethal form of brain cancer, with a median survival of 15 months after diagnosis and a 5 year survival rate of only 5% ...

Measuring Bone Remodeling and Recreating the Tumor-Bone Microenvironment Using Calvaria Co-culture and Histomorphometry

Bone is a connective tissue constituted of osteoblasts, osteocytes, and osteoclasts and a mineralized extracellular matrix, which gives it its strength and flexibility and allows it to fulfill its functions. Bone is continuously exposed to a variety of stimuli, which in pathological conditions can deregulate bone remodeling. To study bone biology and diseases and evaluate potential therapeutic agents, it has been necessary to develop in vitro and in vivo models.
This manuscript describes the dissection process and culture conditions of calvarias isolated from neonatal mice to study bone formation and the bone tumor microenvironment. In contrast to in vitro and in vivo models, this ex vivo model allows preservation of the three-dimensional environment of the tissue as well as the cellular diversity of the bone while culturing under defined conditions to simulate the desired microenvironment. Therefore, it is possible to investigate bone remodeling and its mechanisms, as well as the interactions with other cell types, such as the interactions between cancer cells and bone.
The assays reported here use calvarias from 5-7 day old BALB/C mice. The hemi-calvarias obtained are cultured in the presence of insulin, breast cancer cells (MDA-MB-231), or conditioned medium from breast cancer cell cultures. After analysis, it was established that insulin induced new bone formation, while cancer cells and their conditioned medium induced bone resorption. The calvarial model has been successfully used in basic and applied research to study bone development and cancer-induced bone diseases. Overall, it is an excellent option for an easy, informative, and low-cost assay.

The ex vivo culture of bone explants can be a valuable tool for the study of bone physiology and the potential evaluation of drugs in bone remodeling and bone diseases. The presented protocol describes the preparation and culture of calvarias isolated from newborn mice skulls, as well as its applications.

Calvaria Co-culture ve Histomorfometri Kullanarak Kemik Remodeling ve Tümör-Kemik Mikroortamı yeniden oluşturma

Bone is a connective tissue constituted of osteoblasts, osteocytes, and osteoclasts and a mineralized extracellular matrix, which gives it its strength ...

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of patients with advanced cancer. Adoptive T cell transfer (ACT) of highly enriched tumor antigen-specific T cells has been shown to cause durable regression of metastatic cancer in some patients. However, during expansion, these cells may become exhausted or senescent, limiting their effector function and persistence in vivo. Induced pluripotent stem cell (iPSC) technology may overcome these obstacles by leading to in vitro generation of large numbers of less differentiated tumor antigen-specific T cells. Human iPSC (hiPSC) have the capacity to differentiate into any type of somatic cell, including lymphocytes, which retain the original T cell receptor (TCR) genomic rearrangement when a T cell is used as a starting cell. Therefore, reprogramming of human tumor antigen-specific T cells to hiPSC followed by redifferentiation to T cell lineage has the potential to produce rejuvenated tumor antigen-specific T cells. Described here is a method for generating tumor antigen-specific CD8&#945;&#946;+ single positive (SP) T cells from hiPSC using OP9/DLL1 co-culture system. This method is a powerful tool for in vitro T cell lineage generation and will facilitate the development of in vitro derived T cells for use in regenerative medicine and cell-based therapies.

This article describes a method to generate functional tumor antigen-specific induced pluripotent stem cell-derived CD8&#945;&#946;+ single positive T cells using OP9/DLL1 co-culture system.

Tümör Antijene Özgü T Hücrelerinin Üretimi için İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerin Kullanılması

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

Pathological Analysis of Lung Metastasis Following Lateral Tail-Vein Injection of Tumor Cells

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous metastasis models are available. Thus, the experimental metastasis model involving tail-vein injection of suitable cell lines is a mainstay of metastasis research. When cancer cells are injected into the lateral tail-vein, the lung is their preferred site of colonization. A potential limitation of this technique is the accurate quantification of the metastatic lung tumor burden. While some investigators count macrometastases of a pre-defined size and/or include micrometastases following sectioning of tissue, others determine the area of metastatic lesions relative to normal tissue area. Both of these quantification methods can be exceedingly difficult when the metastatic burden is high. Herein, we demonstrate an intravenous injection model of lung metastasis followed by an advanced method for quantifying metastatic tumor burden using image analysis software. This process allows for investigation of multiple end-point parameters, including average metastasis size, total number of metastases, and total metastasis area, to provide a comprehensive analysis. Furthermore, this method has been reviewed by a veterinary pathologist board-certified by the American College of Veterinary Pathologists (SEK) to ensure accuracy.

Intravenous injection of cancer cells is often used in metastasis research, but the metastatic tumor burden can be difficult to analyze. Herein, we demonstrate a tail-vein injection model of metastasis and include a novel approach to analyze the resulting metastatic lung tumor burden.

Tümör Hücrelerinin Lateral Kuyruk-Damar Enjeksiyonu Sonrasında Akciğer Metastazının Patolojik Analizi

Metastasis, the primary cause of morbidity and mortality for most cancer patients, can be challenging to model preclinically in mice. Few spontaneous ...

Generation of Zebrafish Larval Xenografts and Tumor Behavior Analysis

Zebrafish larval xenografts are being widely used for cancer research to perform in vivo and real-time studies of human cancer. The possibility of rapidly visualizing the response to anti-cancer therapies (chemo, radiotherapy, and biologicals), angiogenesis and metastasis with single cell resolution, places the zebrafish xenograft model as a top choice to develop preclinical studies.

The zebrafish larval xenograft assay presents several experimental advantages compared to other models, but probably the most striking is the reduction of size scale and consequently time. This reduction of scale allows single cell imaging, the use of a relatively low number of human cells (compatible with biopsies), medium-high-throughput drug screenings, but most importantly enables a significant reduction of the time of the assay. All these advantages make the zebrafish xenograft assay extremely attractive for future personalized medicine applications.

Many zebrafish xenograft protocols have been developed with a wide diversity of human tumors; however, a general and standardized protocol to efficiently generate zebrafish larval xenografts is still lacking. Here we provide a step-by-step protocol, with tips to generate xenografts and guidelines for tumor behavior analysis, whole-mount immunofluorescence, and confocal imaging quantification.

Here, we provide a step-by-step protocol, with tips to generate xenografts and guidelines for tumor behavior analysis, whole-mount immunofluorescence, and confocal imaging quantification.

Zebra Balığı Larva Xenografts ve Tümör Davranış AnaliziNin Üretimi

Zebrafish larval xenografts are being widely used for cancer research to perform in vivo and real-time studies of human cancer. The possibility of rapidly ...